nghiên cứu quy trình nhân giống in vitro cây sâm nam núi dành

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGUYỄN THỊ MINH HIỀN

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO
CÂY SÂM NAM NÚI DÀNH

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ SỐ: 60.42.02.01

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1. TS. ĐINH TRƯỜNG SƠN
2. PGS.TS. NGUYỄN THỊ LÝ ANH

HÀ NỘI, NĂM 2015


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả
trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan, nghiêm túc và chưa từng được
ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Nếu có gì sai sót, tôi xin chịu hoàn
toàn trách nhiệm.
Tác giả

Nguyễn Thị Minh Hiền

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page i


LỜI CẢM ƠN
Hoàn thành luận văn này, trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến
PGS.TS. Nguyễn Thị Lý Anh và TS. Đinh Trường Sơn, đã quan tâm giúp đỡ và
hướng dẫn tận tình.
Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn tới các cán bộ, giảng viên của Viện Sinh
học Nông nghiệp và Khoa Công nghệ Sinh học của Học viện Nông nghiệp Việt
Nam đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn ông Vũ Văn Tĩnh, Giám đốc Trung tâm Khoa
học Công nghệ và Môi trường huyện Tân Yên, tỉnh Bắc Giang, ông Trần Đình
Dũng, Phó Giám đốc Trung tâm Khoa học Công nghệ và Môi trường huyện Tân
Yên, tỉnh Bắc Giang đã nhiệt tình giúp đỡ, cung cấp thông tin, hạt giống và cây
giống Sâm nam núi Dành để chúng tôi có thể thực hiện đề tài này.
Tôi xin cảm ơn các đồng nghiệp, bạn bè đã nhiệt tình động viên, hỗ trợ tôi
hoàn thành luận văn.
Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn đến những người thân trong gia
đình đã đóng góp một phần không nhỏ trong việc hoàn thành luận văn này.
Hà Nội, ngày 02 tháng 6 năm 2015
Tác giả

Nguyễn Thị Minh Hiền

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page ii

MỤC LỤC
Trang
Lời cam đoan

i

Lời cảm ơn

ii

Mục lục

iii

Danh mục bảng

vi

Danh mục hình

vii

Danh mục các cụm từ và kí hiệu viết tắt

viii

MỞ ĐẦU

1

1

Đặt vấn đề

1

2

Mục đích, yêu cầu

2

2.1

Mục đích

2

2.2

Yêu cầu

2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

3

1.1

Giới thiệu về cây Sâm nam núi Dành

3

1.1.1

Điều tra cây Sâm nam núi Dành ngoài tự nhiên

4

1.1.2

Sơ bộ phân loại thực vật cây Sâm nam núi Dành

5

1.2

Công nghệ nuôi cấy mô, tế bào thực vật

8

1.2.1

Khái niệm về nuôi cấy mô, tế bào thực vật

8

1.2.2

Cơ sở của kĩ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật

8

1.2.3

Các bước chính trong nhân giống vô tính in vitro

9

1.2.4

Các phương thức nhân giống vô tính in vitro

10

1.2.5

Ý nghĩa nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô, tế bào

11

1.2.6

Một số nhân tố ảnh hưởng tới quá trình nuôi cấy mô, tế bào thực vật

13

1.2.7

Ứng dụng của nhân giống in vitro trong nhân giống cây thuốc và một
số loại cây trồng khác

1.3

18

Một số kết quả nổi bật về nghiên cứu thành phần hoạt chất và nhân
giống vô tính in vitro một số loài thuộc chi Millettia

Chương 2

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

19
22

2.1

Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu

22

2.1.1

Đối tượng và vật liệu nghiên cứu

22

2.1.2

Địa điểm và thời gian nghiên cứu

23

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page iii


2.2

Nội dung nghiên cứu

23

2.2.1

Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nền đến sự sinh trưởng và
phát triển của cây Sâm nam núi Dành

2.2.2

23

Nghiên cứu ảnh hưởng của độ pH môi trường đến sự sinh trưởng và
phát triển của cây Sâm nam núi Dành

2.2.3

23

Nghiên cứu ảnh hưởng của đất núi Dành đến sự sinh trưởng và
phát triển của cây Sâm nam núi Dành

2.2.4

24

Nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi
Sâm nam núi Dành

2.2.5

24

Nghiên cứu sự phát sinh hình thái của lớp mỏng tế bào mô lá Sâm nam
núi Dành

25

2.2.6

Nghiên cứu sự phát sinh hình thái của callus Sâm nam núi Dành

26

2.2.7

Nghiên cứu sự hình thành rễ của chồi Sâm nam núi Dành

28

2.2.8

Nghiên cứu ảnh hưởng của αNAA đến sự tái sinh tạo củ của lớp
mỏng tế bào mô lá Sâm nam núi Dành

29

2.3

Phương pháp nghiên cứu

29

2.3.1

Khử trùng mẫu và tạo nguồn mẫu ban đầu từ hạt

29

2.3.2

Bố trí thí nghiệm

30

2.3.3

Điều kiện nuôi cấy

30

2.3.4

Các chỉ tiêu theo dõi

30

2.3.5

Phương pháp xử lý số liệu

31

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1

32

Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nền đến sự sinh trưởng và
phát triển của cây Sâm nam núi Dành

3.2

32

Nghiên cứu ảnh hưởng của độ pH môi trường đến sự sinh trưởng và

phát triển của cây Sâm nam núi Dành

3.3

34

Nghiên cứu ảnh hưởng của đất núi Dành đến sự sinh trưởng và phát
triển của cây Sâm nam núi Dành

3.4

35

Nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi Sâm nam
núi Dành

3.5

37

Nghiên cứu sự phát sinh hình thái của lớp mỏng tế bào mô lá Sâm nam
núi Dành

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

38

Page iv

3.5.1

Nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4-D đến sự phát sinh hình thái của lớp
mỏng tế bào mô lá Sâm nam núi Dành

3.5.2

Nghiên cứu ảnh hưởng của αNAA đến sự phát sinh hình thái của lớp
mỏng tế bào mô lá Sâm nam núi Dành

3.5.3

39
40

Nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến sự phát sinh hình thái của lớp
mỏng tế bào mô lá Sâm nam núi Dành

42

3.6

Nghiên cứu sự phát sinh hình thái của callus Sâm nam núi Dành

43

3.6.1

Nghiên cứu ảnh hưởng của picloram đến sự phát sinh hình thái của
callus Sâm nam núi Dành

