Nuôi cấy tế bào gốc của cá

Nuôi cấy tế bào gốc của cá

1. Giới thiệu
Tế bào gốc (tế bào mầm phôi) có thể phân chia để tạo thành nhiều tế bào con
giống nhau và giống tế bào mẹ. Điều này được gọi là sự tự đổi mới. Một tế bào gốc
cũng có thể phát triển biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác nhau, gọi là sự phát triển
tiềm năng. Khả năng tự đổi mới và sự phân hóa làm cho tế bào gốc khác biệt với các
loại tế bào khác trong cơ thể. Kể từ khi tế bào gốc đầu tiên được nghiên cứu ở chuột, tế
bào mầm phôi (embryonic stem (ES) cells) đã được tập trung nghiên cứu vì những
tiềm năng to lớn của chúng trong nghiên cứu cơ bản, y học và công nghệ sinh học
động vật.
Việc nghiên cứu nuôi cấy tế bào gốc cá đã được tiến hành cách đây 20 năm [13]. Một vài nghiên cứu đã cho thấy những trạng thái phát triển của các tế bào gốc phôi.
Trong bài bào này, chúng tôi muốn cung cấp thêm những thông tin mới về việc nuôi
cấy tế bào gốc của cá. Sau khi nêu một cách tổng quát lịch sử nghiên cứu tế bào gốc,
chúng tôi sẽ tập trung vào những kiến thức cơ bản và những ứng dụng gần đây của
nuôi cấy tế bào gốc cá và công nghệ sinh học, đặc biệt là nguồn gốc của tế bào ES đơn
bội, nuôi cấy tế bào gốc, định hướng gen và semi-cloning. Trong tiểu luận này chúng
tôi xin trình bày nghiên cứu của nhóm tác giả Ni Hong, Zhendong Li, Yunhan Hong
về đề tài: “Nuôi cấy tế bào gốc của cá”.

2. Tế bào gốc phôi và kỹ thuật tế bào gốc phôi
Sự thành công trong nuôi cấy tế bào gốc phôi là nhờ sự kế thừa các kinh
nghiệm nghiên cứu các khối u tế bào gốc hay các loại quái thai [4]. Những khối u này
bao gồm các tế bào không biệt hóa và các tế bào biệt hóa của ba lớp phôi mầm. Trong
nuôi cấy, những loại khối u này phát triển thành những tế bào ung thư của phôi
(embryonal carcinoma (EC) cells) [5]. Năm 1981, hai phòng thí nghiệm độc lập đã
chứng minh được rằng các tế bào nút (inner cell mass ICM) của túi phôi chuột (không
qua bước hình thành khối u) có thể làm phát sinh các tế bào EK hay các tế bào gốc bắt
nguồn từ phôi thai, là các tế bào ES đa năng đầu tiên [6, 7]. Khi được tiêm vào bên
trong túi phôi của chuột nhận, các tế bào có nguồn gốc từ phôi thai này làm phát sinh
Page 1

Nuôi cấy tế bào gốc của cá
tất cả các loại mô bao gồm cả dòng tế bào mầm, góp phần tạo ra các cá thể động vật
mang thể khảm [8]. Chúng cũng có thể được cảm ứng để biệt hóa trong ống nghiệm
với sự hiện diện của acid retinoic, thể phôi (embryoid bodies EB), và chia sẻ các dấu
hiệu miễn dịch với ICM của túi phôi.
Những tế bào ES đa năng của chuột được ứng dụng để phát triển kĩ thuật tế bào
ES. Sự tái tổ hợp tương đồng (Homologous recombination HR) giữa một bản sao
nhiễm sắc thể nội sinh và một NST đã được cải tiến và được hình thành trong một
dạng của vector tái tổ hợp tương đồng cho phép định hướng gen (gene targeting GT).
Đó là việc thay đổi gen chính xác tại các vị trí đặc hiệu trong hệ gen của tế bào ES [9].
Những tế bào ES biến đổi gen này được đưa trở lại trong phôi của chuột nhận ở giai
đoạn túi phôi, tạo ra dạng phôi khảm. Trong dạng khảm, các tế bào ES có mặt trong
phôi bình thường và góp phần xây dựng nhiều hệ thống cơ quan bao gồm các dòng tế
bào mầm, dẫn đến việc tạo ra các loài động vật có nguồn gốc từ tế bào ES. Trao đổi
chéo giữa các thể khảm dòng tế bào mầm có thể tạo ra các cá thể chuột dị hợp tử hay
đồng hợp tử mang các đột biến mong muốn. Thể đột biến đồng hợp tử như vậy là
những con chuột bị knockout [10]. Đến nay, định hướng gene là việc thường làm trong
di truyền học phát triển của chuột. Trong vấn đề này, các tế bào ES tốt hơn so với các
tế bào EC trong hiệu suất của sự hình thành thể khảm dòng mầm.
Sự tạo thành và tiềm năng của tế bào ES và kĩ thuật tế bào ES mở ra nhiều
hướng phát triển cho các tế bào ES ở nhiều loài động vật khác. Và đến năm 1998, tế
bào ES ở người cũng bắt đầu được nghiên cứu [11]. Giống như ở chuột, tế bào ES
người có một kiểu nhân bình thường, biểu hiện hoạt tính telomerase cao và các marker
bề mặt ở tế bào gốc đa năng. Quan trọng hơn, những tế bào ES người duy trì tiềm năng
phát triển để tạo thành nhiều dạng tế bào khác nhau có nguồn gốc từ ba lớp phôi mầm.
Tính đa năng của các tế bào ES người làm cho nó trở thành một nguồn nguyên liệu
linh hoạt để sản xuất các loại tế bào khác nhau với số lượng lớn phục vụ cho nghiên
cứu phân tích sự phát triển con người in vitro và quan trọng hơn là cho liệu pháp tế

