Phân tích vi sinh vật trong nước.

ĐỀ CƯƠNG PHÂN TÍCH VI SINH VẬT TRONG NƯỚC VÀ THỰC PHẨM

Câu 1 Nêu các qui tắc an toàn trong phòng thí nghiệm vi sinh vật.Nêu phương pháp
định lượng vi sinh vật đếm khuẩn lạc.
1.Quy tắc an toàn trong phòng thí nhiệm vi sinh vật

-

-

-

-

-

 Để đảm bảo cho bản thân và những người khác trong phong thí nghiệm vi sinh vật cần
tuân thủ những quy tắc an toàn sau:
- Nắm vững nguyên tắc, phương pháp làm việc với vsv.
Không ăn uống, hút thuốc trong phòng kiểm nghiệm. Mang khẩu trang khi thao tác với vsv
Mặc áo blouse trong thời gian làm việc.
Trước khi bắt đầu làm cần sát trùng mặt bàn bằng giấy lau tẩm cồn 70 o hoặc dung dịch diệt
khuẩn khác (lysol 5%, amphyl 10%, chlorox 10%), để khô. Thực hiện tương tự cho hai tay. Chú
ý chưa đốt đèn cồn hoặc đèn Bunsen khi tay chưa khô cồn. lặp lại việc sát trùng sau khi hoàn
thành công việc.
Cần ghi chú tên chủng, ngày tháng thí nghiệm lên tất cả các hộp petri, ống nghiệm môi trường,
bình nuôi cấy.
Khi lỡ tay làm đổ, nhiễm vi sinh vật ra nơi làm việc, dùng khăn giấy thấm chất diệt khuẩn lau
kỹ, sau đó thực hiện khử trùng lại bàn làm việc.
Cần cẩn thận thao tác với đèn cồn hoặc đèn Bunsen. Tắt ngọn lửa khi chưa có nhu cầu sử dụng
hoặc ngay sau khi thực hiện xong mỗi thao tác. Lưu ý tránh đưa tay, tóc qua ngọn lửa. Cần có

cách bảo vệ tóc thích hợp trường hợp có tóc dài.
Sử dụng quả bóp cao su khi thao tác ống hút định lượng,không hút bằng miệng.
Khi làm vỡ dụng cụ thủy tinh, cẩn thận mang găng tay thu gọn tất cả các mảnh vỡ vào một túi
rác riêng.
Tác riêng chất thải rắn và chất thải lỏng.
Tất cả các chất thải rắn, môi trường chứa hoặc nhiễm vsv cần được hấp khử trùng trước khi
thải bỏ vào bãi giác. Các dụng cụ, bình chứa nhiễm vsv cần được ngâm vào dung dịch diệt
khuẩn trước khi rửa và tái sử dụng.
Cần gói hoặc ràng bằng băng keo khi đặt trồng các hộp petri lên nhau
Không mở hộp petri và dùng mũi ngửi tránh nhiễm vsv vào đường hô hấp
Khi đốt que cấy có dính sinh khối vi sinh vật, cần đặt vòng hoặc đầu que cấy vào chân ngọn lửa
để tránh sự văng nhiễm vsv vào không khí.
Sát trùng và rửa tay sạch sẽ trước khi rời phòng thí nghiệm.
2. Nêu phương pháp định lượng vi sinh vật đếm khuẩn lạc.
Phương pháp đếm khuẩn lạc cho phép xác định số lượng tế bào VSV còn sống hiện diện trong
mẫu Phương pháp đếm khuẩn lạc có thể được thực hiện bằng kĩ thuật hộp trải hay hộp đổ với
các thiết bị hỗ trợ đọc kết quả. Trong phương pháp này cần thực hiện pha loãng mẫu thành
nhiều độ pha loãng bậc 10 liên tiếp sao cho có độ pha loãng với mật độ tế bào thích hợp đê
xuất hiện các khuẩn lạc riêng lẽ trên bề mặt thạch với số lượn đủ lớn để hạn chế khi đếm và so
sánh, tính toán.
Số lượng khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa phụ thuộc vào mẫu sử dụng, môi trường và điều kiện ủ.
Thông thường điều kiện nuôi cấy ( nhiệt độ, mt, t) cần đảm bao sao cho số khuẩn lạc xuất hiện
tối đa. Phương pháp đếm khuẩn lạc dễ cho sai số lớn nên cần thực hiện ít nhất 2 đĩa. Kết quả
đếm và mật độ tế bào thường được trình bày bằng số đơn vị hình thành khuẩn lạc CFU/ml.


-

Đây là phương pháp tốt nhất để xác định mật độ tế bào sống. Ngoài ra phương pháp này còn
có ưu điểm độ nhạy cao, cho phép định lượng vsv ở mật độ thấp trong mẫu.

Quy trình thao tác xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuản lạc:
+Pha loãng mẫu theo dãy thập phân: mẫu được pha loãng tuần tự thành các dãy
nồng độ:1/10, 1/100, 1/1000…
+Tạo hộp trải hay hộp đổ
+Tính kết quả: được tính theo công thức: Mi (CFU/ml) = Ai * Di/V
Câu 2 Trình bày thử nghiệm sinh hóa TSI và thử nghiệm Catalase.Nêu qui trình phân
tích Staphylococcus aureus.
1. Trình bày thử nghiệm sinh hóa TSI và thử nghiệm Catalase

+
+
+
+
+



−
+
−
+
+
+
+
+
−
+
−

 Thử nghiệm sinh hóa TSI

− Nguyên tắc:
Môi trường TSI cùng với mt KIA được sử dụng để kết hợp thử nghiệm khả năng sử dụng các
nguồn carbon khác nhau và khả năng sinh H2S của chủng vsv.
Về nguồn carbon môi trường TSI chứa 2 loại đường 1% lactose, 0.1% glucose và 1% sucrose.
Khả năng sử dụng cả 3 nguồn đường là glu, lac, sur hay chỉ sử dụng glu để lấy năng lượng
− Phương pháp tiến hành
Môi trường TSI được pha chế, hấp khử trùng, chuyển vào các ống nghiệm vô trùng tạo ống
thạch nghiêng
Dùng que cấy thẳng cấy sinh khối khuẩn lạc vào ống thạch
Tiến hành ủ
Đọc kết quả:

Nếu chỉ lên men glucose, sau 18-24h phần môi trường bề mặt của ống thạch nghiêm
trở lên có pH kiềm và phần sâu trong ống có pH acid.

Nếu sử dụng cả glucose, lactose, sucrose, sau 18-24h i toàn bộ môi trường đều trở lên
pH acid.

