Sắc ký cột lỏng HPLC

ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP
HCM
KHOA CNSH-TP-MT

TIỂU LUẬN

GVHD: ThS. Chu Thị Bích Phượng
Lớp 14DSH04
Thành viên nhóm:
Nguyễn Thanh Hiếu

1411100748

Nguyễn Thị Thu Thủy

1411100788

Trần Minh Nhi

1411100761

Lê Huỳnh Phương Trúc

1411100738

Nguyễn Minh Luân

1411100758

Trương Ngọc Phân

1411100733

Hồ Gia Mẫn

1411100598

Phan Thị Thanh Như

1411100621

Dương Đức Toàn

1411100779


Lê Minh Đức

1411100746


Phương pháp sắc ký lỏng hiệu nâng cao
(HPLC)
HPLC là chữ viết tắt 4 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phương
pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid
Chromatography), trước đây gọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp
(High Pressure Liquid Chromatography).
1. Khái niệm
- Sắc ký là một họ các kỹ thuật phân tích hóa lý dùng để tách, phân ly
các chất trong một hổn hợp dựa vào sự phân bố khác nhau của chúng
giữa pha động và pha tĩnh

- Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời năm 1967-1968
trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển.
HPLC là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và
pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu
phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang
đã được biến bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ. Phương
pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: có
độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó
bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt.
- Phạm vi ứng dụng của phương pháp HPLC rất rộng, như phân tích các
hợp chất thuốc trừ sâu, thuốc kháng sinh, các chất phụ gia thực phẩm
trong lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, môi trường…
2. Phân loại
Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, người
ta chia HPLC thành 4 loại:
•

Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn (adsorption/liquid
chromatography).


•

Sắc ký phân bố (partition chromatography).

•

Sắc ký ion (ion chromatography).

•

Sắc ký rây phân tử (size exclusion/gel permeation
chromatography).
-

Trong đó, sắc ký phân bố (SKPB) được ứng dụng nhiều nhất vì
có thể phân tích được những hợp chất từ không phân cực đến
những hợp chất rất phân cực, hợp chất ion có khối lượng phân
tử không quá lớn (<3000).
SKPB được chia thành hai loại dựa trên độ phân cực tương đối
giữa pha tĩnh và pha động: sắc ký pha thường – SKPT (normal
phase chromatography) và sắc ký pha đảo – SKPĐ (reversed
phase chromatography).
Trong SKPT, pha tĩnh sử dụng có độ phân cực cao hơn pha
động. Pha tĩnh loại này sẽ có ái lực với các hợp chất phân cực.
SKPT dùng để tách và phân tích các hợp chất có độ phân cực
cao với phân tử lượng không lớn lắm.
SKPĐ là thuật ngữ để chỉ một loại sắc ký trong đó pha tĩnh ít
phân cực hơn pha động. Phương pháp này dùng phân tích các
hợp chất từ không phân cực đến phân cực. Hầu hết các hợp chất
hữu cơ có mạch carbon dài (ít phân cực) rất thích hợp cho phân
tích bằng SKPĐ. Dung môi sử dụng trong SKPĐ là các dung
môi phân cực, trong đó dung môi nước đóng vai trò quan trọng
mà lại rẻ tiền. Do đó, SKPĐ được ứng dụng nhiều và phổ biến
hơn SKPT.

3. Cấu tạo của hệ thống máy HPLC
- Bơm cao áp : Bơm pha động vào cột tách ; Điều khiển tốc độ dòng , áp
suất của pha động.Bơm phải tạt được áp suất cao khỏang 250-600bar và
tạo dòng liên tục. Lưu lượng bơm từ 0.1 đến 10ml/phút.

