Nhân Giống Cây Ba Kích Tím (Morinda Officinalis How) Bằng Phương Pháp Nuôi Cấy Mô Tế Bào Tại Quảng Ninh

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
------***------

BÙI THỊ HƯƠNG PHÚ

NHÂN GIỐNG CÂY BA KÍCH TÍM (Morinda officinalis How)
BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO
TẠI QUẢNG NINH

CHUYÊN NGÀNH: LÂM HỌC
MÃ SỐ:

LUẬN VĂN THẠC SĨ LÂM SINH

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. TRẦN THỊ THU HÀ

THÁI NGUYÊN, NĂM 2012


CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc
LỜI CAM ĐOAN

Tên tôi là: Bùi Thị Hương Phú
Học viên cao học khóa 18. Chuyên ngành: Lâm học. khóa 2010 - 2012.
Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên - Đại học Thái Nguyên.
Đến nay tôi đã hoàn thành luận văn nghiên cứu cuối khóa học. Tôi xin cam đoan:
- Đây là công trình nghiên cứu do tôi thực hiện.
- Số liệu và kết quả nêu trong luận văn là trung thực, khách quan.

- Các kết luận khoa học của luận văn chưa từng ai công bố trong các nghiên
cứu khác.
- Các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những lời cam đoan trên.

Thái Nguyên, ngày..... tháng ..... năm 2012
Người làm cam đoan

Bùi Thị Hương Phú


NHỮNG TỪ VIẾT TẮT
CT - Công thức
TN- Thí nghiệm
ĐHST – Điều tiết sinh trưởng
MS – Murashinge and Skoog, 1962
BAP – 6- benzylaminopurine
Kinetin – 6- furfurylaminopurine
NAA - ɑ- Napahlene axetic acid
IBA - Indol – 3- butyric acid
HSNC – Hệ số nhân chồi
TLCHH – Tỷ lệ chồi hữu hiệu


-1-

MỤC LỤC
CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU......................................................................................... 7
1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................... 7
1.2 Mục tiêu của đề tài........................................................................................ 8

1.2.1. Mục tiêu chung ..................................................................................... 8
1.2.2.Mục tiêu cụ thể ...................................................................................... 8
1.3. Ý nghĩa của đề tài ........................................................................................ 9
CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ...................................... 10
2.1. Khái niệm về nuôi cấy mô tế bào thực vật ................................................. 10
2.2. Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật ............. 10
2.2.1 Tính toàn năng của tế bào .................................................................... 10
2.2.2. Sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào ........................................... 11
2.3. Các nhân tố ảnh hưởng tới quá trình nhân giống bằng phương pháp nuôi
cấy mô tế bào ................................................................................................... 13
2.3.1. Môi trường nuôi cấy ........................................................................... 13
2.3.2. Chất điều hòa sinh trưởng ................................................................... 18
2.3.3. Môi trường vật lý................................................................................ 20
2.3.4 Điều kiện vô trùng ............................................................................... 21
2.4. Các giai đoạn chính trong quá trình nhân giống......................................... 21
2.5. Những ưu điểm và hạn chế của vi nhân giống............................................ 23
2.6. Những nghiên cứu về nuôi cấy mô tế bào .................................................. 25
2.6.1. Trên thế giới ....................................................................................... 25
2.6.2. Ở Việt Nam ........................................................................................ 26
2.7. Tổng quan về cây Ba kích.......................................................................... 27
2.7.1. Đặc điểm thực vật học ....................................................................... 27


-2-

2.7.2. Đặc điểm sinh lý, sinh thái................................................................. 28
2.7.3. Giá trị kinh tế và giá trị sử dụng.......................................................... 31
2.7.4. Nhân giống cây Ba kích...................................................................... 32
CHƯƠNG 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................ 34
3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu.............................................................. 34

3.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................. 34
3.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 35
3.4. Bố trí thí nghiệm........................................................................................ 41
3.5. Thu thập số liệu xử lý số liệu..................................................................... 41
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN............................... 43
4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng tới tỷ lệ sống của mẫu
cấy.................................................................................................................... 43
4.1.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng H2O2 đến tỷ lệ
sống của mẫu cấy ......................................................................................... 43
4.1.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng chất khử trùng bằng Clolox đến tỷ lệ
sống của mẫu cấy ......................................................................................... 45
4.1.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng thủy ngân chlorua
đến tỷ lệ sống của mẫu cấy ........................................................................... 46
4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng đến hệ số
nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu ....................................................................... 49
4.2.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng BAP
đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu.................................................... 50
4.2.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng Kinetin
đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu.................................................... 53


-3-

4.2.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng phối hợp của chất điều tiết sinh
trưởng BAP và Kinetin đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu .............. 56
4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng
ra rễ của chồi Ba kích ....................................................................................... 60
4.3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng NAA
đến khả năng ra rễ của chồi Ba kích ............................................................. 60
4.3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng IBA đến

khả năng ra rễ của chồi Ba kích tím.............................................................. 64
4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và
sinh trưởng chiều cao cây con Ba kích tím ở giai đoạn vườn ươm .................... 68
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN, TỒN TẠI VÀ KIẾN NGHỊ ....................................... 72
5.1. Kết luận ..................................................................................................... 72
5.2. Tồn tại ....................................................................................................... 72
5.3. Kiến nghị................................................................................................... 72
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 74
PHỤ LỤC ............................................................................................................ 77