Nếu không sử dụng được cả ba nguồn carbon này, thì pepton được sử dụng để biến
dưỡng thu năng lượng và vật chất cần cho sự tăng trưởng của vsv.
Thử nghiệm Catalase
Nguyên tắc:
Các vsv hiếu khí và kị khí tùy ý chứa chuỗi truyền điện tử có cytochrome đều có enzyme
catalase.. Catalase thủy phân hydrogen peroxide thành H2O và O2.
Phương pháp tiến hành:
Hóa chất sử dụng là dung dịch hydrogen peroxide 30%, dung dịch đệm phosphate pH 7.0
Có thể thực hiện bằng những phương pháp sau đây:
Thử nghiệm phiến kính: dùng ki lấy một ít sinh khối khuẩn lạc, đặt lên phiến kính, nhỏ H 2O2
30% , ghi nhận sự sủi bọt
Thử nghiệm trong ống thạch nghiêng: nhỏ trực tiếp 1ml H 2O2 30% lên sinh khối trên bề mặt

thạch nghiêng.
Thử nghiệm ống mao dẫn: dùng ống mao dẫn thu lấy dung dịch H 2O2 30%, chấm đầu ống mao
dẫn vào tâm khuẩn lạc.
Đọc kết quả:
Thử nghiệm (+) khi có hiện tượng sủi bọt khí do O 2 được tao ra, ngược lại là (-)
2.Nêu qui trình phân tích Staphylococcus aureus.
 Định nghĩa và nguyên tắc:
Là vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy ý, hình cầu, gram dương, có khả năng lên men, sinh và sinh
acid từ mannitol, trehalose, surose.


− S. aureus được xác định dựa trên cơ sở các đặc điểm tăng trưởng và phản ứng đông huyết
tương của các dòng thuần từ khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường phân lập
 Môi trường và hóa chất sử dụng:
− Môi trường canh MSB
− Môi trường thạch máu
− Môi trường thạch BPA
− Môi truường TGA
− Môi trường BHI
− Huyết tương thỏ
 Phân tích định tính
− Cấy 2ml dung dịch mẫu vào ống nghiệm chứa 8ml môi trường MSB, trộn đều và ủ ở 37 oC trong
24h.
− Dùng que cấy ria dịch mẫu từ ống (+) lên môi trường phân lập là thạch TGA, ủ ở 37 oC trong
24h.
− Tìm khuẩn lạc đặc trưng của S. aureus trên môi trường phân lập
− Chọn khuẩn lạc đặc trưng, cấy vào ống môi trường BHI, ủ ở 37oC trong 24h.
− Cấy vào ống nghiệm nhỏ chứa khoảng 0.3ml huyết tương và ủ ở 37 oC trong 24h. để thử phản
ứng đông kết.
− Thực hiện song song một ống đối chứng không được cấy dịch vi sinh vật

− Mẫu được kết luận là có S.aureus khi thử nghiệm coagulase này (+) ( có sự xuất hiện của khối
đông trong khi ống đối chứng không có)
 Phân tích định lượng
−
Bằng phương pháp đếm khuẩn lạc
−
Bằng phương pháp MPN
Câu 3 Trình bày thử nghiệm sinh hóa khả năng lên men và thử nghiệmcoagulase.Nêu
qui trình phân tích tổng số vi sinh vật hiếu khí.

+
+

+
+

•
•

1. Trình bày thử nghiệm sinh hóa khả năng lên men và thử nghiệm coagulase
 Thử nghiệm khả năng lên men
− Nguyên tắc:
Vsv có khả năng khác nhau trong việc sử dụng các nguồn carbon khác nhau.
Khi sử dụng các nguồn acrbon để lên men tùy phương thức lên men các sản phẩm tạo ra sẽ
khác nhau . trong tất cả các trường hợp, các sản phẩm tạo thành đều làm giảm pH của mt dẫn
đến sự thay đổi chỉ thị màu của pH trong mt.ngoài ra CO 2 sẽ được tạo thành, được phát hiện
qua ống Durham
− Phương pháp tiến hành:
Môi trường được sử dụng là Phenol Red Broth Base có pH=7.4, chỉ thị pH là đỏ phenol.
Môi trường đã bổ sung đường được chứa trong bình tam giác được khử trùng bằng một trong

ba cách:
• Lọc vô trùng qua màng lọc
• Hấp 116-118oC trong 15’
• Hấp 121oC trong 15’
+ Làm nguội, phân phối vào các ống nghiệm
+ Tiến hành cấy chủng vào các ống
− Đọc kết quả:
+ Khả năng lên men được đánh giá dựa vào sự sinh acid và sinh hơi.
Sinh acid là (+) khi môi trường với chỉ thị đỏ phenol chuyển tành màu vàng, ngược lại nếu mt
chuyển thành màu đỏ
Sinh hơi là (+) khi có bọt khí trong ống Durham


 Thử nghiệm coagulase
− nguyên tắc:
phát hiện sự có mặt của ezyme coagulase bằng phản ứng đông huyết tương. Từ đó để định
danh các loài thuộc giống Staphylococus, do những loài này có khả năng tiết ra coagulase.
− Phương pháp tiến hành:
+ Thử nghiệm này có thể thực hiện với huyết tương( thỏ, người) hoặc fibrinogen
+ Hoạt tính coagulase có thể được thực hiện bằn hai phương pháp:
• Thử nghiệm trên phiến kính: nhỏ lên lame một giọt nước cất, thu khuẩn lạc hòa vào giọt nước,
thêm huyết tương, hòa đều tạo huyền phù đồng nhất.
• Thử nghiệm trong ống nghiệm: ho vào ống nghiệm 0.5ml huyết tương thỏ và 0.5ml dịch cấy vi
khuẩn, ủ 37oC trong 4h
− Đọc kết quả
+ Thử nghiệm là (+) khi có sự kết tụ, là(-) khi hỗn hợp không kết tụ.
2. Nêu qui trình phân tích tổng số vi sinh vật hiếu khí.
 Định nghĩa và nguyên tắc
− Vi khuẩn hiếu khí là những vi khuẩn tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc trong điều kiện có
sự xuất hiện của khí oxy phận tử.

