Giáo trình Công nghệ tế bào

PHẦN VI

CÔNG NGHỆ TẾ BÀO
THỰC VẬT


Phần VI: CÔNG NGHỆ TẾ BÀO THỰC VẬT

415

SỰ PHÁT SINH CƠ QUAN TỪ LỚP MỎNG TẾ B ÀO CỦA
GIỐNG ĐIỀU (Anacardium occidentale L.) CAO SẢN BO1
NUÔI CẤY in vitro
Huỳnh Hữu Đức, Nguyễn Đình Sỹ, Nguyễn Thị Quỳnh
Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới

MỞ ĐẦU
Cây điều (Anacardium occidentale L.) là cây công nghi ệp đem lại hiệu quả
kinh tế cao ở một số nước thuộc vùng nhiệt đới Châu Á và Châu Phi do nhân h ạt
điều có giá trị cao trong xuất khẩu. Thông th ường cây được nhân giống từ hạt,
nhưng phương pháp này đem l ại tính không đồng nhất về di truyền (Philip v à Unni,
1994). Các phương pháp nhân gi ống vô tính truyền thống nh ư giâm cành, ghép
thường được sử dụng để nhân các d òng điều có năng suất cao, tuy nhi ên hệ số nhân
giống không đáp ứng nhu cầu. Do ph ương pháp nhân gi ống in vitro được sử dụng
và thành công trên nhi ều loài cây ăn trái gần với cây điều (Barghchi & Alderson,
1983; Litz và cộng sự, 1984) nên nhân giống in vitro cây điều có tính khả thi (Vũ
Ngọc Phượng và cs, 2003).
Nuôi cấy lớp mỏng tế b ào là một phương pháp cho nhi ều ưu thế hơn so với
những phương pháp nhân gi ống in vitro truyền thống khác v à được ứng dụng thành
công trên nhiều loài cây khác nhau (Dương T ấn Nhựt và cs, 2003). Tuy nhiên, vi ệc
ứng dụng phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào ở cây thân gỗ chưa được công bố

nhiều.
Trong bài này chúng tôi trình bày m ột số kết quả nghi ên cứu về nuôi cấy lớp
mỏng tế bào từ đốt thân mầm v à đốt tử diệp của cây điều.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Mẫu nuôi cấy là hạt trưởng thành của giống điều cao sản BO1 thu đ ược từ
vườn đầu dòng của Trung tâm H ưng Lộc (Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp
Miền Nam), Đồng Nai. Hạt điều có 2 lớp vỏ, vỏ cứng b ên ngoài và vỏ lụa bên
trong. Hạt được khử trùng bằng dung dịch NaOCl (C ơ sở Vân Phương, Quận 11,
Tp. Hồ Chí Minh) với nồng độ 1% (w/v) trong 24 giờ, sau đó rửa lại bằng n ước cất
vô trùng 3 lần.
Cây mầm phát triển từ hạt nuôi cấy tr ên môi trường khoáng MS không có đ ường
và vitamin sau 2 tu ần được dùng làm nguyên li ệu cho thí nghiệm. Lớp mỏng cắt


416

Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007

ngang từ 2 loại vật liệu l à đốt tử diệp và đốt thân của cây mầm (có bề dày khoảng
0,3-0,5mm) được cấy trên các đĩa petri (Ф = 10cm) chứa 20ml môi trường.
Môi trường nuôi cấy l à môi trường MS (Murashige v à Skoog, 1962) có b ổ
sung nước dừa 10% (v/v), adenine su lphate (Sigma Chemical Co.,USA) 40 mg/L,
saccharose (Cty Đường Biên Hoà, Đồng Nai) 20g/L, maltose (Sigma Chemical
Co., Missouri, USA) 10 g/L, agar (Cty C ổ phần Đồ hộp Hạ Long, Quản g Ninh)
9g/L, than hoạt tính 3g/L. Môi trường được bổ sung các chất điều ho à sinh trưởng
thực vật là 6-benzyladenine (BA), kinetin (KN) và naphthalene -1-acetic acid
(NAA) ở các nồng độ khác nhau. pH của môi tr ường trước khi khử trùng là 5,9.
Môi trường được khử trùng ở 121 oC, 1 atm trong 20 phút. Phòng nuôi cây có nhi ệt
độ 25 ± 2 oC, độ ẩm 60 ± 5%. Đĩa petri đựng mẫu đ ược che tối trong 3 ng ày đầu,
sau đó được đặt dưới cường độ ánh sáng 40 -50 µ mol m -2 s -1 với thời gian chiếu

sáng 12 giờ/ngày.
Mỗi đĩa petri có 24 mẫu cấy của mỗi loại vật liệu (đốt thân mầm hoặc đốt tử
diệp). Thí nghiệm có 3 yếu tố là 3 chất điều hoà tăng trưởng thực vật, mỗi yếu tố
có hai mức độ (Bảng 1). Thí nghiệm đ ược bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên và mỗi
nghiệm thức gồm 4 đĩa petri lập lại 3 lần. Số liệu đ ược phân tích thống k ê bằng
phần mềm MSTATC (Đại học Michigan, M ichigan, USA). Thí nghi ệm được theo
dõi trong 28 ngày.

Bảng 1: Mô tả thí nghiệm (chung cho 2 loại vật liệu)
Nghiệm thức

BA (mg/L)

KN (mg/L)

NAA (mg/L)

1

5

1

1

2

5

1

0,5

3

5

0

1

4

5

0

0,5

5

10

1

1

6

10

1

0,5

7

10

0

1

8

10

0

0,5

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Kết quả thí nghiệm sau 28 ng ày nuôi cấy cho thấy các lát mỏng ở v ùng đốt
thân chỉ cho một chồi còn ở vùng đốt tử diệp thì cho nhiều chồi hơn. Điều này cho
thấy là do vùng sinh mô ch ờ hiện diện chung quanh đốt tử diệp dễ bị kích hoạt
dưới tác động của ch ất điều hoà sinh trưởng thực vật (K. Trần Thanh Vân, 2003).
(Hình 1).


417

Phần VI: CƠNG NGHỆ TẾ BÀO THỰC VẬT

đốt thân mầm

đốt tử diệp
Hình 1. Chồi hình thành từ lớp mỏng đốt thân mầm v à đốt tử diệp sau 28 ng ày.

Số chồi cao nhất (5, 7 chồi) từ lớp mỏng ở đốt tử diệp th uộc nghiệm thức 6 có bổ
sung 10mg/l BA, 1mg/l KN và 0,5mg/l NAA. Lớp mỏng tạo chồi thấp nhất (3 chồi) khi
được ni trên mơi trường có bổ sung 5mg/l BA v à 0,5mg/l NAA.

Số chồi/mẫu

Ảnh hưởng của BA và KN lên sự tạo chồi của lớp mỏng v ùng đốt tử diệp thấy rõ
nhất khi nồng độ BA 10mg/L và KN 1mg/L, trong khi ảnh hưởng của NAA khơng thấy
rõ lắm trong thí nghiệm này. Đối với đốt thân mầm, nồng độ của các chất điều ho à sinh
trưởng thực vật được sử dụng trong thí nghiệm n ày khơng đem lại sự khác biệt về số
chồi hình thành ở cả 8 nghiệm thức (Hình 2).

6
5
4
3
2
1
0
1

2

3

4

5

6

7

8

Nghiệm thức
Đố t thâ n

Đố t tử diệ p

Hình 2. Số chồi tạo thành từ lát mỏng đốt thân mầm v à đốt tử diệp ở ngày thứ 28.


418

Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007

Các chồi hình thành từ lớp mỏng được tiếp tục cấy chuyền sang môi tr ường MS có
bổ sung 1mg/l BA và 1mg/l KN để phát triển thành cây với số lần cấy chuyền l à 2
tuần/lần. Chiều cao cây trung bình đạt 3-4cm sau 2 tháng cấy chuyền (Hình 3).