-4-

DANH MỤC BẢNG
Bảng 4.1. Ảnh hưởng của chất khử trùng H2O2 đến tỷ sống của mẫu cấy
Bảng 4.2. Ảnh hưởng của chất khử trùng Clolox tới tỷ lệ sống của mẫu cấy
Bảng 4.3. Ảnh hưởng của chất khử trùng HgCl2 tới tỷ lệ sống của mẫu cấy
Bảng 4.4. Ảnh hưởng của BAP đến HSNC và TLCHH sau 4 tuần nuôi cấy
Bảng 4.5. Ảnh hưởng của Kinetin đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu
chồi hữu hiệu
Bảng 4.6. Ảnh hưởng của 2mg/lBAP + Kinetin đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ
Bảng 4.7. Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng NAA đến sự ra rễ của chồi
Ba kích
Bảng 4.8. Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng IBA đến khả năng ra rễ của
chồi Ba kích
Bảng 4.9. Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và chiều cao cây
con ở giai đoạn vườn ươm
DANH MỤC ĐỒ THỊ
Đồ thị 4.1. Ảnh hưởng của chất khử trùng H2O2 đến tỷ sống của mẫu cấy
Đồ thị 4.2. Ảnh hưởng của chất khử trùng Clolox tới tỷ lệ sống của mẫu cấy

Đồ thị 4.3. Ảnh hưởng của chất khử trùng HgCl2 tới tỷ lệ sống của mẫu cấy
Đồ thị 4.4. Ảnh hưởng của BAP đến hệ số nhân chồi
Đồ thị 4.5. Ảnh hưởng của BAP đến tỷ lệ chồi hữu hiệu
Đồ thị 4.6. Ảnh hưởng của Kinetin đến đến hệ số nhân chồi
Đồ thị 4.7. Ảnh hưởng của Kinetin đến tỷ lệ chồi hữu hiệu
Đồ thị 4.8. Ảnh hưởng của 2mg/l BAP + kinetin đến hệ số nhân chồi
Đồ thị 4.9. Ảnh hưởng của 2mg/l BAP + Kinetin đến tỷ lệ chồi hữu hiệu
Đồ thị 4.10. Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng NAA tới tỷ lệ chồi ra


-5-

rễ
Đồ thị 4.11. Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng NAA tới số rễ trung
bình (rễ/cây)
Đồ thị 4.12. Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng NAA tới chiều dài
trung bình rễ (cm)
Đồ thị 4.13. Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng IBA tới tỷ lệ chồi ra
rễ
Đồ thị 4.14. Ảnh hưởng của IBA tới số rễ trung bình (rễ/cây)
Đồi thị 4.15. Ảnh hưởng của IBA tới chiều dài trung bình rễ
Đồ thị 4.16. Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện tới tỷ lệ sống cây con ở giai
đoạn vườn ươm
Đồ thị 4.17. Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện tới chiều cao trung bình cây
con ở giai đoạn vườn ươm
DANH MỤC ẢNH
Hình 4.1. Nuôi cấy khởi đầu
Hình 4.2. Chồi được nuôi cấy trong môi trường MS có bổ sung BAP
Hình 4.3. Chồi được nuôi trong môi trường MS có bổ sung Kinetin
Hình 4.4. Chồi được nuôi trong môi trường MS có bổ sung 2mg/l BAP+ Kinetin.

Hình 4.5. Chồi được nuôi cấy trong môi trường có bổ sung NAA
Hình 4.6. Chồi được nuôi cấy trong môi trường có bổ sung IBA
Hình 4.7. Chồi Ba kích nuôi cấy mô sinh trưởng trong giá thể ngoài vườn ươm


-6-

LỜI CẢM ƠN
Luận văn này được thực hiện và hoàn thành theo chương trình đào tạo thạc sĩ
lâm nghiệp của trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.
Nhân dịp hoàn thành luận văn, tác giả bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Trần
Thị Thu Hà. Người đã bồi dưỡng kiến thức quý báu và đã dành tình cảm tốt đẹp
cho tác giả từ khi hình thành, phát triển ý tưởng, xây dựng đề cương, tổ chức
triển khai và hoàn thiện luận văn.
Sau thời gian học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, tôi đã nhận được
sự quan tâm và giúp đỡ tận tình của Trường đại học Nông Lâm Thái Nguyên,
đặc biệt là khoa sau đại học, cùng các thầy cô giáo trực tiếp giảng dạy. Xin trân
trọng cảm ơn tập thể cán bộ phòng công nghệ sinh học trường Đại học Nông
Lâm Thái Nguyên đã tư vấn, góp ý trong quá trình hoàn thiện bản luận văn này.
Đối với địa phương, tác giả chân thành cảm ơn các cán bộ công nhân viên
phòng công nghệ sinh học Trường Cao đẳng Nông lâm Đông Bắc. Nơi tác giả đã
tiến hành nghiên cứu, thu thập số liệu để hoàn thiện luận văn.
Xin cảm ơn bạn bè đồng nghiệp, gia đình đã khuyến khích, giúp đỡ tác giả
trong quá trình học tập và thực hiện luận văn.
Mặc dù đã làm việc nghiêm túc với tất cả nỗ lực, song luận văn không tránh
khỏi những thiếu sót nhất định. Tác giả rất mong nhận được những ý kiến đóng
góp quý báu của các Thầy, Cô giáo, các nhà khoa học, các bạn bè đồng nghiệp
và xin chân thành tiếp thu các ý kiến đóng góp đó.
Xin trân trọng cảm ơn!
Tác giả