− Chỉ số này được xác định bằng phương pháp đếm vi khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch
dinh dưỡng.
 Môi trường và hóa chất:
− Môi trường được sử dụng là PCA có pH +- 0.2
− Dung dịch nước muối pepton SPW
 Quy trình phân tích
− Chuẩn bị mẫu trước khi phân tích:
+ Đồng nhất mẫu:
• Đối với mẫu dạng rắn, dùng các dụng cụ khử trùng cân chính xác 10g(hay25g) mẫu vào trong
bao PE. Thêm vào lượng mẫu này 90ml ( hay 225ml) dung dịch pha loãng SPW. Thực hiện
đồng nhất mẫu.
• Đối với mẫu dạng lỏng, hút 10ml( hay 25ml) cho vào bình tam giác chứa 990ml (hay 225ml)
nước SPW đã được khử trùn, lác đều.
+ Sau khi đồng nhất dung dịch mẫu thu được có độ pah loãng là 10-1.
+ Dung dịch đồng nhất tiếp tục được pha loãng theo dãy thập phân bằng cách dùng pipet vô
trùng chuyển 1ml dịch mẫu vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch pha loãng. Trộn mẫu trong
ống nghiệm cho đồng nhất. Dung dịch mẫu này có độ pha loãng 10 -2
+ Tiếp tục thực hiện tương tự để có các độ pha loãng thập phân tiếp theo cho đến độ pha loãng
cần thiết
− Cấy mẫu
+ Chọn 2 hay 3 độ pha loãng liên tiếp dự kiến chứa 25-250 tế bào vsv trong 1ml để cấy lên đĩa
petri
+ Dùng pipet vô trùng chuyển 1ml dịch mẫu pha loãng vào giữa đĩa petri vô trùng. Tương ứng
với mỗi độ pha loãng cấy ít nhất 2-3 đĩa.
+ Sau khi cấy, đổ vào mỗi đĩa 10-15ml môi trường PCA đã được đun chảy và ổn định ở 45 oC. trộn
đều dịch mẫu với môi trường.
+ Đặt các đĩa lên mặt phẳng nằm nganh cho thạch đông.
+ Lật ngược và ủ trong tủ ấm 30o C trong 72h
Cách tính kết quả:
+

Mật độ tổng số vk hiếu khí trong 1g hay 1ml được tính như sau:
A (CFU/g hay CFU/ml)= N/(n1Vf1+…+niVfi)


Câu 4 Nêu các qui tắc an toàn trong phòng thí nghiệm vi sinh vật.Nêu phương pháp
phát quang sinh học ATP.
2. Nêu phương pháp phát quang sinh học ATP.
− Pháp quang sinh học ATP
− Phân tử ATP ( Adenosin Triphosphat) được tìm thấy trong tất cả các tế bào sống nên sự phát
hiện ATP là dấu hiệu để nhận biết vật chất sống đang tồn tại. Phạm vi áp dụng:
+ Xác định rõ số vi sinh vật đang hiện diện.
+ Đánh giá chất lượng vi sinh của thực phẩm .
+ Kiểm tra tình trạng vệ sinh bề mặt thiết bị trong sản xuất , chế biến thực phẩm ,tổng vi khuẩn
hiếu khí trong thành phẩm
+ Ngày nay sự phát quang sinh học đã sử dụng khá rộng rãi để đánh giá chất lượng vệ sinh bề
mặt thiết bị sử dụng trong quá trình sản xuất ,chế biến , đánh giá chất lượng thực phẩm
− Nguyên tắc:
+ Mẫu thu bằng cách dùng que bông vô trùng quẹt một diện tích nhất định trên bề mặt dụng cụ ,
thiết bị .
+ Sau đó que bông được cho vào dung dịch ly trích ATP, xử lý với ATPase và cho phản ứng phát
sáng
− Cách tiến hành:
+ Chuẩn bị dung dịch đệm.
+ Lấy mẫu cho vào dung dịch đệm.
+ Sử lý với Enzyme ATPase trong 5 phút. Ly trích ATP bằng trichlaoutic axit 5%.
+ Thêm hỗn hợp phản ứng phát sáng (enzyme luciferase) do ánh sáng phát ra
− Kết quả:
+ Để biết mật độ của vi sinh vật ,so sánh trị số ánh sáng đo được với một đường chuẩn tương
quan giữa lượng ánh sáng phát ra và mật độ tế bào vi sinh vật đã được biết trước .
Câu 5 Trình bày thử nghiệm sinh hóa MR (Methyl red), thử VP (Voges- Proskauer)Nêu qui

trình phân tích Coliforms và Escherichia coli.
1. Trình bày thử nghiệm sinh hóa MR (Methyl red), thử VP (Voges- Proskauer)
 Thử nghiệm sinh hóa MR
− Nguyên tắc
− Phân biệt vsv dựa trên sự khác biệt về khả năng tạo ra và duy trì các sản phẩm biến dưỡng có
tính acid bền trong môi trường trong quá trình lên men glucose. Chỉ thị đỏ methy red giúp
phân biệt nồng độ ion H + hiện diện trong môi trường sau khi sinh vật lên men glucosePhương
pháp tiến hành
+ Được thực hiện trong các ống môi trường lỏng Glucose Phosphate.
+ Dùng que cấy vồng cấy sinh khôi từ khuẩn lạc trên môi trường KIA, ủ 37 oC trong khoảng 2-5
ngày.
+ Nhỏ vài giọt methyl red 0.02% vào trong ống nghiệm, đọc kết quả ngay.
− Đọc kết quả
+ Phản ứng (+) khi môi trường có màu đỏ, (-) khi môi trường có màu vàng.
 Thử nghiệm sinh hóa VP
− Nguyên tắc
+ Phát hiện vi khuẩn có hai loại enzyme chuyển hóa 2,3 butanediol thành acetoin khi có oxy và
chuyển hóa tiếp acetoin thành diacetyl.
+ Diacetyl kết hợp với guanidin trong pepton tạo phức diacetyl-guanidin có màu đỏ.
− Phương pháp tiến hành:
+ Môi trường được sử dụng cho thử nghiệm VP là môi trường lỏng MR-VP, có pH 6.9


+ Dùng que cấy, cấy sinh khối từ khuẩn lạc trên môi trường KIA hoặc TSI.
+ Ủ 37oC trong 24-48h.
+ Bổ sung thuốc thử trực tiếp vào môi trường ( có thể dùng một trong 3 loại thuốc thử sau:
Barrit, Koblentz, O’Meara). Lắc nhẹ ống 1 phút.
+ Đọc kết quả sau 20’ chậm nhất là 4h
− Đọc kết quả
+ Thử nghiệm VP là (+) khi có màu đỏ trên bề mặt môi trường, là (-) khi bề mặt môi trường

