Báo cáo thực hành công nghệ vi sinh

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA DƯỢC
BỘ MÔN VI SINH – KÝ SINH

BÁO CÁO THỰC HÀNH

CÔNG NGHỆ
VI SINH
Lớp: DCQ2011

Niên khóa: 2013 - 2014


Báo cáo thực hành: Công nghệ vi sinh

2


Báo cáo thực hành: Công nghệ vi sinh

3


Báo cáo thực hành: Công nghệ vi sinh

BÀI 1: CHỌN LỌC GIỐNG VI SINH VẬT
1. Phát hiện vi sinh vật có tiềm năng:
 Amylase
Chủng
Mô tả khóm
1

Bề mặt phẳng, khô, bìa gợn sóng, màu trắng
đục. Đường kính 5-7mm.
2
Bề mặt lồi, khô, bìa nguyên, màu trắng đục.
Đường kính 0.5-1.5mm
3
Bề mặt mặt phẳng, khô, bìa răng cưa, màu
trắng đục. Đường kính 7-9mm.
 Protease
Chủng
Mô tả khóm
1
Khóm tròn, bìa nguyên, có tâm, màu vàng.
Đường kính 3-5mm.
2
Khóm đa giác, bìa răng cưa, không có tâm,
màu vàng. Đường kính 6-8mm.

Đường kính vòng sáng
Có vòng sáng, đường kính
13-17mm.
Không có vòng sáng
Có vòng sáng, đường kính
14-18mm.
Đường kính vòng sáng
Có vòng sáng, đường kính
5-6mm.
Có vòng sáng, đường kính
7-10mm.

 Kháng sinh
Chủng kiểm tra

B1

B2

B3

B4

S.aureus

+

+

+

+

E.coli

+

+

-

+

Chủng thử nghiệm

2.Trả lời câu hỏi:
Kể tên và nêu nguyên tắc của một số phương pháp phát hiện các đặt tính mong muốn trong thực
nghiệm?
 Amylase ngoại bào
- Phân tán vi sinh vật vào đệm, pha loãng dịch huyền phù vi sinh vật gấp 10 lần, trải lên môi trường,
ủ ở nhiệt độ thích hợp.
- Phát hiện: thuốc thử Lugol. Tráng bề mặt môi trường với một ít dung dịch Lugol khi đó nền môi
trường sẽ có màu tím than do màu của iod với tinh bột.
Nếu chủng vi sinh vật có tính Amylase ngoại bào thì xung quanh chỗ vi sinh vật mọc sẽ có vùng
sáng vì khi đó tinh bột bị thủy phân nên không tạo màu với iod. Đường kính của vòng sáng phân giải
tinh bột tỉ lệ với hoạt tính.

4


Báo cáo thực hành: Công nghệ vi sinh
 Protease ngoại bào
- Phân tán vi sinh vật vào đệm, pha loãng dịch huyền phù vi sinh vật gấp 10 lần, trải lên môi trường,
ủ ở nhiệt độ thích hợp.
- Phát hiện: thuốc thử TCA 50%. Tráng lên môi trường một ít TCA 50% khi đó môi trường sẽ đục ví
gelaatin bị kết tủa. Nếu chủng vi sinh vật sinh ra Protease ngoại bào thì xung quanh chỗ vi sinh vật
mọc sẽ có vùng sáng do gelatin bị thủy phân nên không bị tủa. Đường kính của vòng phân giải tỉ lệ
với hoạt tính.
 Kháng sinh
- Nguyên tắc: phát hiện vi sinh vật kháng sinh dựa vào khả năng ức chế sự tăng trưởng của nó với
các vi sinh vật khác.
- Phương pháp: vạch thẳng vuông góc, khuếch tán.

5


Báo cáo thực hành: Công nghệ vi sinh

BÀI 2: SINH KHỐI VI SINH VẬT
1.