BÙI THỊ HƯƠNG PHÚ


-7-

CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Với mục tiêu phát triển của nghành Lâm nghiệp Việt Nam giai đoạn 2010 2020 là nâng cao tỷ lệ che phủ của rừng và chất lượng rừng trồng. Do vậy những
loài cây được trồng không chỉ là những cây lấy gỗ lâu năm phù hợp với hoàn
cảnh đất trồng rừng mà còn phải đảm bảo có năng suất cao, chu kỳ kinh doanh
ngắn có nhiều tác dụng đáp ứng nhu cầu cấp thiết đặt ra hiện nay. Đặc biệt trong
những năm gần đây việc trồng cây lâm sản ngoài gỗ dưới tán rừng được xem
như là một chiến lược lớn nhằm đáp ứng cả hiệu quả kinh tế trên một đơn vị diện
tích trồng rừng và cải thiện môi trường cũng như tính đa dạng sinh học của rừng.
Một trong những loài cây dược liệu có giá trị kinh tế cao đang được đưa vào
trồng xen dưới tán rừng đó là cây Ba Kích.
Cây Ba kích có 2 loại là Ba kích trắng và Ba kích tím. Cây Ba kích tím
được sử dụng nhiều bởi hàm lượng dược liệu có trong củ tốt hơn so với cây Ba
kích trắng. Cây Ba kích tím (Morinda officinalis How) thuộc họ cà phê
Rubioceae. Cây Ba kích tím được xem là cây bản địa của tỉnh Quảng Ninh đây là
loài cây dược liệu quý hiếm có rất nhiều công dụng. Nước Ba kích sắc có tác
dụng hạ huyết áp, tăng sức dẻo dai, tăng cường đề kháng cơ thể, chống viêm,
chữa thận hư, tráng dương, phụ nữ khó thụ thai, tay chân đau nhức, chữa gân
xương yếu…. có giá trị xuất khẩu cao. Ngoài ra củ Ba kích còn được dùng ngâm
rượi là một loại đặc sản của Quảng Ninh.
Những năm gần đây Ba kích mọc tự nhiên trong rừng bị khai thác cạn kiệt
dẫn đến diện tích bị thu hẹp, nguồn giống cạn dần. Hiện nay nhiều hộ gia đình
tiến hành phát triển trồng cây Ba kích. Song từ trước đến nay chủ yếu dùng cây
giống nhân từ hạt và hom. Việc nhân giống bằng hạt không phải bao giờ cũng

-8-

thuận lợi và hợp lý, thời gian nảy mầm dài, tỷ lệ nảy mầm thấp mặt khác cây
giống đem trồng có nguồn gốc từ hạt không đảm bảo do hiện tượng phân ly
trong sinh sản hữu tính nên quần thể cây rừng không còn giữ được phẩm chất ưu
việt của nguồn giống đem trồng. Đối với phương pháp giâm hom thì hệ số nhân
giống thấp, cây trồng bằng hom có sức sống kém, chất lượng củ kém.
Khó khăn lớn nhất hiện nay là nguồn giống có phẩm chất di truyền tốt phục
vụ cho trồng rừng đại trà còn hạn hẹp. Cùng với yêu cầu và sự phát triển của thị
trường hiện nay cần một lượng cây giống có chất lượng cao rất lớn. Để giải
quyết nhu cầu cây giống hiện nay và tương lai việc nhân giống cây Ba kích bằng
phương pháp nuôi cấy mô tế bào là một hướng đi cần thiết bởi có thể nhân số
lượng cây lớn trong thời gian ngắn để cung cấp thị trường mặt khác cây nuôi cấy
mô mang nhiều ưu điểm, có sức trẻ hóa cao, cây con mang đuợc toàn bộ tiềm
năng di truyền quý của bố mẹ, tăng sự đồng đều rừng trồng, cây trồng có sức
sinh trưởng và phát triển cao có tuổi thọ lớn. Cây con được tạo ra từ công nghệ
nuôi cấy mô tế bào sẽ khắc phục được những nhược điểm của việc tạo cây con từ
hạt và giâm hom.
Để góp phần giải quyết các tồn tại trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên
cứu nhân giống vô tính cây Ba kích tím (Morinda officinalis How) bằng phương
pháp nuôi cấy mô tế bào tại Quảng Ninh”.
1.2 Mục tiêu của đề tài
1.2.1. Mục tiêu chung
Nghiên cứu thành công kỹ thuật nhân giống cây Ba kích bằng phương pháp
nuôi cấy mô, nhằm góp phần phục vụ công tác duy trì và sản xuất giống cây Ba
kích bằng phương pháp nuôi cấy mô trên địa bàn tỉnh Quảng Ninh.
1.2.2.Mục tiêu cụ thể

-9-

- Nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng tới hiệu quả khử trùng mẫu cây Ba
kích
- Nghiên cứu ảnh hưởng một số chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng nhân
nhanh của chồi Ba kích.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA, IBA tới khả năng ra rễ của chồi Ba kích .
- Xác định ảnh hưởng của thời gian huấn luyện tới tỷ lệ sống và sinh trưởng
chiều cao cây con ở giai đoạn vườn ươm.
1.3. Ý nghĩa của đề tài
* Ý nghĩa khoa học:
- Kết quả nghiên cứu sẽ đưa ra được một biện pháp kỹ thuật nhân giống cây Ba
kích bằng phương pháp nuôi cấy mô. Đánh giá được tác động của một số chất
điều tiết sinh trưởng trong nhân giống cây Ba kích.
- Đánh giá được tác động của các thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và sinh
trưởng cây con ở giai đoạn vườn ươm.
- Bổ sung nguồn tài liệu tham khảo cho công tác nghiên cứu, giảng dạy và sản
xuất cây Ba kích.
* Ý nghĩa thực tiễn sản xuất:
Sản xuất được cây con sinh trưởng phát triển tốt, đồng đều và sạch bệnh với khối
lượng lớn, kịp thời phục vụ cho sản xuất.


