giới thiệu về kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật

KỸ THUẬT CỐ ĐỊNH TẾ
BÀO VI SINH VẬT
Ths. Bùi Hồng Quân
09.09.25.24.19/09.17.27.26.25
Email:
Website: www.buihongquan.tk
GBD giữ gìn màu xanh cho quê hương, xây dựng tương lai từ chất lượng cuộc sống


ĐỊNH NGHĨA
• Sự cố định tế bào vi sinh vật là quá trình gắn tế bào vi
sinh vật vào phase riêng biệt tách khỏi phase tự do
của dung dịch, nhưng vẫn có khả năng trao đổi chất
với các phân tử cơ chất có mặt trong phase tự do nói
trên
• Cố định vi sinh vật là việc gắn tế bào vi sinh vật vào
chất mang không hòa tan trong nước. Tế bào sau khi
cố định có thể sử dụng nhiều lần, không lẫn vào sản
phẩm và có thể chủ động ngừng phản ứng mong
muốn


PHÂN LOẠI CÁC PHƯƠNG PHÁP
•
•
•
•

Trên bề mặt chất mang
Trong lòng chất mang
Không mang chất mang

Một số phương pháp khác: gel lạnh sâu, cố
định liên hợp, nhờ photopolymer


CHẤT MANG CỐ ĐỊNH TẾ BÀO
• Vai trò:
– Đóng vai trò quyết định lựa chọn phương pháp
– Quyết định tính hiệu quả của quá trình cố định


YÊU CẦU
• Điểm quan tâm đầu tiên khi lựa chọn chất mang là
phải rẻ tiền. Điều này liên quan đến hiệu quả kinh tế
của quy trình công nghệ, đặc biệt là khi quy trình đó
ứng dụng vào quy mô công nghiệp
• Chất mang phải có tính chất cơ lý bền vững, ổn định.
Nhờ đó mà chất mang mới chịu được các điều kiện
môi trường như khuấy trộn, áp lực trong quy trình sản
xuất
• Về mặt hóa học chất mang phải bền vững, không tan
trong môi trường phản ứng
• Chất mang không được làm mất hay ức chế hoạt tính
enzyme của vi sinh vật


YÊU CẦU
• Chất mang phải có tính kháng khuẩn cao, bền vững với
sự tấn công của vi sinh vật
• Phù hợp hình dạng thiết bị phản ứng sinh học
• Chất mang phải được chọn lọc sao cho cố định vi sinh

vật dễ dàng
• Chất mang có thể sử dụng nhiều lần
• Chất mang phải an toàn cho môi trường sống
• Chất ang phải có độ trương tốt, có diện tích bề mặt tiếp
xúc lớn. Tính chất này của chất mang vừa tăng khả
năng cố định vi sinh vật vừa tăng khả năng tiếp xúc của
cơ chất với enzyme, nhờ đó làm tăng hoạt tính enzyme
và số lần tái sử dụng
• Chất mang có thể có cấu trúc siêu lỗ, lỗ xốp, dạng hạt,
dạng màng, dạng phim mỏng


PHÂN LOẠI
• Polysaccharide:
cellulose,
alginate,
carrageenan…
• Protein: collagen, keratin…
• Hữu
cơ
tổng
hợp:
polysaccharide,
polyvinylacetate…
• Vô cơ tự nhiên: than hoạt tính, zeolit,
silicate…
• Vô cơ tổnh hợp: silicagel, Al2O3…


ƯU ĐIỂM CỦA TẾ BÀO CỐ ĐỊNH

•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•

Mật độ tế bào cao
Sản phẩm sạch
Có thể tái sử dụng nhiều lần
Chịu được sự tác động bên ngoài
Điều chỉnh được kích thước khối vi sinh vật cố định phù hợp
với môi trường phản ứng, reactor
Enzyme của tế bào vẫn xúc tác phản ứng hóa sinh, không tan
trong nước
Kích thước thiết bị nhỏ, gọn
Quá trình sản xuất liên tục, tế bào vi sinh vật không bị rửa trôi
Sử dụng được nhiều loại cơ chất, quy trình thiết kế đơn giản
hơn
Chất lượng sản phẩm đồng đều
Tế bào cố định được bảo vệ ít bị ức chế bởi cơ chất và sản
phẩm cuối


NHƯỢC ĐIỂM CỦA TẾ BÀO CỐ ĐỊNH

• Hoạt lực thấp hơn tế bào tự do
• Trong môi trường phản ứng sử dụng tế bào cố định,
không thể không tránh khỏi hiện tượng rửa trôi tế bào
ra khỏi chất mang. Các tế bào này sẽ lẫn vào sản
phẩm, dẫn đến khó khăn trong việc chiết tách, tinh
sạch sản phẩm, gây tốn kém chi phí
• pH hoạt động tối ưu bị chuyển dịch sang kiềm hay
acid so với tế bào bình thường
• Tế bào cố định cũng đòi hỏi về dinh dưỡng đầy đủ để
có thể hoạt động bình thường, thực hiện trao đổi chất.
• Cơ chất muốn vào trong tế bào để thực hiện trao đổi
chất tạo ra sản phẩm phải qua chất mang, thành tế
bào, màng tế bào…Các chất này ảnh hưởng đến sự
thẩm thấu vào và ra của cơ chất và sản phẩm


CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN
TẾ BÀO CỐ ĐỊNH
• Bản thân chất mang polymer ngăn cản sự khuếch tán
tự do của các phân tử theo hướng tới enzyme cũng
như đi khỏi enzyme từ đó ảnh hưởng tới hiệu quả xúc
tác của enzyme
• Nếu cố định trên chất mang có phân tử lượng cao:
giảm đáng kể hoạt tính của chúng trên bề mặt so với
các chất mang có phân tử lượng thấp
• Các tính chất lý hoc của chất mang: tính kỵ nước, háo
nước, hòa tan, bền cơ học…đều ảnh hưởng nhất định
đến khả năng cố định
• Bản chất hóa học của chất mang cũng ảnh hưởng
đáng kể tới khả năng hấp phụ lên cơ chất

Ảnh hưởng của sự khuếch tán cơ
chất, sản phẩm và các phân tử khác
• Tốc độ khuếch tán cơ chất, sản phẩm và các chất
khác phụ thuộc vào các yếu tố:
– Kích thước lỗ gel của chất mang polymer
– Trọng lượng phân tử của cơ chất
– Sự chênh lệch nồng độ giữa vùng môi trường
vi mô xung quanh vi sinh vật và dung dịch tự
do
– Những giới hạn khuếch tán có thể được thể
hiện ở 2 dạng hàng rào khuếch tán bên ngoài và
bên trong


Ảnh hưởng của sự khuếch tán cơ
chất, sản phẩm và các phân tử khác
• Rào khuếch tán bên ngoài xuất hiện là do có sự tồn
tại của lớp mỏng dung môi bao xung quanh hạt
polymer
• Các chất khuếch tán vào lớp này nhờ sự kết hợp của
khuếch tán phân tử thụ động và sự đối lưu
• Độ dày của lớp phụ thuộc vào tốc độ khuấy trộn dung
dịch xung quanh các hạt chứa tế bào cố định
• Việc gia tăng tốc độ pha trộn sẽ làm giảm rào khuếch
tán bên ngoài
• Trong bất kỳ quy trình công nghệ nào, tốc độ khuấy
đảo đóng vai trò hết sức quan trọng

Ảnh hưởng của vi sinh vật
• Thành phần hóa học, cấu tạo màng ế bào, kích thước,
hình dạng…của những loài vi sinh vật khác nhau sẽ
ảnh hưởng khác nhau đến việc lựa chọn kỹ thuật cố
định tế bào đó vào chất mang
• Bản chất hay hình dạng loài vi sinh vật sẽ quyết định
kiểu liên kết và độ bền kiểu liên kết hình thành giữa
tế bào vi sinh vật và chất mang
• Trạng thái sinh lý cũng như hoạt tính của loài vi sinh
vật ảnh hưởng đến liên kết và độ bền của những liên
kết đó.


CÁC PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH
TẾ BÀO VI SINH VẬT
• Yêu cầu chung của các phương pháp cố định tế
bào vi sinh vật:
–
–
–
–

Đơn giản
Độ lặp lại lớn
Không gây biến tính
Cho phép dễ dàng kiểm soát được số lượng tế bào
cố định
– Các tế bào không bị rửa trôi khỏi chất mang trong
quá trình sử dụng hoặc bảo quản

PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH TẾ BÀO VI
SINH VẬT TRÊN BỀ MẶT CHẤT MANG
• PHƯƠNG PHÁP LIÊN KẾT CỘNG HÓA TRỊ
• PHƯƠNG PHÁP HẤP PHỤ


PHƯƠNG PHÁP LIÊN KẾT CỘNG
HÓA TRỊ
• Định nghĩa: bản chất liên kết cộng hóa trị là nối tế
bào với chất mang thông qua “cầu nối”. Cầu nối
này phải có kích thước không lớn lắm và có hai
đầu, một đầu nối polymer, đầu kia nối tế bào
• Chất mang: cellulose, dẫn xuất của cellulose,
agarose, silicagel, bentonit…
• Cách tiến hành:
– Theo một giai đoạn: chất mang có khả năng
liên kết trực tiếp tế bào. Việc gắn sẽ hiệu quả
hơn nếu diện tích của tế bào và chất mang có
dấu ngược nhau
– Theo hai giai đoạn: hoạt hóa chất mang.
Thường được ứng dụng để cố định enzyme