Hình 3. Cụm chồi cây điều phát triển sau 2 tháng cấy chuyền.

KẾT LUẬN
Phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào có thể được sử dụng để tạo chồi trực tiếp từ
trục thượng diệp của hạt điều nảy mầm. Số chồi đ ược tạo trực tiếp từ lớp mỏng đốt tử
diệp là cao nhất khi môi trường có bổ sung 10mg/l BA, 1mg/l KN v à 0,5mg/l NAA. Đối
với nuôi cấy lớp mỏng của đốt thân mầm th ì chồi có thể phát triển trên môi trường có
BA 5mg/L và có hoặc không có kinetin v à NAA. Cần tiếp tục nghiên cứu để tìm môi
trường thích hợp cho sự phát triển chồi từ nuôi cấy lớp mỏng đốt thân mầm.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.

Barghchi M, Alderson PG (1983). In vitro production of Pistacia species. Acta
Hort. 131, 49-60.

2.

Dương Tấn Nhựt, Da Silva JAT, B ùi Văn Lệ, Kiêm Trần Thanh Vân (2003). Thin
cell layer (TCL) morphogenesis as a powerful tool in woody plant and fruit crop
mircopropagation and biotechnology, floral genetics andgenetic transformation. In:
Jain SM & Ishii K (eds.) Micropropagation of woody trees and fruits, pp. 783-814,
Kluwer Academic Publishers, Dordretch, The Netherlands.

3.

Litz RE, Knight Jr RJ, Gazit S (1984). In vitro somatic embryogenesis from
Mangifera indica L. callus. Sci. Hort. 22, 233 -240.


419

Phần VI: CÔNG NGHỆ TẾ BÀO THỰC VẬT

4.

Philip VJ & Unni PN (1984). In vitro propagation of cashew for crop improvement.
In: Bhaskara Rao EVV & Khan HH (eds.) Cashew Research and Development,
pp.77-82, CPCRI, Kasargod, India.

5.

Trần Thanh Vân K (2003). Thin cell layer concept. In: Duong Tan Nhut, Van Le
Bui, Tran Thanh Van K, Thorpe T (eds.) Thin cell layer culture systerm:
regeneration and transformation applications. pp.1 -16, Kluwer Academic
Publishers, Dordretch, The Netherlan ds.

SUMMARY

The organogenesis via thin cell layers cashew
(Anacardium occidentale L.) of the cultivar BO1 cultured
in vitro
Huynh Huu Duc, Nguyen Dình Sy, Nguyen Thi Quynh
Institute of Tropical Biology

Cashew (Anacardium occidentale L.) is a profi table cash crop of several tropical
countries due to the export value of kernels. A study on the in vitro organogenesis via
thin cell layer (TCL) culture of the cultivar BO1 was carried out for an appropriate
approach to produce cashew transplants on a lar ge scale. Mature seeds of the cultivar
BO1 were surface sterilized with NaOCl 1% (w/v) on the MS sugar -free medium.
Epicotyls of seedlings were used as explants for TCL culture and put on a modified MS
medium (Murashige and Skoog, 1962) supplemented with B A, KN and NAA at

different concentrations, 20g/L sucrose and 10 g/L maltose. The TCL positions on the
explants affected the direct shoot induction and number of shoots. Shoot formation from
TCLs derived from the cotyledonary nodal position was greater than that from other
nodal positions of epicotyls. Concentrations of BA, KN and NAA of 10, 1, and 0.5
mg/L, respectively, were the best for the direct shoot formation of the cultivar BO1.


420

Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007

ẢNH HƯỞNG CỦA ÁNH SÁNG TỰ NHI ÊN TRONG QUÁ
TRÌNH NHÂN GIỐNG in vitro LÊN SỰ TĂNG TRƯỞNG
CỦA CÂY LAN GIỐNG TRONG GIAI ĐOẠN VƯỜN ƯƠM

Lưu Việt Dũng, Vũ Ngọc Phượng, Thái Xuân Du
Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới

MỞ ĐẦU
Trong những năm gần đây, nhu cầu trồng phong lan phát triển ở TP. Hồ Chí
Minh. Tuy nhiên, việc cung cấp một số l ượng lớn cây giống khỏe mạnh, có tỷ lệ
sống khi trồng cao trong thời gian qua c òn gặp nhiều khó khăn do không có đ ơn vị
có khả năng cung cấp.
Nhu cầu trồng lan từ cây giống bằng cách nuôi cấy in vitro ng ày càng lớn và ở
giai đoạn hiện nay. Chính v ì thế việc nhân nhanh v à đưa ra thị trường một số lượng
lớn những cây giống khoẻ mạnh l à một nhu cầu của thực tế.
Để tạo được cây con khỏe mạnh, giá th ành thấp, bên cạnh thành công của nuôi
cấy in vitro, giai đoạn v ườn ươm là một vấn đề hết sức quan trọng. L àm thế nào để
cây con cấy mô khi trồng ra v ườn ươm có tỷ lệ sống cao, phát triển tốt khi chuyển
từ môi trường nhân tạo ổn định trong b ình cấy mô ra môi trường biến động gần với

tự nhiên trong vườn ươm.
Nối tiếp các kết quả nghi ên cứu về nuôi cấy mô ở điều kiện ánh sáng tự nhi ên,
việc khảo sát: “Ảnh h ưởng của ánh sáng tự nhi ên trong quá trình nhân gi ống in
vitro lên sự tăng trưởng của cây lan giống trong giai đoạn v ườn ươm” là một bước
thu hẹp khoảng cách từ các kết quả nghi ên cứu khoa học đến tay nhà vườn ứng
dụng vào thực tiễn, góp phần đ ưa khoa học kỹ thuật phục vụ sản xuất nông nghiệp
công nghệ cao.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Cây lan cấy mô được nhân giống trong điều kiện ánh sáng tự nhi ên và trong
điều kiện ánh đèn huỳnh quang được lựa chọn các cây cùng kích cỡ để trồng ra
vườn ươm.


421

Phần VI: CÔNG NGHỆ TẾ BÀO THỰC VẬT

Hình 1. Cây lan Dendrobium c ấy mô trước
khi trồng ra vườn ươm.

Hình 2. Cây lan Catleya c ấy mô trước khi
trồng ra vườn ưom.

Thí nghiệm được tiến hành trên giống Dendrobium, Catleya và Phalaenopsis. Số
lượng cây thí nghiệm: 150/giống/nghiệm thức x ba lần lặp lại. Giá thể l à xơ dừa và dớn
đen (là rễ của cây dương xỉ). Sau khi lấy cây khỏi b ình cấy mô cây được rửa sạch và
ngâm 10 phút trong dung d ịch Dithan M-45 5gr/lít.
Các chỉ tiêu khảo sát gồm: ♦ Số cây chết tính theo %. ♦ Số lá của một cây tính theo
trung bình cộng. ♦ Tỷ lệ số cây ra lá mới tính theo %. ♦ Chiều cao cây: đo từ cổ rễ l ên
hết thân + lá cao nhất của cây. ♦ Chiều rộng lá: đo chiều rộng của lá lớn nhất, tính trung

bình cộng các cây. ♦ Số nhánh trên một bụi tính theo trung b ình cộng. ♦ Số rễ hình
thành mới trên một cây tính theo trung bình cộng. ♦ Số cây cho rễ mới tính theo %. ♦
Chiều dài rễ tính theo trung bình cộng.
Thí nghiệm được tiến hành ở vườn ươm tại Thủ Đức Tp. HCM, thuộc Ph òng Công
nghệ Tế bào, Viện Sinh học Nhiệt đới, Viện Khoa học v à Công nghệ Việt Nam.

Hình 3: Cây lan Phalaenopsis c ấy mô trước khi trồng ra vườn ươm.