-10-

CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
2.1. Khái niệm về nuôi cấy mô tế bào thực vật
Nhân giống bằng nuôi cấy mô (propagation by tissue culture): Là phương
pháp sản xuất hàng loạt cây con (bản sao) từ các bộ phận của cây (các cơ quan,
mô, tế bào) bằng cách nuôi cấy chúng trong ống nghiệm ở điều kiện vô trùng có

môi trường thích hợp và được kiểm soát (Ngô Xuân Bình, 2000) [1].
Vật liệu để nhân giống có thể là các cơ quan của cây: rễ, thân, lá, hoa, quả,
các tế bào được phát sinh từ các bộ phận của cây (mô sẹo - callus) hoặc các tế
bào đơn được tách từ các mô, các tế bào đã được loại bỏ phần vách (tế bào trần protoplast) [1].
Phương pháp nhân giống này sử dụng một bộ phận rất nhỏ của cơ thể sinh
vật làm vật liệu để nhân giống nên còn được gọi là vi nhân giống và thường được
thực hiện ở điều kiện vô trùng trong ống nghiệm có môi trường thích hợp và
được kiểm soát nên được gọi là nuôi cấy in vitro để phân biệt với quá trình nuôi
cấy trong điều kiện tự nhiên, ngoài ống nghiệm (in vivo) (Vũ Thị Huệ, 2008)
[18].
Phương pháp nhân giống này thường được gọi chung là nhân giống
bằng nuôi cấy mô và tế bào, là một trong những ngành kỹ thuật trẻ, mới được
hình thành từ những năm đầu của thế kỷ XX và được phát triển mạnh trong vài
chục năm gần đây. Ngày nay phương pháp này được coi là một công cụ đắc lực
để nghiên cứu và ứng dụng trong các lĩnh vực có đối tượng sinh vật và là một
nội dung quan trọng không thể thiếu được của công nghệ sinh học hiện đại [18].
2.2. Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật
2.2.1 Tính toàn năng của tế bào


-11-

Năm 1902, nhà sinh lý thực vật học người Đức Haberlandt, đã tiến hành
nuôi cấy các tế bào thực vật để chứng minh tế bào là toàn năng. Haberlandt cho
rằng mỗi tế bào của bất kỳ của cơ thể sinh vật đều mang toàn bộ lượng thông tin
di truyền cần thiết và đầy đủ của cả thực vật đó còn gọi là bộ gen. Đặc tính của
thực vật được thể hiện ra kiểu hình cụ thể trong từng thời kỳ của quá trình phát
triển phụ thuộc vào sự giải mã các thông tin di truyền tương ứng trong hệ gen
của tế bào. Do đó, khi gặp điều kiện thích hợp, trong mối tương tác qua lại với
điều kiện môi trường, cơ quan, mô hoặc tế bào đều có thể phát triển thành một cá

thể mới hoàn chỉnh mang những đặc tính di truyền giống như cây mẹ. [15]
Năm 1953, Miller và Skoog (Notingham, Unio) đã thành công khi thực
nghiệm tái sinh cây con từ tế bào lá, chứng minh được tính toàn năng của tế bào.
Thành công trên đã tạo ra công nghệ mới: công nghệ sinh học ứng dụng trong
nhân giống vô tính, tạo giống cây trồng và dòng chống chịu.[25]
Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở lý luận của
phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Cho đến nay con người đã hoàn
toàn chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một
tế bào riêng rẽ.
2.2.2. Sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào
Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô là kết quả phân hóa và phản
phân hóa tế bào. Cơ thể thực vật trưởng thành là một chỉnh thể thống nhất bao
gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, trong đó có nhiều loại tế bào khác
nhau, thực hiện chức năng cụ thể khác nhau. Các mô có được cấu trúc chuyên
môn hóa nhất định nhờ sự phân hóa [16].
Phân hóa tế bào là sự chuyển hóa các tế bào phôi sinh thành các tế bào của
mô chuyên hóa, đảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể. Quá trình phân


-12-

hóa có thể diễn ra như sau:
Tế bào phôi sinh

Tế bào giãn

Tế bào phân hóa chức năng

Khi tế bào đã phân hóa thành mô chức năng, chúng không hoàn toàn mất
khả năng phân chia của mình. Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp,

chúng lại có thể trở lại về dạng giống như tế bào phôi sinh và tiếp tục thực hiện
quá trình
phân hóa. Quá trình đó gọi là sự phản phân hóa của tế bào.
Phân hóa

Tế bào phôi
sinh

Tế bào giãn

Tế bào
chuyển hóa

Phản phân hóa

Hình 1.01: Tóm tắt quá trình sự phản phân hóa của tế bào
Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt hóa
phân hóa gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một
số gen được hoạt hóa để cho ra tính trạng mới, một số gen khác lại bị ức chế hoạt
động. Quá trình này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc
của phân tử DNA của mỗi tế bào. Khi tế bào nằm trong cơ thể thực vật, chúng bị
ức chế bởi các tế bào xung quanh. Khi tách tế bào riêng rẽ, gặp điều kiện bất lợi
thì các gen được hoạt hóa, quá trình phân chia sẽ được xảy ra theo một chương
trình đã định sẵn trong DNA của tế bào (Vũ Văn Vụ, 1994) [22].