Định lượng sinh khối:
a. Phương pháp đếm sống:
 Số liệu
Nhiệt độ

Môi trường
TSB

TSB+khoáng

Lắc
0

Tĩnh
0

Lắc

0

0

0

Tĩnh
0

0

30 C
37 C
30 C
37 C
30 C
37 C
30 C
370C
Ống 3
>200
>200
<20
>200
>200
>200
>200
>200
Ống 4
>200
>200
<20
105

>200
151
>200
190
Ống 5
59
109
<20
39
192
5
>200
1
 Công thức tính
- Chọn hộp có khoảng 30-200 khóm.
- Số tế bào/ml: A=số khóm x 10số thứ tự hộp+1
 Bảng kết quả
Môi trường
Nhiệt độ
TSB
TSB+khoáng
Lắc
Tĩnh
Lắc
Tĩnh
0
0
0
0
0

0
0
30 C
37 C
30 C
37 C
30 C
37 C
30 C
370C
6
6
4
5
6
5
6
Số tế bào/ml 59.10
109.10 <20.10 105.10 192.10 151.10 >200.10
190.105
Nhận xét:
- Số tế bào/ml cao nhất trong điều kiện nuôi cấy ở 300C, môi trường nuôi cấy có khoáng, lắc.
- Số tế bào/ml thấp nhất trong điều kiện nuôi cấy ở 300C, môi trường nuôi cấy không khoáng, tĩnh.
b. Phương pháp đo quang:
 Công thức:
Số tế bào/ml = OD600nm x 0.8 x 109
Môi trường
Nhiệt độ
TSB
TSB+khoáng

Lắc
Tĩnh
Lắc
Tĩnh
0
0
0
0
0
0
0
30 C
37 C
30 C
37 C
30 C
37 C
30 C
370C
Giá trị OD 0.466
0.361
0.367
0.364
0.348
0.322
0.367
0.381
8
8
8

8
8
8
8
Số tế bào/ml 3.73x10 2.89x10 2.94x10 2.91x10 2.78x10 2.58x10 2.94x10 3.05x108
Nhận xét:
- Số tế bào/ml cao nhất trong điều kiện nuôi cấy ở 300C, môi trường nuôi cấy không khoáng, lắc.
- Số tế bào/ml thấp nhất trong điều kiện nuôi cấy ở 370C, môi trường nuôi cấy có khoáng, lắc.
c. Nhận xét chung:
- Có sự khác nhau về số tế bào/ml khi thực hiện bằng 2 phương pháp đo quang và đếm sống.
- Kết quả số tế bào/ml của phương pháp đo quang luôn cao hơn phương pháp đếm sống.

6


Báo cáo thực hành: Công nghệ vi sinh

2. Trả lời câu hỏi:
So sánh 2 phương pháp xác định số lượng tế bào:
Phương pháp
Ưu điểm
Chính xác do xác định đúng số tế
bào sống.
Đếm sống

Đo quang

Thực hiện nhanh và tiện lợi.

7

Nhược điểm
Quá trình thực hiện phức tạp.
Cần thời gian và nhân công để nuôi cấy
vi khuẩn.
Mang tính thủ công và cảm quan khi
đếm số lượng khóm.
Không chính xác do độ đục có thể là do
xác tế bào chết.


Báo cáo thực hành: Công nghệ vi sinh

BÀI 4: TINH CHẾ ENZYME AMYLASE
BẰNG ALGINAT
1. Xây dựng đường chuẩn để xác định hoạt tính amylase:
Bảng 1.1. Mối quan hệ giữa hàm lượng tinh bột (mg) và mật độ quang (OD)
Ống

0

1

2

3

4

5

Tinh bột
(mg)

0

2

4

6

8

10

∆OD560nm

0.000

0.139

0.286

0.351

0.486

0.579

0

2

4

6

8

10

U/mL

Hình 1.1: Đường chuẩn hoạt độ Amylase
a.
Các thông số

quy trình tinh chế
 Tổng số protein (A
)
280nm
 Enzyme thô (pha loãng 10 lần)
- OD280=1.173
- Tổng thể tích thô: V1=15mL
- Tổng lượng protein thô:
A
= OD280 x V x Độ pha loãng = 1.173 x 15 x 10 = 175.95
280(1)
1