bào trong y học tái sinh

Page 2


Nuôi cấy tế bào gốc của cá

3. Nuôi cấy tế bào gốc của cá
3.1. Nuôi cấy tế bào gốc phôi của cá
Tế bào ES chuột bắt nguồn từ tế bào ICM có khuynh hướng biệt hóa một cách
tự phát. Sự biệt hóa tự phát tạo ra thách thức chủ yếu cho việc tạo thành tế bào ES. Sự
ức chế biệt hóa tự phát ở chuột là do sử dụng một lớp tế bào nuôi dưỡng [6] hoặc do
điều kiện môi trường [7]. Kể từ sự ra đời của tế bào ES chuột đầu tiên, những nỗ lực
được thực hiện theo hướng tạo ra các tế bào ES ở nhiều loài động vật có vú khác nhau.
Những nỗ lực ban đầu trong nuôi cấy tế bào ES ngắn ngày chỉ một phần thành công
hoặc bị thất bại, đặt ra câu hỏi về khả năng thực hiện đối với tế bào ES có bị giới hạn ở
chuột hay không hay là điều kiện nuôi cấy tế bào ES chuột không thích hợp để ức chế
sự biệt hóa tự phát trong các loài động vật có vú khác.
Tiến hành thí nghiệm đối với tế bào ES cá 20 năm trước đây bằng cách áp dụng
kỹ thuật lớp tế bào nuôi dưỡng ở zebra fish [12] và medaka [13], chúng tôi phát triển
điều kiện nuôi cấy lớp nuôi dưỡng tự do để tạo tế bào ES một cách độc lập ở medaka,
dẫn đến tạo thành 3 dòng tế bào ES từ MES1 đến MES3 vào năm 1996 [14]. Vì chuột
là một trong những động vật có xương sống tiến hóa, và medaka là một trong số động
vật có xương sống nguyên thủy nhất, sự thành công ở tế bào ES medaka cung cấp
bằng chứng trực tiếp cho khả năng chung của sự tạo thành tế bào ES ở các loài động
vật có xương sống khác nhau. Thật vây, 2 năm sau, tế bào ES người đã được lấy từ
ICM của túi phôi ở giai đoạn sớm [15].
Trong hệ thống nuôi cấy lớp nuôi dưỡng của chúng tôi, một thành phần cần
thiết của môi trường có ích cho nuôi cấy ES là phôi cá chiết xuất từ medaka, cùng với
yếu tố sinh trưởng nguyên bào sợi và huyết thanh cá. Chúng có thể hỗ trợ sự tự làm

mới của các tế bào phôi giữa (midblastula embryo MBE) đã phân tách trên đĩa nuôi
cấy phủ gelatin [14]. MES1 được chọn để mô tả đặc điểm chi tiết nuôi cấy trong hơn 1
năm với 100 đặc điểm được cho là hiển thị tất cả các chức năng đặc trưng của tế bào
ES chuột. Chúng bao gồm sự tăng trưởng ổn định, kiểu hình ES đặc trưng (dạng vòng/
đa giác, kích thước nhỏ, nhân lớn và nổi bật) (được minh họa ở hình 1A), hoạt tính
alkaline phosphatase cao (1 marker chung của ES), kiểu nhân bình thường và khả năng
Page 3


Nuôi cấy tế bào gốc của cá
biệt hóa tự phát thành các kiểu tế bào khác nhau bao gồm tế bào sắc tố, tế bào cơ, tế
bào thần kinh và nguyên bào sợi [14]. Quan trọng hơn, MES1 có thể trải qua sự sinh
trưởng vô tính, tạo thành nhóm tế bào ES không biệt hóa có khả năng mở rộng thành
dòng tế bào ES.