-13-

Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật thực chất là
kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào. Kỹ thuật nuôi cấy mô,

tế bào xét cho đến cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào
thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo và vô trùng) một cách
định hướng dựa vào sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào trên cơ sở tính
toàn năng của tế bào thực vật. Để điều khiển sự phát sinh hình thái của mô nuôi
cấy, người ta thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy hai nhóm chất điều tiết
sinh trưởng thực vật là Auxin và Cytokinin [13].
2.3. Các nhân tố ảnh hưởng tới quá trình nhân giống bằng phương pháp
nuôi cấy mô tế bào
Môi trường nuôi cấy là điều kiện tối cần thiết, là yếu tố quyết định cho sự
phân hóa tế bào và cơ quan nuôi cấy.
2.3.1. Môi trường nuôi cấy
Trong nuôi cấy mô và tế bào, môi trường nuôi cấy và môi trường xung
quanh là hai vấn đề chính quyết định đến sự thành bại của quá trình nuôi cấy.
Môi trường nuôi cấy là nguồn cung cấp các chất cần thiết cho sự tăng trưởng và
phân hóa mô trong suốt quá trình nuôi cấy. Cơ sở của việc xây dựng các môi
trường nuôi cấy là việc xem xét các thành phần cần thiết cho sự sinh trưởng và
phát triển của cây. Vì thế thời gian đầu các nhà cấy mô đã sử dụng các môi
trường tự nhiên có nguồn gốc thực vật như dịch chiết lá, nước nội nhũ... nên
không thành công. Cho đến nay, rất nhiều môi trường dinh dưỡng đã lần lượt
được tìm ra và chúng đều mang tên tác giả đề xuất như: White (1934), Knudson
(1964), Vacin and Went (1949), Murashige – Soog (MS 1962), Knop (1974)...
Tuy nhiên mỗi môi trường chỉ thích hợp vài loài cây nhất định cho nên trong
nuôi cấy in vitro, tùy thuộc vào quá trình phát triển mà chọn môi trường dinh


-14-

dưỡng cho phù hợp. Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh thành phần,
hàm lượng các chất trong môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng rất lớn đến khả
năng phát sinh hình thái của các bộ phận nuôi cấy, khả năng tái sinh chồi, lá, rễ

của cây hoàn chỉnh cũng như sự sinh trưởng phát triển của toàn cây. Tùy từng
loại giống, nguồn gốc mẫu cấy, thậm chí tùy cơ quan khác nhau trên cùng cơ thể
mà dinh dưỡng cần cho sự sinh trưởng tối ưu của chúng là khác nhau. Trong môi
trường nuôi cấy số lượng và các loại hóa chất phải cực kỳ chính xác với từng đối
tượng cụ thể.
Hầu hết các loại môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật đều bao gồm; các
loại muối khoáng đa lượng và vi lượng, nguồn cácbon, vitamin, các chất điều
hòa sinh trưởng, các nhóm chất bổ sung, chất nền.
* Khoáng đa lượng
Được sử dụng ở nồng độ trên 30 ppm. Những nguyên tố N,S, P, K, Mg, Ca
là cần thiết và thay đổi tùy theo đối tượng nuôi cấy. Riêng Na và Cl cũng được
sử dụng trong một vài loại môi trường, nhưng chưa rõ vai trò của chúng [18].
Nitơ (N): được sử dụng ở dạng NO3- và NH4+ riêng rẽ hoặc phối hợp với
nhau. Hầu hết các thực vật đều có khả năng khử nitrat thành ammonium thông
qua hệ thống nitrat reductase. Ammonium được tế bào thực vật đồng hóa trực
tiếp để sinh tổng hợp nên các chất đạm hữu cơ như axit amin. Nhưng điều đáng
lưu ý là nếu chỉ dùng ammonium (không có nitrat) thì sinh trưởng của tế bào
giảm, thậm chí ngừng hoàn toàn. Vì vậy hầu hết các loại môi trường đều dùng
nitrat và ammonium dạng phối hợp, nhưng tùy theo đặc tính hấp thu nitơ của loài
cây đó mà phối hợp theo tỷ lệ thích hợp [18].
Môi trường giàu nitơ và kali thích hợp cho việc hình thành chồi, còn môi
trường giàu kali sẽ xúc tiến mạnh quá trình trao đổi chất.


-15-

Phốt pho (P) là nguyên tố mà mô và tế bào thực vật nuôi cấy có nhu cầu rất
cao, thường được đưa vào môi trường ở dạng ortophotphat hoặc đường photphat.
Phốt pho là một trong những thành phần cấu trúc của phân tử acid nuleic. Ngoài
ra khi phốt pho ở dạng H2PO4 và HPO4 còn có tác dụng như một hệ thống đệm