3.6.2

Nghiên cứu ảnh hưởng phối hợp của BA, αNAA và ABA đến sự
phát sinh hình thái của callus Sâm nam núi Dành

3.6.3

45

Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn mẫu nuôi cấy và nồng độ đường
đến sự phát sinh hình thái của callus Sâm nam núi Dành

3.6.4

44

47

Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNO3 đến sự phát sinh hình thái của
callus Sâm nam núi Dành

49

3.7

Nghiên cứu sự hình thành rễ của chồi Sâm nam núi Dành

51

3.7.1

Nghiên cứu ảnh hưởng của αNAA đến sự hình thành rễ của chồi
Sâm nam núi Dành

3.7.2

Nghiên cứu ảnh hưởng của αNAA và IBA đến sự hình thành rễ của
chồi Sâm nam núi Dành

3.7.3

51
52

Nghiên cứu ảnh hưởng của αNAA đến sự tái sinh tạo củ của lớp mỏng
tế bào mô lá Sâm nam núi Dành

54

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

57

1

Kết luận

57

2

Kiến nghị

57

TÀI LIỆU THAM KHẢO

58

PHỤ LỤC

62

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page v


DANH MỤC BẢNG
STT
3.1

Tên bảng

Trang

Ảnh hưởng của môi trường nền đến sinh trưởng và phát triển của cây
Sâm nam núi Dành (sau 6 tuần nuôi cấy)

3.2

33

Ảnh hưởng của độ pH môi trường đến sự sinh trưởng và phát triển của
cây Sâm nam núi Dành (sau 8 tuần nuôi cấy)

3.3

35

Ảnh hưởng của đất núi Dành đến sự sinh trưởng và phát triển của
cây Sâm nam núi Dành (sau 12 tuần nuôi cấy)

3.4

36

Ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi cây Sâm nam
núi Dành (sau 8 tuần nuôi cấy)

3.5

37

Ảnh hưởng của 2,4-D đến sự phát sinh hình thái của lớp mỏng tế
bào mô lá Sâm nam núi Dành (sau 8 tuần nuôi cấy)

3.6

39

Ảnh hưởng của αNAA đến sự phát sinh hình thái của lớp mỏng tế
bào mô lá Sâm nam núi Dành (sau 8 tuần nuôi cấy)

3.7

41

Ảnh hưởng của BA đến sự phát sinh hình thái của lớp mỏng tế bào
từ mô lá Sâm nam núi Dành (sau 8 tuần nuôi cấy)

3.8

42

Ảnh hưởng của picloram đến sự phát sinh hình thái của callus Sâm nam
núi Dành (sau 5 tuần nuôi cấy)

3.9

44

Ảnh hưởng phối hợp của BA, αNAA và ABA đến sự phát sinh hình
thái của callus Sâm nam núi Dành (sau 6 tuần nuôi cấy)

3.10

46

Ảnh hưởng của nguồn mẫu nuôi cấy và nồng độ đường đến sự phát sinh
hình thái của callus Sâm nam núi Dành (sau 6 tuần nuôi cấy)

3.11

48

Ảnh hưởng của AgNO3 đến sự phát sinh hình thái callus Sâm nam
núi Dành (sau 6 tuần nuôi cấy)

3.12

50

Ảnh hưởng của αNAA đến sự hình thành rễ của chồi Sâm nam
núi Dành (sau 8 tuần nuôi cấy)

3.13

51

Ảnh hưởng của αNAA và IBA đến sự hình thành rễ của chồi Sâm nam
núi Dành (sau 6 tuần nuôi cấy)

3.14

53

Ảnh hưởng của αNAA đến sự tái sinh tạo củ của lớp mỏng tế bào
mô lá Sâm nam núi Dành (sau 12 tuần nuôi cấy)

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

55

Page vi


DANH MỤC HÌNH
STT

Tên hình

Trang

1.1

Hoa và quả Sâm nam núi Dành

3

1.2

Củ Sâm nam núi Dành

3

1.3

Tiêu bản Callerya nitida (Benth.) Geesink tại vườn thực vật Kew ở

nước Anh

6

1.4

Hình thái của một số loài thuộc chi Callerya

7

3.1

Cây Sâm nam núi Dành trong các môi trường nuôi cấy (sau 6 tuần
nuôi cấy)

3.2

33

Sự tái sinh tạo callus của lớp mỏng tế bào mô lá Sâm nam núi Dành
trên môi trường có bổ sung 2,4-D (sau 8 tuần nuôi cấy)

40

3.3

Các hình thái callus tái sinh từ lớp mỏng tế bào mô lá Sâm nam núi Dành

41

3.4

Sự tái sinh tạo callus của lớp mỏng tế bào mô lá Sâm nam núi Dành
trong môi trường có bổ sung BA (sau 8 tuần nuôi cấy)

3.5

43

Ảnh hưởng của picloram đến sự phát sinh hình thái của callus Sâm
nam núi Dành (sau 5 tuần nuôi cấy)

3.6

45

Callus Sâm nam núi Dành từ 3 nguồn mẫu khác nhau (sau 6 tuần
nuôi cấy)

48

3.7

Sự hình thành rễ của chồi Sâm nam núi Dành (sau 12 tuần nuôi cấy)

53

3.8

Sự tái sinh tạo củ của lớp mỏng tế bào mô lá Sâm nam núi Dành trên

3 môi trường có bổ sung αNAA (sau 12 tuần nuôi cấy)

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

55

Page vii


DANH MỤC CÁC CỤM TỪ VÀ KÍ HIỆU VIẾT TẮT

Viết tắt

Viết đầy đủ

ABA

Abscisic acid

BA (6-BA)

Benzyladenine (6-Benzyladenine)

cs

Cộng sự

CT

Công thức

DCR

Douglas-fir cotyledon revised medium

2,4-D

2,4-dichlorophenoxyacetic acid

ĐC

Đối chứng

IAA

Indole-3- acetic acid

IBA

Indole-3-butyric acid

l

lít

LM

LM: Lloyd and McCown

MS

Murashige và Skoog (1962)

