Nghiên cứu điều kiện thủy phân nấm men bia bằng protease thương phẩm thu peptide có hoạt tính chống oxi hóa

i

I HC THI NGUYấN
TRNG I HC NễNG LM

TRNG MNH HNG

Tờn ti:

Nghiên cứu điều kiện thủy phân nấm men bia bằng protease
thơng phẩm thu peptide có hoạt tính chống oxi hóa

KhóA LUậN TốT NGHIệP ĐạI HọC

H o to
Chuyờn ngnh
Khoa
Khoỏ hc

: Chớnh quy
: Cụng ngh Thc phm
: CNSH-CNTP
: 2010-2014

Thỏi Nguyờn, nm 2014


2

I HC THI NGUYấN
TRNG I HC NễNG LM

TRNG MNH HNG

Tờn ti:

Nghiên cứu điều kiện thủy phân nấm men bia bằng protease
thơng phẩm thu peptide có hoạt tính chống oxi hóa

KhóA LUậN TốT NGHIệP ĐạI HọC
H o to
: Chớnh quy
Chuyờn ngnh
: Cụng ngh Thc phm
Lp
: K42 - CNTP
Khoa
: CNSH-CNTP
Khoỏ hc
: 2010-2014
Ging viờn hng dn : TS. Hong Th L Hng
Vin Nghiờn cu Rau qu H Ni
ThS. Phm Th Vinh
Khoa CNSH - CNTP, trng i hc Nụng Lõm Thỏi Nguyờn

Thỏi Nguyờn, nm 2014


3

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp tại Trung tâm Công nghệ sinh
học và Công nghệ thực phẩm Hà Nội - Sở Khoa học và công nghệ Hà Nội, để
hoàn thành được đợt thực tập tốt nghiệp ngoài sự nỗ lực của bản thân tôi đã
nhận được sự giúp đỡ hết sức tận tình của các thầy cô trong khoa CNSH &
CNTP cùng toàn thể các cô chú, anh chị cán bộ trong Trung tâm Công nghệ
sinh học và Công nghệ thực phẩm Hà Nội.
Trước tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới ThS. Phạm Thị Thu Hiền Trung tâm Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm Hà Nội đã tạo điều kiện
cho tôi được thực tập và tận tình giúp đỡ tôi hoàn thành tốt bản khóa luận tốt
nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn thầy Lưu Hồng Sơn - Giảng viên khoa
CNSH & CNTP, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tận tình chỉ bảo
và giúp đỡ tôi làm khóa luận này.
Đồng cảm ơn các thầy cô trong khoa CNSH & CNTP, Trường Đại học
Nông Lâm Thái Nguyên đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập. Cảm ơn
các cô chú, anh chị cán bộ trong Trung tâm Công nghệ sinh học và Công nghệ
thực phẩm Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực tập ở đó.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình tôi và các bạn bè của tôi đã giúp đỡ
và động viên tôi rất nhiều những lúc tôi gặp khó khăn.
Do thời gian và kiến thức còn hạn chế nên báo cáo tốt nghiệp của tôi
không thể tránh khỏi những thiếu sót. Kính mong các quý thầy cô trong khoa
CNSH & CNTP Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên thông cảm và đóng
góp ý kiến giúp cho báo cáo tốt nghiệp của tôi được hoàn thiện hơn.
Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!
Thái Nguyên, ngày 6 tháng 06 năm 2014
Sinh viên

Trương Mạnh Hùng


4

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Thành phần của bã men bia (%) ................................................................. 4
Bảng 2.2: Thành phần chất khô của bã men bia (%) ................................................. 4
Bảng 2.3: Ứng dụng protease trong công nghiệp .....................................................20
Bảng 3.1: Thành phần gel điện di ...............................................................................31
Bảng 4.1: Một số thông số cơ bản của bã nấm men bia sau rửa đắng ....................33
Bảng 4.2: Tỷ lệ chết của tế bào nấm men ở các nhiệt độ khác nhau.......................34
Bảng 4.3: Đường chuẩn tyrosine ................................................................................35
Bảng 4.4: Đường chuẩn glutamic ...............................................................................37
Bảng 4.5: Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm enzyme Flavourzyme đến khả năng
thuỷ phân protein nấm men...........................................................................39
Bảng 4.6: Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm enzyme Neutrase đến khả năng thuỷ
phân protein nấm men ........................................................................................41
Bảng 4.7: So sánh khả năng thuỷ phân của Flavourzyme và Neutrase ..................43
Bảng 4.8: Kết quả xác định khả năng ức chế gốc tự do ...........................................46


5

DANH MỤC CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ
Hình 2.1: Nấm men Saccharomyces Cerevisiae ......................................................... 3
Hình 2.2: Sự tạo thành liên kết peptide ........................................................................ 5
Hình 2.3: Cấu trúc của pentanpeptide seryl-glycyl-tyrosyl-alanyl-neucine ............. 6
Hình 2.4: Sự tạo phức màu xanh da trời đậm trong phản ứng Biure ........................ 7
Hình 2.5: Cấu trúc vitamin C ........................................................................................ 8
Hình 2.6: Cấu trúc vitamin E ........................................................................................ 9
Hình 2.7: Cấu trúc trung tâm hoạt động (TTHĐ) của protease ..............................16
Hình 2.8: Sơ đồ phân loại protease.............................................................................18
Hình 2.9: Sơ đồ thu nhận và tinh sạch ACEIPS từ dịch thủy phân casein .............24

Hình 4.1: Biểu đồ thành phần hóa học của bã nấm men bia sau khi rửa đắng.......33
Hình 4.2: Hình ảnh vi trường kiểm tra tỷ lệ chết của nấm men...............................35
Hình 4.3: Đồ thị đường chuẩn tyrosine ......................................................................36
Hình 4.4: Đường chuẩn glutamic ...............................................................................38
Hình 4.5: Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm enzyme Flavourzyme đến khả năng
thuỷ phân protein nấm men................................................................................40
Hình 4.6: Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm enzyme Neutrase đến khả năng thuỷ
phân protein nấm men ........................................................................................42
Hình 4.7: So sánh khả năng thuỷ phân của Flavourzyme và Neutrase...................44
Hình 4.8: Kết quả điện di peptide từ dịch thủy phân ................................................45
Hình 4.9: Sơ đồ quy trình công nghệ thủy phân nấm men bia bằng protease
thương phẩm thu dịch peptide kỹ thuật có hoạt tính chống oxi hóa ..............47


