công nghệ lên men glucoamylase lên men bề mặt

Enzyme Glucoamylase

GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

Mục lục
Lời nói đầu.................................................................................................................1
Tài liệu tham khảo...................................................................................................43

Lời nói đầu

1


Enzyme Glucoamylase

GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

Việc sản xuất enzyme từ vi sinh vật trên thế giới đã được tiến hành ở mức độ công
nghiệp, với qui mô lớn – hàng nghìn tấn mỗi năm, sản phẩm thu được là các chế phẩm enzyme
khác nhau, ở dạng thô dùng cho chăn nuôi, và các ngành công nghiệp dệt, thuộc da,… hoặc dạng
tinh khiết cho thực phẩm, y dược học. Nhật là một trong những nước đi đầu trong lĩnh vực này
với hơn 20 công ty sản xuất chế phẩm enzyme. Hàng năm Nhật sản xuất 9850 tấn amylase, 8906
tấn protease, 2200 tấn glucoamylase, 100 tấn lipase, 200 tấn các enzyme khác … Ở các nước
phát triển như Đức, Hungary, Pháp, Anh, Đan Mạch, v.v… ngành công nghiệp sản xuất enzyme
cũng được chú ý và phát triển khá mạnh.
Hệ enzyme amylase là một trong số các hệ enzyme được sử dụng rộng rãi nhất trong
công nghiệp, y học và nhiều lĩnh vực khác. Theo tính chất và cơ chế tác dụng lên tinh bột của
amylase người ta phân biệt amylase gồm các loại α – amylase, β – amylase, γ – amylase hay
glucosamylase, oligo – 1,6 – glucosidase, transglucosyldase. Trong đó glucoamylase được sử
dụng nhiều trong công nghiệp thực phẩm.
Hiện nay Glucoamylase là một enzyme chiếm vị trí hàng đầu trong sản xuất công nghiệp,

đặc biệt là trong công nghiệp lương thực thực phẩm và dược phẩm. Do khả năng thủy phân triệt
để, sản phẩm cuối của phản ứng xúc tác chủ yếu là α – glucose, nên Glucoamylase được sử dụng
trong quy trình sản xuất α – glucose. Glucose có thể được dùng bổ sung vào một số dược phẩm,
hay làm cơ chất cho công nghiệp sản xuất rượu bia, nước giải khát, chế biến thực phẩm. Sử dụng
Glucoamylase trong sản xuất rượu bia giúp thay thế một lượng lớn malt bằng các loại tinh bột
khác rẻ tiền hơn như bột gạo, bột mì… giúp giảm bớt chi phí sản xuất và giảm giá thành sản
phẩm, nhất là đối với những nước phải nhập khẩu nguồn malt nguyên liệu như Việt Nam.

I.

Tổng quan về nguyên liệu

1.

Enzyme glucoamylase
2


Enzyme Glucoamylase

GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

Giới thiệu chung
Glucoamylase được các nhà khoa học Nhật tách ra lần đầu tiên từ Aspergillus awamori
(Katihara, Kurushima, 1966). Sau đó được tìm thấy ở Rhizopus delemar, Aspergillus niger,
Aspergillus oryzae và các nhóm vi sinh vật khác cũng như ở mô động vật.
Glucoamylase từ nấm mốc là các protein có khối lượng phân tử lượng dao động rất lớn từ
27.000 đến 112.000 Dal, tuỳ thuộc vào nguồn gốc của enzyme. Các glucoamylase chủ yếu được
tạo nên từ hai iso enzyme I và II khác nhau ở khả năng thuỷ phân tinh bột ở trạng thái rắn và bởi
độ bền của chúng. Glucoamylase I tự hấp thụ và thuỷ phân tinh bột ở trạng thái rắn, ngược lại

glucoamylase II không có cả hai tính chất này.
1.1

Cấu tạo hóa học enzym glucoamylase

Glucoamylase I và glucoamylase II. Cả hai dạng glucoamylase đều là những chuổi
glyco – protein, trong phân tử có chứa D – gluco, D – maltose, D – galactose, thành phần
carbonhydrate trong phân tử glucoamylase I chiếm khoảng 18%, còn với phân tử glucoamylase
II là 10%.
Phân tử carbonhydrate tham gia trong thành phần cấu tạo enzyme glucoamylase đóng vai
trò giúp ổn định cấu trúc enzyme. Ngoài ra chúng còn giúp tạo liên kết với cơ chất là các phân tử
polysaccharide giúp cho vùng xúc tác trên enzym gần với cơ chất hơn, do đó quá trình thủy phân
của enzyme thuận lợi hơn.
Thành phần acid amine tham gia tạo thành chuổi polypeptid trong phân tử glucoamylase
cũng khác nhau khi enzyme glucoamylase được thu nhận từ các nguồn khác nhau
Số lượng acid amine tham gia vào chuổi polypeptid cấu tạo nên phân tử glucoamylase
thu nhận từ nấm mốc Aspergillus niger và Aspergillus awamori khoảng 650 – 700 acid amin.
Các acid amin chính tham gia trong trung tâm hoạt động của enzyme glucoamylase bao
gồm acid glutamic, tryptophan, tyrosin, asparagin, acid aspatic, lysin, serin. Trong đó acid
glutamic ở vị trí thứ 179 và 400 đóng vai trò chính trong việc xúc tác thủy phân liên kết O –
glucozit của cơ chất.

3


Enzyme Glucoamylase

GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

Hình 1.1: Sơ đồ cấu tạo trung tâm hoạt động của enzyme glucoamylase

1.2.

Cấu trúc không gian enzym glucoamylase
Trong không gian, phân tử glucoamylase được chia làm ba vùng với chức năng riêng

biệt:
-

Vùng SBD (Starch binding domain: vùng gắn kết với tinh bột) có kích thước khoảng
30 A0. Giữ chức năng liên kết với phân tử cơ chất.