NXB

Nhà xuất bản

αNAA

Anpha-Naphthaleneacetic acid

TB

Trung bình

TN

Thí nghiệm

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page viii


MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Trong dân gian, sâm là tên gọi khái quát chỉ một số loài cây mà củ và rễ
được sử dụng làm thuốc từ rất lâu đời tại nhiều nước châu Á. Chính vì vậy, có rất
nhiều loài sâm thuộc nhiều chi, họ khác nhau nhưng chủ yếu là các loài thuộc chi
Sâm (Panax). Rất nhiều loại củ sâm có hình dáng hao hao giống hình người, đặc

biệt là nhân sâm; do đó một số vị thuốc khác không thuộc chi, họ sâm nhưng có
hình dáng củ tương tự cũng thường được gọi là sâm. Thêm vào đó, sâm là một vị
thuốc bổ nên nhiều vị thuốc khác có tác dụng bổ cũng được gọi là sâm hoặc gắn
với chữ sâm. Ở Việt Nam có nhiều loại thảo dược có tên sâm được sử dụng từ rất
lâu đời nhưng với công dụng khác nhau.
Sâm nam núi Dành - một loại sâm quý là sản vật tiến vua trong các triều đại
phong kiến xưa, hiện đang được nhân dân trong vùng thường dùng trong các bài
thuốc dân gian có thể chữa được rất nhiều bệnh. Trong sách “Đại Nam nhất thống
chí” có ghi: “Tên nỏ sản xuất tại Yên Thế. Cát sâm sẵn ở đỉnh núi Chung Sơn…”.
Núi Chung Sơn được nhắc tới đó là núi Dành thuộc 2 xã Việt Lập và Liên Chung,
huyện Tân Yên, tỉnh Bắc Giang. Ngoài tên Sâm nam núi Dành, cây sâm này còn
có tên gọi khác là Cát sâm hay Sâm Bảo Sơn (Kim Sa, 2012).
Tuy nhiên, việc nhân giống Sâm nam núi Dành trong tự nhiên gặp rất nhiều
khó khăn, hầu hết các hạt đem gieo đều không nảy mầm, khi giâm cành cho tỷ lệ
sống thấp, lại là giống sâm quý bị nhiều người săn tìm. Do đó, Sâm nam núi Dành
còn lại rất ít và đang đứng trước nguy cơ bị tuyệt chủng. Từ năm 2009, Trung tâm
Khoa học Công nghệ và Môi trường huyện Tân Yên, tỉnh Bắc Giang đã thực hiện đề
án nhân giống loại sâm quý này tại chính các gia đình đang sống ở khu vực núi
Dành, đến nay bước đầu đã cho kết quả khả quan. Mặc dù vậy, những kết quả điều
tra thực tế của chúng tôi cho thấy số lượng cây Sâm nam núi Dành nhân ra được
chưa tới một ngàn cây. Xuất phát từ những yêu cầu thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành
đề tài: “Nghiên cứu quy trình nhân giống in vitro cây Sâm nam núi Dành” nhằm
góp phần xây dựng quy trình nhân nhanh cây giống, bảo tồn và phát triển giống
Sâm nam núi Dành.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 1


2. Mục đích, yêu cầu

2.1. Mục đích
Bước đầu xây dựng quy trình nhân nhanh cây giống Sâm nam núi Dành
bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật.

2.2. Y êu cầu
- Tạo được nguồn vật liệu ban đầu (tạo cây in vitro sạch vi sinh vật).
- Xác định được phương thức và môi trường nuôi cấy phù hợp trong giai
đoạn nhân nhanh chồi.
- Xác định môi trường phù hợp trong giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 2


Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1. 1. Giới thiệu về cây Sâm nam núi Dành

Hình 1.1. Hoa và quả Sâm nam núi Dành

Hình 1.2. Củ Sâm nam núi Dành
(Hình ảnh được cung cấp bởi tác giả Trần Đình Dũng, Trung tâm Khoa học
Công nghệ và Môi trường huyện Tân Yên, tỉnh Bắc Giang)
Thông thường, để có thể có được phương pháp nghiên cứu cũng như cách
tiếp cận hợp lý nhằm xây dựng được quy trình nhân giống in vitro thì việc tham

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 3


khảo các công trình công bố có liên quan là vô cùng quan trọng. Tuy nhiên, Sâm nam
núi Dành là một đối tượng chưa được nghiên cứu ở Việt Nam. Chính vì vậy, việc tiếp
cận các kết quả nghiên cứu trong nước là vô cùng hạn chế. Thêm vào đó, bản thân
cây Sâm nam núi Dành cũng chưa được phân loại thực vật. Do vậy, việc định hướng
các tài liệu tham khảo trong và ngoài nước càng thêm khó khăn. Trước tình hình đó,
chúng tôi tiến hành điều tra và sơ bộ phân loại thực vật cây Sâm nam núi Dành nhằm
mục đích định hướng nghiên cứu cho có hiệu quả hơn.

1.1.1. Điều tra cây Sâm nam núi Dành ngoài tự nhiên
Sâm nam núi Dành được biết đến qua một số bài báo của tác giả Trần Đình
Dũng, Trung tâm Khoa học Công nghệ và Môi trường huyện Tân Yên, tỉnh Bắc
Giang, trong đó có bài “Săn lùng sâm quý tiến vua” trên báo điện tử An ninh Thủ
Đô ra ngày 30/8/2012, tác giả lấy bút danh là Kim Sa. Chúng tôi đã tìm gặp tác giả
Trần Đình Dũng và đến núi Dành trực tiếp điều tra, tìm hiểu sự tồn tại với những
câu chuyện về tác dụng của cây Sâm nam núi Dành tại gia đình ông Lư, ông Đông,
ông Cẩm và ông Thành, những gia đình trồng Sâm nam núi Dành có tiếng ở vùng.
Kết quả điều tra (bảng phụ lục 2) cho thấy, do Sâm nam núi Dành là một giống
sâm quý, bị nhiều người săn tìm, lại khó nhân giống ở ngoài tự nhiên nên một thời
gian dài người dân ở khu vực núi Dành không còn nhìn thấy cây sâm. Cách đây
gần hai chục năm, ông Nguyễn Khắc Lư, 62 tuổi, ở thôn Hậu, xã Liên Chung,
huyện Tân Yên, tỉnh Bắc Giang trong một lần cuốc đất trồng rừng tại núi Dành đã
cuốc phải những củ nhỏ có mùi thơm, ông nếm thử thấy ngọt mát, vốn là gia đình
có nghề làm thuốc Đông y nên ông Lư biết đó là sâm nam và ông giữ gìn từ đó
cho tới bây giờ. Cũng theo ông Lư, loại sâm này phải có từ trên 10 năm tuổi dùng
mới có tác dụng tốt. Từ gốc sâm ban đầu, ông Lư đã nhân ra và hướng dẫn một số
hộ dân khác trồng để giữ giống.