6

BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Tên đầy đủ

Ký hiệu
TTHĐ

Trung tâm hoạt động

DPPH

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl

BHT

Butylated hydroxytoluen

BHA

Butylate hydroxyanisole

TBHQ

Tertbutyl hydroquinone

EDTA

Ethylendiamin Tetraacetic Acid

KTĐ

Khô tuyệt đối

SDS

Sodium Dodecyl Sulfate

PAGE

Polyacrylamide Gel Electrophoresis

TCA

TriCloroacetic Acid

SGYAL

Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu

ACE

Angiotensin I Converting Enzyme


7

MỤC LỤC
PHẦN 1: MỞ ĐẦU....................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề ....................................................................................................................... 1
1.2. Mục tiêu nghiên cứu ...................................................................................................... 2
1.3. Yêu cầu của đề tài .......................................................................................................... 2
1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ..................................................................... 2
1.4.1. Ý nghĩa khoa học ........................................................................................................ 2
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn ......................................................................................................... 2
PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.........................................................................3
2.1. Tổng quan về nấm men bia ........................................................................................... 3
2.1.1. Tìm hiểu chung về bã men bia................................................................................... 3
2.1.2. Thành phần hóa học và dinh dưỡng của bã men bia ............................................... 4
2.2. Tổng quan về peptide có hoạt tính chống oxi hóa ...................................................... 5
2.2.1. Khái niệm peptide ....................................................................................................... 5
2.2.2. Quá trình tạo thành liên kết peptide .......................................................................... 5
2.2.3. Cách gọi tên và phân loại peptide.............................................................................. 5
2.2.4. Tính chất của peptide.................................................................................................. 6
2.2.5. Peptide có hoạt tính chống oxi hóa ........................................................................... 7
2.3. Tổng quan về protease ................................................................................................. 15

2.3.1. Giới thiệu chung........................................................................................................ 15
2.3.2. Phân loại protease ..................................................................................................... 18
2.3.3. Cơ chế hoạt động protease ....................................................................................... 19
2.3.4. Ứng dụng ................................................................................................................... 20
2.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước................................................................ 21
2.4.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước ........................................................................... 21
2.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước ............................................................................ 22
PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......26
3.1. Đối tượng (vật liệu) và phạm vi nghiên cứu.............................................................. 26
3.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị sử dụng trong nghiên cứu .......................................... 26
3.3. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu .............................................................. 27
3.3.1. Địa điểm nghiên cứu................................................................................................. 27
3.3.2.Thời gian nghiên cứu ................................................................................................. 27
3.4. Nội dung nghiên cứu.................................................................................................... 27


8

3.4.1. Đánh giá chất lượng bã nấm men bia ..................................................................... 27
3.4.2. Xác định tỷ lệ nấm men chết ................................................................................... 27
3.4.3. Xác định hoạt độ enzyme protease.......................................................................... 27
3.4.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng thuỷ phân protein nấm men bằng chế phẩm
enzyme Neutrase và enzyme Flavourzyme .............................................................. 27
3.4.5. Xác định peptide bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide-SDS (SDSPAGE) .......................................................................................................................... 27
3.4.6. Xác định hoạt tính chống oxi hóa của chế phẩm peptide chức năng ................... 27
3.4.7. Viết sơ đồ quy trình công nghệ thủy phân nấm men bia bằng protease thương
phẩm thu peptide có hoạt tính chống oxi hóa ........................................................... 27
3.5. Phương pháp nghiên cứu............................................................................................. 27
3.5.1. Xác định tỷ lệ nấm men chết bằng phương pháp theo dõi vi trường................... 27
3.5.2. Xác định hoạt độ protease (theo phương pháp Anson cải tiến)............................ 28

3.5.3. Phương pháp ninhydrin xác định hàm lượng acid amin ....................................... 29
3.5.4. Xác định hàm lượng peptide tổng bằng OPA ........................................................ 30
3.5.5. Xác định peptide bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide-SDS (SDSPAGE) (theo HOEFER) ............................................................................................. 30
3.5.6. Xác định hoạt tính chống oxi hóa bằng phương pháp β-carotene/ Linoleate
(Shaikhan et al, 1995). ................................................................................................. 32
3.5.7. Phương pháp xử lý số liệu........................................................................................ 32
PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................33
4.1. Đánh giá chất lượng bã nấm men bia......................................................................... 33
4.2. Xác định tỷ lệ nấm men chết....................................................................................... 34
4.3. Xác định hoạt độ enzyme protease ............................................................................. 35
4.3.1. Xây dựng đường chuẩn tyzosine ............................................................................. 35
4.3.2. Xác định hoạt độ enzyme protease trong chế phẩm Flavourzyme ...................... 37
4.3.3. Xác định hoạt độ enzyme protease trong chế phẩm Neutrase 0,8L..................... 37
4.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng thuỷ phân protein nấm men bằng chế phẩm
enzyme Neutrase và enzyme Flavourzyme .............................................................. 37
4.4.1 Xây dựng đường chuẩn glutamic ............................................................................. 37
4.4.2. Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm enzyme Flavourzyme đến khả năng thuỷ
phân protein nấm men ................................................................................................. 39
4.4.3. Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm enzyme Neutrase đến khả năng thuỷ phân
protein nấm men .......................................................................................................... 41


