Luận văn thạc sĩ ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng tới quá trình tạo sản phẩm kombucha từ chè PT10

Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC sư PHẠM HÀ NỘI 2

BÙI THỊ THỦY

ẢNH HƯỞNG CỦẠ
MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG TỚI
QUÁ TRÌNH TẠO SẢN PHẨM KOMBUCHA TỪ
CHÈ PT10
Chuyên ngành : Sinh thái học
Mã số
: 60 42 01 20

LUẬN VĂN THẠC sĩ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Đinh Thị Kim Nhung


Trong quá trình tìm hiểu, nghiên cứu và hoàn thành luận văn tốt nghiệp,
tôi đã nhận được những lời chỉ bảo, hướng dẫn tận tình của các thầy cô giáo,
các anh chị em và các bạn. Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin bày
tỏ lòng biết ơn tới:
PGS. TS. Đinh Thị Kim Nhung - Người đã trực tiếp hướng dẫn, dạy bảo,
động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn cán bộ phòng Vi sinh trường ĐHSP Hà Nội 2
, Ban giám hiệu, Phòng sau đại học, các Phòng, Ban trường ĐHSP Hà Nội 2 đã
tạo các điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong quá trình làm việc.
Cùng với đó là sự biết ơn chân thành tới những người thân trong gia
đình, bạn bè đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài
này.
Hà Nội, tháng 8 năm 2015

Hoc viên

Bùi Thị Thủy


Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, dưới sự
hướng dẫn của PGS.TS Đinh Thị Kim Nhung. Luận văn này không có sự trùng
lặp với các đề tài khác.
Hà Nội, tháng 8 năm 2015
Hoc viên

Bùi Thị Thủy


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

CLCQ
MT

Chất lượng cảm
quan
Môi trường

Nxb

Nhà xuất bản

TCVN

2.2.2.8.

Tiêu chuẩn Việt
Nam
MỤC LỤC

Xác định hàm lượng chất khô hòa tan bằng phương pháp

3.2.1.
3.1. Xây dựng quy trình lên men kombucha quy mô phòng thí nghiệm.... 61


DANH MỤC CÁC HÌNH

DANH MỤC CÁC BẢNG
•

Bảng 3.15. Sự thay đổi độ chua, độ cồn sau 7 ngày lên men...........................59
Bảng 3.16. Sự thay đổi độ chua, độ cồn, điểm cảm quan theo thời gian
lên men..............................................................................................60


6

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Uống trà là một thú vui tao nhã, một nét văn hóa cổ truyền của người Á
Đông nói chung và người Việt Nam nói riêng. Ngày nay văn hóa uống trà cũng
có nhiều thay đổi với nhiều chủng loại trà khác nhau, mỗi hương vị lại có một
nét đặc trưng riêng. Trước đây đơn giản chỉ có trà xanh, ngày nay với sự phát
triển cao về chất lượng cuộc sống đã cho ra nhiều loại trà không những có

hương vị thơm từ các loại hoa mà nó còn có tác dụng cho sức khỏe. Hiện nay ở
nước ta đang xuất hiện một loại thuốc bổ ở dạng lỏng như trà mà mọi người gọi
là trà "thủy sâm" hay còn gọi là kombucha.Thực ra đây chính là một loại thức
uống có từ rất lâu được gọi tên là "The remedy for immortality" nghĩa là
"phương thuốc trường sinh". Thủy sâm thực sự chỉ là một loại giấm phát triển
dưới dạng một váng nhầy dày, dai và màu trắng. Loại giấm này sinh sôi nhanh
trong môi trường nước chè pha đường.
Khi các vi sinh vật được nuôi trong một môi trường trà dược, cung cấp
đủ nitrogen, vitamin và khoáng chất cùng những chất dinh dưỡng căn bản khác
như đường. Chúng phát triển và biến đổi đường thành gluconic acid, đồng thời
sản xuất ra một lượng nhỏ alcohol sau đó biến đổi thành acetic acid tạo cho trà
một vị ngọt và có mùi chua của rượu táo lên men [ 8]. Thành phẩm ‘trà’ sau
cùng chứa trung bình từ 0.5 đến 1% alcohol, acetic acid và một lượng nhỏ acid
như: lactic acid, malic acid, malonic acid, citric acid và oxalic acid và rât giàu
vitamin như: Bl, B2, B3, B6, B12, vitamin

c

và một so hợp chất có tác dụng

kháng sinh, sát trùng và giải độc. Ngoài ra trong môi trường lên men còn có thể
có hyaluronic acid, chondroitin-sulfate acid, mukoitin sulfate, heparin.
Ở Việt Nam, trên thị trường đã có bán các loại kombucha dưới dạng
đóng chai, đồ hộp, nước giải khát nhập khẩu từ nước ngoài. Trên thế giới, đã có


7

rất nhiều nghiên cứu về kombucha như: các nghiên cứu về thành phần các chất,
vitamin có trong kombucha; tác dụng của kombucha trong việc bảo vệ cơ thể

con người tránh các tác hại của hóa chất, tia phóng xạ. Tuy nhiên, ở Việt Nam
các công trình nghiên cứu về kombucha vẫn còn khá khiêm tốn, đặc biệt là về
khu hệ vi sinh vật, về ảnh hưởng của điều kiện môi trường đối với quá trình lên
men kombucha,đặc biệt chưa có nghiên cứu nào về giống chè PT10, chính vì
vậy tôi quyết định lựa chọn đề tài "Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng tới
quá trình tạo sản phẩm kombucha từ Chè PT10".
2. Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng cho quá trình lên
men tạo sản phẩm kombucha từ Chè PT10.
3. Nội dung nghiên cứu
3.1.