không đổi màu.
2. Nêu qui trình phân tích Coliforms và Escherichia coli
 Định nghĩa
− Bao gồm một số vi khuẩn gram âm, không tạo bào tử hiếu khí hoặc kị khí không bắt buộc, có khả
năng lên men đường lactoza, sinh hơi.
 Định lượng coliforms, coliforms chịu nhiệt, coliforms phân và ecoli bằng phương pháp MPN
− Nguyên tắc: dựa vào nguyên tắc mẫu được pha loãng theo dãy thập phân được ủ trong ống
nghiệm chứa môi trường thích hợp. theo dõi sự sinh hơi, đổi màu.
− Môi trường và hóa chất:
+ Môi trường LSB, môi trường BGBL, môi trường lỏng E.coli, môi trường rắn SCA
+ Dung dịch nước muối pepton SPW, thuốc thử Kovac’s, thuốc thử Methyl Red.
− Quy trình phân tích
+ Định lượng coliforms: lấy 1ml dịch mẫu pha loãng 10 -1 vào 3 ống nghiệm chứa 10ml LSB. Thực
hiện tương tự với dịch mẫu pha loãng 10 -2 và 10-3. ủ ở 37oC/48h. Dùng que cấy chuyển dịch mẫu
từ ống LSB sang ống BGBL và ủ 37oC/48h.
+ Định lượng coliforms chịu nhiệt: cấy chuyển dịch mẫu từ ống LBS (+) sang mt EC ủ ở 44.5 +0.2 độ/24h
+ Định lương coliforms phân: dùng que cấy ria dịch mẫu từ ông (+) EC sang mt thạch đĩa EMB. ủ
37oC/24h. Chọn khuẩn lạc > 1mm cấy chuyển vào Trypton. ủ ở 44.5 +- 0.2/24h. nhỏ thuốc thử
Kovac’s vào ống nghiệm.
+ Định lượng ecoli: làm tương tự như coliform phân nhưng cấy khuẩn lạc vào mt MRVP, SCA để
thực hiện thử nghiệm IMViC.
− Đọc kết quả:
Từ số lượng các ống nghiệm có E.coli(+) ở mỗi độ pha loãng dùng bảng MPN thích hợp để tính
mật độ vsv.
 Định lương coliforms, coliform phân bằng phương pháp đếm khuẩn lạc
− Nguyên tắc: mẫu được cấy trên môi trường thạch chứa lactose, đếm khuẩn lạc lên men lactose và
sinh acid.
− Môi trường và hóa chất:
+ Môi trường : TSA, VRB, BGBL, EC broth
+ Hóa chất: thuốc thử Kovac’s.

− Quy trình phân tích
+ Mẫu được đồng nhất và pha loãng. Lấy 1ml dịch pha loãng vào đĩa petri
+ Bổ sung 5ml mt TSA vào mỗi đĩa, trộn đều
+ Bổ sung 10-15ml mt thạch VRB lên mt TSA
+ Thử nghiệm khẳng định coliform: chọn ít nhất 5 khuẩn lạc nghi ngờ , cấy chuyển sang các
ống nghiệm chứa môi trường, BGBL. ủ ở 37 độ, trong 24-48h
− Cách tính kết quả: tính mật độ theo công thức A=N/(n1vf1+…nivfi)*R
 Định lượng e.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc


− Nguyên tắc: mẫu được nuôi cấy trên mt thạch chứa lactose, đếm các khuẩn lạc có hình dạng đặc
trưng của coliforms. Sau đó khẳng định bằng thử nghiệm IMViC.
− Môi trường và hóa chất.
+ Môi trường: TSA, VRB, EC Broth, LST Broth, MR-VP.
+ Hóa chất: thuốc thử Kovac’s
− Quy trình phân tích:
+ Mẫu được đồng nhất và pha loãng và định lượng tương tự như phần coliforms phân với bước
khẳng định như sau: chọn 5 khuẩn lạc nghi ngờ, cấy sang mt EC, urtrong 24h, chọn ống (+) cấy
chuyển sang mt : MR-VP, canh trytone. Thực hiện thử nghiệm indol, methyl red. Ghi nhận số
khuẩn lạc
− Cách tính kết quả: theo công thức trên
Câu 6 Trình bày thử nghiệm sinh hóa Oxidase và thử nghiệm Catalase.Nêu qui trình phân
tích Salmonella.
1. Trình bày thử nghiệm sinh hóa Oxidase và thử nghiệm Catalase

•
+

−
+

−
+
+
+
+
+
−
+

 Thử nghiệm Oxidase
− Nguyên tắc: phát hiện khả năng sinh enzyn cytochrome c oxydase của vi khuẩn.
− Phương pháp tiến hành:
+ Có thể thực hiện bằng một trong hai phương pháp sau:
Cấy sinh khối chủng thuần lên ống thạch nghiêng Nutrie, ủ ở nhiệt độ thích hợp trong 24-48h.
nhúng giấy lọc vào oxalate. Thu sinh khối dàn đều lên thuốc thứ trên giấy lọc. quan sát, ghi nhận
− Đọc kết quả :
Thử nghiệm oxidase (+) khi xuất hiện màu xanh dương đậm, ngược lại, không xuất hiện là (-)
Thử nghiệm Catalase
Nguyên tắc:
Các vsv hiếu khí và kị khí tùy ý chứa chuỗi truyền điện tử có cytochrome đều có enzyme
catalase. Các vsv này có khả năng biến dưỡng năng lương theo phương thức hô hấp với oxy là
chất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi truyền điện tử H 2O2. Catalase thủy phân hydrogen
peroxide thành H2O và O2 ,
Phương pháp tiến hành:
Hóa chất sử dụng là dung dịch hydrogen peroxide 30%, dung dịch đệm phosphate pH 7.0
Có thể thực hiện bằng những phương pháp sau đây:
Thử nghiệm phiến kính: dùng ki lấy một ít sinh khối khuẩn lạc, đặt lên phiến kính, nhỏ H 2O2
30% , ghi nhận sự sủi bọt
Thử nghiệm trong ống thạch nghiêng: nhỏ trực tiếp 1ml H 2O2 30% lên sinh khối trên bề mặt

thạch nghiêng.
Thử nghiệm ống mao dẫn: dùng ống mao dẫn thu lấy dung dịch H 2O2 30%, chấm đầu ống mao
dẫn vào tâm khuẩn lạc.
Đọc kết quả:
Thử nghiệm (+) khi có hiện tượng sủi bọt khí do O 2 được tao ra, ngược lại là (-)
2. .Nêu qui trình phân tích Salmonella.

 Định nghĩa và nguyên tắc
− Là trực khuẩn gram âm, hiếu khí và kị khí tùy nghi, không sinh bào tử, có tiêm mao, lên men
glucose và mannitol sinh acid.
− Salomomella có thể được phát hiện bằng một quy trình gồm 4 bước: tăng sinh, tăng sinh chọn
lọc, phân lập và khẳng định.
 Môi trường và hóa chất:


− Môi trường: RV, RV cải tiến, TT, XLD, HE, BS, BPLS, TSI, URE, canh Mannitol, canh
Sucrose..
− Hóa chất: nước pepton đệm, thuốc thử Kovac’s, kháng huyết thanh Salmonella đa giá.
 Quy trình phân tích đánh giá định tính.
− Tăng sinh: tiến hành cân 25g mẫu trong túi PE vô trùng, bổ sung 225ml dung dịch BPW và đồng
nhất. Ur ở 37 +- 1oC trong 18-24h.
− Tăng sinh chọn lọc: trộn đều dịch tăng sinh, chuyển 0.1ml sang 10ml môi trường tăng sinh
Rappapport-Vasliadis Soya Pepton đã được ủ ấm đến 42 độ. Ủ ở 42+- 0.2 độ trong 18-24h.
− Phân lập và nhận diện: cấy phân lập khuẩn lạc đơn với giống từ dịch tăng sinh chọn lọc lên đĩa
môi trường chọn lọc phân biệt đặc trưng cho Salmonella như XLD,HE,BS…Tất cả các đĩa môi
trường sau khi cấy được ủ ở 37 oC trong 22-26h. Tiến hành các thử nghiệm LDC(+), ure(-), lên
men mannitol, sorbitol(+), indol và VP(-) và thử nghiệm kháng nguyên.
 Báo cáo kết quả: quy trình kiểm nghiệm này chỉ cho phép phân tích định tính Salomella, giúp kết
luận có hay không có Salmonella hiện diện trong 25g mẫu.
Câu 7 Trình bày thử nghiệm sinh hóa decarboxylase và thử nghiệm Urease

.Nêu

qui

trình phân tích tổng số nấm men, nấm mốc.