Sâm nam núi Dành còn có tên gọi khác là Cát sâm hay Sâm Bảo Sơn. Trung
tâm khoa học công nghệ và môi trường huyện Tân Yên (Bắc Giang) đã thực hiện
Đề án để nhân giống loại sâm quý này từ năm 2009 tại chính các gia đình đang sống
ở núi Dành. Tuy nhiên, hệ số nhân giống rất thấp. Hiện tại (năm 2015), làng Hậu có
khoảng 100 gốc sâm 3 lá và làng Đầm Sen, xã Việt Lập có trên 600 gốc sâm 5 lá.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 4


Từ xa xưa người dân trong vùng đã coi Sâm nam núi Dành như một loại
thần dược dùng để chữa bệnh và bồi bổ sức khỏe. Tuy nhiên, chưa có một nghiên
cứu khoa học cụ thể nào khẳng định điều này. Chính vì vậy, cần có những nghiên
cứu, đánh giá đồng thời tìm cách nhân giống để bảo tồn và phát triển loại thảo
dược quý này.

1.1.2. Sơ bộ phân loại thực vật cây Sâm nam núi Dành
Mô tả:
* Đặc điểm hình thái
Cây Sâm nam núi Dành là cây nhỡ leo, dài 1,5 - 5m hay hơn, cành non phủ
lông dày màu nâu nâu.
Lá kép lông chim, lá chét 3 - 7, hình bầu dục dài hay trái xoan, dài 3 - 8 cm,
rộng 1 - 3 cm, mặt trên xanh thẫm, mặt dưới xanh xám nâu; gân bên 5 - 6, dính
nhau ở gần mép lá (Hình 1.1).
Hoa sâm có màu trắng ngà, mùi thơm nhẹ, mọc thành chùm kép ở đầu cành
tạo thành chùy dài 10 - 20 cm, cuống có lông. Đài 5 mảnh dính với nhau, tràng 5
cánh không đều nhau, tiền khai hoa cờ: cánh cờ (ở trên) lớn nhất, có màu sắc đẹp
hơn và ở ngoài cùng, 2 cánh bên nhỏ hơn, trong cùng là 2 cánh thìa dính lại với
nhau ở đáy tạo thành cấu trúc tương tự như cái thuyền con mang nhị và nhụy. Nhị
10, 9 chiếc dính lại với nhau ở phần chỉ nhị thành 1 bó bao quanh nhụy, 1 chiếc rời.

Bầu nhụy lớn, 1 ô, mang 2 dãy noãn, khi phát triển được sẽ tạo ra quả (Hình 1.1).
Quả hình quả đậu dẹt, có lông mềm, hai vỏ của nó có thể tách đôi, bên
trong chứa nhiều hạt trong các khoang riêng rẽ. Hạt không có nội nhũ, phôi cong,
2 lá mầm dầy và lớn chứa nhiều chất dinh dưỡng.
Rễ củ nạc, có lớp vỏ bên ngoài hơi cứng, bên trong lõi màu vàng nhạt, mùi
thơm dịu và có vị hơi ngọt (Hình 1.2).
Công thức hoa: K(5)C5A(9)1G1
* Đặc điểm sinh thái:
Cây sinh trưởng mạnh trong mùa xuân và mùa hè. Mùa hoa vào tháng 6 - 9,
mùa quả vào tháng 9 - 12.
Cây mọc hoang ở vùng rừng núi chỗ dãi nắng, trong rừng thưa, trong lùm
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 5


cây bụi, ở độ cao 100 – 350 mét, thường leo trùm lên những cây bụi và cây gỗ
nhỏ. Theo người dân ở khu vực núi Dành kể lại, Sâm nam núi Dành tái sinh
chủ yếu bằng chồi sau khi đổ đất vào đốt của thân cây hoặc sau khi cắt lấy rễ củ,
phần gốc lấp đất vào là cây có thể tái sinh. Cây ưa đất ẩm mát, thành phần cơ giới
trung bình, nhiều mùn, tơi xốp và không chịu được đất bị úng.
Qua mô tả kết hợp với so sánh hình thái cũng như tham khảo ý kiến chuyên
gia là những nhà Thực vật học, chúng tôi kết luận cây Sâm nam núi Dành là một
loài cây thuộc Họ đậu.

Hình 1.3. Tiêu bản Callerya nitida (Benth.) Geesink
tại vườn thực vật Kew ở nước Anh
Kết hợp mô tả với so sánh hình thái thân, lá, hoa, quả, hạt… cho thấy cây
Sâm nam núi Dành có rất nhiều nét tương đồng với loài Callerya nitida. Bên
cạnh đó, khi so sánh với hình ảnh phân loại các cây thuộc chi Millettia, chúng

tôi cũng thấy có rất nhiều nét tương đồng của cây Sâm nam núi Dành với một
số loài thuộc chi này. Các chi Callerya Endl. được tách ra từ chi Millettia bởi
Geesink (1984) và Schot (1994) dựa trên hình dạng của cụm hoa. Thêm vào đó,

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 6


có một số chi khác trong
Tông

(tribus)

Millettieae

cũng có cụm hoa có hoa
hình chùy. Chính vì vậy,
việc phân loại giữa các loài
thuộc

Tông

Millettieae

thường khó khăn.
Từ những kết quả
quan sát và so sánh trên, do
không có được tiêu bản
chuẩn của các loài nên cho

đến bây giờ chúng tôi chỉ
khẳng định Sâm nam núi
Dành có thể thuộc chi
Millettia hoặc chi Callerya. Tuy nhiên, cần nghiên cứu kĩ hơn nữa để có thể đưa ra
kết luận chính xác tên loài của cây Sâm nam núi Dành.
Cây Sâm nam núi Dành có phân loại khoa học như sau:
PHÂN LOẠI KHOA HỌC:
Giới:

Plantar (Thực vật)

Ngành:

Magnoliophyta (Thực vật hạt kín – Ngọc lan)

Lớp:

Magnoliopsida (Thực vật hai lá mầm thực sự - Ngọc lan)

Phân lớp: Rosidae (Hoa hồng)
Bộ:

Fabales (Bộ đậu)

Họ:

Fabaceae (Họ đậu)

Phân họ: Faboideae (Phân họ đậu)
Chi:

Millettia (Chi thàn mát) hoặc Callerya (Chi thàn mát lưỡng thể)
Công dụng
Theo người dân ở khu vực núi Dành thì Sâm nam núi Dành được sử dụng

chủ yếu trong y học cổ truyền làm thuốc bổ mát, chữa nhức đầu, bí đái, ho, sốt…
Củ dùng dưới dạng tươi, ngâm rượu hoặc thuốc sắc uống.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 7


1.2. Công nghệ nuôi cấy mô, tế bào thực vật

1.2.1. Khái niệm về nuôi cấy mô, tế bào thực vật
Nuôi cấy mô, tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các
loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên các môi
trường dinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng, bao gồm:
Nuôi cấy cây non và cây trưởng thành
Nuôi cấy cơ quan (rễ, thân, lá, hoa, quả, noãn chưa thụ tinh)
Nuôi cấy phôi (phôi non và phôi trưởng thành)
Nuôi cấy mô sẹo (callus)
Nuôi cấy tế bào trần (protoplast)
Nuôi cấy tế bào đơn (huyền phù tế bào) (Nguyễn Quang Thạch và cs., 2005).

1.2.2. Cơ sở của kĩ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật
Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô, tế bào thực vật đó là tính toàn
năng của tế bào do Haberlandt nêu ra năm 1902. Theo quan niệm sinh học hiện đại
thì tính toàn năng của tế bào là mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa đều mang toàn bộ

lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cơ thể sinh vật đó. Khi gặp điều kiện
thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh.
Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật là kết
quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa của tế bào. Trong đó, sự phân hóa tế
bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô chuyên hóa, đảm nhận
các chức năng khác nhau. Tuy nhiên, khi các tế bào đã phân hóa thành các tế bào
có chức năng riêng biệt, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình.
Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế
bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ. Quá trình đó gọi là phản phân hóa tế bào,
ngược lại với sự phân hóa tế bào như sơ đồ sau:
Phân hóa tế bào
Tế bào phôi sinh

Tế bào
Tế bào
dãn dãn

Tế bào chuyên hóa

Phản phân hóa tế bào
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 8


Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt hóa, ức
chế các gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số
gen được hoạt hóa để biểu hiện tính trạng mới còn một số gen khác lại bị ức chế
hoạt động. Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc
phân tử ADN của mỗi tế bào, khiến quá trình sinh trưởng của cơ thể thực vật luôn

được hài hòa.
Như vậy, kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật xét cho cùng là kỹ
thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời
trong điều kiện nhân tạo và vô trùng) một cách định hướng dựa vào sự phân
hóa và phản phân hóa của tế bào trên cơ sở tính toàn năng của tế bào thực vật
(Nguyễn Quang Thạch và cs., 2005; Nguyễn Như Khanh, 2006).

1.2.3. Các bước chính trong nhân giống vô tính in vitro
Theo George (1993) quá trình nhân giống vô tính in vitro bao gồm các
bước sau:
Bước 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ
Trước khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận cây mẹ (nguồn
mẫu nuôi cấy). Các cây này cần phải sạch bệnh, đặc biệt là sạch vi rút và ở giai đoạn
sinh trưởng mạnh. Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi trường thích hợp với
chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi lấy mẫu nuôi cấy sẽ làm
giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh trưởng của mẫu cấy.
Bước 2: Nuôi cấy khởi động
Là giai đoạn khử trùng và đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro. Các giai đoạn này
cần đảm bảo các yêu cầu sau: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh
trưởng tốt. Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển của cây.
Mẫu cấy phù hợp nhất là đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách sau đó là đỉnh chồi hoa,
cuối cùng là đoạn thân, mảnh lá. Ngoài ra, người ta cũng có thể sử dụng hạt làm
nguồn mẫu để nuôi cấy khởi động tạo cây in vitro.
Bước 3: Nhân nhanh
Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh số
lượng thông qua các con đường: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định hay tạo phôi
vô tính. Chúng ta cần phải xác định được môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 9


hợp để có hiệu quả cao nhất. Theo nguyên tắc chung: môi trường có nhiều
cytokinin sẽ kích thích tạo chồi. Nhiệt độ nuôi cấy thường là 25 - 27oC thời gian
chiếu sáng 16 giờ/ngày với cường độ ánh sáng 2000 - 4000 lux. Tuy nhiên, đối với
mỗi loại đối tượng nuôi cấy đòi hỏi có chế độ ánh sáng nuôi cấy khác nhau.
Bước 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh
Để tạo rễ cho chồi người ta chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh sang
môi trường tạo rễ. Một số chồi có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi
trường nhân nhanh giàu cytokinin sang môi trường không chứa chất kích thích
sinh trưởng.
Bước 5: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên
Để đưa cây từ ống nghiệm ra vườn ươm với tỷ lệ sống cao, cây sinh trưởng
tốt cần đảm bảo yêu cầu sau: Cây trong ống nghiệm đã đạt những tiêu chuẩn hình
thái nhất định (số lá, số rễ, chiều cao cây, khối lượng tươi); có giá thể tiếp nhận
cây in vitro thích hợp, giá thể sạch, tơi xốp, thoát nước; có thể chủ động điều chỉnh
được độ ẩm, sự chiếu sáng vườn ươm cũng như có chế độ dinh dưỡng phù hợp
(Nguyễn Quang Thạch và cs., 2005; Lê Văn Hoàng, 2007).