làm ổn định pH của môi trường trong quá trình nuôi cấy.
Lưu huỳnh (S) được sử dụng chủ yếu và tốt nhất là ở dạng muối SO4-2 với
nồng độ thấp.
* Khoáng vi lượng
Là những nguyên tố được sử dụng ở nồng độ thấp hơn 30 ppm, nhưng rất
nhiều nguyên tố vi lượng đã được chứng minh là không thể thiếu được đối với sự
phát triển của mô là: Sắt, Đồng, Kẽm, Mangan, Molybden, Bo, Coban, Iot. Các
nguyên tố này đóng vai trò quan trọng trong các hoạt động của enzym, chúng
được dùng ở nồng độ thấp hơn nhiều so với các nguyên tố đa lượng [3].
Sắt (Fe): thiếu sắt tế bào mất khả năng phân chia. Thiếu Fe làm giảm lượng
ARN và sinh tổng hợp protein nhưng làm tăng lượng ADN và axit amin tự do
dẫn đến giảm phân bào. Fe thường tạo phức hợp với các thành phần khác và khi
pH môi trường thay đổi, phức hợp này mất khả năng giải phóng Fe cho các nhu
cầu trao đổi chất trong tế bào [3].
Mangan (Mn): thiếu Mn cũng làm cho hàm lượng các axitamin tự do và
ADN tăng lên, nhưng ARN và sinh tổng hợp protêin giảm đến kém phân bào [3].
Bo (B): thiếu B trong môi trường gây nên biểu hiện như thừa auxin vì thực
tế Bo làm cho các chất ức chế auxin oxydase trong tế bào giảm. Mô nuôi cấy có
biểu hiện mô sẹo hóa mạnh, nhưng thường là loại mô sẹo xốp, mọng nước, kém
tái sinh.
Molypden (Mo): đóng vai trò co- factor trong hệ thống nitrat reductase, như


-16-

vậy Mo tác động trực tiếp nên quá trình trao đổi đạm trong tế bào thực vật.
* Nguồn cacbon
Cây invitro sống chủ yếu theo phương thức dị dưỡng, mặc dù dưới ánh sáng
nhân tạo chúng có khả năng hình thành diệp lục và quang hợp nhưng bị hạn chế
cho nên việc đưa vào môi trường nuôi cấy nguồn cácbon dưới dạng hữu cơ và

bắt buộc, giúp cho tế bào phân chia và tăng sinh khối [12].
Tùy thuộc mục đích và sự đòi hỏi của từng hệ mô trong trường hợp đặc biệt có
thể dùng các loại đường khác nhau: Sucrose, Maltose, Galactose và Lactose.
Hàm lượng đường bổ sung vào môi trường nuôi cấy khác nhau nhưng
thường dùng với hàm lượng từ 20-40 g/l [20].
Việc trải qua nồi hấp điện gây ra việc phân hủy đường do sự thủy phân nhưng
không thể hiện điều bất lợi nào cho sự phát triển của thực vật. Trong sản xuất đại
trà cây giống, người ta thường sử dụng đường sucrose có giá rẻ và sẵn có trên thị
trường.
* Vitamin
Các vitamin, các axitamin và các chất phụ gia hữu cơ thường được bổ sung
vào môi trường dinh dưỡng nhằm thúc đẩy quá trình sinh trưởng, phát triển của
mô nuôi cấy. Mặc dù tất cả các loại mô và tế bào thực vật nuôi cấy invitro có khả
năng tự tổng hợp được hầu hết các loại vitamin, nhưng thường không đủ về
lượng nên phải bổ sung thêm từ bên ngoài vào, đặc biệt là các vitamin nhóm B.
Tùy từng hệ mô và giai đoạn nuôi cấy mà các vitamin được bổ sung một lượng
thích hợp để mô đạt sinh trưởng tối ưu [23].
Vitamin B1 (thiamin) đóng vai trò quan trọng trong quá trình biến đổi
cácbon và tham gia vào thành phần tổ hợp enzym xúc tác quá trình oxy hóa khử
cacbon ở axit hữu cơ. Nồng độ thường dùng từ 0,1 – 10 mg/l.


-17-

Vitamin B6 (piridoxin): tham gia vào thành phần các enzym khử cácbon và
thay đổi vị trí nhóm amin trong các axitamin. Nồng độ dùng từ 0,1- 1mg/l.
Myo- inostol cần được bổ sung với lượng khá lớn từ 50 – 500 mg/l và tỏ ra có
tác dụng rất rõ rệt đến sự phân chia của mô.
* Chất nền
Để cố đinh mẫu cấy trong môi trường nuôi cấy người ta thường sử dụng

chất làm đông cứng môi trường là thạch. Thạch là một loại polysaccharit của tảo
biển. Khả năng ngậm nước của thạch khá cao 6- 12g thạch / l nước, ở 800c thạch
ngậm nước chuyển sang trạng thái sol và ở 400c trở về trạng thái gel. Độ thoáng
khí của môi trường thạch có ảnh hưởng rất rõ đến sinh trưởng của mô nuôi cấy.
Nồng độ của thạch dùng trong môi trường nuôi cấy dao động tùy thuộc vào độ
tinh khiết của hóa chất và mục tiêu nuôi cấy (thường từ 5-10g/l) [21].
Ngoài ra nước pha môi trường phải là loại nước hoàn toàn sạch ion. Thông
thường người ta sử dụng nước cất hai lần và tốt nhất sử dụng hệ thống cất nước
thủy tinh.
Độ pH của môi trường là yếu tố ảnh hưởng trực tiếp tới khả năng hòa tan
các chất khoáng trong môi trường, sự ổn định của môi trường, khả năng hấp thụ
chất dinh dưỡng của cây. Vì vậy đối với mỗi loại môi trường nhất định và đối
với từng trường hợp cụ thể của các loài cây phải chỉnh pH của môi trường về
mức ổn định ban đầu. Nếu pH thấp (pH < 4,5) hoặc cao hơn (pH > 7,0) đều gây
ức chế sinh trưởng, phát triển của cây trong nuôi cấy invitro [21].
* Các chất phụ gia
Cho đến nay thành phần môi trường ngày càng phong phú, đầy đủ và phức
tạp. Người ta đã sử dụng một số hỗn hợp dinh dưỡng tự nhiên như:
Nước dừa được sử dụng từ năm 1941 để nuôi phôi của Datura. Kết quả phân tích