+

+
+
+
+
+
+
−

1. Trình bày thử nghiệm sinh hóa decarboxylase và thử nghiệm Urease
 Thử nghiệm decarboxylase
− Nguyên tắc:
Phát hiện các loài vi khuẩn đường ruột có khả thăng tạo enzyme carboxlase có vai trò xúc tác
phản ứng loại bỏ nhóm carboxyl ở một loại acid amin tạo amine hoặc diamine và C02 trong điều
kiện kị khí.
− Phương pháp tiến hành
Sử dụng mt Decarboxylase Basal Medium, chứa chỉ thị Bromocresol purple, pH 6.0
Môi trường lỏng, được pha chế, hấp khử trùng.
Đổ 4-5ml mt vào các ống nghiệm
Cấy chủng thuần vào các ống mt, bổ sung thêm 2-3ml khoáng hoặc parafi
ủ 37 độ trong 24h-4 ngày
− đọc kết quả

thử nghiệm là (+) khi môi trường trở nên đục, có màu tím, (-) khi môi trường trong có màu vàng.
 Thử nghiệm Urease
Nguyên tắc: phát hiện enzym urease phân giải ure thành ammonia và carbondioxide. Ammonia
sinh ra kiềm hóa môi trường. Là phản ứng đặc trưng cho các loài Proteus.
− Phương pháp tiến hành
+ Môi trường ure lỏng, chứa chỉ thị đỏ phenol.
+ Cấy lượng sinh khối lớn vi khuẩn vào ống chứa 3ml mt
+ Lắc nhẹ ống, trộn đều, ủ 37 độ trong 48h. quan sát ghi nhận sự chuyển đổi màu.
− Đọc kết quả
+ Dương tính: môi trường chuyển thành màu tím đỏ. Âm tính: không màu.
2.Nêu qui trình phân tích tổng số nấm men, nấm mốc.

 Định nghĩa, nguyên tắc
− Định nghĩa: Nấm men là nhóm vsv nhân thật, có vách tế bào là lớp vỏ chitin, có nhân và các bào
quan khác, thuộc nhóm vsv dị dưỡng, sinh sản bằng bào tử hoặc khuẩn ty.
− Nguyên tắc: mật độ nấm mốc, nấm men được xác định chung dưới dạng tổng nấm mốc nấm men
bằng kĩ thuật pha loãng, trải và đếm khuẩn lạc trên môi trường DG18 hay DRBC.
 Môi trường và hóa chất


− Môi trường thạch: DG18, DBRC, MEA, PDA, SDA, SDB.
− Dung dịch pha loãng (nước pepton 1%)
 Quy trình phân tích định tính: Mẫu pha loãng 10-1 và đồng nhất vào mt SDB. Ủ ở 30oC theo dõi
từng ngày. Các khuẩn lạc nấm mốc xuất hiện được chuyển vào mt SDA để định danh.
 Quy trình phân tích định lượng:
− Cân 10g mẫu trong túi PE, bổ sung 90ml dung dịch pha loãng.
− Đồng nhất mẫu và pha loãng thành các dãy nồng độ thập phân thích hợp
− Hút 0.1ml dịch mẫu vào đĩa mt DBRC hoặc DG18 và trải đều dịch mẫu đến khô
− ủ ở nhiệt độ 25oC trong 5-7 ngày.
− Đếm và tính số khuẩn lạc nấm mốc và nấm men trên đĩa.

Câu 8 Trình bày dụng cụ và các thiết bị, máy móc chuyên dụng cần thiết cho nghiên cứu vi
sinh vật. Nêu các bước chuẩn bị dụng cụ cho nuôi cấy vi khuẩn

−
+
+
+

−
−
−
−
−
−
−
−
−
−
−
−
−
−
−

Dụng cụ và các thiết bị, máy móc chuyên dụng cần thiết cho nghiên cứu vi sinh vật
Các dụng cụ bằng thủy tinh
Ống nghiệm: chứa môi trường nuôi cấy và cấy vsv
Đĩa petri: gồm một lắp lớn và một nắp nhỏ lồng vào nhau, đường kính: 8,10,12 cm
Các dụng cụ thủy tinh khác: đèn cồn, cốc thủy tinh, bình cầu, đáy bằng và tròn, bình
tam giác, các loại ống đong, ống hút.

− Các loại que cấy
+ Que cấy thẳng: dùng để cấy sâu, hay thu lấy vsv trên môi trường đặc.
+ Que cấy vòng: dùng cấy ria vsv, phân lập vsv.
+ Que cấy móc: dùng cấy các loại nấm men, nấm mốc, xạ khuẩn.
Nhiệt kế: nhiệt kế chia độ 0.2oC hoặc 0.1oC.
pH kế : sử dụng máy đo pH độ chính xác ít nhất là 0.1 đơn vị
Cân: có mức phân biệt tối thiểu 0.01g và mức cân tối đa 200g. sử dụng cân phân tích với mức
phân biệt tối thiểu 0.1mg để cân lượng nhỏ dưới 2g.
Máy cất nước: nước cất để pha môi trường và dung dịch.
Tủ sấy: sấy khô dụng cụ hoặc khử trùng
Tủ ấm: để nuôi cấy vsv.
Máy lắc: đảo trộn môi trường, tăng cường oxi hòa tan trong mt
Bể điều nhiệt: giữ mt rắn được đun chảy ổn định.
Tủ lạnh: có nhiệt 4-10oC để lưu giữ mẫu, môi trường, hóa chất.
Màng lọc vô trùng: đê lọc, thanh trùng môi trường.
Đèn tử ngoại: tia UV có tác dụng khử trùng không khí trong phòng, khử trùng bề mặt nước,
các dung dịch nhạy cảm với nhiệt.
Nồi hấp: tiêu diệt catr tế bào sinh dưỡng lẫn bào tử của vsv, là thiết bị bắt buộc của phòng
kiểm nghiệm vsv.
Tủ sấy vô trùng: đảm bảo tính vô trùng cao khi thao tác với vsv.
Kính hiển vi: phóng đại, quang sát vsv
Bình ủ kị khí
 Nêu các bước chuẩn bị dụng cụ cho nuôi cấy vi khuẩn
− Bước 1 : Xử lý dụng cụ
+ Phương pháp trung tính dụng cụ:
• Đổ vào bên trong dụng cụ nước có pH = 7
• Hấp khử trùng dụng cụ ở 1200C trong 30 phút bằng nồi hấp.
• Lấy dụng cụ ra để nguội rồi kiểm tra pH của nước trong dụng cụ.
• Rửa kĩ bằng nước nhiều lần là dùng được.