422

Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Một trong những yêu cầu đầu tiên khi trồng lan là cây phải thích nghi và sống
được. Nhờ đã được tôi luyện trước đó trong các điều kiện ánh sáng v à nhiệt độ gần
giống như trong vườn ươm nên cây cấy mô trong điều kiện ánh sáng tự nhi ên tỏ ra thích
nghi tốt.
Các kết quả trên cây Dendrobium được trình bày ở bảng 1 dưới đây:
Bảng 1. So sánh tăng tr ưởng cây lan Dendrobium trồng trong vườn ươm
cây nguồn gốc ánh sáng đ èn
ngày đo

0

10

30

60

90

cây nguồn gốc ánh sáng tự nhi ên
0

10

30

60

90

số cây chết %

0

4,7

10,9

14,4

14,8

0

3,0

5,2

5,6

5,9

số lá (trung bình)

3,4

3,4

3,7

4,5

5,3

3,6

3,6

3,8

4,7

5,4

số cây ra lá mới (%)

0

2

15

52

100

0

6

40

89

100

cao cây (cm)

5,2

5,2

6,6

10,1

12,9

5,0

5,0

6,4

10,8

14,6

số nhánh của một bụi

2,0

2,0

2,8

3,4

3,6

2,0

2,0

2,4

3,1

3,8

số rễ mới

0

1,8

3,9

5,4

12,6

0

2,4

4,6

6,8

15,7

số cây ra rễ mới (%)

0

14,8

42,7

87,4

100

0

28,6

82,1

100

100

Dài rễ (cm)

8,2

8,3

11,4

16,7

19,8

8,4

8,5

12,6

18,4

24,4

A
Hình 4. Cây dendrobium ngu ồn gốc ánh
sáng tự nhiên 60 ngày tuổi

B

Hình 5: A- cây gốc ánh sáng tự nhiên
B- cây gốc ánh sáng đèn

Cây giống sản xuất trong điều kiện ánh sáng tự nhiên có sức sống tốt hơn, biểu
hiện ở số cây chết giảm, mau ra lá mới, lớn nhanh n ên có chiều cao cây và số nhánh
cũng như số rễ phát sinh mới tính tr ên một bụi cao hơn đối chứng là cây giống bình
thường được sản xuất trong phòng máy lạnh và chiếu sáng bằng đèn.
Các kết quả trên giống lan dendrobium đã khích lệ những nghiên cứu tiếp theo trên
cây Catleya. Kết quả nghiên cứu được trình bày ở bảng 2 sau đây:


423

Phần VI: CÔNG NGHỆ TẾ BÀO THỰC VẬT

Bảng 2. So sánh tăng tr ưởng cây lan Catleya trồng trong v ườn ưom
cây nguồn gốc ánh sáng đèn

cây nguồn gốc ánh sáng tự nhi ên

ngày đo

0

10

30

60

90

0

10

30

60

90

số cây chết %

0

12,2

14,6

17,5

19,4

0

3,0

4,8

5,2

6,8

số cây ra lá mới (%)

0

11,3

44,6

78,5

100

0

23,4

64,8

98,1

100

Dài lá=cao cây cm

6,5

6,7

7,1

8,1

10,8

6,5

6,6

7,2

8,4

11,3

số nhánh của một bụi

2,0

2,0

2,2

2,8

3,3

2,0

2,0

2,4

2,8

4,4

số rễ mới

0

1,6

2,8

3,9

5,8

0

2,3

3,4

4,8

6,9

số cây ra rễ mới (%)

0

5,8

28,9

76,8

100

0

15,1

40,9

89,5

100

Dài rễ cm

5,2

7,4

8,7

10,5

13,4

5,2

8,6

9,4

12,6

14,8

Sự khác biệt biểu hiện ngay t ừ 10 ngày đầu tiên. Trong khi gần một phần tư cây lan
Catleya con bung lá mới ở công thức nguồn ánh sáng từ nhi ên thì chỉ trên mười phần
trăm số lan con ở công thức đối chứng có thở bung lá non. Đây l à việc quan trọng vì
Catleya vốn là một giống lan lớn chậm. Số nhánh mới, chiều cao thân lá cũng nh ư số rễ
phát sinh mới cũng vượt trội so với đối chứng.

Hinh 7. Lan Catleya 90 ngay tu ổi
gốc ánh sáng tự nhiên

Hinh 6. Lan Catleya 90 ngay tu ổi
gốc ánh sáng đèn

Trên giống lan Phalaenopsis cũng ghi nhận được các kết quả tương tự, xem bảng 3 dưới đây:
Bảng 3. So sánh tăng tr ưởng cây lan Phalaenopsis trồng trong v ườn ưom
cây nguồn gốc ánh sáng đ èn

cây nguồn gốc ánh sáng tự nhi ên

ngày đo

0

10

30

60

90

0

10

30

60

90

số cây chết %

0

2,1

5,6

10,5

16,4

0

2,0

3,4

5,8

6,9

số cây ra lá mới (%)

0

2,8

38,4

56,8

100

0

3,0

4,1

76,2

100

rộng lá cm

1,8

1,8

2,2

2,6

3,0

1,8

1,9

2,4

2,9

3,5

Dài lá=cao cây cm

5,1

5,2

5,9

6,8

7,9

5

5,2

6,2

7,6

8,4

số rễ mới

0

0,6

1,8

3,1

3,9

0

1,1

2,4

3,8

4,5

số cây ra rễ mới (%)

0

4,0

12,6

76,8

100

0

11,2

54,6

98,8

100

Dài rễ cm

4,6

4,7

5,6

6,4

10,3

4,5

4,8

6,2

8,6

11,4


424

Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007

Các cây giống khi được sản xuất trong điều kiện ánh sáng tự nhi ên có một màu sắc
trung gian giữa cây đối chứng được nuôi trong phòng lạnh dưới ánh sáng đèn và cây đã
trồng trong vườn ươm. Cây nuôi trong ph òng lạnh thường có màu xanh tươi nhưng cây
nuôi trong ánh sáng tự nhiên thường vàng hơn và lẫn sắc tố đỏ. (Vũ ngọc Ph ượng 2004,
2005). Có thể do ánh sáng tự nhiên mạnh đã giúp cây thích nghi một phần nên khi đem
trồng ra vườn ươm ít bị chết và sớm bắt đầu tăng trưởng và phát triển.
KẾT LUẬN
Cây lan Dendrobium, Catleya và Phalaenopsis nhân giống bằng cấy mô trong ánh
sáng tự nhiên khi trồng ra mau thích nghi với điều kiện v ườn ươm hơn đối chứng là cây

lan nhân trong phòng máy lạnh ánh sáng đèn. Biểu hiện trước tiên nhận thấy ngay là tỷ
lệ chết giảm, cây mau ra rễ v à bung lá mới. Sau 90 ngày trồng trong vườn ươm cây có
chiều cao, và số mầm nhánh cũng như số rễ phát sinh mới tính tr ên một bụi cao hơn đối
chứng. Như vậy khi được nhân giống trong điều kiện ánh sáng v à nhiệt độ tự nhiên
không những chỉ là một biện pháp để giảm giá th ành sản xuất do không cần sử dụng
điện chiếu sáng và điện máy lạnh mà đây còn là một biện pháp “rèn luyện” cho cây
giống cho thích nghi trước một phần với điều kiện tự nhiên.

Hình 8: Cây Phalaenopsis 60 ngày tu ổi
gốc ánh sáng đèn

Hình 9: Cây Phalaenopsis 60 ngày
tuổi gốc ánh sáng tự nhi ên

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.

Nguyễn Thị Quỳnh., Phượng V. N. , N. Đ. Sỹ, H. H Đức (2006). Ảnh hưởng của
nồng độ đường và điều kiện ánh sáng lên sự tăng trưởng của lan Dendrobium nuôi
cấy in vitro. Tạp chí Khoa học v à Công nghệ 44 (3), 100-106.

2.