-

Vùng CD (Catalyse Domain: vùng xúc tác) có kích thước khoảng 60 A0, giữ chức năng
xúc tác phản ứng thủy phân liên kết O – glucozit.

-

Vùng Linker có độ dài khoảng 100 A0 liên kết hai vùng trên lại với nhau.

4


Enzyme Glucoamylase

GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

Hình 1.2: Sơ đồ cấu trúc không gian Enzyme Glucoamylase
1.3

Các tính chất của glucoamylase

•

Enzym glucoamylase có mã số EC: 3.2.1.3

•

Tên khoa học: glucan 1,4 – α – glucohydrolase

Ngoài ra enzym glucoamylase còn có các tên gọi khác như: amyloglucosidase;
γ – amylase; lysosomal α – glucosidase; acid maltase; exo – 1,4 – α – glucoside; glucose
amylase; γ – 1.4 – glucan glucohydrolase.
Đặc trưng phản ứng: enzyme glucoamylase xúc tác phản ứng thủy phân liên kết
1,4 – 1,6 o – glucoside và tách tuần tự từng gốc gluco từ đầu không khử của chuỗi
polysaccharide.
Enzym glucoamylase xúc tác phản ứng thủy phân tinh bột và tách tuần tự từng gốc
glucose từ đầu không khử của chuổi polysaccharide. Gốc gluco từ đầu không khử được gọi là
glycone, còn chuổi oligosaccharide sau khi gluco được tách ra thì được gọi là Alglycone.
Cơ chế xúc tác thủy phân liên kết o – glucozit là do hoạt động chủ yếu của một cặp acid
amin đóng vai trò như một cặp acid – base. Khi tương tác với cơ chất, acid glutamic ở vị trí thứ
179 đóng vai trò như một chất xúc tác acid, nó sẽ proton hóa oxi – glycosidic (phân tử oxi ở vị trí
liên kết o – glucozit). Acid glutamic ở vị trí thứ 400 đóng vai trò như một chất xúc tác base, acid
amin này sẽ thu hút và tạo liên kết với proton H+ của phân tử nước làm giải phóng gốc OH-, gốc
OH- này sẽ tấn công vào vị trí carbon glycosidic và như vậy liên kết o – glucozit của phân tử cỏ
chất sẽ bị phá vỡ.
1.4

Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme glucoamylase

I.4.1. Nhiệt độ
5


Enzyme Glucoamylase

GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

Nhiệt độ là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzym, khi tăng
nhiệt độ lên 100C thì vận tốc phản ứng của enzyme tăng lên gấp đôi, nhưng khi tăng nhiệt độ lên
quá cao vượt quá nhiệt độ tối ưu thì enzyme bắt đầu biến tính, do đó vận tốc phản ứng của
enzyme cũng giảm xuống. Mỗi enzyme sẽ hoạt động trong khoảng nhiệt độ nhất định, enzyme
glucoamylase hoạt động trong khoảng 200C – 750C. Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzym
glucoamylase: 400C – 650C.
1.4.2

pH

pH cũng là yếu tố có ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng của enzym, là do pH thay đổi có
ảnh hưởng đến trạng thái ion hóa tham gia trong trung tâm hoạt động của enzym như nhóm α –
COOH, ω – COOH, – NH2, – OH. Vòng imodazol… cũng như trạng thái ion hóa của cơ chất và
của phức chất trung gian ES.
Khoảng pH mà enzym glucoamylase hoạt động được là từ 2 – 8, pH tối ưu: 4 – 5.5
1.4.3

Các chất ức chế

Enzyme glucoamylase sẽ bị ức chế bởi các ion kim loại như Al3+, Hg2+, Pb2+, Ni2+,Cu2+.
Ngoài ra, khi cơ chất là tinh bột thì schardinger dextrin sẽ hoạt động như một chất ngăn cản khả
năng taog phức hợp giữa enzyme glucoamylase và tinh bột. với cơ chất là maltose thì trong môi

trường có sự hiện diện của gentitobiose, mantitol với nồng độ khoảng 20mM sẽ ức chế hoạt động
của enzyme glucoamylase
1.4.4

Các chất hóa học

Khi cho thêm vào môi trường phản ứng các dung môi như: chloroform, hexane, n –
deoecane với nồng độ khoảng 50% sẽ làm tăng hoạt tính glucoamylase lên 2 lần so với môi
trường chỉ có nước là chất dung môi duy nhất. Các chất 2,2’ – dipyridyl, iodoacetamyde sẽ làm
tăng hoạt tính enzym glucoamylase.
1.5.

Tính chất của glucoamylase
Cơ chế tác động

Enzym glucoamylase có khả năng thủy phân mạnh mẽ liên kết – 1,4 lẫn – 1,6 glucoside
của phân tử tinh bột.

6


Enzyme Glucoamylase

GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

Hình 1.3: Sơ đồ phân giải của enzyme glucoamylase
Khả năng thuỷ phân mạnh mẽ liên kết – 1,4 lẫn – 1,6 glucoside glucoamylase để tạo
thành glucose đã đưa enzyme này lên hàng đầu về hiệu lực xúc tác thuỷ phân tinh bột. Vì thế
việc dùng chế phẩm glucoamylase từ các chủng vi sinh vật trong việc sản xuất bia, rượu, mật,
glucose… có một ý nghĩa triển vọng rất lớn. Enzyme glucoamylase xúc tác tách tuần tự từng gốc