Phân lập, tuyển chọn chủng nấm men và vi khuẩn có khả nănglên

men kombucha từ Chè PT10.
3.2.

Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng tới quá trình lên men

kombucha
3.3.

Xây dựng quy trình lên men kombucha từ Chè PT10 quy mô

phòng thí nghiệm
4. Ý nghĩa khoa học và ỷ nghĩa thực tiễn
4.1.

Ý nghĩa khoa học

Nghiên cứu khu hệ nấm men và vi khuẩn thực hiện quá trình lên men tạo
sản phẩm kombucha từ Chè PT10.
4.2.

Ý nghĩa thực tiễn

Tạo ra sản phẩm kombucha từ Chè PT10 nhằm đa dạng hóa sản phẩm,
tăng thu nhập cho người trồng chè.
5. Điểm mới của đề tài


8

Từ Chè PT10 đã phân lập 25 mẫu nấm men và 20 mẫu vi khuẩn, tuyển
chọn được chủng Saccharomyces M Ị và Acetobacter x 4 phù hợp cho quá trình
lên men korabucha; Xác định được tỉ lệ giữa vi khuẩn/nấm men là
2/1 với hàm lượng giống 14%thích họp nhất cho quá trình lên men
kombucha; Tìm được môi trường dinh dưỡngthích họp gồm: glucose
100g/l; (NH4)2S04 0,06%; KH2P040,05%; MgS04.7H20 0,05%; nồng độ
chất khô 20% và thời gian lên men 7 ngày cho quá trình tạo sản
phẩm kombucha từ Chè PT10.


NỘI DUNG
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Giói thiêu về kombucha

1.1.1.

Nguồn gốc

Kombucha đã được sử dụng phổ biến qua hơn 200 năm ở vùng Viễn
Đông và khoảng hơn 100 năm ở Đông Âu. Một số tài liệu ghi chép cho thấy có
một số cư dân sống tại vùng Caucase đã thọ trên trăm tuổi. Những người sống
trường thọ như vậy còn tìm thấy tại một số làng mạc ở Poltaya, Ukraine, Tây
Tạng và Tây Ban Nha. Những người trường thọ ở Nga cho biết họ sống lâu như
vậy nhờ từ hàng trăm năm nay họ có thói quen dùng loại trà lên men
kombucha. Thời xưa người Kargasoks tin tưởng rằng trà nấm này có tác dụng
giúp họ được sống khỏe và kéo dài tuổi xuân. Cho nên khi một nữ du khách
quý tộc người Nhật đến thăm thắng cảnh ở làng Kargasok, trông thấy những
người già ở đây khoẻ mạnh lạ thường, gương mặt họ không có nếp nhăn và ít lộ
vẻ già nua. Bà lấy làm ngạc nhiên và hỏi rõ thì được biết dân chúng ở đây có
thói quen uống kombucha hằng ngày. Bà đã xin một ít nấm để làm giống và
mang về Nhật rồi sau đó chia với bạn bè cùng sử dụng. Sau nhiều tuần lễ, các
bạn của bà đều vô cùng khen ngợi về sự hữu hiệu của loại nấm này. Do đó trà
nấm này được truyền bá nhiều nơi trên Nhật Bản [42],
1.1.2.

Đặc điểm cẩu tạo

Nghiên cứu về vi sinh vật cộng sinh trong kombucha cho thấy:
kombucha thực sự là một tập hợp cộng sinh của nấm men và vi khuẩn acid
acetic [24], [28], [36]. Các vi khuẩn acetic chính được tìm thấy trong các loại
nấm

trà:

Acetobacter

xyỉinum

[16],

Acetobacter

aceti,

Acetobacter

pasteurianus [23], Gluconobacter oxydans [22], [29], Ngoài ra còn có thể có
các

chủng

Lactobacillus,

Brettanomyces,

Pediococcus,

Bacterium

gỉuconicum...Chính sự có mặt của các chủng Acetobacter (đặc biệt là


Acetobacter xylinum) đã hình thành nên cấu trúc của kombucha. Acetobacte
rxyỉỉnum có khả năng tạo màng hemicellulose khá dày và chắc, tạo màu xanh
với thuốc nhuộm iod và H2SO4. Kombucha còn được gọi là nấm trà. Chúng

sinh trưởng tốt trong môi trường nước trà đường. Bởi vậy, thường được sử
dụng để lên men dung dịch trà đường, nên gọi là nấm trà. Trong quá trình lên
men kombucha sẽ tạo ra một lóp màng mỏng trên bề mặt dịch trà và dần dần
tăng bề dày, hình thành nên một kombucha thứ hai (thường gọi là kombucha
con) tách biệt với kombucha ban đầu.Hình dạng và kích thước của kombucha
phụ thuộc vào hình dạng tiết diện của bình chứa [42], [45].

Hình l.l.Kombucha Hình 1.2. Lớp màng kombucha
1.1.3.

Hệ vỉ sinh vật trong kombucha

1.1.3.1.