 Enzyme tinh chế (không pha loãng)
- OD280 = 0.665
- Tổng thể tích tinh chế: V2 = 35mL
8


Báo cáo thực hành: Công nghệ vi sinh
- Tổng lượng protein tinh chế:
A
= OD280 x V x Độ pha loãng = 0.665 x 35 x 1 = 23.28
280(2)
2
 Tổng hoạt tính (U)
Dựa vào phương trình hồi quy: y = 0.0572x + 0.0210 với y là ∆OD và x là hoạt độ của
amylase (U/ml)
 Enzyme thô (pha loãng 50 lần)
- OD
: 0.393 và OD
= 0.097  ∆OD = 0.296
chứng
thử
- Hoạt độ amylase thô: 4.808 U/ml
- Hoạt tính tổng của amylase thô (U ):
1
U = Hoạt độ x Độ pha loãng x V = 4.808 x 50 x 15 = 3606.00U
1
1
 Enzyme tinh chế.
- OD
= 0.572 và OD

= 0.231  ∆OD = 0.341
chứng
thử
- Hoạt độ enzyme sau tinh chế : 5.594 U/ml
- Hoạt tính tổng của amylase tinh chế (U ):
2
U = Hoạt độ x Độ pha loãng x V = 5.594 x 5 x 35 = 978.95U
2
2
 Hoạt tính chuyên biệt (U/A

)
280nm
 Của enzyme thô: U1/A280(1) = 3606/175.95 ≈ 20.49
 Của enzyme tinh chế: U2/A280(2) = 978.95/23.28 ≈ 42.05
 Hiệu suất tinh chế: U2/U1100 = (978.95/3606) × 100 = 27.15%
 Mức tinh chế: Hoạt tính chuyên biệt của Enzyme sau tinh chế/Hoạt tính chuyên biệt của Enzyme
thô = 42.05/20.49 = 2.052 lần
Thông số

A280

U

Hoạt tính
chuyên biệt

Dịch thô

175.95

3606.00

20.49

Enzyme sau
tinh chế

23.28

978.95

42.05

Hiệu suất (%)

 Nhận xét:
-

Hiệu suất tinh chế: 27.15%  Tương đối thấp

-

Hoạt tính chuyên biệt: + Của Enzyme thô: 20.49 Tốt
+ Của Enzyme sau tinh chế: 42.05  Tốt

-

Mức tinh chế: 2.096 lần  Tốt

9

Mức tinh chế


Báo cáo thực hành: Công nghệ vi sinh

b.

Vẽ quy trình tinh chế enzyme
Dịch Enzym thô
- Natri Alginat

- Calcium chlorid
- Lọc lấy tủa
Dịch tạp chất

- Phản hấp phụ
- Lọc lấy dịch

Alginat calci

- Cô đặc
- Thẩm tích

10


Phức
Tủa

Sản
Dịch
Enzym
Enzym
phẩm
Enzym
Alginat
Alginat
Amylase
tinhcalci
natri
Báo cáo thực hành: Công nghệ vi sinh

11


Báo cáo thực hành: Công nghệ vi sinh

BÀI 5: CỐ ĐỊNH CGTASE LÊN ALGINATE
1. Kết quả xác định hàm lượng protein trong chế phẩm CGTase và protein cố định:
a. Xây dựng đường chuẩn định lượng protein
Ống nghiệm

0

1

2

3

4

5

Nồng độ BSA
(µg/mL)