- Bình chứa pha động : Máy HPLC thường có 4 đường dung môi vào
đầu bơm cao áp cho phép chúng ta sử dụng 4 bình chứa dung môi cùng
một lần để rửa giải theo tỉ lệ mong muốn và tổng tỉ lệ của 4 đường là
100%.Tuy nhiên, theo kinh nghiệm, ít khi sử dụng 4 đường dung môi
cùng một lúc mà thường sử dụng 2 hoặc 3 đường để cho hệ pha động
luôn được pha trộn đồng nhất hơn, hệ pha động đơn giản hơn giúp ổn
định quá trình rửa giải.
Lưu ý: Tất cả dung môi dùng cho HPLC đều phải là dung môi tinh khiết
sử dùng cho HPLC. Tất cả các hóa chất dùng để chuẩn bị mẫu và pha hệ
đệm đều phải là hóa chất tích khiết dùng cho phân tích.
- Van bơm mẫu : Bơm mẫu phân tích vào cột tách theo những lượng
mẫu nhất định.
- Cột tách : Cột chứa pha tĩnh ; yếu tố quyết định quá trình tách sắc
ký.Cột pha tĩnh thông thường làm bằng thép không rỉ, chiều dài cột thay
đổi từ 5-25cm đường kính trong 1-10mm, hạt nhồi cỡ 0.3-5µm,…Chất
nhồi cột phụ thuộc vào lọai cột và kiểu sắc ký.
- Đầu dò ( Detector ) : Thiết bị phát hiện chất phân tích ; Có nhiều loại
khác nhau tuỳ mục đích phân tích ( UV – VIS , Huỳnh Quang ,… )Có
một số cách phát hiện khi một chất đã đi qua cột. Một phương pháp phổ
biến là dễ dàng để giải thích sử dụng đầu dò tử ngoại. Nhiều hợp chất
hữu cơ hấp thụ ánh sáng tia cực tím bước sóng khác nhau. Nếu bạn có
một chùm ánh sáng tia cực tím chiếu sáng qua các dòng chất lỏng đi ra
khỏi cột, và một đầu dò tử ngoại ở phía đối diện của dòng, bạn có thể
đọc trực tiếp ánh sáng được hấp thụ. Lượng ánh sáng hấp thụ phụ thuộc
vào số lượng của một hợp chất đặc biệt đó đi qua chùm tia vào thời điểm
đó.
- Hệ thống ghi nhận và xử lý tín hiệu : Thu nhập và xử lý kết quả

4. Nguyên tắc
- HPLC được thực hiện dựa trên việc bơm để đẩy một lượng chất lỏng
dưới áp suất cao và hỗn hợp mẫu cần phân tích đi qua một cột được nhồi
đầy một loại chất hấp phụ và từ đó dẫn tới việc tách các thành phần của
mẫu. Chất hấp phụ – được nhồi trong cột, là các hạt rắn (như silica,
polymers) với kích thước từ 2 – 50 µm. Các thành phần trong hỗn hợp
mẫu được tách ra khỏi nhau nhờ vào mức độ tương tác khác nhau với
các hạt chất hấp phụ. Dòng chất lỏng dưới áp suất cao thường là hỗn hợp
của các dung môi (nước, acetonitrile và/hoặc methanol), được gọi là
“pha động”. Thành phần và nhiệt độ dung môi đóng vai trò chính trong
quá trình tách chất do tương tác xảy ra giữa các thành phần của mẫu và
chất hấp phụ. Về bản chất, các tương tác này là tương tác vật lý như
tương tác kị nước (phân tán), tương tác lưỡng cực và tương tác ion,
thông thường nhất là tổng hợp của tất cả các tương tác trên.
- HPLC ưu việt hơn so với phương pháp sắc ký lỏng cổ điển (áp suất
thấp) bởi vì áp suất hoạt động cao hơn nhiều (từ 50-400 bar) trong khi
kỹ thuật sắc ký cổ điển chỉ dựa trên lực hấp dẫn để đẩy pha động ra khỏi
cột. Do chỉ có một lượng nhỏ mẫu được tách trong phân tích HPLC, vì
vậy cột thông thường có đường kính khoảng 2.1 – 4.6 mm và độ dài
khoảng 30-250 mm . Ngoài ra, cột sắc ký được nhồi các hạt hấp phụ có
kích thước nhỏ hơn (kích thước trung bình từ 2-50 µm). Điều này cho
phép HPLC khả tách các hỗn hợp một cách hữu hiệu và trở hành một kỹ
thuật sắc ký phổ biến.
5. Pha tĩnh trong sắc ký pha đảo
Trong sắc ký phân bố nói chung, pha tĩnh là những hợp chất hữu cơ
được gắn lên chất mang rắn silica hoặc cấu thành từ silica theo hai kiểu:
•

Pha tĩnh được giữ lại trên chất mang rắn bằng cơ chế hấp phụ vật

lý → sắc ký lỏng-lỏng (liquid-liquid chromatography).