9

4.4.4. So sánh hiệu quả thuỷ phân bằng chế phẩm enzyme Neutrase với chế phẩm
enzyme Flavourzyme .................................................................................................. 43
4.5. Xác định peptide bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide-SDS (SDSPAGE) .......................................................................................................................... 44
4.6. Xác định hoạt tính chống oxi hóa của chế phẩm peptide chức năng ...................... 46
4.7. Hoàn thiện quy trình thủy phân, tinh sạch nấm men bia bằng protease thương
phẩm thu peptide có hoạt tính chống oxi hóa ........................................................... 47

PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................50
5.1. Kết luận ............................................................................................................... 50
5.2. Kiến nghị ............................................................................................................. 50
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................51


1

PHẦN 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Peptide là những protein thường có cấu trúc đoạn ngắn khoảng từ hai đến
vài chục amino acid nối với nhau, có khối lượng phân tử thường dưới 6.000
Dalton. Mặc dù có cấu trúc nhỏ nhưng nhiều peptide có vai trò khá quan trọng
trong hoạt động trao đổi chất của cơ thể. Nó có tác dụng trong cả y học, công nghệ
thực phẩm và các ngành khác. Một trong những tác dụng quan trọng nhất của
peptide là khả năng chống oxy hóa, ngăn ngừa tác hại của các gốc tự do sinh ra từ
hoạt động trao đổi chất trong cơ thể.
Chất chống oxi hóa có thể có mặt trong các loại trái cây và rau quả, thảo
dược, trứng, sữa. Tuy vậy, hàm lượng của chúng biến động rất khác nhau trong
các loại thực phẩm và thường đi kèm với nhiều chất khác. Do vậy nhu cầu đặt ra
là phải tạo ra một sản phẩm giàu các peptide loại này để có thể bổ sung một cách
có kiểm soát với những đối tượng có nhu cầu. Qua tìm hiểu có thể thấy được bã
men bia với hàm lượng protein dồi dào chính là một trong số các nguồn cung cấp
peptide chống oxi hóa tiềm năng.
Ngày nay công nghệ sản xuất và thị trường tiêu thụ bia ngày càng phát
triển, sản lượng bia được tạo ra với số lượng lớn, kéo theo lượng bã men bia thải
ra cũng tăng. Ở Việt Nam, nấm men bia thu được từ các nhà máy bia rất lớn. Ước
tính trung bình cứ 1000 lít bia thu được 1,5 kg nấm men khô, trong đó chứa
khoảng 700g protein [19,2]. Năm 2005 sản lượng bia của cả nước đạt 1,5 tỷ lít,

tương ứng với 18 triệu tấn sinh khối nấm men thải ra. Đến năm 2010 sản lượng
bia của cả nước đạt 2,5 tỷ lít và bã men thải ra là 30 triệu tấn [2]. Như vậy, lượng
protein có chất lượng cao từ nấm men thải ra của quá trình sản xuất bia nếu tận
dụng được là không nhỏ. Việc nghiên cứu chế biến và sử dụng nấm men còn rất ít
và hiện nay ở Việt Nam có một nghịch lý là nấm men thải ra từ các nhà máy bia
một phần nhỏ được bán cho các hộ chăn nuôi gia súc sử dụng làm thức ăn trực
tiếp, còn lại được thải ra ngoài môi trường gây ô nhiễm môi trường.
Xuất phát từ tình hình thực tế trên, để giảm bớt gánh nặng ô nhiễm cho môi
trường đồng thời có thể nghiên cứu tạo ra một sản phẩm chức năng có ứng dụng


2

cao chúng tôi quyết định thực hiện đề tài: “Nghiên cứu điều kiện thủy phân nấm
men bia bằng protease thương phẩm thu peptide có hoạt tính chống oxi hóa”.
1.2. Mục tiêu nghiên cứu
Tối ưu điều kiện thủy phân nấm men bia bằng protease thương phẩm thu
peptide có hoạt tính chống oxi hóa.
Tạo ra và thử nghiệm chế phẩm peptide có hoạt tính chống oxi hóa.
1.3. Yêu cầu của đề tài
- Xác định được tỷ lệ nấm men chết và chọn phuơng pháp phá tế bào
phù hợp.
- Nghiên cứu được quy trình thủy phân, tinh sạch protein bã nấm men thu
một số peptide có hoạt tính chống oxi hóa.
- Xác định được hoạt tính chống oxi hóa của chế phẩm peptide chức năng.
- Viết được sơ đồ quy trình công nghệ thủy phân nấm men bia bằng protease
thương phẩm thu peptide có hoạt tính chống oxi hóa.
1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
1.4.1. Ý nghĩa khoa học
Giúp sinh viên củng cố và hệ thống lại kiến thức đã học và nghiên cứu

khoa học.
Biết được phương pháp nghiên cứu một số vấn đề khoa học, xử lý và phân
tích số liệu, cách trình bày một bài báo cáo khoa học.
Kết quả nghiên cứu của đề tài góp phần bổ sung cơ sở khoa học về peptide
có hoạt tính chống oxi hóa từ nấm men bia, mở rộng ứng dụng thực phẩm chức
năng nhằm cải thiện sức khỏe cho người tiêu dùng.
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Sau khi thu nhận được peptide có hoạt tính chống oxi hóa từ nấm men bia
sẽ làm nền tảng nghiên cứu ứng dụng vào trong sản xuất thực phẩm chức năng ở
quy mô lớn phục vụ nhu cầu thiết yếu của thị trường và người tiêu dùng. Cũng
trên cơ sở đó giúp giảm ô nhiễm môi trường.