glucose từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide. Gốc glucose từ đầu không khử được gọi là
glycone, chuỗi oligosaccharide sau khi glucose được tách ra gọi là alglycone.
Cơ chế xúc tác thủy phân liên kết O – glucoside là do hoạt động chủ yếu của một cặp
acid amin đóng vai trò như một cặp acid – base. Khi tương tác với cơ chất, acid glutamic ở vị trí
thứ 179 đóng vai trò như một chất xúc tác acid, nó sẽ proton hóa oxi – glycosidic (phân tử oxi ở
vị trí liên kết o – glucoside). Acid glutamic ở vị trí 400 đóng vai trò như một chất xúc tác base,
acid amin này sẽ thu hút và tạo liên kết với proton H+ của phân tử nước làm giải phóng gốc OH-,
gốc OH- này sẽ tấn công vào vị trí carbon glycosidic và như vậy liên kết o – glucoside của phân
tử cơ chất sẽ bị phá vỡ.
Glucoamylase phân thuỷ phân tinh bột thành những dextrin có phân tử thấp, liên tục tách
gốc glucose và cuối cùng tạo sản phẩm là glucose. Glucoamylase thuỷ phân tinh bột, glycogen,
polysaccharide đồng loạt ở các liên – 1,4 và – 1,6 glucoside. Nó có giá trị đặc biệt trong ngành
sản xuất rượu, chuyển những dextrin có phân tử lượng cao không lên men thành những hợpchất
lên men được và do đó nâng cao hiệu suất lên men rượu từ các nguyên liệu là tinh bột.
Các chế phẩm enzyme glucoamylase tách chiết từ các tế bào vi sinh vật tuy có những
điểm giống nhau, song chúng cũng có một vài điểm khác nhau. Ngay cả các chế phẩm được tách
từ các chủng của nấm mốc Aspergillus cũng khác nhau, thậm chí ngay cả các chủng cùng loài
cũng khác nhau về các đặc điểm về tính chất lý, hoá, phân tử lượng, thành phần acid amin, tính
đặc hiệu với cơ chất và điều kiện hoạt động. Khi nghiên cứu các cơ chế của sự thủy phân một số
oligosaccharide và polysaccharide bằng glucoamylase của nấm mốc, Backer và cộng sự thấy
rằng sự thủy phân tinh bột được thực hiện theo cơ chế “đa mạch” chứ không phải theo cơ chế
đơn mạch. Sơ đồ thủy phân tinh bột bởi glucoamylase:

Tinh bột hay oligosaccharide

Glucoseamylase kiểu Asp.niger khác nhau

Glucose
7

Enzyme Glucoamylase

GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

Phản ứng cho ra 80 – 85 % glucose
1.6.

Ứng dụng của enzym glucoamylase

Chế phẩm glucoamylase từ nấm mốc Aspergillus, Rhizopus … được thay thế malt làm
tác nhân đường hóa tinh bột trong sản xuất rượu, bia từ nguyên liệu có bột. Việc sử dụng chế
phẩm amylase vi sinh vật thay malt đã tiết kiệm được hàng vạn tấn đại mạch loại tốt, giảm giá
thành, rút ngắn quy trình sản xuất.
Trong giai đoạn đường hóa, glucoamylase chiếm vị trí hàng đầu và đóng vai trò quyết
định trong việc chuyển hóa tinh bột thành đường để lên men, do đó cần chọn chủng vi sinh vật
có khả năng sản sinh nhiều enzym glucoamylase. Trong sản xuất rượu người ta thường dùng hỗn
hợp canh trường bề mặt của Aspergillus Usamii và Aspergillus Balatae.
Nếu coi tổng lượng đường maltose, glucose, saccharose, fructose là 100% thì khi đường
hóa bằng malt ta có 71% maltose, 24 – 28% glucose, còn khi đường hóa bằng amylase nấm mốc
sẽ có 14 – 21% maltose, 80 – 85% glucose, sản phẩm cuối cùng của sự thủy phân bởi amylase
nấm mốc chủ yếu là glucose – đường dễ lên men, do vậy sự lên men rượu xảy ra nhanh hơn
Glucose được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực như y học, trong công nghiệp thực
phẩm. ngày nay việc sản xuất glucose đa số được sử dụng công nghệ enzyme. Enzyme
glucoamylase là enzyme chủ yếu cho quá trình đường phân tinh bột để tạo thành glucose. Tinh
bột có chỉ số DE khoảng 4 – 8, sau khi thủy phân bằng enzyme glucoamylase thì chỉ số DE tăng
lên 96 – 98. Dung dịch sau thủy phân có thể trực tiếp được sử dụng để sản xuất siro giàu fructose
hoặc là sản xuất glucose ở dạng tinh thể.
Trong công nghiệp dược phẩm, enzyme glucoamylase còn được bổ sung vào một số loại
thuốc giúp tăng khả năng tiêu hóa cho cơ thể.

Ngày nay, enzyme glucoamylase còn được sử dụng kết hợp với các enzyme cellulase và
protease dưới dạng canh trường nấm mốc bổ sung vào trong thức ăn gia súc, làm tăng quá trình
đồng hóa giúp cho gia súc tăng trọng nhanh hơn.
2.

Nấm mốc Aspergillus niger

2.1.

Tổng quan về nấm sợi Aspergillus niger
Giống Aspergillus có khoảng 200 loài phân bố khắp nơi trong tự nhiên, trong đó có các

loài Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae,…có giá trị sử dụng trong sản xuất
enzyme, rượu, axit hữu cơ…
Van Tieghem là người đầu tiên phát hiện và phân lập chủng nấm mốc Aspergillus niger
từ hạt chứa nhiều dầu như: hạt đậu nành, đậu phộng, hạt ngũ cố, hạt bắp…; Aspergillus niger
8


Enzyme Glucoamylase

GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

cũng được phân lập từ các sản phảm lên men cổ truyền
2.2.

Vị trí phân loại của Aspergillus niger
Giống Aspergillus do Michelli mô tả lần đầu vào năm 1729. Năm 1901 Wehmer đã cho

ra đời một chuyên luận phân loại giống nấm bất toàn này.

Raper and Fennell (1965) chỉ dùng một tên Aspergillus cho tất cả các loài tạo thành bào
tử trần. Như vậy Aspergillus niger có vị trí phân loại như sau:
Bảng 1.1: Phân loại Aspergillus niger
Giới
Lớp
Bộ
Họ
Loài

Fungi
Fungi imperfecti
Moniliales
Aspergillaceae
Aspergillus niger

Khuẩn ty phân nhánh có vách ngăn, bào tử đính không nằm tron bọc bào tử, cuống sinh
thể bình phình ra rõ rệt ở đầu tạo thành bọc lớn hình cầu 5 – 6 x 20 – 30µm, đôi khi 6 – 10 x 60 –
70µm màu nâu đen

Hình 1.4: Nấm mốc Aspergillus Niger
2.3.