•

Pha tĩnh liên kết hóa học với chất nền → sắc ký pha liên kết
(bonded phase chromatography)
Trong quá trình sử dụng, người ta nhận thấy sắc ký pha liên kết có
nhiều ưu điểm hơn sắc ký pha lỏng-lỏng vì một số nguyên nhân
sau:
o

o

Pha tĩnh trong hệ sắc ký lỏng-lỏng dễ bị hòa tan bởi pha động
nên dễ bị mất mát pha tĩnh trong thời gian sử dụng và gây
nhiễm đối với hợp chất phân tích.
Do pha tĩnh của sắc ký lỏng-lỏng dễ tan trong pha động nên
người ta không thể ứng dụng phương pháp rửa giải gradient
dung môi.

Vì vậy, người ta thường chỉ quan tâm đến loại sắc ký phân bố pha liên
kết và phần lớn các loại cột sử dụng hiện nay trong sắc ký phân bố đều
có cấu trúc dạng này.
Bề mặt các hạt silica – SiO2 (các hạt này có đường kính 3, 5 hoặc 10
µm) được xử lý (thủy phân) bằng cách đun nóng với HCl 0,1M trong
một hoặc hai ngày để tạo ra những nhóm SiOH như sau (thông thường
chỉ có khoảng 8 µmol SiOH/m2 bề mặt):

Hình 1. Bề mặt silica đã thủy phân

Sau đó bề mặt silica đã thủy phân này sẽ được cho phản ứng với các
organochlorosilan để tạo ra các pha tĩnh không phân cực, phân cực trung
bình hoặc rất phân cực tùy theo nhóm R gắn vào.


Hình 2: Tạo nhánh trên bề mặt silica
Thường chỉ khoảng 50% nhóm –OH mất H+ để tạo ra HCl (tức <
4µmol/m2 bề mặt bị silan hóa) vì sự kết hợp sẽ dần dần bị ảnh hưởng
bởi hiệu ứng lập thể. Ngoài nhóm Cl người ta còn sử dụng –OCH3.
Hợp chất cần phân tích khi đi qua pha tĩnh sẽ bị giữ lại bởi những lực
lượng tương tác khác nhau tùy thuộc tính chất, đặc điểm của chất tan và
pha tĩnh.
Trong SKPĐ, nhóm thế R trong hợp chất siloxan hầu như không phân
cực hoặc ít phân cực. Đó là các ankyl dây dài như C8 (n-octyl), C18 (noctadecyl) còn gọi là ODS (octadecylsilan) hoặc các nhóm alkyl ngắn
hơn như C2; ngoài ra còn có cyclohexyl, phenyl trong đó nhóm phenyl
có độ phân cực cao hơn nhóm alkyl. Người ta nhận thấy các alkyl dây
dài cho kết quả tách ổn định hơn các loại khác nên đây là loại được sử
dụng nhiều nhất.

Hình 3: Cấu trúc của cột ODS
Tuy nhiên do hiệu ứng lập thể nên trong cấu trúc của pha tĩnh còn nhóm
–OH chưa phản ứng, gây ảnh hưởng xấu đến quá trình tách sắc ký tùy
môi trường pH phân tích.
Trong môi trường quá acid (pH < 2) thì có sự phân ly các nhóm ether (O-Si-C18) ra khỏi nền. Lúc này cột sẽ mất hoạt tính dẫn đến chất cần
phân tích không còn tương tác tốt với pha tĩnh nữa.
Trong môi trường baz (pH > 7), chính nền silic mang pha tĩnh có thể bị
hòa tan (SiO2 thành silicat), hệ quả là N giảm và số nhánh ghép cũng
giảm, mũi rộng ra và thời gian lưu cũng có thể giảm. Kết quả phân tích

như vậy sẽ mất đi độ chính xác.
Một trong những cách khắc phục hiện tượng này là dùng các chất như
trimethylchlorosilan ClSi(CH3)3 hoặc hexamethyldisilazan (ít sử dụng
hơn) để tương tác với nhóm –OH này (gọi là hiện tượng end-capping).
Lúc này ta sẽ có loại cột ít tương tác với chất phân tích có tính baz (cột
LC-DB của hãng SUPELCO).