0

10

20

30

40

50

0.000

0.097

0.124

0.194

0.242

0.310

OD595 nm

Hình 1.1: Đường chuẩn định lượng protein theo phương pháp Bradford.
Phương trình hồi quy: y = 0.0059x + 0.0144 (y là ∆OD550 nm,x là nồng độ CD mg/mL) (1)

b. Tính hàm lượng protein trong chế phẩm CGTase:
- Pha loãng chế phẩm 50 lần. Lấy 0.1mL chế phẩm và 0.9mL thuốc thử Bradford, đo OD được giá
trị 0.177
- Dựa theo phương trình hồi quy (1):
Nồng độ protein trong mẫu thử = (∆OD595 nm - 0.0144)/0.0059 = 27.56 µg/mL

12


Báo cáo thực hành: Công nghệ vi sinh
- Hàm lượng protein trong 1mL enzyme = n*x*10-3 = 50*27.56*10-3 = 1.38mg
Với n là hệ số pha loãng, x: nồng độ protein có trong mẫu thử (µg/mL)
- Hàm lượng protein trong 2mL enzyme ban đầu = 1.38*2 = 2.76mg
∆OD595 nm

0.177

Nồng độ protein (µg/mL)

27.56

Hàm lượng protein (mg)

2.76

c. Tính hàm lượng protein cố định:
i) Phương pháp bắt giữ:
- Dịch lọc: ∆OD595 nm = 0.165. Theo phương trình hồi quy (1), nồng độ protein là 25.53µg/mL. Hàm
lượng protein dịch lọc = 25.53*Vlọc = 25.53*30 = 766µg
- Dịch rửa: ∆OD595 nm = 0.066. Theo phương trình hồi quy (1), nồng độ protein là 8.75µg/mL. Hàm
lượng protein dịch rửa = 8.75*Vlọc = 8.75*20 = 175µg
 Suy ra, hàm lượng protein không cố định: 766+175=941µg=0.941mg
 Hàm lượng protein cố định:
- mpr cố định = mpr ban đầu – mpr không cố định = 2.76 mg – 0.941mg = 1.819mg.
- Hiệu suất cố định protein:

Dịch lọc

Dịch rửa

∆OD595 nm

0.165

0.066

Nồng độ protein trong mẫu thử (µg/mL)

25.53

8.75

30

20

0.766

0.175

Thể tích (mL)
Hàm lượng protein (mg)
Tổng hàm lượng protein không cố định (mg)

0.941

Hàm lượng protein cố định (mg)

1.819

Hiệu suất cố định (%)

65.91

13


Báo cáo thực hành: Công nghệ vi sinh

ii) Phương pháp hấp phụ:
Dịch lọc

Dịch rửa

∆OD595 nm

0.384

0.127

Nồng độ protein trong mẫu thử(µg/mL)

62.64

19.08

20

20

1.253

0.382

Thể tích (mL)
Hàm lượng protein (mg)
Tổng hàm lượng protein không cố định (mg)

1.635

Hàm lượng protein cố định (mg)

1.125

Hiệu suất cố định (%)

40.76

 Nhận xét:
Hiệu suất cố định enzyme bằng phương pháp bắt giữ cao hơn phương pháp hấp phụ (65.82% so
với 40.73%). Tuy nhiên, nhìn chung, tỉ lệ lượng enzyme được cố định vẫn còn khá thấp, lượng
hao hụt thất thoát vẫn còn cao.
2. Kết quả xác định hoạt tính enzyme trong chế phẩm và hoạt tính enzyme cố định:
a. Xây dựng đường chuẩn cyclodextrin
Số thứ tự

1

2

3

4

5

6

Nồng độ CD (mg/mL)

0

2

4

6

8

1

∆OD550 nm

0

0.207

0.372

0.508

0.602

0.661

Hệ số góc (a)

0.066

14

Báo cáo thực hành: Công nghệ vi sinh

Hình 2.1: Đường chuẩn cyclodextrin
Phương trình hồi qui: y= 0.0661x (y là ∆OD550 nm, x là nồng độ CD mg/mL) (2)

b. Xác định hoạt tính CGTase
- Pha loãng 20 lần. Với ∆OD550 nm=0.49, theo phương trình (2), nồng độ CD là 7.42mg/mL.
- Hoạt tính CGTase trong mỗi mL dung dịch chế phẩm:
Với CD: nồng độ cyclodextrin trong mẫu đo (µg/mL)
n: hệ số pha loãng, M: khối lượng mol CD (M= 1135g/mol=1135 µg/µmol),
10: tỷ lệ enzyme phản ứng.