Đặc điểm sinh hoc của Aspergillus niger
Aspergillus niger sinh trưởng được ở nhiệt độ tối thiểu là 6 – 80C và tối đa là 45 – 470C,

tối ưu ở 28 – 350C, trong môi trường có độ ẩm tối thiểu là 23%. Độ ẩm môi trường thích hợp để
lên men bán rắn của Aspergillus niger là 60 – 65%, nó chỉ sinh trưởng và phát triển khi có mặt
9

Enzyme Glucoamylase

GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

O2 ở pH tối ưu là 4 – 6.5, cũng có những chủng Aspergillus niger sinh trưởng được ở pH 2. Sự
thay đổi pH của môi trường nuôi cấy từ 3 đến 6.5 làm thay đổi đáng kể hình thái của Aspergillus
niger.

2.4.

Sinh trưởng của nấm mốc A.Niger

Asp.niger có nhiều kiểu sinh sản khác nhau: Sinh sản sinh dưỡng, sinh sản vô tính bằng
bào tử hoặc sinh sản hữu tính.
2.4.1. Điều kiện sinh trưởng

•

Nhiệt độ

Nấm mốc có nhiệt độ phát triển tốt ưu là 28 – 320C, trong quá trình sinh trưởng và phát
triển vi sinh vật đồng hóa chất dinh dưỡng và thải ra một lượng nhiệt khá lớn. Do đó trong quá
trình nuôi cấy cần phải có những trang thiết bị phù hợp để duy trì và ổn định nhiệt độ canh
trường.

10


Enzyme Glucoamylase

GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

UI (Hoạt độ enzyme)

t0
Hình 1.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme glucoamylase
•

Độ ẩm

Độ ẩm tối ưu trong quá trình nuôi cấy nấm mốc là 65 – 70%. Tuỳ theo điều kiện khí hậu
và điều kiện vô trùng của mỗi phòng thí nghiệm của mỗi quốc gia mà lựa chọn độ ẩm cho thích
hợp, độ ẩm thường khống chế ở 50 – 60%, thường sử dụng 58 – 60%. Độ ẩm mà tăng quá 55 –
70% sẽ làm giảm độ thoáng khí, còn thấp hơn 50 – 55% thì kìm hãm sự sinh trưởng và phát triển
của vi sinh vật cũng như sự tạo Enzyme Glucoamylase. Trong điều kiện tiệt trùng tốt (môi
trường trong bình tam giác, trong tủ ấm phòng thí nghiệm hoạt lực Glucoamylase cao nhất thu ở
độ ẩm 65 – 68%). Cần nhớ rằng khi nuôi trong điều kiện không được vô trùng tuyệt đối (trên các
khay), thì độ ẩm môi trường không được vượt quá 60%, vì cao hơn nữa sẽ dễ bị nhiễm khuẩn.
Tuy vậy, việc giữ được độ ẩm cao (việc phòng ngừa và hạn chế sự hư hỏng của canh trường)
trong suốt quá trình sinh trưởng của nấm sợi lại còn có ý nghĩa to lớn hơn đối với sự tạo thành
Enzyme.
•

pH

Khi nuôi cấy trên môi trường bán rắn theo phương pháp bề mặt thì pH ít ảnh hưởng đến
sự sinh trưởng của nấm mốc, thường người ta sử dụng pH tự nhiên vào khoảng 5.5 – 6.

11

Enzyme Glucoamylase

GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

UI (Hoạt độ enzyme)

pH
Hình 1.6:Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính enzyme glucoamylase
•

Cung cấp Oxy

Trong quá trình phát triển và tích tụ enzyme nấm mốc rất cần oxy, khi nuôi cấy nấm mốc
theo phương pháp bề mặt nấm mốc dễ dàng tiếp xúc với không khí qua hệ thống sợi tơ và micell
vì thế đòi hỏi môi trường phải xốp giúp cho nấm mốc tạo nhiều hệ sợi và tích luỹ nhiều enzyme.
Nếu môi trường dính bết, không đủ độ xốp, không khí sẽ ít tiếp xúc vi sinh vật xảy ra hô hấp
yếm khí ảnh hưởng đến việc tích luỹ enzyme. Độ hoà tan của oxy vào môi trường nuôi cấy phụ
thuộc rất nhiều yếu tố: nhiệt độ, nồng độ chất và phương pháp thổi khí, nhiệt độ cao thì khả năng
hoà tan oxy kém, nồng độ chất tỷ lệ nghịch với khả năng hoà tan của oxy, ngược lại cũng có một
số yếu tố làm tăng khả năng hoà tan của oxy: ete, rượu, acid hữu cơ…

I.4.2. Nguồn cơ chất
•

Nguồn C

Thường là hợp chất hữu cơ trong đó chủ yếu là gluxit
Đối với các hệ vi sinh vật sinh enzyme amylaza: Tinh bột, dextrin, maltoza vừa là chất
cảm ứng vừa là nguồn cacbon tốt nhất để sinh tổng hợp amylaza. Khi nuôi cấy theo phương pháp

bề mặt nếu dùng cám thì không cần bổ sung tinh bột, ngoài cám có thể dùng bột ngô, bột mì, bo
bo. Cần chú ý trong đa số trường hợp, một số loại đường điển hình, nhất là glucose lại kìm hãm
12