Hình 4. Cấu trúc cột LC-DB
Có một cách khác để loại trừ bớt ảnh hưởng của nhóm –OH mà không
cần tương tác với nó là thay những nhóm methyl của –Si(CH3)2-C18
bằng những nhóm thế lớn hơn như isopropyl để những nhóm này sẽ che
đi những nhóm –OH, cản trở tương tác của nhóm –OH với chất cần phân
tích.

Hình 5: Cấu trúc cột có gốc isopropyl
Người ta còn ghép lên dây C18 một số nhóm phân cực để tăng thêm độ
phân cực của dây C18, làm cột có khả năng tách chọn lọc hơn đối với
những hợp chất phân cực mạnh (cột EPS – Expended Polar Selectivity).


Ngoài sườn silica, thời gian gần đây người ta có sử dụng đến nền nhựa
polystyren (Polystyren Reversed Phase – PRP) cho phép phân tích trong
môi trường pH từ 1 – 13. Cột này dễ sử dụng trong môi trường acid và
baz mạnh.
6. Pha động trong sắc ký pha đảo
Pha động trong sắc ký lỏng nói chung phải đạt những yêu cầu sau:
•

Hòa tan mẫu phân tích.

•

Phù hợp với đầu dò.

•

Không hòa tan hay làm mòn pha tĩnh.

•

Có độ nhớt thấp để tránh áp suất dội lại cao.

•

Tinh khiết dùng cho sắc ký (HPLC grade).

Trong sắc ký pha đảo, dung môi pha động có độ phân cực cao. Trên lý
thuyết chúng ta có thể sử dụng khá nhiều dung môi nhưng kinh nghiệm
thực tế cho thấy methanol (MeOH), acetonitrile (ACN) và
tetrahydrofuran (THF) là đạt yêu cầu nhất. Nước là một dung môi được
cho vào các dung môi hữu cơ để giảm khả năng rửa giải.
Mỗi dung môi đều đặc trưng bởi các hằng số vật lý như chỉ số khúc xạ
(refractive index), độ nhớt (viscocity), nhiệt độ sôi (boiling point), độ
phân cực (polarity index), độ rửa giải (eluent strength)…
Trong đó độ phân cực và độ rửa giải có tác động lớn lên khả năng phân
tách của các mũi sắc ký.


Bảng 1: Tính chất của một số pha động trong sắc ký lỏng
Có ba thông số gây ảnh hưởng lớn đến tách các mũi sắc ký: số đĩa lý

thuyết N, hệ số dung lượng K’, độ chọn lọc α . Khi sự thay đổi thành
phần pha động không đem lại kết quả tách mũi theo yêu cầu thì chúng ta
phải thay đổi bản chất pha động (sử dụng dung môi khác), tức thay đổi
α. Đôi khi có thể phải thay đổi cả pha tĩnh.
Trong quá trình tách của SKPĐ, sự tương tác giữa hợp chất cần phân
tích và pha động phụ thuộc rất nhiều vào moment lưỡng cực, tính acid
(cho proton) hoặc tính baz (nhận proton) của dung môi.
Thông thường pha động trong SKPĐ bao gồm một hỗn hợp nước hoặc
dung dịch đệm với một hoặc nhiều dung môi hữu cơ phân cực tan được
trong nước. Nước là một dung môi rất phân cực nên nó không tương tác
với những nhóm alkyl không phân cực trong pha tĩnh, do đó nó được coi
như pha động yếu nhất và có tốc độ rửa giải chậm nhất trong tất cả các
dung môi động của SKPĐ.
Hỗn hợp nước và dung môi hữu cơ thường làm gia tăng độ nhớt dẫn đến
việc tăng áp suất cột.