1.2.4. Các phương thức nhân giống vô tính in vitro
Quá trình thực hiện nhân giống in vitro sẽ tạo ra các dòng vô tính. Theo
khái niệm chung về dòng vô tính trong chọn giống thì dòng vô tính là một nhóm
cá thể có kiểu gen tương tự nhau, chúng được nhân bằng sinh sản vô tính. Các
dòng vô tính này có thể được tạo ra theo các phương thức sau:
* Tái sinh cây trực tiếp
Là quá trình phát động những điểm tồn tại sẵn có trong mô nuôi cấy phân
chia và tái sinh thành cây. Xét về nguồn gốc các cây này có thể phát sinh từ chồi
đỉnh, chồi nách phá ngủ hoặc từ chồi mới phát sinh (Bhojwani, 1980). Các cây con
này được phát sinh từ các đỉnh sinh trưởng có bộ nhiễm sắc thể 2n, hoàn toàn đồng

nhất về mặt di truyền và duy trì được các tính trạng của cây mẹ. Tái sinh trực tiếp
cũng có thể xuất phát từ những tế bào không nằm trên đỉnh sinh trưởng đó là các
đoạn thân, mảnh lá, cuống lá, mảnh hoa… Trong trường hợp này, các tế bào
thường phân chia nhưng không hình thành các tế bào mô sẹo mà tạo thành các
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 10


điểm sinh trưởng phụ sau đó tái sinh thành cây con. Xác suất biến dị và đột biến
thường cao hơn so với tái sinh từ đỉnh sinh trưởng (Đỗ Năng Vịnh, 2002).
* Tái sinh gián tiếp
Mẫu cấy khi nuôi cấy trong môi trường thích hợp có chứa auxin và cytokinin
có thể đem lại sự gia tăng thành khối tế bào không tổ chức. Đó chính là các tế bào mô
sẹo. Sự tăng sinh của các tế bào callus có thể được duy trì nhiều hay ít là không hạn
định, chỉ cần mô sẹo được cấy chuyển sang môi trường mới theo chu kỳ. Tuy nhiên,
tế bào mô sẹo khi cấy chuyển nhiều lần sẽ không ổn định về mặt di truyền. Để tránh
tình trạng này nên sử dụng các loại mô sẹo vừa mới phát sinh. Nuôi cấy mô sẹo có vai
trò vô cùng quan trọng trong công nghệ sinh học thực vật. Tỷ lệ auxin và cytokinin
trong môi trường có thể dẫn tới sự phát triển của ngọn, rễ hay phôi soma. Từ đó có
thể tạo thành cây hoàn chỉnh. Nuôi cấy mô sẹo cũng có thể được sử dụng để mở đầu
nuôi cấy tế bào dịch huyền phù hay tạo ra hạt nhân tạo.
Để có thể thực hiện nuôi cấy có kết quả tốt, dù bằng con đường nào đi chăng
nữa cũng cần chú ý tới các yếu tố ảnh hưởng tới nuôi cấy; vì chính các yếu tố này
quyết định đường hướng vô tính cũng như chất lượng của cây giống thu được.

1.2.5. Ý nghĩa nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô, tế bào
Nuôi cấy mô, tế bào thực vật là phương pháp nhân giống vô tính. Đối với
nhiều loài thực vật quý hiếm, có giá trị kinh tế và ý nghĩa sinh học cao mà gặp
khó khăn trong vấn đề nhân giống hữu tính thì nhân giống vô tính in vitro là

công cụ vô cùng hữu ích. Trên thực tế, nhiều loài thực vật nhân giống hữu tính
bằng hạt có hệ số nhân cao nhưng vẫn tiến hành nhân giống vô tính in vitro; vì khi
nhân giống bằng hạt sẽ cho ra các cây con không hoàn toàn giống bố mẹ cả về
hình thái và khả năng tích lũy các thành phần hoá học (Bammi and Randhava,
1975). Sự không đồng nhất này gây ra khó khăn trong việc đưa cây vào sản xuất
theo dây truyền công nghiệp; vì các cây có chất lượng sản phẩm không đồng đều,
làm giảm giá trị thương phẩm. Đặc biệt, đối với cây thuốc thì việc không đồng
nhất về chất lượng (hàm lượng các chất hoạt tính) sẽ dẫn đến hậu quả là nguyên
liệu không ổn định, không đáp ứng được nhu cầu sản xuất. Ví dụ như đối với các

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 11


cây lấy tinh dầu, việc nhân giống bằng hạt dẫn tới sự phân ly không đều về hàm
lượng các thành phần hoạt chất. Cây cọ dầu khi nhân giống bằng hạt, hàm lượng
tinh dầu ở cây con phân ly từ 0,5% đến 11,3%, hàm lượng lynalyl acetat từ 11%
đến 78%; cây bạc hà nhân giống hữu tính có sự phân ly rất lớn về hàm lượng và
thành phần tinh dầu (Staritsky, 1970).
Đối với nhiều cây dược liệu, việc nhân giống hữu tính gặp khó khăn như ô
dầu, bạch thược có hạt nảy mầm chậm; đan sâm thì hạt chín không đều và thời
gian nảy mầm kéo dài, gây khó khăn cho việc sản xuất đại trà. Các cây tam thất,
nhân sâm, hoàng liên phải sử dụng hạt tươi mới nảy mầm nên thu hoạch đến đâu
cần gieo ngay đến đó, gây nhiều khó khăn cho sản xuất… (Đỗ Huy Bích và Bùi
Xuân Chương, 1980). Mặt khác, phương pháp nhân giống truyền thống (chiết,
giâm, ghép) vẫn còn nhiều nhược điểm như sự lây nhiễm bệnh qua nguyên liệu
rất phổ biến và phức tạp, hệ số nhân thấp: xuyên khung 2 - 5 cây/cây mẹ (Đỗ
Huy Bích và Bùi Xuân Chương, 1980), chuối là 2 - 3 cây/cây mẹ (Đoàn Thị Ái
Thuyền và cs., 1993). Hơn nữa, việc sử dụng chính các bộ phận làm thuốc để

nhân giống rất lãng phí, tốn kém.
Để khắc phục những nhược điểm trên, nhân giống cây trồng bằng phương
pháp nuôi cấy mô, tế bào đã mang lại nhiều hiệu quả kinh tế và ý nghĩa sinh học to
lớn thực sự. Việc sử dụng các mô nuôi cấy có kích thước nhỏ làm cho mô nuôi cấy
dễ phân hóa và dễ tái sinh hơn. Kỹ thuật nhân nhanh in vitro có những ưu việt mà
các phương pháp khác không có được: Có thể nhân giống cây trồng ở quy mô
công nghiệp (kể cả trên các đối tượng khó nhân bằng phương pháp thông thường),
hệ số nhân rất cao và cho các cá thể hoàn toàn đồng nhất về mặt di truyền. Kỹ
thuật nhân nhanh in vitro có thể được ứng dụng vào các mục đích như duy trì và
nhân nhanh các kiểu gen quí làm vật liệu cho công tác giống; nhân nhanh các loài
hoa, cây cảnh khó trồng bằng hạt; duy trì và nhân nhanh các dòng bố mẹ và các
dòng lai để tạo hạt giống cây rau, cây hoa và cây trồng khác; nhân nhanh kết hợp
làm sạch virut; bảo quản tập đoàn gen (Nguyễn Quang Thạch và cs., 2005).