-18-

thành phần nước dừa của Tulecke và cộng tác viên (1961) cho thấy trong nước
dừa có: Amino acid tự do, amino acid dạng liên kết, axit hữu cơ, đường, ARN và
ADN [19].
Dịch chiết mầm lúa mỳ (mạch nha): thành phần hóa học chưa được phân
tích kỹ, chủ yếu chứa một số đường, vitamin và một số chất có họat tính điều
khiển sinh trưởng [23].
Dịch chiết nấm men (Yeast Extract): thành phần hóa học của dịch chiết nấm

men ít được chú ý phân tích. Chủ yếu chứa đường, nucleic acid, amino acid,
vitamin, auxin khoáng. Tác dụng của YE rất tốt, nhưng với mô sẹo không rõ
ràng [18].
2.3.2. Chất điều hòa sinh trưởng
Trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật, thành phần phụ gia quan trọng nhất
quyết định kết quả nuôi cấy là các chất điều hòa sinh trưởng. Tùy theo từng mục
đích nuôi cấy có thể chọn các nồng độ và tổ hợp các chất điều hòa sinh trưởng
phù hợp. Những chất điều hòa sinh trưởng thường dùng bao gồm.
* Auxin
Auxin do Went và Thimann (1937) phát hiện. Auxin có tác dụng kích thích
sự hình thành mô sẹo và xuất hiện rễ bất định, kích thích sự giãn của tế bào [29].
Các loại auxin thường được sử dụng trong nuôi cấy mô là:
- Indol – 3- acetic acid (IAA): auxin tự nhiên
- Indol – 3- butyric acid (IBA)
- Naphthyl acetic acid (NAA).
* Cytokinin
Được phát hiện bởi Skoog (vào khoảng năm 1950) trong một thí nghiệm
chiết xuất acid nucleic. Đó là những cấu tử của nucleic acid bị phân hủy thành.


-19-

Các chất thuộc nhóm cytokinin thường được sử dụng là Kinetin, BAP, Zeatin.
Trong các chất này BAP và Kinetin được dùng phổ biến nhất vì có hoạt tính cao
và giá thành không đắt. BAP và Kinetin cùng có tác dụng kích thích phân chia tế
bào, kéo dài thời gian hoạt động của tế bào phân sinh và làm hạn chế sự hóa già
của tế bào. Cytokinin được bổ sung vào môi trường chủ yếu để kích thích sự
phân chia tế bào và quyết định sự phân hóa chồi bất định từ mô sẹo và cơ quan
[29].
Tác động phối hợp của Auxin và cytokinin có tác dụng quyết định đến sự

phát triển và phát sinh hình thái tế bào và mô.Việc sử dụng tỷ lệ Auxin/cytokinin
trong môi trường nuôi cấy tác dụng quyết định đến sự phân hóa của mô theo
hướng tạo rễ, tạo chồi hay mô sẹo. Cytokinin được tổng hợp ở rễ và hạt đang
phát triển, được vận chuyển từ dưới lên trên.
* Gibberellin
Gibberellin được phát hiện đầu tiên bời nhà nghiên cứu người Nhật
Kurasawa (1920) khi nghiên cứu bệnh ở mạ lúa do nấm Gibberella Fujikuroi gây
ra. Năm 1939 đã tách chiết được Gibberellin từ nấm G. Fujikuroi và được gọi là
Gibbellin. Gibberellin kích thích mạnh mẽ sự sinh trưởng kéo dài của thân, sự
vươn dài của lóng cây họ lúa. Hiệu quả này có được là do ảnh hưởng kích thích
đặc trưng của Gibberellin lên pha giãn của tế bào theo chiều dọc. Tới nay đã phát
hiện được trên 60 loại chất khác nhau thuộc nhóm Gibberellin acid. Loại
Gibberelin thông dụng nhất trong nuôi cấy mô là GA3 có tác dụng kích thích nảy
mầm của các loại hạt khác nhau, kéo dài các lóng đốt thân cành. Bên cạnh đó
GA3 còn có tác dụng phá ngủ của các phôi, ức chế tạo rễ phụ (Picrick, 1987).
Ngoài ra, còn có tác dụng ảnh hưởng đến sự ra hoa của một số thực vật và có tác
dụng rút ngắn thời gian sinh trưởng dinh dưỡng của cây [28].


-20-

2.3.3. Môi trường vật lý
Trong nuôi cấy mô tế bào các yếu tố của môi trường vật lý được quan tâm
đó là ánh sáng, độ ẩm, nhiệt độ.
* Ánh sáng
Đây là yếu tố cần thiết cho sự phát triển và phát sinh hình thái của mô nuôi
cấy. Ánh sáng có ảnh hưởng tới mẫu cấy thông qua thời gian chiếu sáng, cường
độ ánh sáng và chất lượng ánh sáng. Thời gian chiếu sáng vai trò quan trọng
trong quá trình phát triển của mô.
Cường độ ánh sáng ảnh hưởng đến quá trình phát sinh hình thái mô nuôi

cấy, cường độ ánh sáng cao kích thích sinh trưởng của mô sẹo trong khi cường
độ thấp gây nên sự tạo chồi (Ammirato, 1986). Nhìn chung, cường độ ánh sáng
thích hợp cho nuôi cấy mô từ 1000 – 7000 lux [27].
Bên cạnh thời gian chiếu sáng cường độ ánh sáng thì chất lượng ánh sáng
cũng ảnh hưởng khá rõ tới sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy. Ánh sáng đỏ
làm tăng chiều cao của thân chồi hơn so với ánh sáng trắng, còn ánh sáng xanh
thì ức chế sự vươn cao của chồi nhưng lại ảnh hưởng tới sự sinh trưởng của mô
sẹo. Chính vì vậy mà phòng thí nghiệm thường sử dụng ánh sáng của đen huỳnh
quang với cường độ 1000 - 3000 lux.
* Nhiệt độ
Là nhân tố ảnh hưởng rõ rệt đến sự phân chia tế bào và các quá trình trao
đổi chất của mô nuôi cấy, đồng thời nó có ảnh hưởng tới sự hoạt động của Auxin,
do đó làm ảnh hưởng đến khả năng ra rễ của cây mô. Tùy thuộc vào xuất xứ của
mẫu nuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độ cho phù hợp. Nhìn chung nhiệt độ thích
hợp nhất cho sự sinh trưởng tốt ở nhiều loài cây là 250C [27].
* Độ ẩm