Hình 6: Độ nhớt của hỗn hợp nước và dung môi hữu cơ ở 25oC
Việc lựa chọn dung môi và thành phần dung môi trong pha động được
tối ưu hóa cho những hợp chất cần phân tích. Thông thường, người ta sử
dụng hỗn hợp dung môi MeOH/nước trước, rồi ACN/nước hay
THF/nước. Với một hỗn hợp chất phân tích phức tạp thì sẽ có sự trộn lẫn
của các dung môi hữu cơ với nước. Khi lựa chọn thì phải chọn các hỗn
hợp MeOH, ACN và THF với nước có độ rửa giải tương đồng.
Thành phần pha động có thể cố định trong suốt quá trình chạy sắc ký
(chế độ isocratic) hoặc được thay đổi theo một chương trình đã định sẵn
(chương trình gradien dung môi) để có hiệu quả tách tốt hơn.
7. Một số đại lượng cơ bản trong phân tích sắc ký
7.1. Hệ số phân bố
Cân bằng của một cấu tử X trong hệ sắc ký có thể được mô tả bằng

phương trình như sau:

Hằng số cân bằng K cho cân bằng này được gọi là tỉ lệ phân bố hay hằng
số phân bố (partition coefficient) và được tính như sau:


Với CS : nồng độ cấu tử trong pha tĩnh.
CM : nồng độ cấu tử trong pha động.
Hệ số K tùy thuộc vào bản chất pha tĩnh, pha động và chất phân tích.
7.2. Thời gian lưu:
tR : thời gian lưu của một cấu tử từ khi vào cột đến khi tách ra ngồi cột.
tO : thời gian để cho chất nào đó không có ái lực với pha tĩnh đi qua cột;
đó cũng là thời gian pha động đi từ đầu cột đến cuối cột và còn gọi là
thời gian lưu chết.
tR' : thời gian lưu thật của một cấu tử.

Hình 7. Thời gian lưu của cấu tử phân tích
7.3. Hệ số dung lượng k’
k’ được định nghĩa theo công thức sau:


Với VS : thể tích pha tĩnh
VM : thể tích pha động
Nếu k’~ 0, tR~ tO: chất ra rất nhanh, cột không có khả năng giữ chất lại.
Nếu k’ càng lớn (tR càng lớn): chất ở trong cột càng lâu, thời gian phân
tích càng lâu, mũi có khả năng bị tù.
Khoảng k’ lý tưởng là 2-5, nhưng khi phân tích một hỗn hợp phức tạp,
k’ có thể chấp nhận trong khoảng rộng 1-20.
7.4. Hiệu năng
Hiệu năng hay số đĩa lý thuyết N của cột đặc trưng cho khả năng tách

mũi sắc ký của các cấu tử trên cột. N càng lớn, hiệu năng tách càng cao.
Số đĩa lý thuyết có thể đo trên sắc ký đồ. Người ta chứng minh được:

Hay

Với W1/2 là chiều rộng mũi sắc ký ở vị trí ½ chiều cao mũi (phút)
W là chiều rộng mũi sắc ký ở vị trí đáy mũi (phút)
7.5. Độ chọn lọc
Đặc trưng cho khả năng tách hai chất của cột.


7.6. Độ phân giải:
Đây là đại lượng biểu thị rõ cả ba khả năng của cột sắc ký: sự giải hấp,
sự chọn lọc và hiệu quả tách. Nó được xác định qua phương trình sau:

Hay

Với N được xác định từ phương trình (2.5) hoặc (2.6).
8. Ứng dụng sắc ký
- Tách các chất dẻo hóa.
- Tách các phenol.
- Tách các axit amin.
- Tách gluxit.
- Tách các phức chất.
- Ưng dụng sắc ký lỏng cao áp trong hóa học lâm sàn.
- Phương pháp tách dựa trên kích thước hình học phân tử.
- Tách các axit nucleic.


- Tách các dược phẩm.

- Tách các steroit.
- Tách các vitamin.
- Tách chất bảo vệ thực phẩm.
- Tách các chất bảo vệ thực vật: Hidrocacbon trong dầu mỏ, chất phụ gia
cho nhiên liệu, hợp chất sunfonat hữu cơ.
9. Ưu điểm sắc ký
- Có thể phân tích đồng thời nhiểu hợp chất.
- Không cần làm bay hơi mẫu.
- Độ phân giải cao nhờ quá trình tách trên cột.
- Độ nhạy cao nhờ đầu dò.
- Thể tích mẫu phân tích nhỏ.