Acetobacter

Giống vi khuẩn Acetobacter thuộc họ Pseudomonadaceae, phân bố rộng
rãi trong tự nhiên và có thể phân lập được các vi khuẩn này từ không khí, đất,
nước, lương thực thực phẩm, giấm, rượu, bia, hoa quả... Có khoảng 20 loài
thuộc giống Acetobacter đã được phân lập và mô tả, trong đó có nhiều loài có ý
nghĩa kinh tế.
* Đặc điểm chung của chủng Acetobacter
Chủng Acetobacter có dạng hình que, tùy điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ,


thành phần môi truờng nuôi cấy) mà các vi khuẩn Acetobacter có thể sinh ra
các tế bào có hình thái khác biệt dạng kéo dài hoặc phình to ra. Kích thước thay
đổi tùy loài (0.3-0.6

X

1.0-8.0pm).Có thể di động (có tiên mao đơn hoặc chu

mao) hoặc không di động (không có tiên mao). Hiếu khí bắt buộc, chịu được độ
acid cao.Vi khuẩn Acetobacter có khả năng đồng hoá nhiều nguồn thức ăn
cacbon khác nhau nhưng không sử dụng được tinh bột. Tế bào đứng riêng lẽ
hoặc kết thành từng chuỗi. Có khả năng tạo thành váng trên môi trường lỏng
váng thay đổi tùy loại.
Acetobacter xylỉnum: tạo thành váng cellulose khá dày và chắc.
Acetobacter orleanoe: tạo thành váng mỏng nhưng chắc. Acetobacter
pasteurianum: tạo thành váng khô và nhăn nheo. Acetobacter suboxydans: tạo
thành váng mỏng dễ tan rã. Acetobacter có khả năng đồng hoá muối (NH 4)+ và
phân giải pepton. Một số loài đòi hỏi một số acid amin nhất định như acid
pantothenic và các chất khoáng K, Mg, Ca, Fe, p,

s ...ở dạng muối vô cơ, hữu

cơ hoặc họp chất hữu cơ. Do đó bia, dịch tự phân nấm men, nước mạch nha,
nước trái cây...là nguồn dinh dưỡng rất tốt cho sự phát triển của vi khuẩn
Acetobacter. Ngoài khả năng oxy hoá ethanol thành acid acetic, một số loài
Acetobacter còn tổng hợp được vitamin Bi, vitamin B 2, oxy hoá sorbit thành
đường sorbose (dùng trong công nghiệp sản xuất vitamin C) [4], [45],
1.1.3.2.

Nấm men

* Hình thái và cấu tạo tế bào
Te bào nấm men thường có dạng hình cầu, ovan, elip, hình trụ... kích
thước rất lớn gấp từ 5 - 10 lần tế bào vi khuẩn. Kích thước trung bình: chiều
dài: 9 - 10|im, chiều rộng: 2 - 7|im. Hình dạng và kích thước tế bào thay đổi,

không đồng đều ở các loài khác nhau, ở các lứa tuổi khác nhau và điều kiện
nuôi cấy khác nhau. Nấm men là sinh vật đon bào, tế bào nấm men cũng như
nhiều loại tế bào khác được cấu tạo chủ yếu từ các phần cơ bảnnhư: glucan,


protein, lipid và một số thành phần nhỏ khác như kitin.... Màng nguyên sinh
chất: gồm các họp chất phức tạp như protein, phospholipit, enzyme
permeaza...Chất nguyên sinh: thành phần cấu tạo chủ yếu là nước, protit, gluxit,
lipit và các muối khoáng, enzyme và có các cơ quan trong đó. Nhân tế bào và
những thành phần cơ quan con khác: không bào, ty lạp thể, riboxom,...[4], [45].
* Sự sinh sản của nấm men
Nấm men có một số hình thức sinh sản: nảy chồi; phân đôi; sinh sản
bằng bào tử và hình thành bào tử (tiếp họp đẳng giao, tiếp họp dị giao, sinh sản
đơn tính) [4].
* Phân loại nấm men
Chủ yếu có hai lóp: nấm men thật (Ascomyces) và nấm men giả (Fungi
imporfecti) [4], [45].
Lớp nấm men thật (Ascomyces): phần lớn nấm men dùng trong công
nghiệp thuộc lóp Ascomyces, đa số thuộc giống Saccharomyces; giống
Endomyces; giống Schizosaccharomyces.
Lớp nấm men giả (Fungi imporfecti): Crytococm (toscula, tornlopsis);
Mycoderma; Candida; Geotrichum (đã được xếp vào lóp nấm mốc);
Rhodotorula.
* Các quá trình sinh lí của tế bào nấm men
Nấm men cũng như các sinh vật sống khác cần oxy, hydro, cacbon,
nitơ,phospho, kali, magiê.. .[4], [45],
Dinh dưỡng cacbon: nguồn cacbon cung cấp là các loại đường khác
nhau: saccharose, maltose, lactose, glucose...Dinh dưỡng oxy, hydro: được
cung cấp cho tế bào từ nước của môi trường nuôi cấy hay dịch. Dinh dưỡng
nitơ: nấm men không có men ngoại bào để phân giải protein, nên không thể

phân cắt albumin của môi trường mà phải cung cấp nitơ ở dạng hòa tan, có thể
là đạm hữu cơ hoặc vô cơ. Dạng hữu cơ thường dùng là acid amin, pepton,