3

PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về nấm men bia
2.1.1. Tìm hiểu chung về bã men bia
Nấm men bia là một phế phẩm của sản xuất, được nằm lại trong các
thùng lên men, các hầm chứa sau khi lên men chính và lên men phụ [5].
Nấm men thuộc nhóm cơ thể đơn bào, chúng phân bố rộng rãi trong thiên
nhiên, đặc biệt có nhiều ở vùng đất trồng nho và các nơi trồng hoa quả. Nhiều loài
nấm men có khả năng lên men rượu. Từ lâu người ta đã biết sử dụng nấm men để
sản xuất rượu bia. Nấm men sinh sôi nhanh, tế bào lại chứa nhiều vitamin, acid
amin không thay thế, hàm lượng protein chiếm tới 50% trọng lượng khô của tế
bào, nên nhiều loại nấm men còn được sử dụng để sản xuất protein. Ngoài ra nấm
men còn được sử dụng trong công nghệ sản xuất bánh mì [11].
Nấm men dùng trong sản xuất bia thường là các chủng thuộc giống
Saccharomyces, chúng có khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng trong môi

trường nước mạch nha như các loại đường hoà tan, các hợp chất nitơ (các amino
acid, peptide), vitamin và các nguyên tố vi lượng…qua màng tế bào. Sau đó,
hàng loạt các phản ứng sinh hóa mà đặc trưng là quá trình trao đổi chất để
chuyển hoá các chất này thành những dạng cần thiết cho quá trình phát triển và
lên men của nấm men được tiến hành. Bã men bia chứa rất nhiều tế bào nấm
men và trong tế bào nấm men lại chứa rất nhiều các chất dinh dưỡng có giá trị
nổi bật như protein và vitamin nhóm B. Hàm lượng protein của nấm men dao
động trong khoảng từ 40 - 60% vật chất khô tế bào [11].

Hình 2.1: Nấm men Saccharomyces Cerevisiae


4

Ngày nay công nghệ sản xuất và thị trường tiêu thụ bia ngày càng phát
triển, sản lượng bia được tạo ra với số lượng lớn, kéo theo lượng bã men bia
được thải ra ngày càng tăng, do đó nó sẽ là nguồn nguyên liệu lý tưởng được
khai thác trong tương lai không xa.
2.1.2. Thành phần hóa học và dinh dưỡng của bã men bia
Thành phần hóa học và dinh dưỡng của nấm men phụ thuộc vào chủng
giống, môi trường, trạng thái sinh lý cũng như điều kiện nuôi cấy.
Bảng 2.1: Thành phần của bã men bia (%) [5]
Nước

75,0

Chất chứa nitơ

14,0

Lipid

0,75

Chất hòa tan không chứa nitơ

8,25

Tro

2,0

Bảng 2.2: Thành phần chất khô của bã men bia (%) [5]
Protein ( Nx6,25)

51-58

Lipid

2,0-3,0

Glucide

9,0

Tro

8,1-9,1

Chất hòa tan không chứa nitơ

25-30

Nhiệt lượng tính bằng cal/g

4560-4840

Men bia có phức hợp có chứa rất nhiều vitamine nhóm B, vitamine E,
vitamine H, acid panthonic, acid nicotinic (vitamine PP), biotin, inozit...
Ngoài ra, trong men bia còn chứa glutathione điều chỉnh qua trình oxi hóa và
khử hàng loạt các chất khác giúp cho việc bình thường hóa việc trao đổi chất
trong cơ thể sống. Mặt khác nấm men bia giàu vitamin và glutathione hơn
nấm men bánh mì [20].
Protein và các chất chứa nitơ khác chiếm 50 - 70% vật chất khô và nấm
men bia, 90% tổng số nitơ nằm trong các protein, khoảng 10% tổng lượng
nitơ có trong bia là các amino acid (lysine, tyrosine). Trong tro của nấm men


5

bia chứa khoảng 50% H3PO4, 30% K, còn lại là Ca, Mg và các chất khác. Mặt
khác, trong chất hữu cơ của tế bào nấm men bia thì protein có giá trị nhất.
Tính chất của protein nấm men bia gần giống như protein nguồn gốc
động vật. Protein của nấm men bia chứa khoảng 20 acid amin, trong đó có
đầy đủ các acid amin thiết yếu.
2.2. Tổng quan về peptide có hoạt tính chống oxi hóa
2.2.1. Khái niệm peptide
Peptide là những protein thường có cấu trúc đoạn ngắn khoảng từ hai
đến vài chục amino acid nối với nhau, có khối lượng phân tử thường dưới
6.000 Dalton. Chúng có thể được tổng hợp trong tự nhiên hoặc được hình

thành do thủy phân protein. Mặc dù có cấu trúc nhỏ nhưng nhiều peptide có
vai trò khá quan trọng trong hoạt động trao đổi chất của cơ thể.
2.2.2. Quá trình tạo thành liên kết peptide
Liên kết peptide (-CO-NH-) được tạo thành do phản ứng kết hợp giữa
nhóm α-cacboxil của một amino acid này với nhóm α-amino của một amino
acid khác, loại đi một phân tử nước (phản ứng ngưng tụ) [1]. Khi thủy phân
đến cùng các peptide thì thu được hỗn hợp có từ 2 đến 50 phân tử α-amino
acid. Vậy peptide là những hợp chất chứa từ 2 đến 50 gốc α-amino acid liên
kết với nhau bằng các liên kết peptide. Peptide có vai trò quan trọng trong sự
sống: Một số peptide là hoocmon điều hòa nội tiết, một số peptide là kháng
sinh của vi sinh vật, peptide là cơ sở tạo nên protein.

Hình 2.2: Sự tạo thành liên kết peptide
2.2.3. Cách gọi tên và phân loại peptide
Căn cứ vào số amino acid trong peptide để gọi tên của peptide và cách
gọi tên các peptide theo gốc amino acid bằng cách đọc tên amino acid đầu


6

tiên lần lượt đến amino acid cuối cùng. Trừ amino acid cuối cùng còn tất cả
đuôi của các amino acid đều bị thay đổi bằng đuôi -yl [1].