Enzyme Glucoamylase

GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

sinh tổng hợp các enzyme thủy phân nói chung (chẳng hạn theo cơ chế trấn áp phân giải do làm
giàu lượng AMPV trong tế bào)
Ngoài nguồn gluxit là chủ yếu còn phải kể đến các nguồn cacbon khác như:
‒ Các axit béo phân tử lượng lớn (Oleic, stearic, miniotic). Ví dụ: axit oleic có tác dụng
kích thích tổng hợp glucoamylaza lên 2.5 – 3.5 lần so với nồng độ thích hợp 2 – 3%.
‒ Etanol và glyxerin trong nhiều trường hợp nuôi cấy được dùng làm cacbon bổ sung.
•

Nguồn Nitơ

Ở nhiều loại nấm mốc, nguồn nitơ tốt nhất là NaNO3 và NH4NO3, nhưng khi nồng độ nitơ
dưới 0.05% nấm mốc vẫn phát triển được nhưng sinh tổng hợp amylaza rất kém. Các muối
amoni vô cơ, một số nguồn nitơ hữu cơ (gelatin, cazein, cao ngô) cho hiệu quả sinh tổng hợp
amylaza thấp.
Trong thực tế, người ta thường dùng nguồn nitơ là các axit amin có nguồn gốc từ dịch
thủy phân protein (dịch tự phân nấm men, nước chấm, cao ngô, dịch chiết malt), đây vừa là
nguồn nitơ vừa là nguồn cacbon và chất cảm ứng sinh enzyme. Các axit amin có tác dụng tốt
nhất trong những trường hợp này là asparagin, axit glutamic; D,L serin, histamin, alanin. Trong
khi casein thậm chí là ức chế thì dịch thủy phân casein lại cảm ứng sinh tổng hợp amylaza lên
gấp 2 lần so với ban đầu.
Trong số các nguồn nitơ vô cơ thì NH4, H2PO4 là tốt cho nuôi cấy vi sinh vật hơn cả. Các

muối amon và nitrat khác đều làm giảm hoạt lực enzyme.
Các axit amin có ảnh hưởng rõ rệt nhất đến quá trình sinh tổng hợp enzyme vi sinh vật
nói chung. Nhiều acid amin lại có tác dụng ức chế sinh tổng hợp enzyme như valin, axit
glutamic, izolơxin, treonin.

•

Nguồn các nguyên tố khoáng và các yếu tố (chất) kích thích sinh trưởng
Muối khoáng rất cần thiết cho hoạt động của vi sinh vật, đặc biệt là đối với các quá trình

sinh tổng hợp các enzyme kim loại. Để sinh tổng hợp glucoamylaza, nồng độ MnSO4 thích hợp
nhất là 0.05%. Nếu thiếu muối này và muối photphat kali thì vi sinh vật không thể sinh tổng hợp
được dextrinaza. Hoạt lực glucoamylaza được nâng cao ở nồng độ KCl 0,05%
Ion Mg2+ có tác dụng sinh tổng hợp và ổn định các enzyme có hoạt tính ở nhiệt độ cao.
Lưu huỳnh S với nguồn chủ yếu là các axit amin chứa S như metionin, cystein, sistin, và
các muối sunphat (CuSO4). Các muối khoáng có Fe, Mn, Zn, B, Mo, Cu ảnh hưởng đến khả năng
sinh tổng hợp enzyme. Trong đa số trường hợp biotin (vitamin H) và một số vitamin cũng rất cần
thiết cho quá trình sinh tổng hợp enzyme.
13


Enzyme Glucoamylase
2.5.

GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

Tiêu chí chọn giống

Giống nấm mốc sử dụng phải đạt những chuẩn mực nhất định mới được phép sử
dụng.Các yếu tố cơ bản đối với giống nấm mốc sử dụng lên men thu nhận chế phẩm

glucoamylase gồm:
-

Giống nấm mốc phải có khả năng sinh tổng hợp enzyme glucoamylase mạnh, sản phẩm
này phải có chất lượng và số lượng cao hơn hẳn các sản phẩm từ các giống nấm mốc
khác.

Hình 1.7: So sánh hoạt tính enzyme glucoamylase sinh ra từ các giống nấm mốc khác
nhau

-

Giống phải có khả năng sử dụng các nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm tại địa phương nơi nhà
máy hoạt động, các phụ phẩm của các nhà máy.

-

Chế phẩm enzyme cần thu nhận do giống đang áp dụng trong sản xuất phải dễ dàng tách
ra khỏi các tạp chất môi trường và sinh khối của nấm mốc giống.

-

Giống nấm mốc sử dụng phải là chủng thuần khiết, không nhiễm các sinh vật lạ.

-

Giống phải có tính thích nghi cao, đặc biệt phải thích nghi với điều kiện sản xuất công
nghiệp, trong đó có sự ổn định về nhiệt độ, pH, độ ẩm…

14

Enzyme Glucoamylase

GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

-

Giống phải có tốc độ sinh sản và phát triển rất mạnh trong điều kiện môi trường công
nghiệp. Tính chất này rất quan trọng vì khi nhiễm các vi sinh vật lạ thì giống dung trong
sản xuất phải có khả năng lấn át sự phát triển của vi sinh vật lạ.

-

Tốc độ trao đổi chất mạnh để nhanh tạo ra sản phẩm mong muốn, giúp ta tăng nhiều chu
kỳ sản xuất.

-

Giống phải ổn định trong bảo quản và dễ dàng bảo quản, ít bị thoái hóa

3.

Môi trường lên men

Yêu cầu cơ bản đối với thành phần của môi trường nuôi vi sinh vật tạo Glucoamylase
cũng giống như yêu cầu đối với môi trường nuôi vi sinh vật tạo enzyme khác là tính hoàn thiện.
Hầu hết các vi sinh vật tạo glucoamylase đều hấp thụ carbon chủ yếu ở các dạng hợp chất hữu cơ
(tinh bột, dextrin…), hyđro ở dạng H2O và của các hợp chất hữu cơ, oxy ở trong thành phần cấu
tử cơ bản của môi trường và ở dạng oxy phân tử.