amid, urê. Đạm vô cơ là các muối amon khử nitrat, Sulfat...Các vitamin và chất
khoáng: chất khoáng có ảnh hưởng to lớn đến hoạt động sống của nấm men.
Phospho: có trong thành phần nucleoprotein, polyphosphat của nhiều enzyme
của sản phẩm trung gian của quá trình lên men rượu, chúng tạo ra liên kết có
năng lượng lớn. Magiê: tham gia vào nhiều phản ứng trung gian của sự lên
men. sắt: tham gia vào các thành phần enzyme, sự hô hấp và các quá trình khác.
Kali: chứa nhiều trong nấm men, nó thúc đẩy sự phát triển của nấm men, tham
gia vào sự lên men rượu, tạo điều kiện phục hồi phosphorin hóa của acid
pyruvic. Mangan: đóng vai trò tương tự như magiê.
* Quá trình sinh trưởng và phát triển
Trong quá trình nuôi cấy, trong điều kiện dinh dưỡng đầy đủ, tế bào nấm
men tăng nhanh về kích thước và đồng thời sinh khối được tích lũy nhiều. Các
nấm men sinh sản bằng phương pháp nhân đôi thường cho lượng sinh khối rất
lớn sau một thời gian ngắn. Trong trường họp sinh sản theo phương pháp này
thì trong dịch nuôi cấy sẽ không có tế bào già. Vì rằng tế bào được phân chia
thành hai, cứ như vậy tế bào lúc nào cũng ở trạng thái đang phát triển. Te bào
chỉ già khi môi trường thiếu chất dinh dưỡng và tế bào không có khả năng sinh
sản nữa. Tuy nhiên đa số nấm men sinh sản bằng phương pháp nảy chồi nên
hiệntượng phát hiện tế bào già rất rõ.Khi chồi non tách khỏi tế bào mẹ để sống
độc lập thì nơi tách đó trên tế bào mẹ tạo thành một vết sẹo.vết sẹo này sẽ
không có khả năng tạo ra chồi mới. Cứ như vậy tế bào mẹ sẽ chuyển thành tế
bào già theo thời gian [4], [45].
Đe xác định số lượng tế bào nấm men phát triển theo thời gian hiện nay
người ta dùng nhiều phương pháp khác nhau như: xác định số lượng tế bào
bằng phương pháp đếm trực tiếp trên kính hiển vi hay trên mặt thạch. Đo độ
đục của tế bào trong dung dịch nuôi cấy trên cơ sở xây dựng một đồ thị chuẩn

của mật độ tế bào [4].


Quá trình sinh trưởng của nấm men trong nuôi cấy không liên tục sinh
trưởng theo một đường cong gồm 4 pha: pha tiềm phát (pha lag): nấm men
thích nghi với môi trường, số lượng tế bào chưa tăng. Pha lũy thừa (pha log):
nấm men sinh trưởng với tốc độ lớn nhất và không đổi, số lượng tế bào trong
quần thể tăng lên rất nhanh. Phacân bằng: số lượng nấm men đạt cực đại và
không đổi theo thời gian. Phasuy vong: số tế bào trong quần thể giảm dần do tế
bào trong quần thể bị phân hủy ngày càng nhiều, chất dinh dưỡng cạn kiệt.
1.1.3.3.

Giống vi khuẩn lên men lactic

Vi khuẩn lên men lactic thuộc họ Lactobacterỉum. Đây là những trực
khuẩn, cầu khuẩn không tạo bào tử và hầu hết không di động, hô hấp tùy tiện.
Chúng có khả năng lên men nhiều loại đường đơn và đường đôi nhưng không
có khả năng lên men các loại glucid phức tạp và tinh bột. Sự phát triển của nó
cần có sự có mặt của pepton, acid amin hay muối amon. Quá trình lên men xảy
ra tốt nhất trong môi trường acid pH từ 5,5 -ỉ- 6, khi pH nhỏ hơn 5,5 quá trình
lên men bị dừng lại. Nhiệt độ thích họp cho quá trình lên men từ 15 -í-

50°c.

Tuy nhiên mỗi loài có khoảng nhiệt độ thích hợp khác nhau, nếu nhiệt độ lớn
hơn 80°c vi khuẩn lactic bị tiêu diệt hoàn toàn [45],
1.2.

Cơ sở khoa học của quá trình lên men kombucha

Theo kết quả nghiên cứu về thành phần cấu tạo của kombucha thì quá
trìnhlên men dịch trà có thể xảy ra như sau:
* Lên men ethanol
Lên men rượu là quá trình lên men yếm khí với sự có mặt của nấm men,
chúng sẽ chuyển hóa đường lên men thành ethanol và CC> 2.Quá trình lên men
rượu chia làm hai thời kỳ chính: thời kỳ phát triển sinh khối và thời kỳ lên men
chuyển đường thành rượu và CƠ2. Sau khi được vận chuyển vào trong tế bào
chất, đường hexose được chuyển hóa theo chu trình đường phân để tạo thành
acid pyruvic. Tiếp theo acid pyruvic sẽ được chuyển hoá thành acetaldehyde rồi


thành ethanol.Dihydroxyacetone phosphat là một sản phẩm trung gian trong
chu trình đường phân, họp chất này có thể chuyển hoá thành glyxerol.Trong
môi trường pH acid, glycerol chỉ được tạo ra với hàm lượng nhỏ. Ngược lại,
trong môi trường pH kiềm lượng glycerol sinh ra sẽ tăng lên rất nhiều và
glycerol sẽ trở thành một trong những sản phẩm chủ yếu của quá trình lên men.
Cơ chế phân giải đường trong tế bào nấm men được trình bày ở hình 1.3.
Phương trình tổng quát của quá trình lên men trong môi trường pH acid:
C6H1206 + 2ADP +2PĨ -> 2C2H5OH + 2C02 + 2ATP
Sự chuyển hóa đường hexose thành ethanol và khí C0 2 diễn ra trong tế
bào chất của nấm men. Đây là quá trình trao đổi năng lượng của nấm men trong
điều kiện kỵ khí. Ethanol và C02 trong tế bào chất sẽ được nấm men thải vào
môi trường lên men. Ngoài ra, tế bào nấm men còn tổng họp và thải vào dịch
lên men hàng trăm sản phẩm phụ và sản phẩm lên men khác, những họp chất
này được tìm thấy với hàm lượng rất nhỏ, chúng được chia thành 4 nhóm:
glyxerol cùng rượu bậc cao, aldehyde, acid hữu cơ và este.Trong quá trình lên
men ethanol, nhiều acid hữu cơ được tạo thành (The Moll, 1990). Một số acid
hữu cơ được sinh tổng hợp từ chu trình Krebs, nếu như quá trình lên men
không diễn ra trong điều kiện kỵ khí nghiêm ngặt, các acid hữu cơ chiếm hàm
lượng cao nhất trong dịch lên men là: acid citric, malic, acetic, lactic...[45].