Hình 1. Kiểu hình của dòng tế bào gốc medaka phát triển trong nuôi cấy. Tất cả các tế bào sinh trưởng
trong chất nền có phủ gelatin không có tế bào nuôi dưỡng.
Kiểu hình tương tự được thấy ở tất cả 3 dòng tế bào. (A) MES1, một dòng tế bào ES lưỡng bội từ phôi
đã thụ tinh. (B) SG3, một dòng tế bào gốc đực từ tinh hoàn trưởng thành. (C) HX1, dòng tế bào ES
đơn bội từ phôi di truyền theo dòng mẹ.
Thước đo, 50 μm (ở trên) và 10 μm (ở dưới).

Nguồn gốc và những đặc điểm ban đầu được xác định nhờ sử dụng các tiêu chí
trên đại diện cho bước đầu tiên trong việc tạo ra các tế bào ES mới. Một vài thí nghiệm
độc lập được thực hiện để điều tra sự đa năng in vitro và in vivo thường xuyên được
biểu hiện trong nuôi cấy ES chuột nhờ biệt hóa thông qua sự tạo EB. Tế bào ES trong
một lớp đơn được phân tách tạo ra các tế bào đơn và các cụm tế bào nhỏ, được nuôi
cấy huyền phù để tạo ra tập hợp các tế bào phát triển trong các không gian hình cầu 3
chiều gọi là EB. EB có thể biểu hiện các cấu trúc tương tự nhau ở phôi giai đoạn sớm
Page 4

Nuôi cấy tế bào gốc của cá
bao gồm 3 lớp phôi. Những tế bào ES trong EB được cảm ứng để trải qua giai đoạn
biệt hóa thành các loại tế bào khác nhau. MES1 có thể tạo thành ES và xuất hiện biệt
hóa. Điều này được chứng minh bởi sự tăng cường biệt hóa melanocyte [14] và biểu
hiện của các gen biệt hóa (sẽ thấy ở dưới đây). MES1 dễ biệt hóa trực tiếp. Khi chuyển
một vector biểu hiện yếu tố phiên mã microphthalmia (mitf), MES1 phát triển đặc hiệu
thành melanocyte bởi hình thái, melanosome linh động và các mẫu biểu hiện gen của
tế bào sắc tố đã biệt hóa hoàn toàn [16]. Do đó, tế bào ES medaka đại diện cho một mô
hình tuyệt vời của sự biệt hóa trực tiếp.
Những tế bào ES chuột không biệt hóa biểu hiện đặc trưng cho một tập hợp
gene đa năng, như oct4, nanog, klf4, sox2, myc, ronin, sall4, tcf3 (tcf 7l1) [17]. Ở động
vật có vú, biểu hiện của các gene đa năng thường xuyên được sử dụng để mô tả quá
trình nuôi cấy tế bào gốc ở mức độ phân tử. Đồng hợp tử/dị hợp tử của chúng cũng có
mặt ở cá. Ví dụ, đồng hợp tử/dị hợp tử ở medaka của nanog [18], oct4 [19] và các
gene khác đã được xác định [20]. Bằng chứng chứng minh có sự xuất hiện những gene
này là marker đa năng in vitro. Marker này có được từ sự quan sát tế bào ES medaka
đơn bội biểu hiện nanog và oct4. Nó biểu hiện mạnh trong nuôi cấy không biệt hóa
nhưng được điều hòa khá thấp và thậm chí là bị mất sau khi tế bào được cảm ứng biệt
hóa [20]. Wang và cộng sự đã nghiên cứu một tập hợp 7 gene đa năng medaka (ví dụ:
nanog và oct4), mà tất cả đều có sự biểu hiện mạnh trong tế bào ES lưỡng bội [21].
Rao và cộng sự đã báo cáo việc thiếu sự biểu hiện của các biến thể tert được cắt dán
cũng chỉ ra sự đa năng của ES không biệt hóa, mặc dù hoạt tính telomerase và sự biểu
hiện của tert RNA (mã hóa quá trình sao chép ngược telomerase, cụ thể là các tiểu đơn
bị xúc tác của telomerase) là linh động in vivo và hiện diện trong tất cả 7 dòng tế bào
medaka ổn định [22]. Những dữ liệu này chỉ ra rằng những gene đa năng và hoạt tính
telomerase là những marker trong nuôi cấy ES từ cá cho đến động vật có vú.
Tế bào ES chuột sau khi biệt hóa biểu hiện các marker phân tử của các dòng và
các loại tế bào khác nhau. Sự biểu hiện của những gene biệt hóa thường được sử dụng