Hình 2.3: Cấu trúc của pentanpeptide seryl-glycyl-tyrosyl-alanyl-neucine
Người ta cũng có thể dùng ký hiệu viết tắt 3 chữ hoặc 1 chữ theo thứ tự
các amino acid để biểu thị thành phần và thứ tự các amino acid trong chuỗi ví
dụ pentapeptide ở trên (Hình 2.3), có thể viết Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu hoặc
SGYAL. Thông thường người ta viết amino acid đầu N tận cùng phía bên trái
và amino acid đầu C tận cùng phía bên phải và cũng có thể ghi rõ đầu nào của
chuỗi peptide là đầu N-tận cùng hay đầu C tận cùng và như vậy cũng

pentapeptide ở trên có thể viết H2N-Leu hay Leu-COOH. Trong trường hợp
có những amino acid ở đoạn nào trong chuỗi peptide chưa xác định được rõ
người ta có thể để các amino acid đó trong ngoặc chẳng hạn Ala-Ser-Gly(Ala, Leu, Val) [25].
2.2.4. Tính chất của peptide
Peptide có tính chất hóa lý không khác nhiều so với amino acid vì đều
chứa nhóm -NH2 và nhóm -COOH tự do. Sự sai khác chủ yếu là do bên R của
gốc amino acid tham gia trong chuỗi peptide. Chính sự khác nhau giữa các
mạch bên R, khác về số lượng và loại amino acid trong peptide làm cho điểm
đẳng điện, khối lượng cũng khác nhau.


7

Peptide tham gia các phản ứng đặc trưng của nhóm -NH2 và nhóm - COOH
Tính lưỡng tính
H2N-R-COOH + H+
H3N+-R-COOH
H2N-R-COO- + H2O
H2N-R-COOH + OHTạo phức chất với este
H2N-R-COOH + R’OH khí HCl bão hòa H2N-R-COO R’ + H2O
Sản phẩm tạo ra ở dạng muối, lấy sản phẩm cho tác dụng với
ammoniac để tái tạo nhóm chức amin (-NH2) [12].
Ngoài phản ứng của nhóm -NH2 và -COOH đầu tận cùng, các gốc R
của peptide cũng cho những phản ứng màu đặc trưng của các amino acid tự
do tương ứng. Một trong những phản ứng màu đặc trưng nhất cho liên kết
peptide đó là phản ứng biure, phản ứng này không xảy ra với amino acid tự
do. Trong môi trường kiềm mạnh, liên kết peptide phản ứng với CuSO4 tạo
thành phức chất màu tím đỏ và có khả năng hấp thụ cực đại ở bước sóng
540nm. Đây là phản ứng được sử dụng rộng rãi để định lượng protein.
Phương pháp xác định protein theo Lowry cũng dựa trên nguyên tắc của phản

ứng này bằng cách thêm thuốc thử Folin-Ciocalteau để làm tăng độ nhạy của
phản ứng sau khi đã thực hiện phản ứng biure, đồng thời dựa vào các gốc Tyr,
Trp nhờ thuốc thử đó để tạo phức màu xanh da trời.

Hình 2.4: Sự tạo phức màu xanh da trời đậm trong phản ứng Biure
2.2.5. Peptide có hoạt tính chống oxi hóa
Chất chống oxi hóa
Chất chống oxi hóa là một loại hóa chất giúp ngăn chặn hoặc làm chậm
quá trình oxi hóa chất khác. Chất chống oxi hóa ngăn quá trình phá hủy này


8

bằng cách khử đi các gốc tự do, kìm hãm sự oxi hóa bằng cách oxi hóa chính
chúng [25,25]. Để làm vậy người ta hay dùng các chất khử như: Thiol,
protease hay polyphenol làm chất chống oxi hóa.
Theo nguồn gốc tạo thành thì chất chống oxi hóa gồm hai nhóm chính:
• Chất chống oxi hóa tự nhiên:
Các chất béo không no trong mô sinh học tương đối bền. Nguyên nhân
là do trong mô sinh học có chứa các chất chống oxi hóa cũng như các enzyme
ngăn ngừa hiện tượng oxi hóa.
Acid ascorbic (vitamin C):
Vitamin C hay ascorbic acid là chất đinh dưỡng chủ yếu cho động vật bậc
cao và các loài khác. Sự hiện diện của ascrobate có vai trò quan trọng cho những
phản ứng trao đổi chất cho động vật, cây trồng và hoạt động bên trong của cơ thể
con người. Nó được biết đến như vitamin mà sự thiếu hụt của nó là nguyên nhân
gây ra bệnh scorbus (do thiếu vitamin C trong cuộc sống hàng ngày).
Vitamin C có hoạt chất chống oxi hóa khi nó làm giảm oxi hóa chất
như hydrogen peroxyde. Ngoài ra, nó cũng sẽ làm giảm các ion kim loại tạo
ra các gốc tự do thông qua các phản ứng Fenton [21].

2Fe3+ + ascorbate
2Fe2+ + Dehydroascorbate
2Fe2+ 2H2O2
2Fe3+ + 2OH. + 2OH-

Hình 2.5: Cấu trúc vitamin C
Tocopherol (vitamin E):
Vitamin E là tên gọi chung cho một bộ tám tocopherols liên quan và
tocotrienols, đó là vitamin tan trong chất béo có tính chất chống oxi hóa.


9

Trong đó, hình thức δ-tocopherol là các chất chống oxi hóa quan trọng nhất
hòa tan trong chất béo, nó có khả năng bảo vệ màng tế bào khỏi quá trình oxi
hóa bằng cách phản ứng với các gốc lipid được sản sinh trong phản ứng dây
truyền. Từ đó, loại bỏ các gốc tự do trung gian và ngăn ngừa các phản ứng lan
truyền diễn ra liên tục.
Vitamin E được tách ra trong quá trình tinh luyện dầu. Vitamin E có
nhiều trong dầu đậu nành, ngũ cốc…

Hình 2.6: Cấu trúc vitamin E
Một số chất chống oxi tự nhiên khác:
- Carotenoids: Cũng thể hiện hoạt tính chống oxi hóa. Trong đó, βcaroten thể hiện hoạt tính chống oxi hóa mạnh nhất.
- Flavanone và flavonol là chất có hoạt tính chống oxi hóa cao có thể
tìm thấy trong thực vật như trong lá trà xanh, dược thảo, gỗ…
- Vanilin ngoài có vai trò tạo mùi, nó cũng đóng vai trò là chất chống
oxi hóa [21].
• Chất chống oxi hóa tổng hợp:
Các chất chống oxi hóa tổng hợp phải thỏa mãn những yêu cầu sau:

Không độc
Có hoạt tính chống oxi hóa cao ở nồng độ thấp
Có thể tập trung được trên bề mặt pha dầu
Bên trong các điều kiện kỹ thuật của quá trình chế biến thực phẩm.