Glucose
ị Hexokinaza
Glucose — 6 — phösphar
ị_ Ph otph o glu CO za IS ornera za

I PhosphoFnictokhiaza Fructos e — 1.6 — dipho sphat I
Aldolaza
Glyceraldehyd — 3 — ph.osph.at ^
Dihydro aceton phosphat

ị Glyceraldehyd ph 0 sph 1t d ehydro g enaza
Acid — 1.3 — diphösphoglvceric
Acid — 3 —
phosphoglvceric
ị Pho sphoglvcerat-mutaza
Acid — 2 — phosphoglycenc ị Enoiaza
Acid phosph0en olpyruLvic
I Pyruvat kinaza
Acid — en ol — pyruvic

Acid pyruvic

Fructose — 6 — phosphat

Ethan al

Ethanol

Aid o d e shy drO g en
az a

Hình 1.3. Cơ chê phân giải đường trong tê bào nâm men


* Lên men acetic
Lên men acid acetic là quá trình oxy hóa rượu thành acid acetic dưói tác
dụng của vi khuẩn.
C2H5OH + 02-> CH3CHO (Acetaldehyde) + H20
CH3CH0 + H20 -> CH3CH(OH)2 (Hydrat acetaldehyde) CH3CH(OH)2 +
02 -> CH3COOH + H2O
* Lên men ỉactic
Lên men lactic là một quá trình trao đổi năng lượng. Các phân tử ATP
được hình thành trong quá trình chuyển hóa cơ chất sẽ được vi khuẩn giữ lại
trong tế bào để phục vụ cho quá trình trao đổi chất và sinh trưởng của vi sinh
vật. Ngược lại, các sản phẩm như acid lactic, ethanol, C0 2 được vi khuẩn thải
vào môi trường lên men. Kết quả là hàm lượng acid lactic tích lũy trong môi
trường lên men ngày càng tăng, làm giảm pH môi trường và kéo theo những
biến đổi hóa lý khác. Bản chất là quá trình chuyển hóa đường thành acid lactic
nhờ vi sinh vật.
Phương trình phản ứng:
C6H1206 -> CHaCHOHCOOH + 94kcal
Trong quá trình lên men lactic ngoài sản phẩm acid lactic (lên men đồng
hình), acid acetic, ethanol, C02 (lên men dị hình) trong dịch lên men còn xuất
hiện cả trăm hợp chất hóa học mới khác.Một số hợp chất trong nhóm trên rất dễ
bay hơi.Chúng đóng vai trò quan trọng trong việc góp phần hình thành nên mùi
vị đặc trưng cho những sản phẩm lên men lactic.
Phương trình tổng quát:
C6HI2O6

-> CH3CHOHCOOH + CH3COOH + C2H5OH + C00H(CH2)2C00H+C02

Lượng sản phẩm phụ tạo thành hoàn toàn phụ thuộc vào giống vi sinh
vật, vào môi trường dinh dưỡng và điều kiện ngoại cảnh: acid lactic thường
chiếm 40% lượng đường đã được phân hủy, acid succinic 20%, ethanol chiếm
10%, acid axetic 10% và các loại khí gần 20%.


* Bản chất sinh hóa của quá trình tạo váng cellulose của vi khuẩn
acetic
Quá trình hình thành cellulose được nhà bác học Muhlethaler sử dụng
kính hiển vi điện tử để nghiên cứu và cho rằng: đầu tiên các tế bào vi khuẩn sẽ
tiết ra chất nhầy bao bọc xung quanh chúng, tiếp đó là sự hình thành các sợi
cellulose được polymer hóa từ các đơn phân glucose ở vị trí a-1,6 dưới tác dụng
của enzyme có trong bao nhầy. Các sợi này ngày càng dầy lên và được kết nối
với nhau tạo thành lóp cellulose bên trong bao nhầy.Lóp cellulose này sau đó
được thoát ra khỏi tế bào hoàn toàn.
Dung dịch môi trường ban đầu có dạng huyền phù mịn, chuyển sang
dạng rời rạc sau đó lại kết thành khối lớn hơn dạng gel chứa các tế bào vi khuẩn
bên trong đó. Bộ khung của gel là mạng lưới cellulose với thành phần chủ yếu
là nước. Nó được hình thành ở mức tối đa chỉ 30 phút sau khi có sự tiếp xúc
giữa vi khuẩn Acetobacter xylỉum với glucose và oxy.
Polysaccaride của vi sinh vật thường được tích tụ đáng kể trong các môi
trường lỏng. Tất cả các oligo và polysaccaride được tổng họp bằng cách kéo dài
chuỗi saccaride có trước nhờ vào việc thêm vào đơn vị monosaccharide. Đơn vị
được hoạt hóa thường là dẫn xuất của các uridin diphotphate nhưng đôi khi
cùng với các nucleotide, nucleotide, purin và các pirimidin khác.
1.3.