PHƯƠNG PHÁP HẤP PHỤ
• Định nghĩa: ???. Trong quá trình cố định vi
sinh vật bằng cách hấp phụ có các liên kết sau
được hình thành:
– Liên kết tĩnh điện Van der walls: giữa tế bào và bề

mặt chất mang tạo nên một sự chênh lệch điện thế
giữa bề mặt chất mang và bề mặt tế bào giúp tế
bào và chất mang gắn liền nhau.
– Liên kết mao quản: chất mang có các mao quản,
khi được ngâm trong các huyền phù vi sinh vật sẽ
hình thành các lực mao quản kéo huyền phù vi
sinh vật vào trong long chất mang
– Liên kết ion: bề mặt chất mang và vi sinh vật có
mang các ion trái dấu, nhờ vậy tế bào vi sinh vật
liên kết chất mang


PHƯƠNG PHÁP HẤP PHỤ
• Chất mang:
– Chất mang không có cấu trúc xốp: thủy tinh
– Chất mang không có cấu trúc lỗ xốp: than
hoạt tính
– Chất mang có điện tích: nhựa trao đổi ion

• Cách tiến hành:
– Phương pháp cổ điển
– Phương pháp cổ điển có cải tiến
– Phương pháp bơm canh trường vi sinh vật
qua cột chứa chất mang


PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH TẾ BÀO VI
SINH VẬT TRONG CẤU TRÚC GEL
• Định nghĩa:
– Polymer tạo màng lưới bao xung quanh tế bào

– Mạng lưới này có lỗ nhỏ tới mức không cho tế bào
chui ra khỏi mạng, nhưng đồng thời đủ lớn cho cơ chất
và sản phẩm tạo ra có thể ra vào dễ dàng
• Các phương pháp:
– Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trong ion gel
– Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trong covalent
gel
– Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trong cryogel
– Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trong noncovalent gel


CỐ ĐỊNH TẾ BÀO KHÔNG CHẤT MANG

• Cố định tế bào vi sinh vật bằng liên kết
chéo giữa các tế bào vi sinh vật
• Cách tiến hành:
– Các tế bào liên kết với nhau tạo thành khối
tế bào
– Tác nhân liên kết: glutaraldehyde, toluene,
diisocyanate, hexamethylene
• Vai trò của các tác nhân:
– Tính thẩm thấu nhanh vào tế bào vi sinh vật
– Phản ứng được với thành tế bào vi sinh vật


CỐ ĐỊNH TẾ BÀO KHÔNG CHẤT MANG
• Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật bằng
màng chắn membrane:
• Ví dụ tế bào vi khuẩn A.xylinum trong mạng
lưới cellulose, tế bào nấm men cố định trong

mạng lưới cellulose


CỐ ĐỊNH TẾ BÀO TRÊN CHẤT
MANG ALGINATE
• Tính chất tạo gel của dung dịch alginate:
– Một trong những tính chất quan trọng của
alginate là khả năng tạo gel ở những điều
kiện nhất định
– Khi cho kết hợp cation hóa trị II và III,
thường dung nhất là Ca2+ sẽ xuất hiện vùng
nối giữa các mạch phân tử alginate và tạo
gel theo mô hình “hộp trứng”


CỐ ĐỊNH TẾ BÀO TRÊN CHẤT
MANG ALGINATE
• Phương pháp cố định sử dụng chất mang alginate:
– Alginate được ứng dụng làm chất cố định tế bào do
có những đặc điểm: alginic acid là polyanion nên dễ
dàn khâu mạch tạo gel trong dung dịch CaCl2 và
KCl, alginic acid có khả năng bao xung quanh tế bào
– Phương pháp cố định tế bào dung chất mang alginate
phổ biến là phương pháp bẫy tế bào trong lòng chất
mang
– Hỗn hợp huyền phù của tế bào vi sinh vật và chất
mang alginate được nhỏ vào dung dịch đa diện để
thực hiện phản ứng tạo mạng lưới gel
– Qua đó, tế bào vi sinh vật sẽ được cố định trong hệ
thống mạng lưới vừa được hình thành

CỐ ĐỊNH TẾ BÀO TRÊN CHẤT
MANG CARRAGEENAN
• Chất mang carageenan:
– Carrageenan là những phân tử polymer
mạch thẳng, gồm ~ 25000 dẫn xuất
galactose được sắp xếp một cách cân đối
– Tính chất tạo gel của carrageenan:
– Một trong những tính chất quan trọng nhất
là khả năng tạo gel
– Carrageenan hình thành gel trong điều kiện
làm lạnh dung dịch nóng chứa một số loại
cation, đặc biệt là K+ và Ca2+


CỐ ĐỊNH TẾ BÀO TRÊN CHẤT
MANG CARRAGEENAN
• Được thực hiện theo phương pháp nhốt trong
long chất mang
– Làm lạnh đông huyền phù tế bào và carrageenan
xuống nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ nóng chảy
– Hỗn hợp huyền phù của tế bào vi sinh vật và chất
mang carrageenan được nhỏ vào dung dịch đa diện
để thực hiện phản ứng tạo mạng lưới gel

• Tế bào vi sinh vật sẽ được cố định trong hệ
thống mạng lưới vừa đựơc hình thành