Vũ Ngọc Phượng. , Đ. T. A. Thuyền, L. V. Dũng, T. X. Du & N. V. Uyển (2001).
Quy trình ươm cây hồng (Paulownia fortunei) giai đoạn sau ống nghiệm. Trong
cuốn: Công nghệ Sinh học v à Nông nghiệp Sinh thái Bền vững. Viện Sinh học
Nhiệt đới. NXB Nông nghiệp. 69 -75.

3.

Vũ Ngọc Phượng (2004). Sử dụng các nguồn carbon hydrat khác nhau trong môi
trường nuôi cấy Dendrobium ở điều kiện ánh sáng tự nhiên. Báo cáo Nghiệm thu
kết quả nghiên cứu đề tài nhánh năm 2004


425

Phần VI: CÔNG NGHỆ TẾ BÀO THỰC VẬT

4.

Vũ Ngọc Phượng (2005). Sử dụng ánh sáng tự nhiên trong nuôi cấy mô cây lan hồ
điệp. Báo cáo Nghiệm thu kết quả nghi ên cứu đề tài cơ sở chọn lọc năm 2005.

SUMMARY

The impact of natural daylight conditions during
micropropagation on growth of greenhouse orchid plantlets

Luu Viet Dung, Vu Ngoc Phuong, Thai Xuan Du
Institute of Tropical Biology

Plantlets of Dendrobium, Phalaenopsis and Catleya multiplicated in vitro under
naturally light conditions expressed better growth for first days in greenhouse
comparing to normal fluorescent lamp illumination. The results suggest that the natural
day light is not only a solution for saving the electricity for light and/or air conditio ning
but also created a way somehow to “harden” orchids for better adaptable plantlets to
greenhouse conditions.

426

Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007

NHÂN in vitro GIỐNG TIÊU GỐC GHÉP
(Piper columbrium Link.)
Đỗ Đăng Giáp, Đoàn Thị Ái Thuyền. Thái Xuân Du
Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới
MỞ ĐẦU
Hồ tiêu (Piper) là một chi lớn, gồm khoảng 1.200 lo ài, phân bố chủ yếu ở các khu
vực có khí hậu nhiệt đới điển h ình. Trong vùng Đông Nam Á có khoảng 400 loài. Ơ
nước ta, theo Phạm Hoàng Hộ (1991), chi Hồ tiêu có chừng 40 loài. Do đó nghiên cứu
để khai thác, phát triển sử dụng hợp lý v à toàn diện nguồn gen đa dạng của chi Hồ ti êu ở
nước ta là vấn đề đáng được quan tâm.
Cây Hồ tiêu (Piper nigrum L.) rất dễ bị bệnh hại do nấm gây ra, đặc biệt l à nấm
Phytophthora palmivorra. Ngoài ra các loại tuyến trùng Radopholus spp. cũng là mối
gây hại đối với cây Hồ tiêu ở nước ta. Do đó đồng thời với các biện pháp ph òng trừ
thích hợp thì việc nghiên cứu, chọn lọc các giống Hồ ti êu có tính chống chịu khoẻ và
cho năng suất cao là hướng giải quyết rất tích cực hiện đang đ ược quan tâm. Ở một vài
nước, người ta cũng đã bắt đầu nghiên cứu việc ghép các giống Hồ ti êu trồng lên trên
những gốc ghép là các loài cùng chi có tốc độ sinh trưởng cao, chống chịu bệnh khoẻ
(như dùng loài Piper columbrium Link.) (Lã Đình Mới, 2002).
Trong vài năm gần đây ở nước ta, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam
đang thử nghiệm ghép giống hồ ti êu trên loài tiêu gốc ghép (Piper columbrium Link.)
và đã trồng trên đồng ruộng. Nhưng sự sạch bệnh của gốc ghép và khả năng giới hạn
trong sự nhân nhanh gốc ghép là một vấn đề đặt ra cần phải giải quyết. Đồng thời với
những thành công trong việc nghiên cứu qui trình nhân in vitro giống hồ tiêu sạch virút
(Đoàn Thị Ai Thuyền và cs, 2003) đưa tới hướng nghiên cứu vi ghép in vitro trên cây Hồ
tiêu tạo ra những giống Hồ tiêu không những sạch virút mà còn có khả năng kháng bệnh.
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Giống tiêu gốc ghép (P. colubrinum L.) do viện Khoa học Kỹ thuật miền Nam cung
cấp. Tìm hiểu sự tương thích giữa cây Hồ tiêu (P. nigum L.) và tiêu gốc ghép (P.
columbrinum Link.) bằng phương pháp giải phẫu cấu trúc thân. Giống ti êu gốc ghép
được trồng trong bầu đất tại v ườn ươm viện Sinh học Nhiệt đới. Cây cao 30 -70cm, có từ
10-15 đốt. Cắt những đoạn thân chứa những đ ốt bánh tẻ để khử trùng thu nhận mẫu nuôi
cấy in vitro. Những mẫu không nhiễm đ ược nuôi cấy trên môi trường Murashige and
Skoog, 1962 (MS) có bổ sung 6 - benzylaminopurine - BA (0,5mg/l) để tạo chồi. Tạo
cụm chồi từ đốt trên môi trường MS có bổ sung BA (0 -5mg/l), indole-3-butyric acid IBA (0,5mg/l). Các chồi dài 2-3 cm, được nuôi cấy trên môi trường trên MS để tạo cây


Phần VI: CÔNG NGHỆ TẾ BÀO THỰC VẬT

427

con hoàn chỉnh. Ươm cây nhân giống in vitro ngoài vườn ươm. Cây tiêu gốc ghép được
kiểm tra virút bằng kỹ thuật ELISA, tr ước, trong và sau khi nuôi cấy in vitro đối với các
loại virút hại chính trên cây Hồ tiêu là: ToMV (tobacco mosaic virus), PVX (potato
virus X), PVY (potato virus Y) và CMV (cucumber mosaic virus).
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
1. Tìm hiểu sự tương thích cấu trúc thân giữa loài Hồ tiêu và tiêu gốc ghép
Vài năm gần đây, Viện Khoa học và Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam đ ã thực hiện
ghép và trồng thử nghiệm ngoài đồng ruộng giữa cây Hồ ti êu và cây tiêu gốc ghép.
Bằng phương pháp giải phẫu cấu trúc thân, chúng tôi nhận thấy có sự t ương thích cơ
bản giữa cấu trúc thân của cây Hồ ti êu và cây tiêu gốc ghép. Từ đó có những định
hướng trong việc nhân giống in vitro cây ti êu gốc ghép để làm nguồn nguyên liệu gốc
ghép sạch bệnh trong thực hiện thử nghiệm vi ghép in vitro cây ti êu sau này.
2. Vô trùng và đưa mẫu tiêu gốc ghép vào nuôi cấy in vitro
Chọn những cành dài khoảng 20-30cm, có từ 5-7 đốt, cắt lấy những đốt bánh tẻ.
Sau đó rửa sạch bằng sà phòng pha loãng và sát trùng b ề mặt bằng cồn 70 0C trong 1
phút. Dùng dung dịch Javel thương mại pha loãng 1/3 để khử trùng mẫu trong khoảng