Cấu tử chính của môi trường vi sinh vật tạo Glucoamylase bằng phương pháp lên men bề
mặt là cám mì, cám gạo. Cám mì, cám gạo là nguyên liệu hoàn hảo và có thể là một cấu tử duy
nhất của môi trường để nuôi vi sinh vật không cần bổ sung thêm các chất khác nữa. Cám mì có
16 – 22% tinh bột, 10 – 12% protein, trong đó các amino acid quan trọng như methionine
(0,19%), cystine (0,3%), arginine (1%), lysine (6%), tryptophan (0,3%), 3 – 4% chất béo, 10,3%
celulose, các nguyên tố trơ (Na – 0.09% , K – 1% , Ca – 0.16% , P – 0.94%) và các nguyên tố vi
lượng cùng các chất khác. Cám gạo có khoảng 20% tinh bột 10 –15% chất béo, 10 – 14%
protein, 8 – 16% celulose, các chất hoà tan không chứa nitơ (37 – 59%).
Bảng 1.2: Thành phần hóa học của cám mì
Thành phần
Độ ẩm
Tinh bột
Protein thô
Béo thô
Xơ thô
Canxi
Phospho tổng
Natri
K

% Khối lượng
13
16 – 22
10 – 12
3–4
10 – 11
0.16
0.94
0.09
1

15


Enzyme Glucoamylase

GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

Bảng 1.3: Thành phần hóa học của cám gạo
Thành phần
Tinh bột
Chất béo
Protein
Cellulose
Cấu tử hòa tan không chứa Nito

% Khối lượng
20
10 – 15
10 – 14
8 – 16
37 – 59

Chất lượng của cám gạo, cám mì có ảnh hưởng lớn tới hoạt lực của enzyme. Cám không
được chứa tinh bột dưới 20 – 30%. Nên dùng cám tốt, cám mới không có vị chua hay vị đắng,
không hôi mùi mốc. Độ ẩm của cám không quá 15%, tạp chất độc không quá 0,05%... Tuy là phế
liệu của công nghiệp xay xát, nhưng cám cũng tương đối đắt tiền, hơn nữa trong quá trình nuôi vi
sinh vật, các chất dinh dưỡng không được sử dụng hết, vì thế có thể thay cám bằng một số cấu tử
rẻ tiền hơn. Cấu tử này thường là mầm mạch (15 – 20%), trấu (2 – 5%), mùn cưa (5 – 10%)…
Có thể dùng cặn bã canh trường rắn (sau khi cách ly Enzyme) là cấu tử chính của môi trường

(Silova, Fenikxov) 1967, đảm bảo chế độ tiệt trùng. Cám và các chất phụ gia chứa nhiều bào tử
vi sinh vật khác nên cần phải tiệt trùng để đảm bảo chủng nuôi phát triển bình thường và canh
trường sản xuất không chứa vi sinh vật ngoại lai. Cần thanh trùng dưới áp suất hơi 1 – 5atm
trong vòng 4 – 6 giờ, có thể thanh trùng bằng hơi nóng ở nhiệt độ 1200C trong 90 phút. Khi
thanh trùng cho vào 0,2% formalin (40%) và 0,8% HCl kỹ thuật theo khối lượng môi trường.
Tiêu chuẩn chọn nguyên liệu: Tiêu chuẩn chất lượng cám mì, cám gạo theo qui định của
Bộ Nông nghiệp – phát triển nông thôn.
•

Độ ẩm: < 12%

•

Không mùi chua mốc

•

Độc tố Aflatoxin: không quá 50 ppb
Tỉ lệ cám mì/Cám gạo = 7/3

Bảng 1.4: Thành phần dinh dưỡng của hỗn hợp nguyên liệu cám gạo – cám mì
Thành phần dinh dưỡng
Độ ẩm
Protein thô
Xơ thô
NDF (Hàm lượng chất xơ trung tính)

% Khối lượng
11
16.5

9.75
42
16


Enzyme Glucoamylase

GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

ADF (Hàm lượng xơ acid dễ tiêu hóa)
Hàm lượng tro và khoáng

16
4.75

Bảng 1.5: Chỉ tiêu nước sạch trong công nghiệp

•

Chỉ tiêu vật lí

•

Tiêu chuẩn

-

Mùi vị

-

Không mùi

-

Độ trong (ống Dienert)

-

100 ml

-

Màu sắc (thang màu Coban)

-

50

•

Chỉ tiêu hoá học

-

pH

- 6 ÷ 8,5

-

Độ cặn cố định (đốt ở 600C)

- 75 ÷ 150 mg/lít

-

Độ cứng toàn phần (độ Đức)

- Dưới 150

-

Độ cứng vĩnh viễn

- 70

-

CaO

- 50 ÷ 100 mg/lít

-

MgO

- 50 mg/lít

-

Fe2O3

- 0.3 mg/lít

-

MnO

- 0.2 mg/lít

-

BO4-3

- 2.5 mg/lít

-

SO4-2

- 0.5 mg/lít

-

NH4+

- 0.3 mg/lít

-

NO2-

- Không có

-

NO3-

- Không có
- 0.1 mg/lít
17


Enzyme Glucoamylase

GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

-

Pb

- 0.05 mg/lít

-

As

- 0.3 ÷ 0.5 mg/lít

-

Fe

- 5.00 mg/lít

-

Zn

•

Chỉ tiêu vi sinh vật

-

Tổng số vi sinh vật hiếu khí

-

Dưới 100 cfu/ml

-

Chỉ số Coli

-

Dưới 20 cfu/ml

-

Vi sinh vật gây bệnh

-

Không có

Các chất bổ sung môi trường lên men bán rắn:
•

K2HPO4, MgSO4, FeSO4.7H2O, NaNO3

•

Chất độn: Mùn cưa

Bảng 1. 6: Hàm lượng các chất bổ sung trong nguyên liệu

Chất bổ sung
K2HPO4
MgSO4
NaNO3
FeSO4.7H2O
Mùn cưa

% (Khối lượng)
0.001
0.005
0.9

0.1
10

Bảng 1.7: Chỉ tiêu cho phép của MgSO4
Độ tinh khiết
Asen

> 99.5 %
< 3 ppm
18


Enzyme Glucoamylase

GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Selen
Chì

< 30ppm
< 10 ppm

Bảng 1.8: Chỉ tiêu cho phép của KH2PO4
Độ tinh khiết
Asen
Flo
Clo
Sulfate
Sắt
Chì

> 98 %
< 3 ppm
< 10 ppm
< 0.03%
<0.1 %
<0.003 %
< 5 ppm

Bảng 1.9: Chỉ tiêu cho phép của FeSO4.7H2O
Độ tinh khiết
Asen
Thủy ngân
Chì
4.