10

Các chất chống oxi hóa tổng hợp thường được sử dụng là: BHT (Butylated
hydroxytoluen), BHA (Butylate hydroxyanisole), TBHQ (Tertbutyl hydroquinone),
tocopherol tổng hợp, dodecyl gallate, propyl gallate, ascorbyl palmitate,…
BHT (Butylated hydroxytoluen)
Còn được gọi là 3,5-di-tert-butyl-4-hydroxytoluen; methyl-ditertbutyphenol; 2,6-di-tert-butyl-para-cresol. BHT được tạo thành phản ứng
của p-cresol (4-methylphenol) với isobutylen (2-methylpropene) xúc tác bởi
acid sulfuric.
Công thức phân tử: C15H24
Bột màu trắng
BHT ngăn ngừa oxi hóa chất béo. Nó được sử dụng để bảo quản thực
phẩm có mùi, màu sắc và hương vị. Nhiều vật liệu đóng gói kết hợp BHT. Nó
cũng được bổ sung trực tiếp để rút ngắn ngũ cốc và các loại thực phẩm khác
có chứa chất béo và dầu.
BHA (Butylate hydroxyanisole)
BHA là hỗn hợp của các đồng phân 3-tert-butyl-4-hydroxyanisole và 2tert-butyl-4-hydroxyanisole.
Công thức phân tử: C11H16O2
Màu trắng hoặc hơi vàng
Mùi thơm đặc trưng
BHA thường được sử dụng để giữ chất béo khỏi bị ôi.
BHA được tìm thấy trong bơ, thịt, ngũ cốc, kẹo cao su, đồ nướng, thực
phẩm snack, khoai tây khử nước và bia. Nó cũng được tìm thấy trong thức ăn
động vật, bao bì thực phẩm, mỹ phẩm, sản phẩm cao su và các sản phẩm dầu khí.

BHT và BHA có gậy hại hay không?
Nghiên cứu cho thấy: Các tính chất hóa học làm cho BHA và BHT bảo quản
tốt thực phẩm và cũng có thể ảnh hưởng đến sức khỏe con người. Các đặc tính oxi
hóa hoặc chất chuyển hóa của BHA và BHT có thể góp phần vào việc gây ung thư.
Tuy nhiên các phản ứng tương tự có thể có tác dụng chống oxi hóa. Có
bằng chứng cho thấy nếu như cơ thể một người nào đó gặp khó khăn trong
chuyển hóa BHA và BHT, sẽ dẫn đến những thay đổi về sức khỏe và hành vi.


11

BHA và BHT cũng có thể kháng virus và kháng khuẩn. Một số nghiên
cứu đang được tiến hành liên quan đến việc sử dụng BHT trong điều trị
herpes simplex và AIDS.
TBHQ (Tertbutyl hydroquinone)
TBHQ là một chất chống oxi hóa được dùng rộng rãi trong thực phẩm,
mỹ phẩm, cao su, đặc biệt là trong bảo quản các loại dầu và chất béo. Nó còn
được sử dụng như một chất ổn định để hạn chế sự trùng hợp tự động của các
peroxyt hữu cơ.
TBHQ là một tinh thể rắn, màu trắng có mùi đặc trưng, không tan trong
nước nhưng hòa tan trong rượu và ete.
• Cơ chế hoạt động chống oxi hóa
Sự hình thành các gốc tự do
Các gốc tự do (OH, O2, NO,…) phát sinh dưới tác dụng của tia UV,
bức xạ ion hóa, ô nhiễm không khí, hút thuốc, trao đổi chất, sự cháy, căng
thẳng,… Các gốc tự do là nguyên nhân gây tổn thương tế bào, protein, acid
nucleic, ADN… và dẫn tới các căn bệnh nguy hiểm như ung thư, lão hóa, tiểu
đường, tim mạch… Do đó, để tránh sự gây hại của các gốc tự do thì phải loại
bỏ chúng bằng cách sử dụng các chất chống oxi hóa bổ sung hay được sử
dụng như: Vitamin A, Vitamin C, Vitamin E, polyphenol,…

Sự chống oxi hóa
Sự khử gốc tự do của chất chống oxi hóa, trong đó các electron không
ghép đôi của gốc tự do sẽ được nhận electron của chất chống oxi hóa để tạo
thành các electron ghép đôi bền vững.
Có nhiều chỉ tiêu để đánh giá quá trình chống oxi hóa, trong đó mỗi chỉ
tiêu thể hiện một khía cạnh của hoạt động chống oxi hóa, như vậy nhiều chỉ
tiêu sẽ phản ánh một quá trình chống oxi hóa tổng thể.
• Một số chỉ tiêu thường được sử dụng để đánh giá quá trình chống
oxi hóa như sau:
Hoạt động quét gốc tự do DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)
Cơ chế của hoạt động quét gốc tự do DPPH là sự ghép đôi hydro và
đình chỉ quá trình oxi hóa bằng sự chuyển các gốc tự do sang trạng thái ổn


12

định hơn. Như vậy, khi có mặt của chất chống oxi hóa nó sẽ khử gốc tự do
DPPH và làm cho dung dịch bị giảm màu sắc, do đó độ hấp thụ của dung dịch
sẽ giảm đi [25].
Z. + AH = ZH + A.(1)
Trong đó: Z.: là gốc tự do DPPH
AH: là chất chống oxi hóa
Hoạt động khử ion Fe3+
Cơ chế của hoạt động khử ion Fe3+ là sự ghép đôi electron và đình chỉ
phản ứng oxi hóa dây chuyền bằng sự khử dạng oxi hóa thành dạng tự do.
Nguồn gốc chính của gốc tự do hydroxyl là phản ứng Haber-Weiss, trong đó
gốc tự do superoxide khử Fe3+ thành Fe2+, sau đó nó xúc tác cho phản ứng
Fenton giữa Fe2+ và H2O2. Như vậy, khi có mặt của chất chống oxi hóa nó sẽ
khử gốc tự do superoxide nên hạn chế sự khử Fe3+ thành Fe2+ và làm cho dung
dịch giữ màu sắc, do đó độ hấp thụ của dung dịch sẽ tăng lên [25].