-21-

Trong các bình nuôi cấy thì độ ẩm tương đối luôn bằng 100% nên ta không
cần phải quan tâm nhiều đến độ ẩm khi nuôi cấy mô.
2.3.4 Điều kiện vô trùng
Thiết lập trạng thái vô trùng là tiền đề quan trọng hàng đầu cho thành công
của nuôi cấy mô thực vật. Nếu điều kiện này không được đảm bảo thì mẫu nuôi
cấy hoặc môi trường sẽ bị nhiễm, mô nuôi cấy sẽ bị chết. Do đó, trong toàn bộ
quá trình nuôi cấy invitro cần đảm bảo điều kiện vô trùng tuyệt đối. Muốn đảm
bảo điều kiện vô trùng cần có phương pháp khử trùng mẫu thích hợp, phương
tiện khử trùng hiện đại, phòng nuôi cấy vô trùng, chọn đúng phương pháp khử
trùng sẽ cho tỷ lệ sống cao, môi trường dinh dưỡng thích hợp sẽ đạt tốc độ sinh

trưởng nhanh.
Nồi hấp tiệt trùng: dùng áp suất hơi nước và nhiệt độ cao để tiệt trùng dụng
cụ và môi trường nuôi cấy.
Box cấy vô trùng: là một không gian tác nghiệp vô trùng tối đa cho các
hoạt động cấy chuyển. Đây là thiết bị lọc không khí vô trùng. Tạo buồng không
khí sạch để thực hiện các thao tác trong điều kiện vô trùng nhờ màng lọc ngăn
cản tất cả các vật có kích thước lớn hơn 0,2 - 0,3mm [23].
Dung dịch khử trùng: vô trùng mẫu cấy là một thao tác khó, ít khi thành
công ngay trong lần khử trùng đầu tiên. Tuy vậy nếu kiên trì tìm được nồng độ
thích hợp và thời gian vô trùng thích hợp thì sau vài lần thử chắc chắn sẽ đạt kết
quả tốt. Để khử trùng vật liệu đưa vào nuôi cấy ngươi ta thường sừ dụng các
dung dịch như HgCl2 (clrua thủy ngân), NaHCl 10%, nước Clolox, cồn 750… để
khủ trùng. [23]
2.4. Các giai đoạn chính trong quá trình nhân giống
Giai đoạn 1: Giai đoạn chuẩn bị


-22-

Mục đích tạo ra được nhiều mẫu sạch nhất có khả năng sống cao nhất để từ
đó tạo ra được nhiều chồi nhân ban đầu nhất. Mẫu đưa từ bên ngoài vào phải
đảm bảo các yêu cầu không bị thâm, dập nát, đảm bảo tiêu chuẩn của mẫu cấy,
tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, tạo nhiều mẫu sạch, sinh trưởng phát triển bình
thường, không dị dạng [18].
Giai đoạn 2: Giai đoạn cấy khởi động
Nuôi cây đầu tiên khi tách tế bào, mô hoặc mẫu vật từ cơ thể ban đầu (cây
mẹ) tính đến khi cấy chuyển hữu hiệu lần đầu, từ đó sẽ thu được chồi nhân ban
đầu.
Mục đích của giai đoạn này là tái sinh một cách định hướng sự phát triển
của mô nuôi cấy từ đó tạo ra các chồi mới từ mô nuôi cấy. Khi có nguồn nguyên

liệu nuôi cấy, cần tiến hành lấy mẫu và xử lý trong những điều kiện vô trùng.
Người ta thường dùng các loại hóa chất như HgCl2, H2O2, NaOCl… để khử
trùng mẫu cấy. Tùy thuộc vào từng loại vật liệu mà chọn hóa chất, nồng độ và
thời gian khử trùng thích hợp.
Quá trình này được điều khiển chủ yếu bằng các chất điều hòa sinh trưởng
(tỷ lệ auxin/cytokinin) đưa vào môi trường nuôi cấy. Tuy nhiên bên cạnh đó
cũng phải quan tâm đến tuổi của mẫu đem vào nuôi cấy. Thường các mô non,
chưa phân hóa có khả năng tái sinh cao hơn những mô đã chuyển hóa [18].
Giai đoạn 3: Giai đoạn nhân nhanh chồi
Nhân nhanh chồi là quá trình kích thích chồi nhân ban đầu nảy mầm từ vật
liệu nuôi cấy phát sinh được nhiều chồi nhất trong thời gian ngắn nhất [18].
Đây là giai đoạn cực kỳ quan trọng, nó quyết định tốc độ và hiệu quả của
quá trình nhân giống invitro. Nguyên liệu của nhân nhanh chồi là các cụm chồi
và chồi non nảy mầm từ mẫu cấy và từ các cụm chồi và chồi non đã qua cấy