Giói thiệu về trà lên men kombucha

Đây là một loại thức uống được lên men trong dung dịch trà đường bởi
kombucha. Kombucha có thể sử dụng một số loại trà để lên men, nhưng không
sử dụng được trà thảo mộc vì kombucha dễ bị hỏng khi lên men trà có nhiều
tinh dầu.Một số loại trà có chứa dầu thơm, có thể làm cho kombucha bị chết
hoặc bị ảnh hưởng xấu. Sử dụng các loại trà khác nhau sẽ cho ra những loại
thức uống với những hương vị khác nhau [44],


1.3.1.

Thành phần của trà đường lên men

Khi các vi sinh vật được nuôi trong môi trường trà dược, cung cấp đủ
nitrogen, vitamin và khoáng chất cùng những chất dinh dưỡng căn bản khác
như đường. Chúng phát triển và biến đổi đường thành gluconic acid, đồng thời
tạo thành một lượng nhỏ alcohol chính lượng alcohol này sau đó biến đổi thành
acetic acid tạo cho trà có vị ngọt và có mùi chua của rượu táo lên men. Thành
phẩm trà sau cùng chứa trung bình 0.5 - 1% alcohol, một lượng nhỏ acid lactic,
acid malic, acid acetic, acid malonic và acid oxalic. Lượng vitamin B trong
thành phẩm khá cao.Trà lên men kombucha được xác định là có khả năng
kháng khuẩn mạnh. Khả năng chống vi khuẩn được quan sát thấy trong các
mẫu lên men có chứa tong so acid là 33g/l (trong đó acid acetic chiếm 7g/l).
Tuy nhiên, Candida albicans không bị ức chế bởi kombucha.Nghiên cứu này
cũng chỉ ra khả năng kháng khuẩn của kombucha là nhờ acid acetic [44], [48].
1.3.2.

Công dụng của trà đường lên men

Kombucha đã được Cục quản lí thực phẩm và dược phẩm của Mỹ
(FDA) chứng nhận là an toàn đối với con người [43]. Việc sử dụng rộng rãi
thức uống từ kombucha đã được nghiên cứu qua nhiều tài liệu trong suốt thế kỷ
qua. Dạng kombucha lỏng và dạng đặc cũng được nghiên cứu và kết quả ban
đầu cho thấy trong dịch trà này có chứa chất kháng sinh (diệt khuẩn và kìm
hãm vi khuẩn) có tác dụng chống lại một số vi sinh vật gây bệnh và đã được sử
dụng cho mục đích điều trị trong thuốc thú y và thuốc cho người. Đầu thế kỷ
XX, chủ yếu là những nghiên cứu y học của người Đức, chứng minh kombucha
có tác dụng điều tiết đường ruột và có ảnh hưởng tốt đến chức năng nói chung
của cơ thể, nhưng cũng dần có hiệu quả cụ thể trong những trường hợp như rối
loạn tiêu hóa, táo bón, tri, sỏi thận, các vấn đề về túi mật, tiểu đường,
cholesterol, cao huyết áp, xơ cứng động mạch, đau đầu, mệt mỏi ... Theo nhiều
nghiên cứu trên thế giới thì trà kombucha có nhiều lợi ích đối với con người,


thường được tìm mua ở các cửa hàng thực phẩm chức năng. Tác dụng của trà
kombucha dựa trên các thành phần sau: acid lactic: cần thiết cho hệ thống tiêu
hóa. Giúp cho việc lưu thông máu, cân bằng độ acid và kiềm trong cơ
thể.Trong kombucha, acid này tồn tại ở dạng có lợi nhất (lactic - L). Acid
acetic: là 1 chất bảo quản chống lại sự xâm nhập của vi khuẩn có hại. Acid
usnic: là 1 loại chất kháng sinh tự nhiên, giúp chống lại nhiều loại virus. Có báo
cáo cho rằng môi trường nuôi cấy kombucha có chứa acid usnic nhưng kết quả
chưa được xác nhận.Acid oxalic là một chất bảo quản hiệu quả và cung cấp
năng lượng.Acidgluconic tạo ra bởi vi khuẩn, có lợi cho người mắc các bệnh
như nhiễm nấm Candỉda. Acid malic giúp giải độc gan.Acid butyric tạo ra bởi
nấm men, bảo vệ màng tế bào, kết họp với acid gluconic tăng cường thành ruột
chống lại kí sinh trùng, trong đó có nhiễm nấm như Candỉda. Các họp chất
tanin trong trà: có khả năng kháng khuẩn và phòng chống bệnh ung thư, làm
chậm quá trình lão hóa. Caffein trong thành phần của trà có khả năng giảm mệt
mỏi, căng thẳng, giảm cảm giác buồn ngủ, cung cấp năng lượng hoạt động cho

cơ thể.Trà kombucha còn tốt cho da đầu và tóc, kích thích sự phát triển của tóc
[7], [44], [45].
1.3.3.

Một số lưu ý khi sử dụng

Với những bệnh nhân trong giai đoạn điều trị ung thư do xạ trị hoặc hóa
trị, nếu dùng trà cần sự giám sát của thầy thuốc. Do trà chứa quá nhiều acid
lactic, uống trong một thời gian dài có thể dẫn đến đau khóp, chóng mặt và
viêm xoang. Trẻ em có thể dùng nhưng liều lượng thay đổi theo tuổi, cân nặng
và quan trọng cần phải được pha loãng với nhiều nước, không nên cho trẻ dưới
2 tuổi uống. Phụ nữ có thai không nên dùng vì có đến 1% lượng cồn trong nước
trà. Không nên uống trong thời gian cho con bú vì gây đau bụng cho trẻ sơ sinh.
Người tiểu đường chỉ nên dùng trà đang lên men vì hầu hết lượng đường bị
biến đổi, tuy nhiên nếu ủ men trà với quá ít đường (dưới 50 gam/lít) thì khó
xuất hiện các đặc tính hữu ích của trà kombucha. Vì vậy người tiểu đường cũng


không nên uống nhiều.Trà korabucha gây loãng máu, cần giảm liều và chú ý
ngưng một tuần trước khi phẫu thuật; phụ nữ bị rong kinh cũng cần thận trọng
và nên ngưng sử dụng trước kinh kỳ tối thiểu một tuần.Men trà kombucha có
thể bị hư và mất hết tác dụng nếu ủ không đúng quy cách [44], [45], [46].
1.4. Nguyên liệu
1.4.1.