- Hoạt tính riêng của enzyme tự do:

∆OD550 nm

0.49

Hoạt tính của CGTase (U/mg protein)

63.15

15


Báo cáo thực hành: Công nghệ vi sinh

c. Xác định hoạt tính enzyme cố định:
i. Phương pháp bắt giữ:
- ∆OD550 nm=0.306. Theo phương trình hồi qui (2), nồng độ CD là 4.64 mg/ml. Lượng CD này

tương ứng với 300mg (10 hạt) gel bắt giữ enzyme. Mà tổng khối lượng các hạt gel là 10g.
- Hoạt tính riêng của enzyme cố định theo phương pháp bắt giữ:

- Tỉ lệ hoạt tính enzyme cố định so với enzyme tự do:

∆OD550 nm

0.306
4.99
7.9

Hoạt tính riêng (U/mg)
Tỉ lệ hoạt tính (%)

ii. Phương pháp hấp phụ:
- ∆OD550 nm=0.184. Theo phương trình hồi qui (2), nồng độ CD là 2.79 mg/ml. Lượng CD này
tương ứng với 750mg (25 hạt) gel bắt giữ enzyme. Mà tổng khối lượng các hạt gel là 10g.
∆OD550 nm

0.184
1.94
3.08

Hoạt tính riêng (U/mg)
Tỉ lệ hoạt tính (%)

 Nhận xét:
Tỉ lệ hoạt tính của enzyme cố định so với enzyme tự do thấp. Trong đó, enzyme cố định bằng
phương pháp hấp phụ có tỉ lệ hoạt tính rất thấp (3.08%). Enzyme cố định bằng phương pháp bắt
giữ giữ được hoạt tính cao hơn, nhưng không nhiều (7.9%)

16


Báo cáo thực hành: Công nghệ vi sinh

3. Câu hỏi:

1) So sánh hai phương pháp cố định:
Phương pháp bắt giữ
Trộn enzyme và alginate, cho hỗn
hợp này tạo hạt gel với CaCl2.

Tạo hạt gel bằng alginate và CaCl2,
cho hạt gel tiếp xúc với dung dịch
có enzyme.

Ủ 15 phút để quá trình bắt giữ xảy
ra. Lọc, rửa thu hạt gel.

Để 45 phút để quá trình hấp phụ
xảy ra. Lọc, rửa thu hạt gel.

Enzyme được cố định bên trong
hạt gel.

Enzyme được định vị trên bề mặt
hạt gel.

Cách thực hiện

Kiểu cố định

Phương pháp hấp phụ

Hiệu suất cố định
(thực nghiệm)

65.82%

40.73%

Tỉ lệ hoạt tính
(thực nghiệm)

7.9%

3.08%

2) Bàn luận về khả năng tái sử dụng enzyme cố định
Enzyme cố định có thể sử dụng nhiều lần với cùng một kiểu phản ứng, số lần phụ thuộc vào bản chấn enzyme,
bản chất chất mang, kiểu phản ứng và kiểu cố định cụ thể của enzyme. Quá trình bảo quản dễ dàng hơn so với
enzyme tự do. Việc tách enzyme ra khỏi các thành phần cơ chất, sản phẩm để thu hồi sẽ tiện lợi hơn khi có thể
dựa vào đặc điểm của chất mang để thực hiện.
Tuy nhiên, hoạt tính của enzyme có thể bị ảnh hưởng do sự thay đổi trong cấu trúc enzyme khi tạo liên kết với
chất mang cũng như cản trở về không gian khi có mặt chất mang.