> 99.5 %
< 3 ppm
< 3 ppm
< 10 ppm

Phương pháp nuôi cấy
Ở đây, ta sử dụng phương pháp nuôi cấy bề mặt

Trong phương pháp nuôi cấy bề mặt vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường rắn
hoặc lỏng (vì vậy còn gọi là phương pháp nổi). Các môi trường rắn trước khi nuôi cấy vi sinh
vật cần được làm ẩm. Thường dùng cám, đôi khi dùng gạo tấm, ngô, bã bia, bã củ cải đường,
khoai tây, lõi ngô…hoặc hỗn hợp những nguyên liệu này.
Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp nuôi cấy vi sinh vật mà trong đó vi sinh vật
phát triển trên bề mặt môi trường hay phát triển trên hạt, trên môi trường bán rắn.
Nguyên liệu dùng để nuôi cấy nấm mốc theo phương pháp này thường là môi trường cám

trấu, cám gạo, cám mì, bột ngô, hạt kê. Để làm tăng độ xốp của môi trường từ các nguyên liệu
trên, người ta thường bổ sung vào các thành phần làm xốp như trấu, lõi ngô được làm nhỏ. Tuy
nhiên, các thành phần trên là các thành phần chứa rất ít chất dinh dưỡng vì vậy cần phải bổ sung
vào môi trường một lượng phụ liệu trong khoảng 15 – 20%. Mặc khác, để tăng cường quá trình
sinh tổng hợp enzyme thì cần phải bổ sung vào môi trường nuôi vi sinh vật những chất cảm ứng
để cảm ứng tổng hợp enzyme.

19


Enzyme Glucoamylase

II.

GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

Quy trình công nghệ
Nguyên liệu

Trộn

Tiệt trùng

Nấm mốc

Cấy giống

Nhân giống
20

Enzyme Glucoamylase

GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

Lên men

Nghiền
Nước

Trích li

Bã

Li tâm

Bã

Siêu lọc UF

Chất
độn

Sấy thăng hoa

Phối trộn

Bao bì

Đóng gói

Chế phẩm enzyme

1.

Trộn
Mục đích công nghệ: chuẩn bị cho quá trình lên men

Quá trình trộn làm cho nguyên liệu phân tán đều vào nhau, đảm bảo thành phần dinh
dưỡng ở mọi vị trí là gần như nhau để thích hợp cho vi sinh vật sử dụng.
Các biến đổi của nguyên liệu: do đây là quá trình phối trộn vật liệu rời nên trong quá
trình phối trộn thường không tạo ra biến đổi nào đáng kể.
•

Vật lí: nhiệt độ môi trường tăng

•

Hóa học: thành phần hóa học của môi trường thay đổi
21


Enzyme Glucoamylase

GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

•

Hóa lí: không có biến đổi đáng kể.

•

Hóa sinh: phản ứng do enzyme xúc tác

•

Sinh học: Hỗn hợp cám mì, cám gạo là môi trường giàu dinh dưỡng thích hợp cho
vi khuẩn, nấm mốc phát triển nên trong quá trình phối trộn có thể bị nhiễm vi sinh
vật

Thiết bị: thiết bị phối trộn dạng thùng quay

Hình 2.1: Thiết bị phối trộn dạng thùng quay
Thiết bị trộn dạng thùng quay, bên trong thùng có thể lắp thêm các thanh chặn để làm
tăng hiệu quả của quá trình phối trộn. Nguyên liệu thường được cho vào với thể tích khoảng
50 – 60% thể tích thùng, rồi điều chỉnh tốc độ quay của thùng và thời gian phối trộn cho phù hợp
Thông số công nghệ:

2.

-

Tỉ lệ phối trộn: cám mì/cám gạo = 7/3

-

Tốc độ quay của thùng = 1/2 tốc độ giới hạn (tốc độ mà vật liệu bắt đầu di chuyển
trên thành thùng do lực ly tâm)

-

Nhiệt độ phối trộn: 28 – 30oC

-

Thời gian phối trộn: 15 phút

Tiệt trùng
Mục đích công nghệ: Chuẩn bị cho quá trình lên men
22


Enzyme Glucoamylase

GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

Quá trình tiệt trùng sẽ làm giảm lượng vi sinh vật có trong nguyên liệu, tức là giảm các
yếu tố cạnh tranh và các yếu tố làm thay đổi thành phần dinh dưỡng môi trường lên men, nhằm
tạo điều kiện tốt cho Aspergillus Niger phát triển và tạo hệ enzyme glucoamylase
Các biển đổi của nguyên liệu:
-

Vật lí: trong quá trình tiệt trùng, biến đổi vật lý quan trọng nhất là sự tăng nhiệt độ của
nguyên liệu, có sự giảm nhẹ khối lượng do sự bay hơi nước trong nguyên liệu.

-

Hóa học: các phản ứng hóa học xảy ra dưới tác dụng của nhiệt độ như phản ứng
Maillard, oxy hóa chất béo, phân hủy một số vitamin… nhưng mức độ các phản ứng xảy
ra không đáng kể.

-

Hóa lí: biến đổi hóa lý chủ yếu trong quá trình tiệt trùng nguyên liệu là sự bay hơi nước,
tuy nhiên độ ẩm ban đầu của nguyên liệu cũng không quá cao nên mức độ bay hơi nước
cũng không đáng kể.