Nguồn gốc và đặc tính thực vật

Cây chè có tên khoa học là Camellia sinensis, có nguồn gốc ở khu vực
Đông Nam Á, nhưng ngày nay nó được trồng phổ biến ở nhiều nơi trên thế
giới, trong các khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới. Chèlà loài cây xanh lưu niên

mọc thành bụi hoặc các cây nhỏ, thông thường được xén tỉa để thấp hơn 2 mét
khi được trồng để lấy lá. Nó có rễ cái dài, hoa màu trắng ánh vàng, đường kính
từ 2,5 - 4cm, với 7-8 cánh hoa. Hạt của nó có thể ép để lấy dầu. Cả lá và chồi
của cây trà đều được sử dụng để sản xuất các sản phẩm trà xanh, trà đen, trà
đỏ.. .Lá dài từ 4 - 15cm. Lá tươi chứa khoảng 4% caffein. Lá non và các lá có
xanh lục nhạt được thu hoạch để sản xuất trà khi mặt bên dưới của chúng còn
các sợi lông tơ ngắn màu trắng, các lá già có màu lục sẫm... ở các độ tuổi khác
nhau của lá trà tạo ra các sản phẩm trà khác nhau về chất lượng, do thành phần
hóa học trong các lá này là khác nhau. Thông thường, chỉ có lá chồi và 2 đến 3
lá mới mọc gần thời gian đó được thu hoạch để chế biến. Việc thu hoạch thủ
công bằng tay diễn ra đều đặn sau khoảng 1 đến 2 tuần [40],
1.4.2.

Phương pháp sản xuất trà xanh

Trà xanh được chế biến từ trà tươi, qua các quá trình sau:
Trà tươi —» diệt men —» vò trà —»làm khô —» sao lăn gia nhiệt tạo
hình —» phân loại —» sao hương —» phân loại —» sản phẩm.
Trong quá trình sản xuất trà xanh, tùy theo từng phương pháp diệt men
khác nhau và phương pháp làm khô khác nhau mà chia ra nhiều loại theo tính
chất, hương vị đặc biệt của nó [40],[45].


1.4.3.

Đăc điểm của trà xanh

Ngoại hình: xoăn chặt, màu xanh đen. Màu nước xanh tươi hoặc xanh
vàng. Hương: hương thơm đặc trưng của trà tươi. Vị chát đậm.
Do quá trình diệt men làm đình chỉ hoạt động của enzym, nên các thành

phần trong trà xanh rất ít bị biến đổi, hàm lượng polyphenol trích ly trong nước
là 30 - 40%, các vitamin và khoáng chất vẫn được giữ lại (đặc biệt là vitamin
C). Vì vậy, giá trị dinh dưỡng của trà xanh tương đối cao. Trà xanh có khả năng
chống ung thư cao, tác dụng tương tự như trà tươi [40].
1.4.4.

Giá trị và thành phần hóa học của lá chè tươi

Từ lâu, trà xanh không chỉ được dùng là nguyên liệu nước giải khát tốt
cho sức khỏe con người mà trà xanh còn là một trong những loại thảo dược có
ý nghĩa rất quan trọng trong việc duy trì sức khỏe tốt của cơ thể.uống trà xanh
có tác dụng tránh đau đầu, trầm cảm, tinh thần được minh mẫn sảng
khoái.Ngoài ra uống trà xanh có tác dụng phòng ngừa và điều trị đa xơ cứng,
chống lại một số bệnh như tiêu chảy, tả lỵ, thương hàn. Đặc biệt trà xanh là một
nguồn tự nhiên của chất chống oxy hóa, là chất sát khuẩn có thể giảm nhiễm
trùng... [1], [9],


>

r

Bảng 1.1. Thành phân hóa học chủ yêu của lá chè tươi
Thành phần
Hàm lượng (% chất
khô)
Flavonoid
19-34
+ Catechin (C)

1-2

+ Gallocatechin (GC)

3-4

+ Epicatechin (EC)
+ Epigallocatechin (EGC)

1-3
3-6

+ Epicatechingallate (ECG)

3-6

+ Epigallocatechingallate (EGCG)
Caffeine

8-12
3-5

Acid hữu cơ (Citric, malic, oxalic...)
Đường (glucose, fructose, raffmose,
stachyose...)
Chất xơ (cellulose, hemicellulose, lignin)
Protein và acid amin

0,5 - 0,6
4-5

7-20
15-20

Pectin
Lipid

1-2
3-6

Acid hữu cơ và nhựa

3-6

Khoáng

5-6

Sắc tố (chlorophill, carotenoid)

0,5 - 0,6

Enzyme
-------- ----- 9---------------------------------- ----------------------'

'

Nguôn: Tông hợp các tài liệu vê cây chè, 2010

Các chất có trong thành phần hóa học của lá chè tươi, một mặt tham gia
trực tiếp vào sự hình thành chất lượng trà sản phẩm (như pectin, caffeine...). Mặt

khác quan trọng hơn là qua sự biến đổi hóa học (như sự biến đổi của tannin,
protein, glucid...) để tạo nên các tính chất đặc trưng cho trà sản phẩm. Thành
phần hóa học của lá chè rất đa dạng và phong phú về số lượng các chất, đồng


thời cũng có chứa một lượng lớn các chất có giá trị sinh học cao mà có tính chất
đặc trưng cho sản phẩm trà.Các nhóm chất có ý nghĩa lớn đó là họp chất phenol
thực vật, các họp chất chứa nito và hệ enzyme có sẵn trong trà [ 1].
1.4.5.