O 2- + Fe3+ = O2 + Fe2+ (2)
Fe2+ + H2O2 = Fe3+ + OH- + OH (3)
Hoạt động quét gốc H2O2
Hydroperocid có thể làm tăng sự hình thành gốc tự do hydroxyl trong
tế bào và gây độc. Nguồn gốc của gốc tự do hydroxyl là phản ứng Fenton
giữa Fe2+ và H2O2 [25].
Fe2+ + H2O2 = Fe3+ + OH- + OH (4)
Hoạt động chuyển ion Fe2+
Nguồn gốc của các gốc tự do hydroxyl là phản ứng Fenton giữa Fe2+ và
H2O2. Như vậy, khi có mặt của chất chống oxi hóa sẽ hạn chế sự chuyển Fe2+
thành Fe3+ nên màu của dung dịch phản ứng sẽ nhạt hơn, do đó độ hấp thụ sẽ
giảm đi [25].
Fe2+ + H2O2 = Fe3+ + OH- + OH (5)
• Ứng dụng của chất chống oxi hóa
Chất chống oxi hóa là chất dinh dưỡng có tác dụng giảm tác hại của oxi
hóa (các gốc tự do) trên các tế bào cơ thể. Như chúng ta đều biết, các tế bào
cơ thể cần cung cấp oxi cho sự tăng trưởng và năng lượng. Các tế bào cơ thể


13

sử dụng oxi để tạo ra năng lượng, duy trì sự sống và các gốc tự do được hình
thành như một sản phẩm phụ. Chất chống oxi hóa sẽ loại bỏ các gốc tự do để
ngăn ngừa bệnh tật trong cơ thể và giúp tăng tuổi thọ cho con người.
Trong lĩnh vực sức khỏe hiện nay, người ta nói đến nhiều tác hại của
chất chống oxi hóa, phản ứng oxi hóa và nhấn mạnh sự cần thiết sử dụng chất
chống oxi hóa để bảo vệ, duy trì sức khỏe. Chất chống oxi hóa được tìm thấy
nhiều trong các loại trái cây và rau quả, thảo dược, trứng sữa… Nhiều nghiên
cứu đã chứng minh lợi ích của chúng đối với sức khỏe trên nhiều mặt.
• Một số chất chống oxi hóa điển hình

Flavonoid: Các chất chống oxi hóa này đóng một vai trò quan trọng
trong việc tăng cường sức khỏe tâm thần khi có tuổi tác. Hoa quả và trái cây
có múi như cam là một nguồn phong phú của chất flavonoid.
Isoflavone: Chất chống oxi hóa này có tác dụng đáng kể trong việc
ngăn chặn các bệnh, nó có nhiều trong đậu nành. Isoflavone không chỉ làm
giảm đáng kể nguy cơ ung thư dài hạn mà còn giúp giảm bớt các triệu chứng
mãn kinh và cải thiện sức khỏe của xương.
Kẽm: Khả năng chống oxi hóa của khoáng chất này là rất cao. Các
thuộc tính chống oxi hóa của kẽm có thể bảo vệ cơ thể con người khỏi sự rối
loạn thần kinh. Sản phẩm từ sữa như phô mai và sữa là nguồn cung cấp kẽm
rất phong phú.
Coenzyme Q10: Đây là một trong những chất chống oxi hóa được
sản xuất trong cơ thể. Coenzyme Q10 là cần thiết cho hoạt động bình
thường của các tế bào. Tuy nhiên, tùy theo độ tuổi, mức độ Coenzyme Q10
có thể thay đổi đáng kể. Bạn có thể bù đắp sự mất mát này bằng cách ăn
thực phẩm có chứa Coenzyme Q10 như thịt cừu, cá... Chất chống oxi hóa
này còn có thể thúc đẩy nướu răng khỏe mạnh và tăng cường sức khỏe của
hệ thống tim mạch.
Melatonin: Đây là một trong những chất chống oxi hóa quan trọng nhất
và được tổng hợp bởi cơ thể của chúng ta. Melatonin giúp duy trì giấc ngủ bình
thường vì có tác dụng trong việc sản xuất melatonin. Mặc dù chất chống oxi hóa
này hiện diện trong rau quả, nó là chủ yếu được tìm thấy trong cà chua.


14

Các chất như: Catechin, acid citric, acid phytic, lutein, acid oxalic,
epigallocatechin gallate, ginkgo biloba, glutathione, alpha carotone và
zexathin cũng có trong danh sách các chất chống oxi hóa.
• Peptide có hoạt tính chống oxi hóa