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 12


1.2.6. Một số nhân tố ảnh hưởng tới quá trình nuôi cấy mô, tế bào thực vật
1.2.6.1. Ảnh hưởng của điều kiện khử trùng mẫu cấy
Việc khử trùng mẫu trước khi đưa vào nuôi cấy là một vấn đề cần thiết vì mẫu
cấy ở trong tự nhiên tiếp xúc với môi trường xung quanh mang rất nhiều vi sinh vật.
Tuy nhiên, mức độ nhiễm và đặc điểm của từng loại mẫu là khác nhau. Do đó, ta cần
có sự thử nghiệm về khử trùng mẫu cấy nhằm thu được lượng mẫu vô trùng nhiều nhất
mà tốn ít nguyên liệu ban đầu.
Hiệu quả khử trùng phụ thuộc vào loại chất khử trùng, nồng độ, thời gian
xử lý và mức độ xâm nhập của chất khử trùng vào các kẽ và những phần gồ gề
trên bề mặt của mô cấy. Để làm tăng hiệu quả, người ta thường nhúng mẫu vào
ethanol 70% trong 30 giây hoặc sử dụng tween nhằm làm giảm sức căng bề mặt

mẫu, sau đó mới khử trùng bằng dung dịch khử trùng. Đối với các mẫu quá bẩn,
việc rửa kỹ bằng nước xà phòng và để dưới vòi nước chảy từ 20 đến 30 phút sẽ có
tác dụng làm giảm đáng kể hệ vi khuẩn có trong mẫu cấy (Bhojwani, 1980).
Thời gian khử trùng là một điều kiện quan trọng, nó phụ thuộc vào từng loại
dung dịch khử trùng và đặc điểm của từng loại mẫu cấy. Thời gian quá lâu, dung dịch
khử trùng xâm nhập vào mẫu có thể gây chết mẫu, thời gian quá ngắn sẽ không loại
bỏ hết nấm và vi khuẩn nên mẫu dễ bị nhiễm khuẩn.
Sau khi khử trùng, mẫu cấy được đặt vào các môi trường nuôi cấy; từ đây
giai đoạn nuôi cấy in vitro bắt đầu. Thành phần của môi trường nuôi cấy có ảnh
hưởng quyết định tới quá trình nuôi cấy.
1.2.6.2. Ảnh hưởng của các thành phần môi trường nuôi cấy
Trong nuôi cấy in vitro, cả yếu tố hóa học và yếu tố vật lý của cây trong các
bình nuôi đều phải được cung cấp đầy đủ. Môi trường dinh dưỡng phải cung cấp tất
cả các ion khoáng cần thiết; nguồn chất hữu cơ bổ sung như amino acid và vitamin;
nguồn các bon cố định và nước. Các yếu tố vật lý như nhiệt độ, pH, môi trường khí,
ánh sáng và áp suất thẩm thấu cũng phải được duy trì trong giới hạn cho phép.
Trong giai đoạn đầu của quá trình nuôi cấy, các chất dinh dưỡng giảm
nhanh, sản phẩm trao đổi chất mới bắt đầu được tích tụ và tăng dần. Ba hợp phần

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 13


của môi trường có ảnh hưởng lớn đến quá trình nuôi cấy tế bào thực vật là carbon,
nitrogen và phospho. Tuy nhiên, cũng không thể coi nhẹ các hợp phần khác của
môi trường nuôi cấy, đặc biệt là các nguyên tố vi lượng và các chất điều hòa sinh
trưởng. Chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất mặc dù nồng
độ của chúng có trong môi trường ở mức độ rất thấp (Vũ Văn Vụ, 1999).
* Các nguyên tố đa lượng

Nitơ, phốt pho, kali, magie, canxi và lưu huỳnh là cần thiết và thay đổi
theo đối tượng nuôi cấy. Trong môi trường nuôi cấy, nồng độ các nguyên tố này
khoảng trên 30 mg/l và được cung cấp dưới dạng muối vô cơ. Nó có mặt trong các
hợp chất quan trọng (protein, diệp lục, axit nucleic…), tham gia vào các quá trình:
điều chỉnh áp suất thẩm thấu của tế bào, vận chuyển năng lượng trong hô hấp và
quang hợp, thực hiện vai trò tín hiệu tế bào…
Môi trường giàu nitơ và kali thích hợp cho việc hình thành chồi. Nitơ được
sử dụng ở 2 dạng là NH4+ và NO3- riêng rẽ hoặc phối hợp với nhau. Điều đáng lưu
ý là nếu chỉ dùng NH4+ thì sinh trưởng của tế bào giảm hoặc ngừng hoàn toàn.
Nguyên nhân chính là do quá trình trao đổi ion của tế bào bị lệch dẫn đến tình
trạng thay đổi pH của môi trường. Cụ thể, khi chỉ dùng NO3-, độ pH của môi
trường tăng dần và khi chỉ dùng NH4+ thì độ pH của môi trường giảm dần do tế
bào hấp thụ chúng và thải ra ngoài môi trường loại ion có giá trị tương đương.
Lưu huỳnh: chủ yếu và tốt nhất là dùng dạng muối SO42- còn các dạng khác
thường kém tác dụng, thậm chí còn độc.
Phốt pho: Mô và tế bào thực vật nuôi cấy có nhu cầu phốt pho rất cao. Nó
không chỉ là một trong những thành phần cấu trúc của tế bào mà khi phot pho ở
dạng H2PO4- và HPO42- còn có tác dụng như một hệ đệm làm ổn định pH của môi
trường trong quá trình nuôi cấy (Nguyễn Văn Uyển, 2000).
* Các nguyên tố vi lượng
Thường được dùng với nồng độ rất thấp khoảng < 30 mg/l. Các nguyên tố
thường được dùng trong nuôi cấy mô là: sắt, kẽm, mangan, iốt, đồng, coban, bo.
Nó đóng vai trò quan trọng trong hoạt động của enzim, tham gia vào các phản
ứng trao đổi điện tử, sinh tổng hợp diệp lục… Riêng sắt được sử dụng ở dạng
phức: Fe - NaEDTA.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 14