Đăc điểm của chè PT10

Tuyên Quangđược biết đến không những là cái nôi của khu di tích lịch sử
Tân Trào mà còn nổi tiếng với những sản phẩm chè như Bát Tiên, PT10, Ngọc
Thúy,... trong đó có giống chè PT10 được quan tâm và trồng nhiều bởi PT10 là
giống chè lai cho năng suất cao. Đặc điểm hình thái lá: màu xanh đậm, hình
trứng, chóp lá nhọn, bề mặt phẳng nhẵn, thế lá hơi xiên.Đặc điểm hình thái búp:
màu xanh vàng, lông tơ nhiều, chiều dài búp 3,8cm.Nước trà sau khi pha có màu
vàng đậm có hương thơm, uống lúc đầu chát gắt, có vị đắng sau có vị ngọt kéo
dài, pha nhiều lần vẫn đậm [13].
1.5.

Tình hình nghiên cứu kombucha ở trong và ngoài nước

1.5.1.

Trên thế giới

ở trên thế giới đã có rất nhiều các bài báo, các nghiên cứu về kombucha
được đăng trên tạp chí quốc tế. Đó là các bài báo, các công trình nghiên cứu về

tác dụng của trà kombucha đối với sức khỏe, các nghiên cứu về phân lập hệ vi
sinh vật trong trà kombucha.. .Đầu tiên phải kể đến các bài báo, các nghiên cứu
về tác dụng của kombucha và các nghiên cứu sinh hóa: Bacinskaja (1914) và
cộng sự cho rằng kombucha tốt cho hệ tiêu hóa, điều chỉnh các hoạt động đường
ruột, đặc biệt là chống táo bón. Đen năm 1927, Madaus đã có những nghiên cứu
và đưa ra kết luận nấm kombucha và các sản phẩm chuyển hóa của nó có tác
động tích cực trong việc tái sinh vách tế bào, một phương thuốc tuyệt vời cho
bệnh xơ vữa động mạch[49]. Vào năm 1987, Veronika Carstens trong nghiên
cứu của mình đã chỉ ra: kombucha có tác dụng giải độc cơ thể, cải thiện chức
năng hệ miễn dịch [48], Reiss, J. (1994) đã tìm hiểu ảnh hưởng của các loại
đường khác nhau lên quá trình trao đổi chất của nấm trà [33].Năm 2006,


Steinkraus K. H. và cộng sự đã có những nghiên cứu về hoạt động kháng sinh
của trà nấm kombucha [36]. Năm 2007, Velicanski và cộng sự đã cho biết hoạt
động kháng khuẩn và chống oxy hóa của kombucha [38]. Jayabalan R. và cộng
sự (2010) đã nghiên cứu về đặc điểm sinh hóa của nấm trà [27]. Cavusoglu K.,
Gluer p. (2010) đã phát hiện tác dụng bảo vệ của nấm trà kombucha trên nhiễm
sắc thể gây ra bởi bức xạ gamma trong tế bào bạch huyết ngoại vi của con người
trong ống nghiệm [18]. Yapar K và cộng sự (2010) đã có những nghiên cứu về
tác dụng bảo vệ của nấm trà kombucha đối với chuột bạch tạng bị nhiễm độc do
phenol [39]. Các nghiên cứu về định danh các chủng vi sinh vật trong kombucha
và ứng dụng của các chủng được phân lập từ kombucha cũng đã có từ rất lâu: Từ
năm 1928, Hermann đã định danh hai chủng Bacterium xyỉinum và B. xylinoides
và B. gluconicum. Các nhà nghiên cứu còn xác định được kombucha là một sự
họp tác cộng sinh giữa Bacterium xylinum cùng các vi khuẩn khác, với những tế
bào nấm men thuộc chủng Saccharomyces, tạo thành một khối như tổ chim. Vào
năm 1973, List và cộng sự đã phân lập được Acetobacter ketogenum; Pichia
fermentans;

Saccharomyces

apiculatus;

s.ludwigli;

B.xylỉnoỉdes;

Schizosaccharomyces pombe từ dịch nuôi cấy kombucha [47], Năm 2001,
Kurtzman CP. và cộng sự đã phân lập được một chủng nấm men mới từ
kombucha và đặt tên là Zygosaccharomyces kobuchaensis [29].Vào năm 2006,
Dutta D. và cộng sự đã có công trình nghiên cứu về khả năng cố định đạm của
chủng Acetobacter nitrogen nifigens sp.nov được phân lập từ trà kombucha
[21].Đen năm 2007, Dutta D. và cộng sự đã có công trình nghiên cứu về khả
năng cố định đạm và sản xuất cellulose của Gỉuconacetobacter kombucha sp.nov
được phân lập từ kombucha [16] .Nguyen, Vu Tuan; Flanagan và cộng sự vào
năm 2008 đã có những nghiên cứu về đặc tính của màng BC bởi chủng
Gluconacetobacter xylỉnus phân lập từ kombucha [32].
Các nghiên cứu về kombucha ở trên thế giới rất phong phú, đa dạng.Mặc