+
•
•
•
•
−
+
+
−
+
+

-

Câu 9

Phương pháp rửa dụng cụ:
Phiến kính:
Với phiến kính cũ( đã dùng làm tiêu bản)
Chùi sạch mỡ hoặc vazolin trên phiến kính bằng miếng vải tẩm xilen Ngâm tiêu bản
vào nước xà phòng và đun sôi trong 1h.
Rửa nước, để ráo.
Ống nghiệm:
Với các ống nghiệm cũ đã bị nhiễm khuẩn :
Hấp trùng ở 1200C trong 30 phút.
Rửa ống nghiệm bằng cách:
Dùng chổi chấm xà bông hay tro bếp cọ xát vào thành ống đều khắp nhiều lần.
Rửa nước 2- 3 lần.
Úp ống nghiệm cho thật ráo nước và khô.

Đĩa pêtri:
Dùng xà bông xát vào 2 mặt của đĩa, các khe ở chân đĩa và thành đĩa.
Rửa nước 2 -3 lần.
Úp nghiêng các đĩa trong giỏ nhựa cho thật khô.
Các dụng cụ thủy tinh khác: phễu, chai lọ, bình cầu, bình tam giác.
Dùng giẻ với nước xà bông cọ rửa phần ngoại dụng cụ.
Dùng nước xà bông đặc lắc kĩ để rửa phần trong dụng cụ.
Bước 2: Bao gói dụng cụ
Làm nút bông : cho các ống nghiệm, bình tam giác, pipet, que gạt.
Bao gói: cho hầu hết các dụng cụ thủy tinh.
Bước 3: Khử trùng dụng cụ
Các hình thức khử trùng: khử trùng khô, khử trùng ướt.
Sau khi khử trùng cần đảm bảo:Sự vô trùng tuyệt đối cho các vật phẩm và các dụng cụ.
Không làm thay đổi chất lượng mẫu vật.
Trình bày sự sai khác cơ bản trong môi trường lỏng, rắn trong nuôi cấy vi khuẩn.

Nêu các bước cần thiết để tiến hành chế tạo môi trường.

−
+
+

−
−
+
+

Trình bày sự sai khác cơ bản trong môi trường lỏng, rắn trong nuôi cấy vi khuẩn
Môi trường lỏng:
môi trường không được bổ sung agar, môi trường ở trạng thái lỏng.

Thường được sử dụng trong nuôi cấy vi sinh vật nhằm thu sinh khối. được Dùng để
nghiên cứu quá trình vi tổng hợp của vi sinh vật.
+ Ví dụ: được sử dụng trong sản xuất nấm men, phản ứng test sinh hóa.
− Môi trường rắn:
+ Môi trường có được bổ sung agar.
+ Môi trường thường ở trạng thái thạch đông, rắn.
+ Mục đích sử dụng: để phân lập giống thuần khiết, giữ giống khuẩn lạc, dùng để nghiên
cứu các đặc điểm hình thái, sinh lí của vi sinh vật.
 Nêu các bước cần thiết để tiến hành chế tạo môi trường
Chuẩn bị môi trường nuôi cấy: tùy vào từng loại vi khuẩn mà sử dụng môi trường nuôi cấy
phù hợp, cần biết được tỉ lệ % các chất phù hợp cho vi khuẩn phát triển.
Pha chế:
Cân, đong thật chính xác từng thành phần môi trường và pha chế theo đúng trình tự
Môi trường lỏng: Cân, đong các chất rồi hòa tan vào nước .


+ Môi trường đặc:Cân agar rồi ngâm vào nước.Cân hóa chất rồi hòa tan trong nước.Vớt agar ra,
vắt khô, bỏ vào xoong môi trường để đun
+ Chú ý đun sôi, hòa tan các chất để môi trường đồng nhất.
− Điều chỉnh độ pH của môi trường:
+ Người ta dùng HCl 10% hay NaCl 10%.
+ Sử dụng máy đo pH, và giấy quỳ để kiểm tra độ pH.
− Phân phối môi trường vào dụng cụ:
+ Môi trường cần được đun cho hóa lỏng rồi đổ qua phễu thủy tinh vào các dụng cụ.
− Khử trùng môi trường:
+ Tùy theo tính chất và điều kiện cụ thể của từng loại môi trường mà có chế độ và phương pháp
khử trùng khác nhau.
+ Các phương pháp khử trùng thường sử dụng là: phương pháp Pasteur, phương pháp Tyndal,
phương pháp lọc bằng dụng cụ lọc vi khuẩn và phương pháp hấp hơi nước bão hòa ở áp suất
cao.

− Làm thạch nghiêng, thách đứng, đổ thạch vào đĩa Pêtri:
+ Làm thạch nghiêng: Cần tiến hành ngay sau khi khử trùng môi trường vừa kết thúc và môi
trường chưa đông đặc.Đặt ống nghiệm có môi trường lên giá đặt nghiêng
+ Làm thạch đứng: Đặt các ống nghiệm đã có môi trường làm thạch đứng vào giá, để yên cho
đến khi môi trường nguội và đông đặc.
+ Đổ thạch vào đĩa pêtri:
• Mở bao giấy gói các đĩa pêtri.
• Nghiêng bình và rót nhẹ một chút môi trường vào đĩa pêtri sau khi tay trái mở hé nắp trên của
đĩa.
• Đậy nắp trên lại, xoay tròn đĩa pêtri để môi trường được phân phối đều trên mặt đĩa.
• Để yên cho môi trường nguội và đông đặc
− Chú ý:
+ Nhớ viết vào nhãn: Tên môi trường …
+ Khử trùng: ngày … tháng … năm
+ Để vào nơi cất giữ môi trường để tiện cho việc theo dõi, sử dụng và bảo quản.
Câu 10 Trình bày phương pháp pha loãng mẫu nước và các vấn đề cần lưu ý trong
thao tác thực hiện. Các chú ý trong thao tác cấy trải vi sinh vật trên môi trường thạch
 Trình bày phương pháp pha loãng mẫu nước và các vấn đề cần lưu ý trong thao tác thực hiện.
− Nguyên tắc: pha loãng mẫu là một trong những công đoạn cơ bản nhưng rất quang trọng
trong quá trình phân tích vsv. Việc pha loãng mẫu ở nồng độ thích hợp sẽ giúp ích rất nhiều
trong quá trình định lượng cũng như phân tích vsv.
− Phương pháp: dùng pipet hút 1 ml mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch pha
loãng( Nacl 0.9%), khi đó ta được nồng độ pha loãng 10 -1. Tiếp tục từ ống nghiệm 10-1 hút 1ml
và cho vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch pha loãng ta được nồng độ pha loãng 10 -2. Tiếp
tục như vậy cho đến nồng độ cần thiết.
− Các lưu ý trong thao tác thực hiện:
+ Cần khử trùng pipet và ống nghiệm trước khi pha loãng.
+ Lắc đều mẫu trong ống nghiệm ít nhất 2 phút.
+ Khi pha loãng xong, ống nghiệm cần đậy nút bông hoặc nút cao su ngay.
 Các chú ý trong thao tác cấy trải vi sinh vật trên môi trường thạch.