30-40 phút. Sau mỗi bước khử trùng, mẫu được rửa lại 3 lần bằng nước vô trùng. Tiếp
theo lắc mẫu trong dung dịch kháng sinh cefotaxin (0,5%) từ 12 -24 giờ trên máy lắc (60
vòng/phút). Mẫu vô trùng được cấy trên môi trường ½ MS có bổ sung BA 0,5mg/l. Sau
21 ngày có từ 10-15% các mẫu vô trùng hình thành chồi mới. Các chồi mới đ ược cấy
truyền sang mô trường MS để tạo nguồn gốc ghép.
3. Thí nghiệm tạo cụm chồi từ cắt đốt
Các chồi cao 5-7cm, có 3 đốt được sử dụng tạo cụm chồ i từ cắt đốt. Cắt mỗi đốt có
một lá, dài khoảng 1,5-2cm được cấy vào môi trường MS có bổ sung BA (0 -5mg/l),
IBA(0,5mg/l). Sau 1 tuần ở nách lá xuất hiện chồi mới ở đốt gốc v à đốt giữa. Đốt ngọn
không hình thành chồi mới do ưu thế ngọn của chồi đỉnh. Sau 4 tuần nuôi cấy, ở những
nghiệm thức có BA cao (2-5mg/l) hình thành những chồi bất định ở phần gốc của đốt
cấy, nơi mẫu cấy tiếp xúc với môi tr ường. Nghiên cứu ảnh hưởng vị trí đốt cấy lên khả
năng hình thành chồi bất định cho thấy có sự khác nhau c ơ bản giữa đốt ngọn và những
đốt còn lại. Không có khác biệt rõ rệt giữa đốt gốc và đốt giữa. ở đốt ngọn có thể do ưu
thế chồi ngọn phát triển mạnh rất sớm khi mới bắt đầu cấy v ào môi trường đã ức chế
khả năng hình thành chồi bất định, nên tỉ lệ tạo chồi bất định thấp chỉ khoảng từ 2-3
chồi/mẫu cấy ở môi trường có BA cao (5mg/l). Trong khi đó, vị trí đốt gốc v à đốt giữa
sự hình thành chồi bất định với tỉ lệ rất cao sau 4 tuần nuôi cấy. Chồi ngủ cũng h ình
thành nhưng không phát tri ển nhanh như là đốt ngọn ở những môi trường có BA cao (25mg/l). Sự hình thành chồi bất định cao nhất (> 11 chồi/ mẫu cấy) ở đốt gốc với môi
trường MS có bổ sung BA (5mg/l).


428

Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007

Như vậy, để nhân nhanh in vitro cây ti êu gốc ghép ta có thể dùng phương pháp tạo
cụm chồi bất định từ cắt đốt. Đốt c àng gần gốc chồi càng nhiều trên môi trường MS có
bổ sung BA (2-5mg/l). Các cụm chồi bất định sau 6 tuần tuổi đ ược cấy truyền sang môi
trường MS không bổ sung chất điều ho à sinh trường thực vật để chồi phát triển. C ác

chồi mới có thể cao từ 1-1,5cm sẽ được sử dụng để tạo cây con in vitro hoàn chỉnh.
4. Nhân cây và đưa cây tiêu g ốc ghép ra trồng ngoài vườn ươm
Các chồi cao 1-1,5cm được nuôi cấy trong môi tr ường ½ MS không bổ sung chất
ĐHSTTV, trước khi đưa ra vườn ươm với các điều kiện nuôi cấy sau: Sử dụng á nh
sáng nhân tạo (ASNT) trong phòng sáng; Sử dụng ánh sáng nhân tạo + ánh sáng tự
nhiên (ASNT+TN); Sử dụng ánh sáng tự nhiên (ASTN); Thời gian nuôi cấy: 4 tuần.
Kết quả thí nghiệm cho thấy, sau 4 tuần nuôi cấy các chỉ ti êu thu được ở những
bình cây nuôi kết hợp trong điều kiện ánh sáng nhân tạo (2 tuần) sau đó chuyển sang
điều kiện ánh sáng tự nhiên (2 tuần) là tốt nhất. Tuy nhiên sự chênh lệch ở các chỉ tiêu ở
ba điều kiện nuôi cấy như trên là không đáng kể. Do đó chúng ta có thể nuôi cây trong
giai đoạn trước khi ra vườn ươm bằng ánh sáng tự nhiên để tiết kiệm được chi phí trong
quá trình sản xuất.
5. Đưa cây ra vườn ươm
Các cây con sau 4 tuần nuôi cây ở thí nghiệm tr ên được đưa ra trồng ngoài vườn
ươm với giá thể là hỗn hợp xơ dừa + tro trấu với tỉ lệ 1 :1. Sau 3 tuần ngoài vườn ươm
cho thấy tỉ lệ sống của cây nuôi cấy mô l à 100%. Sau 3 tháng trồng ngoài vườn ươm
cây có thể cao từ 25 - 35cm. Tuy nhiên những cây được nuôi cấy in vitro trong điều
kiện có ánh sáng tự nhiên đã thích ứng nhanh hơn và phát triển tốt hơn so với những cây
nuôi trong điều kiện nhân tạo.
KẾT LUẬN
Thành công trong nhân giống tiêu làm gốc ghép. Sử dụng phương pháp cắt đốt trên
môi trường MS có bổ sung BA (2 -5mg/l) để tạo chồi bất định ở cây ti êu gốc ghép. Kết
hợp nuôi cây mô trong đ iều kiện ánh sáng nhân tạo v à ánh sáng tự nhiên ở giai đoạn
nhân cây trước khi ra vườn ươm.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.

Bysov A. S, (2001). Virus and viral diseases of black pepper ( Piper nigrum L.) in
condition of closed ground and tropical, subtropical agrocenose s. The theasis for
obtaining PhD degree. Kyiv National Univercity, Kyiv.

2.

Chacko, S. et al, (1996). Roasting studies on black pepper ( Piper nigrum L.).
Flavour and Fragrance Journal 11, 305 -310.

3.

De Waard, P. W. F & Anunciado, I, S., (1999). Piper nigrum L. Plant Resources of
South-East Asia. (13): 189-194.


429

Phần VI: CÔNG NGHỆ TẾ BÀO THỰC VẬT

4.

Đoàn Thị Ai Thuyền, Thái Xuân Du, Đỗ Đăng Giáp, Nguyễn Tăng Tôn (2005).
Bước đầu nghiên cứu nhân giống in vitro một số giống Hồ ti êu (Piper nigrum L.)
sạch virút. Tạp chí Sinh học, 27(3): 39 -45.

5.

Joseph-B, Joseph-D. (1996). Plant regeneratin from somatic em bryos in black
pepper. Plant Cell Tissue Organ Culture., 47(1): 87 -90.

6.

Kelkar SM, Krishnamurthy K. (1998). Adventitious shoot regeneration from root,

internode, petiole and leaf expl ants of Piper colubrinum Link. Plant Cell Rep.
17(9): 721-725.

7.

Hoàng Quốc Tuấn (2003). Phát triển sản xuất ti êu hữu cơ - tiêu sạch. Hội thảo Hồ
tiêu Việt Nam trên đường hội nhập. Hiệp Hội Hồ ti êu Việt Nam.

8.

Lã Đình Mới. (2002). Tài nguyên thực vật có tinh dầu. Nxb Nông nghiệp, pp158 -173.

SUMMARY

In vitro culture in Piper columbrium Link.
Do Dang Giap, Đoan Thi Ai Thuyen. Thai Xuan Du
Institute of Tropical Biology

Black pepper (Piper nigrum L.) is a major spice used in food and medicine.
Phytophthora foot rot is the major disease affecting pepper plant killing the entire vine .
P. colubrinum Link, a related species is unaffected by this fungi. Grafting P.nigrum on
P. colubrinum is one approach to safeguard the pepper from this disease. Single node P.
colubrinum Link was used as material in culture on the basic medium MS (1962)
supplemented with BA (0 -5mg/l). Within 10 weeks of culture adventitious shoot
formation was observed on the best medium MS + BA (5 mg/L). Shoots were rooted on
1/2 MS medium and in vitro culture plant conditions was described.