để phát hiện sự biệt hóa ES bằng phân tích RT-PCR. Chúng bao gồm marker ngoại bì
nf200, marker trung bì ntl và atn2, marker nội bì sox17 và hnf3b, và marker đỉnh thần
Page 5


Nuôi cấy tế bào gốc của cá
kinh sox10 và mitf. Điều thú vị là biểu hiện của những gene này trở nên có hoạt tính
hoặc được điều hòa cao trong tế bào ES medaka lưỡng bội và đơn bội sau khi cảm ứng
biệt hóa [20].
Để phát hiện sự biệt hóa ở mức độ tế bào đơn, nhuộm màu miễn dịch được sử
dụng trong nuôi cấy tế bào ES động vật có vú. ES là đối tượng trong nuôi cấy huyền
phù để tạo EB cho sự cảm ứng biệt hóa. Sau một vài ngày nuôi cấy huyền phù, EB
được chuyển sang nuôi cấy dính bám, và các tế bào đơn trở nên rõ ràng. Sau khi định
hình, các tế bào này được phát hiện in situ bằng các kháng thể chống lại các marker
đặc hiệu cho từng loại tế bào. Nhiều kháng thể chống lại phân tử động vật có vú đã
được bán trên thị trường. Đối với cá, những kháng thể này phải được kiểm tra hoạt
tính chéo và bắt màu đặc hiệu. Gần đây, chúng tôi đã chứng minh được sự thích hợp
của chất miễn dịch đạt được trong tế bào ES cá [20]. Đặc biệt, 5 kháng thể thương mại
cung cấp sự bắt màu rõ ràng. Chúng chống lại NF200 và Map2, protein acid sợi thần
kinh đệm (glial fibrillary acidic protein GFAP), panCK và actinin2, lần lượt phát hiện
ra tế bào thần kinh, tế bào hình sao, biểu bì gai và cơ vân trưởng thành.
Sự đa năng in vivo được đánh giá bởi việc cấy tế bào ES vào phôi ở giai đoạn
phát triển sớm để tạo thành thể khảm. Phương pháp này được sử dụng để kiểm tra sự
phát triển đa năng của tế bào gốc in vivo. Wakamatsu và cộng sự đã đầu tiên thiết lập
được những điều kiện cho sự tạo thành thể khảm dựa trên cơ sở phát triển quy trình
cấy phôi bào medaka không nuôi cấy [23]. Thể khảm tạo ra bằng việc cấy phôi bào
medaka không nuôi cấy từ toàn bộ phôi hiển thị melanocyte dạng hoang dại nguồn gốc
từ thể cho [24]. Gần đây, chúng tôi thấy rằng sự tiếp cận vật chủ để tạo ES xảy ra ở
các chủng khác nhau [25]. Ví dụ, MES1 tạo melanocyte trong i1 nhưng không có ở i3
trong chủng bạch tạng. Sau khi chiếu tia γ, i1 trở nên khó tiếp cận và i3 trở nên dễ tiếp

cận để MES1 tạo melanocyte. Do đó, để tạo thể khảm bằng việc sử dụng sắc tố như là
một marker của sự biệt hóa ES, các chủng vật chủ khác nhau phải được kiểm tra.
Những nghiên cứu tương tự cũng được tiến hành ở chuột. Tiểu tập hợp của dòng ES
129, PO và CBA/Ca cũng như dòng đơn c57BL/6 được kiểm tra việc tạo thể khảm và
sự truyền dẫn dòng tế bào mầm bằng cách tiêm vào túi phôi. Tỷ lệ đạt yêu cầu của thể
Page 6