17

Báo cáo thực hành: Công nghệ vi sinh

BÀI 9: TINH CHẾ PROTEIN BẰNG SẮC KÍ ÁI LỰC
1. Mô tả các hiện tượng xảy ra khi thực hiện phá hủy tế bào:
Ly tâm môi trường nuôi cấy E.coli thu được cắn, đổ bỏ phần nước. Phân tán cắn
tế bào trong đệm bằng voxtex, ta được dịch đục, không đồng nhất và có độ nhớt
cao. Tán siêu âm để thu dịch đồng nhất và không nhớt chứa các đoạn peptid, chú
ý khi siêu âm có thể gia nhiệt nên cần chia nhiều lần, giữ nhiệt độ lạnh. Để loại
sạch tạp cần ly tâm để thu dịch chứa các đoạn peptid đích có độ dài trung bình
hòa tan trong phần dịch nổi.
1.

Xây dựng đường chuẩn định lượng protein:

Ống nghiệm

0

1

2

3

4

5

Nồng độ BSA
(µg/mL)

0

10

20

30

40

50

0.000

0.097

0.124

0.194

0.242

0.310

∆OD595 nm

Hình: Đường chuẩn định lượng protein theo phương pháp Bradford.
Phương trình hồi quy: y = 0.0059x + 0.0144 (y là ∆OD550 nm, x là nồng độ CD mg/mL)
18

Báo cáo thực hành: Công nghệ vi sinh
2. Mẫu thử Protein:
Mẫu

A

B1

B2

C

D1

D2

D3

D4

Thể tích
(mL)

2.00

1.75

2.50

1.50

0.80

1.00

1.00

0.90

OD595

0.478

0.773

0.364

0.824

0.271

0.169

0.087

0.067

Nồng độ

Protein
(µg/mL)

78.58

128.58

59.25

137.22

43.49

26.20

12.31

8.92

Hệ số pha
loãng

20

5

1

1

1

1

1

1

3143.2

1125.08

148.13

205.83

34.79

26.2

12.31

8.03

Lượng
(µg)
Hiệu suất
(%)

Mẫu gộp

73.30

HS = [(Mẫu gộp)/Mẫu A] x 100% = (73.33/3143.2) x 100% = 2.33%

(Loại ống D4 vì nằm ngoài khoảng tuyến tính)
 Nhận xét: Hiệu suất tinh chế chỉ có 2.33% là quá thấp.
 Giải thích:
- Do thao tác định lượng chưa chính xác gây hao hụt.
- Có thể do cột sắc kí chưa được hoạt hóa tốt, cột dùng nhiều lần nên hiệu suất bị kém đi.

19


Báo cáo thực hành: Công nghệ vi sinh
3. Vẽ sơ đồ quá trình tinh chế:
Cột rỗng

Dịch nuôi cấy E.coli

- Rửa sạch bằng nước cất vô trùng.
- Phân tán đều nhựa sắc kí

Cột chứa nhựa sắc kí

Cắn tế bào

- Thêm 2mL Ni-Sepharose, để yên 1h

Cột chứa nhựa sắc kí

(gắn Ni-Sepharose)

- Phân tán trong đệm chạy H 1X
- Tán siêu âm (giữ lạnh)
- Ly tâm 10.000rpm, 5 phút

Dịch A (nước nổi)

Hoạt hóa cột
- 0,5mL x 3 lần nước cất vô trùng
- 0,5mL x 5 lần đệm ion 1X.
- 0,5mL x 3 lần đệm chạy H 1X.

Cột đã hoạt hóa

- Ly tâm 10.000 rpm, 5 phút
- Thu lấy cắn tế bào.

Lấy 1,0mL nạp vào cột

Dịch B
- 0,5mL x 5 đệm chạy H 1X
- 0,5mL x 3 đệm rửa H 1X

Dịch C
- Từng 1mL đệm thôi H 1X

Dịch D

- 0,5mL x 5 đệm chạy H 1X

Cột đã cân bằng

20