430

Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007

SỬ DỤNG TINH BỘT TRONG NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH
PHONG LAN BẰNG NUÔI CẤY MÔ Ở ĐIỀU KIỆN ÁNH
SÁNG TỰ NHIÊN

Vũ Ngọc Phượng, Thái Xuân Du
Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới

MỞ ĐẦU
Hiện nay chi phí điện cho máy lạnh v à đèn chiếu sáng chiếm một tỷ trọng cao trong
cơ cấu giá thành cây giống. Và như thế khi để bình trong điều kiện nhiệt độ và ánh sáng
tự nhiên là một giải pháp mang lại hiệu quả kinh tế.
Tuy nhiên khi để bình nuôi cấy mô trong điều kiện ánh sáng tự nhi ên để tiết kiệm
điện năng thì một vấn đề lớn đặt ra là cây rất dễ nhiễm. Có một cách chống nhiễm l à
loại bỏ đường hoàn toàn khỏi môi trường nuôi cấy, nhưng thiếu đường thì cây mọc
chậm lại nhất là trong giao đoạn đầu khi cây còn nhỏ chưa có khả năng quang hợp với
hiệu suất cao.
Việc bổ sung tinh bột là một giải pháp đang được lựa chọn giúp cây một mặt l à lớn
nhanh giữ được tốc độ tăng trưởng mặt khác giảm bớt nhiễm trong điều kiện nhiệt độ v à
ánh sáng tự nhiên.
Báo cáo này trình bày h ệ thống các giải pháp cụ thể cũng nh ư những hiệu ứng hữu
ích khi cây được tôi luyện trong điều kiện trung gian chuyển tiếp từ cấy mô ra v ườn
ươm. Và kết quả đạt được là tạo được cây con khỏe mạnh, giá th ành thấp.
Việc hoàn tất quy trình còn cho phép chuyển giao những tiến bộ kỹ thuật nhân
giống cấy mô phong lan ở quy mô hộ gia đình nông thôn ven đô thị, góp phần đưa khoa
học kỹ thuật phục vụ sản xuất nông nghiệp công nghệ cao.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Nguyên liệu: giống Dendrobium Madam Cherry, Doritanopsis Sarah Jones v à
Catleya BLC Tainan City .

Môi trường: nuôi cấy Dendrobium có khoáng đa lượng như sau (mg/l): KNO 3
1900, NH 4NO3 1050, KH 2PO4 1000, Ca(NO 3)2.2H2O 400, MgSO 4.7H2O 500. Môi
trường nuôi cấy Catleya và Doritannopsis có khoáng đa lượng Vacin & Went (1949)
như sau như sau (mg/l): KNO 3 525, ()NH 4)2SO4 500, KH 2PO4 250, Ca 3(PO4)2.2H2O
200, MgSO 4.7H2O 122. Vi lượng và FeEDTA theo môi trư ờng MS (Murashige &


431

Phần VI: CÔNG NGHỆ TẾ BÀO THỰC VẬT

Skoog 1962). Thiamin HCL 1mg/l, m -inositol 100mg/l. Nước dừa 10%. pH 5,8. Đường
hoặc tinh bột 30gr/l chia đều v ào từng bình. Agar 6gr/l.

Hình 1. Nhà plastic nuôi lan trong đi ều kiện ánh sáng tự nhi ên

Thí nghiệm thực hiện cho giai đoạn cấy cây lớn, cấy lần cuối c ùng chuẩn bị đưa ra
vườn ươm. Catleyas và Doritanopsis có kích thước trung bình 3cm. Dendrobium có
kích thước trung bình 5cm. Cấy 6 cây một bình. Mỗi bình cấy mô chứa 65ml môi
trường. Mỗi công thức gồm 30 b ình. Công thức nuôi trong phòng được chiếu sáng 2000
lux bằng đèn huỳnh quang. Thời gian chiếu sáng 8 giờ mỗi ng ày. Nhiệt độ 28 oC+3.
Công thức sử dụng ánh sáng tự nhiên để ngoài hành lang hoặc nhà plastic. Ánh sáng tự
nhiên khác với ánh sáng đèn ở chỗ cường độ chiếu sáng thay đổi liên tục trong ngày từ 5007000lux. Nhiệt độ ngày đêm cũng liên tục thay đổi và biên độ dao động trong điều kiện ánh
sáng tự nhiên là 29oC+8 lớn hơn nhiều so với trong phòng chạy máy lạnh.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Trên đối tượng là cây Dendrobium kết quả đo đạc và cảm quan cho thấy việc sử dụng
carbohydrat ở dạng tinh bột tốt hơn so với dùng đường trình bày trong bảng 1 dưới đây:
Bảng 1. So sánh tăng tr ưởng cây lan Dendrobium trên môi trư ờng đường và tinh bột.
ánh sáng đèn
ngày đo

môi trường
đường
30gr/l

cao (cm)
nặng (gr)
số rễ
rễ (cm)

môi trường
tinh bột
30gr/l

cao (cm)
nặng (gr)
số rễ
rễ (cm)

10
5,8
0,64
6
0,8
5,7
0,57
5
1,2

20
7,1

0,89
8
3,0
6,9
0,86
7
3,2

30
8,0
1,03
11
5,0
7,9
1,14
10
6,2

ánh sáng tự nhiên
45
8,8
1,28
11
5,9
9,8
1,48
10
7,2

10

6,2
0,64
5
1,0
6,0
0,60
5
1,5

20
7,5
0,88
8
3,3
7,2
0,79
9
3,5

30
8,2
1,04
11
5,8
8,5
1,21
10
6,5

45

9,0
1,29
11
6,8
10,9
1,61
11
8,0


432

Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007

Qua bảng 1 cho thấy trong chu kỳ phát triển b ình thường 10 ngày đầu của cây
Dendrobium cấy mô không ghi nhận sự khác biệt đáng kể về trọng l ượng giữa cây để
trong phòng chiếu sáng bằng đèn và cây bên ngoài sử dụng ánh sáng tự nhi ên.

Hình 2. Dendrobium cấy mô 45 ngày tuổi. (A) cây ánh sáng tự nhiên + tinh bột (B) cây ánh
sáng tự nhiên + đường. (C) cây ánh sáng đèn + tinh bột (D) cây ánh sáng đèn + đường.

Khi để cây đến 45 ngày thì ghi nhận được những khác biệt rõ rệt bên ngoài về
màu sắc. Cây được chiếu sáng tự nhiên “xanh” hơn cây trong ph òng. Lá rộng bản hơn
nhiều so với cây nuôi dưới ánh sáng đèn trên cùng một công thức môi trường nuôi cấy.
Khi tinh bột được dùng thay cho đường sự khác biệt được ghi nhận giữa cây trong
phòng dùng ánh sáng đèn và cây ánh sáng tự nhiên. Bắt đầu từ ngày 30 trở đi cây trên
môi trường tinh bột bắt đầu khác biệt với cây sống tr ên đường. Nuôi cấy càng kéo dài
thì sự khác biệt càng rõ rệt. Số lượng cũng như chiều dài rễ cũng ghi nhận được sự khác
biệt giữa các công thức nhưng không rõ rệt như trọng lượng thân lá.
Tỷ lệ nhiễm giảm rõ rệt trên các công thức nuôi cấy dùng tinh bột làm nguồn

carbohydrat duy nhất.
Như vậy việc đưa cây cấy mô ra nuôi dưới ánh sáng tự nhiên không những chỉ là
giải pháp tiết kiệm điện m à lại tốt cho cây. Trọng lượng sinh khối của công thức d ùng
tinh bột kết hợp ánh sáng tự nhi ên giúp tăng được đến 30% so với công thức cây nuôi
trên đường dưới ánh sáng đèn.
Trên đối tượng là cây lan hồ điệp Doritanopsis cũng ghi nhận một kết quả tốt t ương tự
khi sử dụng ánh sáng tự nhiên thay cho ánh sáng đèn tr ình bày trong bảng 2 dưới đây:
Bảng 2. So sánh tăng tr ưởng cây lan Doritanopsis tr ên môi trường đường và tinh bột
ánh sáng đèn
ngày đo
cao cm
môi trường
nặng gr
đường
số rễ
30gr/l
rễ cm
môi trường
tinh bột
30gr/l