Gốc tự do (chất oxi hóa) luôn luôn được sinh ra trong cơ thể con người
và cũng có vai trò tích cực đối với cơ thể (có thể nói ta không thể sống được
nếu cơ thể hoàn toàn thiếu vắng gốc tự do). Oxi (dưỡng khí) mà ta hít thở
hàng ngày là chất rắn cần thiết nhưng chính nó cũng trở thành gốc tự do (khi
đó gọi là oxi nguyên tử).
Hiện tượng thực bào (là hiện tượng vi khuẩn, virus bị tế bào bạch cầu
tiêu diệt trong cơ thể), hiện tượng hô hấp trong tế bào, hoặc cơ chế giải độc ở
gan đều là các hoạt động làm sinh ra gốc tự do.
Điều quan trọng là trong cơ thể khỏe mạnh, gốc tự do sinh ra có giới hạn,
không quá thừa để gây hại. Do đó bên cạnh các gốc tự do luôn có hệ thống các
chất chống oxi hóa “nội sinh” (tức có sẵn trong cơ thể) cân bằng lại, vô hiệu hóa
các gốc tự do có hại. Hệ thống các chất chống oxi hóa này gồm các enzyme như:
glutathione peroxidase, superroxide dismutase… đặc biệt là vitamin C, vitamin
B, tiền vitamin A, khoáng chất selen “nội sinh” có sẵn trong cơ thể, xúc tác các
phản ứng khử để vô hiệu hóa các gốc tự do (còn gọi là “bẫy” gốc tự do) giúp cơ
thể khỏe mạnh.
Chỉ khi nào gốc tự do sinh ra quá nhiều (do ô nhiễm môi trường, do tia
cực tím từ ánh nắng, do khói thuốc lá, do viêm nhiễm trong cơ thể, thậm chí
do dùng một số dược phẩm…) và hệ thống chất chống oxi hóa nội sinh không
đủ sức cân bằng, cơ thể sẽ sinh ra rối loạn bệnh lý. Người ta đã chứng minh,
khi có sự tăng quá nhiều gốc tự do sẽ gây ra tình trạng viêm nhiễm ở các cơ
quan, các bệnh lý như tim mạch, bệnh thần kinh, đục thủy tinh thể, thoái hóa
hoàng điểm ở mắt, tăng nguy cơ các bệnh ung thư và nhất là sớm xuất hiện
hiện tượng lão hóa [27].
Các tế bào mau già đi, đến thời điểm diệt vong. Cơ quan dễ bị lão hóa
nhất chính là lớp da bảo vệ cơ thể, là nơi dễ bị tác động của tia cực tím của
ánh nắng, hứng chịu tác hại của ô nhiễm môi trường cộng thêm lối sống của


15

người thường xuyên bị stress, sai lầm trong dinh dưỡng, thói quen lạm dụng
độc chất như: hút thuốc, uống rượu, kể cả dược phẩm… làm da mịn màng của
người phụ nữ nhất là da mặt sẽ nhanh chóng nhăn, cằn cỗi, không còn sức
sống tươi mát do có sự bội tăng gốc tự do gây lão hóa.
Để chống lại sự bội tăng các gốc tự do sinh ra quá nhiều mà hệ thống “chất
chống oxi hóa nội sinh” không đủ sức cân bằng để vô hiệu hóa, các nhà khoa học
đặt vấn đề dùng các “chất chống oxi hóa ngoại sinh” với mục đích phòng bệnh,
nâng cao sức khỏe, chống lão hóa. Các chất chống oxi hóa ngoại sinh đó đã được
xác định, đó là beta-caroten, chất khoáng selen, các hợp chất flavonoid,
polyphenol, peptide…
Một số peptide có hoạt tính chống oxi hóa có khả năng ức chế quá trình oxi
hóa diễn ra trong cơ thể sống và chống quá trình hình thành các gốc tự do làm giảm
chất lượng của thực phẩm và thời gian bảo quản. Chúng có nhiều trong các loại
thực phẩm như: Sữa, đậu tương, cám gạo, kiều mạch, protein lòng trắng trứng,
protein trong một số loài thủy hải sản… Một số các tác giả đã nhận thấy rằng các
peptide chống oxi hóa thường chứa các amino acid tryptopan, lysine.
Peptide chống oxi hóa có thể được tách ra từ enzyme thủy phân protease
trứng, sữa của Aleixandre và cộng sự (2008); Davalos và cộng sự (2004); Huang
(2010)…và nhiều công trình được công bố về peptide có khả năng chống oxi hóa từ
các nguồn protein của đậu tương, lòng trắng trứng gà như: Chen HM và cộng sự
(1996) thu được từ protein đậu tương; Miguel và cộng sự (2006) từ lòng trắng
trứng, Zhipeng và cộng sự (2011) đã thu được peptide từ protein của lòng trắng
trứng gà (Arg-Val-Pro-Ser-Leu) có hoạt tính chống oxi hóa [27].
2.3. Tổng quan về protease
2.3.1. Giới thiệu chung
Protease là enzyme thủy phân các liên kết peptide trong phân tử protein
giải phóng các acid amin, peptone hoặc ditripepton. Nhóm enzyme protease
(peptide-hidrolase) xúc tác trong quá trình thủy phân liên kết peptide (-CONH)n trong phân tử protein, polypeptide đến sản phẩm cuối cùng là các acid
amin. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thủy phân liên kết este và

vận chuyển acid amin [8].


16

Hình 2.7: Cấu trúc trung tâm hoạt động (TTHĐ) của protease [8]
Trong TTHĐ của protease vi sinh vật ngoài gốc acid amin đặc trưng
cho từng nhóm còn có một số gốc acid amin khác. Các kết quả nghiên cứu
chung về TTHĐ của một số protease vi sinh vật cho phép rút ra một số nhận
xét chung như sau:
TTHĐ của protease đủ lớn và bao gồm một số gốc acid amin và trong
một số trường hợp còn có cả cofacto kim loại.
Các protease kim loại có TTHĐ lớn hơn vào khoảng 210A, có thể phân
biệt thành sáu phần dưới TTHĐ (subsite), mỗi phần dưới TTHĐ tương ứng
với mỗi gốc acid amin trong phân tử cơ chất.
Đối với các protease acid, theo nhiều nghiên cứu cấu trúc TTHĐ của
các tinh thể protease acid này của Phizopuz chinenis và Endothia parasilica
đã cho thấy phân tử các protease này gồm có hạt, giữa chúng có khe hỏ vào
khoảng 200A. Khe hở này là phần xúc tác của các enzyme, các gốc Asp-35 và
Asp-215 xếp đối diện nhau trong khe ấy [3].
Đối với các protease không chứa cysteine, TTHĐ của chúng có tính mềm
dẻo hơn vì cấu trúc không gian của chúng không được giữ vững bởi các cầu
disulphide.