− Quy trình cấy trải
+ Dùng pipetman và đầu tip vô trùng, thao tác vô trùng chuyển 0.1ml dịch chứa giống vsv lên bề
mặt môi trường trong đĩa petri.


+ Nhúng đầu thanh gạt(que trải) thuy tinh vào cồn 70 độ, hơ qua ngọn lửa để khử trùng. Để đầu
thanh gạt nguội trong không gian vô trùng của ngọn lửa.
+ Mở đĩa petri, đặt nhẹ nhàng thanh gạt lên bề mặt thạch của đĩa petri. Dùng đầu thanh gạt
xoay, trải đều dịch giống lên bề mặt thạch. Trong khi trải, thực hiện xoay một vài lần, mõi lần
½ chu vi đĩa, tạo điều kiện cho thanh gạt trải dịch giống đều khắp mặt môi trường.
+ Rút thanh gạt ra khỏi đĩa, đậy đĩa, gói và ủ nhiệt độ vào thời gian thích hợp trong tủ ấm.
− Các chú ý:
+ Hấp khử trùng dụng cụ, khử trùng tay và bàn làm việc bằng cồn trước khi cấy
+ Chỉ mở hé lắp petri.
+ Sử dụng gang tay và khẩu trang trong suốt quá trình tiến hành
+ Mọi thao tác đều phải thực hiện trong không gian vô trùng( tủ cấy vô trùng)
+ Hơ que cấy trên ngọn lửa đèn cồn trước khi cấy và sau khi cấy.
+ Cấy nhẹ nhàng tránh làm vỡ, lứt môi trường.
+ Ghi tên vi khuẩn, ngày cấy, môi trường cấy ngoài lắp đĩa.
+ Bao gói và bảo quản đúng thời gian và nhiệt độ.
+ Chú ý phải trang khô mặt thạch.
Câu 11 Trình bày các bước tiến hành để phân lập, tuyển chọn và cấy truyền vi sinh vật gây
bệnh và các vấn đề cần lưu tâm trong thao tác thực hiện. Trong cấy trải, tại sao phải trang khô
mặt
thạch ?
 Trình bày các bước tiến hành để phân lập, tuyển chọn và cấy truyền vi sinh vật gây
bệnh và các vấn đề cần lưu tâm trong thao tác thực hiện

Mẫu bệnh

Thu mẫu bệnh phẩm

Nuôi cấy, phân lập
Hình thái
khuẩn lạc

Nhuộm gram
Phân loại vi khuẩn
Gây nuôi cảm nhiễm
Phân lập vi khuẩn, xác định biểu hiện

Kết luận giống, loài sinh vật gây

Thử các
phản ứng
sinh hóa


−
−

−
+

Sơ đồ tiến hành phân lập, tuyển chọn và cấy truyền vi sinh vật gây bệnh
Mẫu bệnh: có thể là mẫu nước hay mẫu thực phẩm khả nghi chứa vi sinh vật gây bệnh.
Thu mẫu: nguyên tắc mẫu thu được cần có tính đại diện, đối với thực phẩm cần thu mẫu tại
nhiều thời điểm và các công đoạn sản xuất khác nhau. Trong quá trình thu mẫu cần chú ý
tránh gây tạp nhiễm trong lúc thu mẫu.
Nuôi cấy phân lập:

Nguyên tắc: Tách rời các tế bào vi sinh vật. Nuôi cấy các tế bào trên trong môi truờng dinh

dưỡng đặc trưng để cho khuẩn lạc riêng rẽ, cách biệt nhau.
+ Với hầu hết các mẫu nghiên cứu, quá trình phân lập vi sinh vật ở dạng thuần khiết bao gồm các
bước sau:Tạo ra các khuẩn lạc riêng rẽ từ quần thể vi sinh vật ban đầu.Phân lập vi sinh vật thuần
khiết.Kiểm tra độ tinh khiết của các khuẩn lạc.
+ Trong quá trình nuôi cấy, phân lập vi khuẩn cần chú ý: chọn môi trường và phương pháp nuôi
cấy cho hù hợp với từng loại vsv. Cần khử trùng dụng cụ, môi trường nuôi cấy.
− Nhuộm gram: nhằm phân biệt các loài vi khuẩn thành 2 nhóm (Gram dương và Gram âm)
− Phân loại vi khuẩn: sử dụng các phản ứng test sinh hóa để phận loại và phát hiện sự hiện diện của
các vi khuẩn trong mẫu. trong quá trình thuer phản ứng sinh hóa cần lựa chọn các phản ứng phù
hợp và cần đảm bảo dụng cụ, thao tác đều vô trùng.
 Trong cấy trải, tại sao phải trang khô mặt thạch ?

Câu 12 Trình bày các bước tiến hành phân tích Vibrio trong nước. Các vấn đề cần lưu ý trong
thao tác thực hiện?
 Trình bày các bước tiến hành phân tích Vibrio trong nước
Thu mẫu