* Chất điều tiết sinh trưởng
Chất điều tiết sinh trưởng thực vật là thành phần môi trường không thể thiếu
nếu muốn tác động đến các con đường phát triển của tế bào thực vật. Các chất điều
tiết sinh trưởng được sử dụng thông thường là các phytohoocmon hoặc các chất
tổng hợp tương tự chúng. Trong 5 nhóm chất điều tiết sinh trưởng của thực vật là
auxin, giberellin, cytokinin, etylen và axit abcicic thì auxin và cytokinin là hai chất
được sử dụng nhiều hơn cả trong nuôi cấy in vitro.
• Nhóm auxin gồm một số hợp chất có chứa nhân idol trong phân tử. Trong
nuôi cấy in vitro, auxin thúc đẩy sinh trưởng của mẫu do hoạt hoá sự phân chia và
giãn nở của tế bào, kích thích các quá trình tổng hợp và trao đổi chất, tham gia điều
chỉnh sự phân hoá của rễ, chồi…(Hoàng Minh Tấn và cs., 2004).
Auxin được chia thành hai nhóm do có nguồn gốc khác nhau. Trong đó,
auxin tự nhiên quan trọng nhất là IAA nhưng nó chỉ được dùng trong một số môi
trường nuôi cấy vì IAA không ổn định với nhiệt độ và ánh sáng. Nhóm auxin tổng
hợp tương tự IAA được sử dụng rộng rãi hơn trong các môi trường nuôi cấy như
2,4-D, IBA, αNAA, picloram…(Vũ Văn Vụ, 1999).
• Nhóm cytokinin có tác dụng tích cực trong việc kích thích sự phân chia
và ảnh hưởng tới sinh trưởng của tế bào, cảm ứng hình thành chồi cây và loại bỏ
ưu thế ngọn (Hoàng Minh Tấn và cs., 2004).
Trong nuôi cấy mô thực vật, cytokinin được dùng để kích thích sự phát sinh
chồi, sử dụng kết hợp với auxin kích thích phân chia tế bào. Nồng độ cytokinin
cao kìm hãm sự hình thành và phát triển của rễ (Vũ Quang Sáng, 2005). Các chất
tổng hợp tương tự như kinetin và BA được sử dụng nhiều hơn trong nuôi cấy mô.
Trong cây có sự cân bằng nội hoocmone (Vũ Văn Vụ, 1999). Do vậy, khi
sử dụng các chất điều tiết sinh trưởng trong nuôi cấy mô cần đặc biệt lưu tâm tới
vấn đề này. Nhiều tác giả đã tổng kết, tỷ lệ auxin/cytokinin nếu nghiêng về phía
auxin sẽ kích thích hình thành rễ, nghiêng về phía cytokinin sẽ thúc đẩy hình thành
chồi, ở tỷ lệ trung gian sẽ hình thành mô sẹo (Nguyễn Văn Uyển, 1985).
Nhiều nghiên cứu cho thấy, các chất điều tiết sinh trưởng có ảnh hưởng lớn

đến tốc độ sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp các chất của mô thực vật trong
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 15


nuôi cấy in vitro cũng như trong cây hoàn chỉnh (Võ Châu Tuấn, 2014). Zhao và cs
(2001) đã nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4-D và αNAA phối hợp với BA ở các nồng
độ khác nhau lên sinh trưởng và tích lũy jaceosidin của tế bào cây hoa sen tuyết
(Saussurea medusa). Kết quả cho thấy, các môi trường có sự phối hợp giữa BA với
2,4-D thì không thích hợp cho sinh trưởng của tế bào; khi nồng độ 2,4-D gia tăng,
khả năng sinh trưởng của tế bào giảm đi rõ rệt. Sử dụng các môi trường bổ sung
phối hợp giữa BA với αNAA, lượng jaceosidin tích lũy trong tế bào tăng tỷ lệ thuận
với sự gia tăng nồng độ của αNAA (Zhao, 2001). Mô của cây cà trái vàng (Solanum
xanthocarpum) khi nuôi cấy trên môi trường chứa 2,4-D thì cây tích lũy solasodine
nhưng khi nuôi cấy trên môi trường có chứa IAA hoặc IBA thì cây lại không tích
lũy được chất này (Narayanaswany, 1994).
* Nguồn cacbon
Mô và tế bào thực vật trong nuôi cấy in vitro sống chủ yếu dựa theo phương
thức dị dưỡng. Vì vậy, việc bổ sung vào môi trường nuôi cấy nguồn carbon hữu cơ
là điều bắt buộc. Nguồn carbon trong môi trường nuôi cấy tế bào thực vật thường
được cung cấp dưới dạng carbohydrate. Carbon vừa tham gia tổng hợp các thành
phần của tế bào vừa cung cấp năng lượng cho quá trình sinh trưởng và tồn tại của
tế bào. Ngoài ra, carbohydrate cũng là nguồn cung cấp carbon cần thiết cho sự
hình thành các sản phẩm trung gian thông qua trao đổi chất (Zhong and Yoshida,
1995). Trong phần lớn các môi trường nuôi cấy, nguồn carbon được bổ sung chủ
yếu là đường sucrose và glucose với nồng độ 20 – 40 g/l. Gautheret (1959) cho
rằng đối với phần lớn các mô và tế bào nuôi cấy, đường sucrose và glucose là
nguồn carbon tốt nhất; trong một số trường hợp khác, có thể dùng fructose,
galactose và maltose (Nguyễn Đức Thành, 2000). Ảnh hưởng của nồng độ sucrose

trong môi trường nuôi cấy đã được nghiên cứu ở nuôi cấy tế bào tam thất (Panax
notoginseng). Khối lượng khô của tế bào tăng tỷ lệ thuận với sự gia tăng nồng độ
sucrose từ 20 đến 40 g/l, nhưng khi nồng độ sucrose lên đến 60 g/l thì dường như
ức chế sự sinh trưởng của tế bào (Sheper, 2001). Môi trường có chứa 30 g/l
sucrose hoặc phối hợp giữa đường sucrose (15 g/l) và glucose (15 g/l) là thích hợp
nhất cho sinh trưởng của tế bào (Gunter and Ovodo, 2003).

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 16