-

Sinh học: dưới tác dụng của nhiệt độ cao các vi sinh vật sẽ bị ức chế hoặc tiêu diệt. đây
chính là mục đích chính của quá trình.

-

Hóa sinh: nhiệt độ cao sẽ làm biến tính bất thuận nghịch các enzyme có mặt trong nguyên
liệu, do đó chúng sẽ bị vô hoạt.
Thiết bị: Thiết bị tiệt trùng dạng nằm ngang

Hình 2.2: Thiết bị thanh trùng dạng nằm ngang
1 – Vỏ; 2 – Khớp nối để nạp hơi; 3 – Cửa để nạp nguyên liệu; 4 – Van không khí; 5 –
Trục nối các cánh; 6 – Khớp nối để mở nước rửa; 7 – Cửa tháo liệu; 8 – Áo nước; 9 – Khớp nối
để tháo nước ngưng; 10 – Khớp nối để thải hơi trong áo tơi

23


Enzyme Glucoamylase

GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

Trong công nhiệp vi sinh để tiệt trùng các môi trường dinh dưỡng dạng rời, người ta sử
dụng rộng rãi các thiết bị tiệt trùng hình trụ dạng nằm ngang có áo hơi. Bên trong thiết bị tiệt
trùng được bố trí hai trục với các cánh có thể quay một góc độ nào đó để dễ dàng điều chỉnh.
Điều đó cho phép xác định khe hở cần thiết theo hướng kính giữa các cánh và thành
tường của thiết bị, nó phụ thuộc vào các tính chất hoá lý của các cấu tử và thành phần của môi
trường. Các trục quay theo các hướng khác nhau làm cho môi trường chuyển đảo liên tục trong
những hướng đối nhau. Loại cấu tạo này sẽ đảm bảo sự đảo trộn môi trường, làm giảm đáng kể
sự vón cục và đảm bảo sự đồng nhất môi trường có thành phần nhiều cấu tử. Điều đó có ảnh
hưởng tốt tới quá trình nuôi cấy.
Hơi có áp suất 0,2 MPa cho vào áo tơi để làm tăng nhanh quá trình đun nóng môi trường.
Môi trường được giữ ở chế độ tiệt trùng đã cho khi khởi động chu kì các cơ cấu chuyển đảo. Sau
khi tiệt trùng, môi trường sẽ được làm nguội về 38 – 400C và thoát liệu ra ngoài. Tiến hành tháo
môi trường dinh dưỡng đã được tiệt trùng qua cửa tháo liệu bên dưới. Cửa tháo liệu có các nắp
trong và ngoài được lắp chặt bằng các vít. Ngoài ra, thiết bị tiệt trùng còn có các cửa nạp liệu,
nhiều khớp nối để nạp hơi và thải nước ngưng, để nạp và thải nước làm lạnh, cho các dụng cụ
kiểm tra và điều chỉnh nhiệt độ, áp suất và có van bảo hiểm.
Thông số công nghệ:
-

Nhiệt độ: 1210C

-

Thời gian: 20 – 30 phút

3.

Quá trình nhân giống

Mục đích công nghệ: Chuẩn bị cho quá trình cấy giống, thu nhận bào tử vi sinh vật chuẩn

bị cho quá trình nuôi cấy thu nhận enzyme glucoamylase.
Các biến đổi trong quá trình nhân giống:
-

Sinh học: vi sinh vật thực hiện quá trình trao đổi chất và sinh sản tạo ra nhiều tế bào mới.

-

Hóa sinh: các phản ứng hóa sinh xảy ra bên trong và ngoài tế bào, hầu hết chúng đều có
liên quan đến sự trao đổi chất của tế bào. Các phản ứng này được chia làm hai nhóm:

-

•

Phản ứng dị hóa: chuyển hóa cơ chất phức tạp thành cơ chất đơn giản hoặc phân giải
cơ chất để tạo ra năng lượng sinh học.

•

Phản ứng đồng hóa: tổng hợp các polymer sinh học của tế bào từ các hợp chất đơn
giản và năng lượng do dị hóa cung cấp.

Vật lý: có sự tăng nhiệt độ canh trường, do trong quá trình sinh trưởng một phần năng
lượng sẽ được vi sinh vật thải ra bên ngoài tế bào dưới dạng nhiệt năng.
24


Enzyme Glucoamylase

GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

Nhân giống bao gồm 2 quá trình:
•

Trong phòng thí nghiệm: Ở số lượng nhỏ. Môi trường nhân giống được đưa tiệt
trùng, sau đó cấy giống vi sinh vật vào môi trường và cho sinh trưởng ở điều kiện
bình thường.

•

Trong phân xưởng: Ta sử dụng thiết bị lên men hình trụ, có cánh khuấy, bộ phận
sục khí và lớp vỏ điều nhiệt.
Bảng 2.1: Thành phần môi trường nhân giống
Cơ chất
Pepton
Glucose
(NH4)2SO4
MgSO4.7H2O
CaCl2.H2O
KH2PO4
K2HPO4
Nước cất

Hàm lượng
5g/l
10g/l
5g/l
2g/l
2g/l

1,5g/l
0,1g/l
1000ml

Thông số công nghệ:

4.

•

Nhiệt độ môi trường: 28 – 32oC

•

Độ ẩm môi trường: 60 – 65%

Cấy giống

Mục đích công nghệ: Chuẩn bị cho quá trình lên men thu nhận chế phẩm enzyme
glucoamylase
Các biến đổi của nguyên liệu: Không có biến đổi đáng kể.
Thiết bị: Thiết bị phun bào tử vi sinh vật
Môi trường sau khi được xử lý sẽ được phân phối vào các khay rồi được đưa vào một
thiết bị kín có băng tải, các khay di chuyển trên băng tải, giống được cấy vào môi trường bằng
cách phun bào tử lên bề mặt môi trường nhờ hệ thống vòi phun ở phía trên.
Thông số công nghệ:
-

Tỉ lệ giống cấy: 5 – 10% v/v

25