Tăng sinh chọn lọc

Phân lập

Thử nghiệm sinh hóa

Thử nghiệm kháng huyết
thanh
Báo cáo kết quả

− Nguyên lý phương pháp: một lượng mẫu xác định được tăng sinh trong môi trường chọn lọc
đặc trưng. Cấy phân lập từ môi trườn tăng sinh sang môi trường phân biệt chọn lọc đặc
trưng. Các khuẩn lạc nghi ngờ trên môi trường phân lập, được khẳng định bằng các thử
nghiệm sinh hóa và huyết thanh học.
− Môi trường và hóa chất:
+ Môi trường:canh pepton APW, canh colistine, thạch TCBS, canh tryptone, thạch KI, canh HLG.
+ Hóa chất: dung dịch oxidase, dung dich string, kháng huyết thanh O, dung dịch NaOH 1N, dung
dịch HCL 1N, dung dịch dầu phủ vô trùng, dung dịch brom tím.
− Quy trình phân tích:
+ Tăng sinh chọn lọc: cho 25g muẫ vào túi PE vô trùng, thêm 225ml canh thang tăng sinh chọn
lọc. đồng nhất bằng máy dập mẫu. ủ ở 37 độ C/6-8h.
+ Phân lập:Dùng que cấy vòng ria váng trên bề mặt môi trường tăng sinh chọn lọc lên bề mặt
đĩa thạch TCBS để phân lập khuẩn lạc đơn. ủ 37 độ C trong 18-22h. thu khuẩn lạc đặc trưng,
cấy chuyển sinh khối của khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường phân lập sang môi trường
không chọn lọc hay thạch máu, ủ qua đêm ở nhiệt độ 37 để thu sinh khối.
+ Thử nghiệm sinh hóa: các thử nghiệm sinh hóa để phát hiện và phân biệt các loài. Vibrio là
quan sát tính di động trên kính hiển vi, quan sát sự di động trên thạch mềm và các thử nghiệm
khác.
+ Thử nghiệm kháng huyết thanh: thử nghiệm kháng huyết thanh được dùng để xác định các
dòng vibio có biểu hiện kháng nguyên chuyên biệt.
• O1: một số trường hợp kháng nguyên O1 không bị che lấp vì thế cần xử lí chúng trước khi
ngưng kết bằng cách dùng que cấy chuyển sinh khối của chúng trên môi trường thạch chọn
lọc vào dung dịch nacl 3% hấp khử trùng 121 độ/30’
• Thử nghiệm với huyết thanh đa giá palyvalent O nhóm 1: nhỏ 1 giọt kháng huyết thanh O1 và
một giọt nước muối sinh lí lên phiến kính. Dùng que cấy vô trùng chuyển vsv nuôi cấy lên hai
giọt trên, phân tán vi khuẩn đều, kết quả (+) khi ngưng kết.
− Báo cáo kết quả:
+ Kết quả được báo cáo dướng dạng phát hiện hay không phát hiện V. cholerae hay V.
parahaemolyticus trong 25g mẫu
 Các lưu ý trong thao tác thực hiện: vibrio là nhóm chứa các dòng gây bệnh lên cần tuân thủ

triệt để các biện pháp an toàn khi làm việc với chủng Vibrio dùng làm đối chứng (+) cũng như
khi thao tác trên các chủng phân lập được. Các môi trường hay mẫu vật sau khi nuôi cấy cần
phải hấp khử trùng cẩn thận trước khi rửa.
Câu 13 Trình bày các bước tiến hành phân tích coliform và E. coli trong nước. Các vấn
đề cần lưu ý trong thao tác thực hiện?
a.Trình bày các bước tiến hành phân tích coliform và E. coli trong nước.
 Định nghĩa
− Bao gồm một số vi khuẩn gram âm, không tạo bào tử hiếu khí hoặc kị khí không bắt buộc, có khả
năng lên men đường lactoza, sinh hơi.
 Định lượng coliforms, coliforms chịu nhiệt, coliforms phân và ecoli bằng phương pháp MPN
− Nguyên tắc: dựa vào nguyên tắc mẫu được pha loãng theo dãy thập phân được ủ trong ống
nghiệm chứa môi trường thích hợp. theo dõi sự sinh hơi, đổi màu.
− Môi trường và hóa chất:
+ Môi trường LSB, môi trường BGBL, môi trường lỏng E.coli, môi trường rắn SCA
+ Dung dịch nước muối pepton SPW, thuốc thử Kovac’s, thuốc thử Methyl Red.
− Quy trình phân tích


Chuẩn bị dung dịch đồng nhất
hoặc pha loãng mẫu để có độ pha
loãng 10-1, 10-2, 10-3.
Chuyển 1 ml dung dịch 10-1, 102, 10-3 vào ống 10ml canh LSB,
mỗi nồng độ 3 ống lặp lại, ủ 37
độ/48h
Cho và ống canh BGBL, ủ ở
Cấy vào ống ECủ ở 44.5 +- 0.2
37 độ +-1 độ, 48h
Ghi nhận các ống LSB (+) ở mỗi
độ, 24h
nồng độ pha loãng

Số ống (+) ở mỗi nồng độ pha
loãng

Sô ống (+) ở mỗi nồng độ pha
loãng

Cấy lên thạch EMB, ủ ở 37 độ ,
24h

Chọn khuẩn lạc điển
hình cấy vào canh
trypton. 44.5 +- 0.2
độ, 24h

coliforms

Chọn khuẩn lạc điển
hình cấy vào canh
trypton,MR-VP,SC
citrate. 44.5 +- 0.2

Thử nghiệm indol

Thử nghiệm IMVIC

Đếm số canh EC (+)
và indol (+) tra bảng
MPN

Đếm số canh EC (+)
và IMViC ++ tra
bảng MPN

Coliforms chịu
nhiệt

Coliforms phân

ecoli

− Đọc kết quả:
Từ số lượng các ống nghiệm có E.coli(+) ở mỗi độ pha loãng dùng bảng MPN thích hợp để tính
mật độ vsv.
 Định lương coliforms, coliform phân bằng phương pháp đếm khuẩn lạc
− Nguyên tắc: mẫu được cấy trên môi trường thạch chứa lactose, đếm khuẩn lạc lên men lactose và
sinh acid.
− Môi trường và hóa chất:
+ Môi trường : TSA, VRB, BGBL, EC broth


+
−
+
+
+

Hóa chất: thuốc thử Kovac’s.
Quy trình phân tích
Mẫu được đồng nhất và pha loãng. Lấy 1ml dịch pha loãng vào đĩa petri

Bổ sung 5ml mt TSA vào mỗi đĩa, trộn đều,
Bổ sung 10-15ml mt thạch VRB lên mt TSA, thực hiện tương tự trên mẫu ở 2 nồng độ
pha loãng liên tiếp cho mỗi mẫu.
+ Thử nghiệm khẳng định coliform: chọn ít nhất 5 khuẩn lạc nghi ngờ , cấy chuyển sang các
ống nghiệm chứa môi trường, BGBL. ủ ở 37 độ, trong 24-48h. khẳng định dương khi môi
trường đục và sinh hơi.
− Cách tính kết quả: tính mật độ theo công thức A=N/(n1vf1+…nivfi)*R
 Định lượng e.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc
− Nguyên tắc: mẫu được nuôi cấy trên mt thạch chứa lactose, đếm các khuẩn lạc có hình dạng đặc
trưng của coliforms. Sau đó khẳng định bằng thử nghiệm IMViC.
− Môi trường và hóa chất.
+ Môi trường: TSA, VRB, EC Broth, LST Broth, MR-VP.
+ Hóa chất: thuốc thử Kovac’s
− Quy trình phân tích:
+ Mẫu được đồng nhất và pha loãng và định lượng tương tự như phần coliforms phân với bước
khẳng định như sau: chọn 5 khuẩn lạc nghi ngờ, cấy sang mt EC, u trong 24h, chọn ống (+) cấy
chuyển sang mt : MR-VP, canh trytone. Thực hiện thử nghiệm indol, methyl red. Ghi nhận số
khuẩn lạc
− Cách tính kết quả: theo công thức trên
b.Các vấn đề cần lưu ý trong thao tác thực hiện