cao mm
nặng gr
số rễ
rễ cm

15
3,1
1,80
3

1,5
3,22
1,82
3
2,1

30
4,3
3,00
3
1,7
5,31
2,50
4
2,3

45
5,7
3,20
3
2,0
6,12
2,96
4
3,2

ánh sáng tự nhiên
60
6,1
3,40

4
2,2
7,92
3,26
5
4,5

15
3,3
1,84
3
2,1
3,34
1,91
3
2,1

30
4,2
2,25
4
2,3
4,43
2,82
4
2,3

45
6,0
2,69

4
3,5
6,61
3,50
5
3,5

60
7,9
3,32
4
4,3
8,60
4,12
5
4,0


433

Phần VI: CÔNG NGHỆ TẾ BÀO THỰC VẬT

Một đặc điểm quan trọng đ ược ghi nhận là cây lan hồ điệp lớn chậm. Để có thể
xuất cây ra trồng cần nuôi trong b ình đến 60 ngày trong khi Dendrobium chỉ cần 30
ngày là đủ. Khi kéo dài thời gian nuôi cấy thường làm môi trường bị khô. Ở điều kiện
ánh sáng tự nhiên với biên độ dao động nhiệt lớn trao đổi khí diễn ra mạnh h ơn làm cây
lớn nhanh hơn nhưng cũng làm mất nước và môi trường mau khô hơn. Việc bổ sung
môi trường lỏng có cùng thành phần giúp giữ môi trường không bị cạn kiệt và cây phát
triển tốt. Đồng thời khi nuôi trong ph òng thì việc bổ sung môi trường không có tác dụng
rõ rệt như khi nuôi ở điều kiện ánh sáng tự nhi ên. (Vũ ngọc Phượng, 2005).

Hình 3. Doritanopsis c ấy mô 60 ngày tuổi (A) cây ánh sáng tự nhi ên + tinh bột
(B) cây ánh sáng đèn + đư ờng

Việc sử dụng môi trường có chứa tinh bột là nguồn carbohydrat kết hợp chiếu sáng
bằng ánh sáng tự nhiên giúp cây vượt 50% so với đối chứng nếu xét ri êng bộ lá.
Doritanopsis lớn nhanh với chiều cao cộng cả rễ to gần gấp đôi so với đối chứng nuôi
trên môi trường đường dưới ánh sáng đèn.
Thí nghiệm trên cây lan Catleya cũng cho một kết quả tương tự được trình bày
trong bảng 3 sau đây:

Bảng 3. So sánh tăng tr ưởng cây lan Catleya trên môi trường đường và tinh bột
ánh sáng đèn
ngày đo

ánh sáng tự nhiên

15

30

45

60

15

30

45

60

4,1

5,0

6,2

3,2

4,5

5,6

7,0

môi
trường
đường

cao cm

3,3

nặng gr

0,64

0,89

1,03

1,28

0,64

0,88

1,04

1,29

số rễ

5

8

10

11

5

9

12

12

30gr/l

rễ cm

môi
trường
tinh bột

cao cm

3,1

4,8

6,0

7,2

3,0

5,2

7,1

8,2

nặng gr

0,57

0,86

1,14

1,48

0,60

0,79

1,21

1,61

30gr/l

0,8

3,0

5,0

5,9

1,0

3,4

5,9

6,8

số rễ

5

7

10

12

5

9

10

11

rễ cm

1,3

3,4

6,5

7,2

1,5

3,5

6,8

7,1


434

Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007

Nhìn chung Catleya có tốc độ tăng trưởng chậm hơn Dendrobium. Khi nuôi trong
điều kiện ánh áng tự nhi ên bằng môi trường tinh bột sự gia tăng về chiều cao đ ược
khoảng 32% và trọng lượng khoảng 26% so với đối chứng l à môi trường đường và
chiếu ánh sáng đèn.
Sắc tố đỏ tía đặc trưng khi có ánh sáng mạnh xuất hiện trên cây cấy mô trong điều
kiện ánh sáng tự nhiên (xem hình 4). Hiện tượng này ghi nhận được ở tất cả các giống
lan nhưng đặc biệt rõ trên Catleya.

Hình 4: Catleya 60 ngày tu ổi nuôi ở ánh sáng
tự nhiên trên môi trường tinh bột.

Hình 5: Catleya 60 ngày tu ổi nuôi ở ánh
sáng đèn trên môi trư ờng đường.

KẾT LUẬN
Có thể sử dụng ánh sáng tự nhi ên như một giải pháp tiết kiệm điện máy lạnh v à đèn

chiếu sáng để nuôi cấy phong lan Dendrobium, Doritanopsis và Catleya. Dendrobium
có tốc độ lớn nhanh hơn Doritanopsis và Catleya. Khi sử dụng tinh bột thay cho đ ường
tỷ lệ nhiễm giảm. Lượng agar dùng làm đông môi trường giảm đi. Trong điều kiện ánh
sáng tự nhiên chiếu mạnh cây có sắc tố tím đỏ. Trên đối tượng là cây Dendrobium,
Doritanopsis và Catleya kết quả đo đạc cho thấy ở môi tr ường ánh sáng tự nhiên việc
sử dụng carbohydrat ở dạng tinh bột tốt h ơn so với dùng đường. Kể từ ngày 30 trở đi bắt
đầu ghi nhận được sự khác biệt với cây sống tr ên đường. Trong vòng 60 ngày, thời gian
nuôi cấy càng kéo dài về sau thì sự vượt trội càng càng rõ rệt.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.

Murashige T., & F. Skoog, 1962. A revised medium for rapide growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant 15, 473 -497.

2.

Vacin E. F. and Went E. W. 1949. Bot.Gaz 110, 605. Trong cu ốn: DUCHEFA
Biochemicals Plant Cell and Tissue Culture. Catalogue 2003 -2005. 78.


435

Phần VI: CÔNG NGHỆ TẾ BÀO THỰC VẬT

SUMMARY

The use of starch for micropropagation of orchids
under natural daylight conditions

Vu Ngoc Phuong, Thai Xuan Du
Institute of Tropical Biology

Plantlets cultured under naturally light conditions expressed better growth
comparing to normal fluorescent lamp illumination. The results suggest that the natural
day light is not only a solution for saving the electricity for light and/or air con ditioning
but also created a better biomas growth. The use of starch as lonely source of
carbohydrate help the growth plantlet at the late period of cultivation. The same results
obtained for Dendrobium, Doritanopsis and Catleya multiplicated in vitro.


436

Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007

NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH CÂY vani BẰNG NUÔI CẤY MÔ

Vũ Ngọc Phượng, Lê Hoàn Hảo, Thái Xuân Du
Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới

MỞ ĐẦU
Vani có nguồn gốc từ vùng Mexicô, vùng Caribbean thu ộc châu Mỹ nhiệt đới. Sản
xuất vani năm 2001 ước khoảng gần 5000 tấn tr ên diện tích 41.000 ha. Giá cây vani
hiện nay rất cao bằng khoảng h ơn 12-15 lần giá cà phê. Việt Nam nằm trong vùng khí
hậu thích hợp cho việc trồng cây vani. B ên cạnh những cây có giá trị kinh tế khác đ ã
được đưa vào nuôi cấy mô (V. N. Phượng & CTG 2000, 2002, Đ. T. A Thuyền và CTG
2001) việc đưa cây vani vào sản xuất là một bước đa dạng hóa sản phẩm nông nghiệp
phục vụ xuất khẩu.
Để khởi đầu phát triển, nuôi cấy mô l à một công việc hữu hiệu để nhân nhanh trong
một thời gian ngắn các giống đầu d òng sạch bệnh. Bài viết trình bày các kết quả nghiên
cứu từ khởi đầu đưa mẫu cây vào nuôi cấy, xác định môi trường và sau đó là trồng trong
vườn ươm thành cây giống hoàn chỉnh.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Thí nghiệm nhân giống được tiến hành trên giống Vanilla tahitiensis và Vanilla
Indonesia. Thí nghiệm trồng được thực hiện trên giống Vanilla tahitiensis. Mẫu được
lấy từ chồi bên cây trưởng thành. Khử trùng bằng hypoclorit canxi 3% trong 15 phút.
Sau đó rửa sạch ba lần bằng nước vô trùng.
Môi trường nuôi cấy có khoáng đa l ượng Vacin & Went 1949 nh ư sau (mg/l):
KNO3 525, (NH4)2SO4 500, KH 2PO4 250, Ca3(PO4)2. 2H2O 200, MgSO 4. 7H2O 122. Vi
lượng và Fe-EDTA theo môi trường MS (Murashige & Skoog 1962). Thiamin HCL
1mg/l, m-inositol 100mg/l. Nước dừa 10%. pH 5,8. Đường 30gr/l. Agar 7gr/l.
Môi trường tạo chồi có bổ xung chất sinh tr ưởng và phụ gia hữu cơ là: 6-Benzyn
Adenin (BA) 5mg/l. Adenin 15mg/l. Tyrosin 20mg/l. Môi trư ờng tạo cây và ra rễ có bổ
xung chất sinh trưởng là: α-Naphthalene Acetic Acid (NAA) 0,5mg/l.
Bình cấy chồi được chiếu sáng 2000 lux bằng đ èn huỳnh quang. Thời gian chiếu
sáng 8 giờ mỗi ngày. Nhiệt độ 28 oC+3. Bình cấy cây sử dụng ánh sáng tự nhi ên để
ngoài hành lang. Cường độ chiếu sáng thay đổi li ên tục trong ngày từ 500-7000lux.
Nhiệt độ ngày đêm dao động trong khoảng 29 oC+8.


Phần VI: CÔNG NGHỆ TẾ BÀO THỰC VẬT

437

Cây nuôi cấy 60 ngày đạt chiều dài trên 5cm được ươm trên dớn cọng trong 15
ngày. Dớn cọng là một loại giá thể trồng lan có độ giữ n ước ít, giúp cho bộ rễ khô ráo
phù hợp với việc ươm vani trong 15 ngày đầu. Trong những ngày này không sử dụng
phân bón.
Khi đầu rễ vani bắt đầu nhú l ên chứng tỏ sự hồi phục cây vani đ ược chuyển sang
bầu có giá thể gồm: phân b ò 60%, tro trấu 20%, đất 20%. Phân bón trong giai đoạn n ày
là NPK 30-10-10 và vi lượng HP-306.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Khởi đầu từ chồi nách cây mẹ giâm c ành các đốt thân được nuôi trên môi trường
tạo chồi. Sau 1 tháng nuôi cấy từ nách lá nảy l ên chồi. Chồi được cấy chuyển sang môi
trường mới lại tiếp tục cho chồi khoẻ mạnh xem h ình 1:
Khi muốn có cây chồi được tách và cấy lên môi trường tạo cây. Cây hoàn chỉnh có
thể xuất ra vườn ươm được trình bày ở các hình 2, hình 3 và hình 4. Ươm cấy, cấy mô
là một công việc đòi hỏi kỹ năng thuần thục (V.N. Ph ượng và CTG 2001). Cây vani r ất
dễ chết úng khi trồng ra vườn ươm. Các kết quả thử nghiệm cho thấy khi chọn dớn bông
loại có khả năng giữ nước cao vốn để trồng lan hồ điệp th ì tỷ lệ cây chết rất cao. Khi
cây được ươm trên một giá thể khô ráo ít giữ n ước thì tỷ lệ sống có thể đạt gần 100%
(Lê Hoàn Hảo 2005).
Khi cây đã sống và bắt đầu bung rễ mới cây đ ược chuyển sang bầu gồm phân b ò, tro
trấu và đất. Các kết quả được trình bày ở hình 5 sau đây.
Theo quy trình đã trình bày kể trên sau 12 tháng kể từ khi bắt đầu tiến h ành nuôi
cấy đã sản xuất được trên 10 nghìn bầu cây vani giống cấy mô. To àn bộ số cây giống kể
trên do một thương nhân người Pháp nhập cành từ nước ngoài về và bao tiêu toàn bộ số
cây giống sản xuất ra đem trồng tại nông trại ở tỉnh B ình Thuận.

Vanilla tahitiensis

Hình 1: Chồi Vani cấy mô


438

Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007

KẾT LUẬN
Sau một quá trình nghiên cứu đã xác định được môi trường phù hợp với nuôi cấy
cây vani như sau: Môi trư ờng nuôi cấy có khoáng đa l ượng như sau (mg/l): KNO 3 525,
(NH4)2SO4 500, KH 2PO4 250, Ca 3(PO4)2.2H2O 200, MgSO 4.7H2O 122. Vi lượng và FeEDTA theo môi trường MS (Murashige & Skoog 1962). Vitamin theo Morel (1949).

Nước dừa 10%. pH 5,8. Đường 30gr/l. Agar 7gr/l. Môi tr ường tạo chồi có bổ sung chất
sinh trưởng và phụ gia hữu cơ là: 6-Benzyn Adenin (BA) 5mg/l. Adenin 15mg/l.
Tyrosin 20mg/l. Môi trư ờng tạo cây và ra rễ có bổ sung chất sinh trưởng là: αNaphthalene Acetic Acid (NAA) 0,5mg/l. Đây m ột quy trình hoàn chỉnh cho phép nhân
giống cây vani bằng nuôi cấy mô với quy mô sản xuất.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.

2.
3.
4.

5.

6.

7.

Hảo L.H. (2005). nghiên cứu khả năng thích nghi của cây Vanilla tahitien sis in
vitro trong giai đoạn vườn ươm. Luận văn tốt nghiệp cử nhân. Khoa Công nghệ
Sinh học. Đại học mở - bán công Tp. HCM.
Murashige T., & F. Skoog, (1962). A revised medium for rapide growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant 15, 473-497.
Phượng V. N. , P. Đ. Trí, T. X. Du & N. V. Uyển (2000). Nhân giống vô tính cây xoan
Ấn Độ (Azadirachta indica A. Juss.) bằng nuôi cấy mô. Tạp chí Sinh học 22 (2), 34 -39.
Phượng V. N. , P. Đ. Trí, Đ. T. A. Thuyền, T. V. Nga, T. X. Du & N. V. Uyển
(2002). Nhân giống in vitro cây tre tàu (Sinocalamus latiflorus) và tre mạnh tông
(Dendrocalamus asper) . Tạp chí Sinh học 24 (2), 59 -64.
Phượng V. N. , Đ. T. A. Thuyền, L. V. Dũng, T. X. Du & N. V. Uyển (2001). Quy
trình ươm cây hông (Paulownia fortune i) giai đoạn sau ống nghiệm. Trong cuốn:
Công nghệ Sinh học và Nông nghiệp Sinh thái bền vững. Viện Sinh học Nhiệt đới.
NXB Nông nghiệp. 69-75.

Thuyền Đ. T. A., V. N. Phượng, T. X. Du & N. V. Uyển (2001). Nhân giống vô
tính cây hông - Paulownia fortunei (Seem.) Hemsl. bằng phương pháp nuôi cấy
mô. Tạp chí Sinh học 23 (3), 46 -50.
Vacin E. F. and Went E. W. (1949). Bot. Gaz 110, 605. Trong cuốn: DUCHEFA
Biochemicals Plant Cell and Tissue Culture. Catalogue 2003 -2005. 78.

SUMMARY

Micropropagation of Vanilla.
Vu Ngoc Phuong, Le Hoan Hao, Thai Xuan Du
Institute of Tropical Biology
The authors have establishe a complete in vitro technology to multiply Vanilla tahitiensis
and Vanilla Indonesia for mass seed plantlets production. Culture medium contains macro elements (mg.l-1) KNO3 525, (NH4)2SO4 500, KH2PO4 250, Ca3(PO4)2.2H2O 200,