Nuôi cấy tế bào gốc của cá
khảm và sự truyền dẫn dòng tế bào mầm có được với tất cả 3 kiểu gene của tế bào ES.
Điều này ảnh hưởng sâu sắc đến sự lựa chọn kiểu gene của phôi nang chủ như là một
điều hiển nhiên về hiệu quả của thể khảm và sự truyền dẫn dòng tế bào mầm [26].
Ngoài điều kiện nuôi cấy thích hợp dẫn đến tự đổi mới ES hơn là biệt hóa, sự
khác nhau của chủng cũng ảnh hưởng đến sự tạo ES. Một cuộc khảo sát ở medaka chỉ
ra rằng chỉ 5 trong số 11 chủng và loài cho phép có thể nuôi cấy ES, một trong số
chúng là HB32C mà từ đó MES1 được tạo ra [24]. Vì vậy, sự thành công ban đầu ở tế
bào ES medaka đầu tiên là một sự kiện may mắn nhờ đã chọn được một chủng cho
phép. Nghiên cứu gần đây của chúng tôi đã bổ sung i1 vào danh sách các chủng cho
phép. Hiện tượng này tương tự ở chuột. Tế bào ES chuột hầu như thường bắt nguồn từ
chủng 129, mặc dù ES chiết xuất thành công từ các chủng không cho phép như
CBA/Ca [26,27].
Gần đây, chúng tôi đã tạo được những dòng tế bào ES đơn bội đầu tiên từ HX1
đến HX3 ở medaka [20]. Điều kiện để tạo tế bào ES đơn bội tương tự như MES1
lưỡng bội, nhưng bằng việc sử dụng phôi nang đơn bội để tạo tế bào thay vì thụ tinh
phôi nang lưỡng bội (hình 2). Tinh trùng chủng i3 được xử lý với một liều lượng chiếu
xạ cực tím đến một mức độ đủ phá hủy nhân nhưng vẫn duy trì khả năng kích hoạt
hoạt tính của trứng. Tinh trùng không hoạt động được trộn với tế bào trứng chín của
chủng i1 cho sự sinh sản vô tính, tạo ra trứng chỉ với một nhân đơn bội cái. Những
phôi như vậy trải qua sự phát sinh phôi ở tất cả con cái gọi là di truyền theo dòng mẹ.
Cho đến giai đoạn phôi giữa, phôi đơn bội di truyền theo dòng mẹ phân ly thành các tế

bào đơn và được cấy lên môi trường nuôi dưỡng tự do có chất nền phủ gelatin. Những
chi tiết của việc tạo sự di truyền theo dòng mẹ đơn bội và sự tạo tế bào đã được nghiên
cứu [28]. Đáng chú ý là sự tạo tế bào ES đơn bội đòi hỏi bổ sung vào môi trường nuôi
cấy MES1 và MO1, một dòng tế bào từ buồng trứng medaka. Tuy nhiên, một khi đã
được tạo ra thì tế bào ES đơn bội không khác so với tế bào ES lưỡng bội về điều kiện
duy trì nuôi cấy. Tế bào ES đơn bội (hình 1C) chỉ ra tất cả các đặc tính của MES1, bao
gồm sự sinh trưởng ổn định và cạnh tranh, tính ổn định di truyền và tính đa năng in
vitro và in vivo [20].
Page 7


Nuôi cấy tế bào gốc của cá

Hình 2. Quá trình tạo tế bào ES đơn bội medaka. Tia UV phá hủy vật chất di truyền của tinh trùng
không ảnh hưởng đến khả năng hoạt hóa trứng trong di truyền theo dòng mẹ đơn bội. Phôi đơn bội
được phân ly ở giai đoạn phôi giữa thành các tế bào đơn trong giai đoạn khởi đầu nuôi cấy.

Những tế bào ES của động vật có vú thường được thu nhận từ ICM hay lá phôi
ngoài của phôi ở giai đoạn túi phôi. Hai dòng phôi ngoài ở giai đoạn này cũng có thể
sử dụng để nuôi cấy tế bào gốc, cụ thể là các tế bào gốc từ lá nuôi phôi [29] và tế bào
gốc nội bì nguyên thủy [30]. Không có tế bào gốc nào trong số đó có tính toàn năng
trong biểu hiện gen và tạo dòng trong phôi khảm. Đó là chưa kể đến việc liệu phôi
sớm cho đến giai đoạn túi phôi có thể được nuôi cấy theo hướng toàn năng như nuôi
cấy tế bào gốc hay không. Li và cộng sự báo cáo rằng phôi medaka ở giai đoạn 32 tế
bào có thể nuôi cấy như ở tế bào ES [31], chỉ ra khả năng nuôi cấy tế bào gốc từ phôi
cá ở những giai đoạn sớm.
3.2. Nuôi cấy tế bào ES ở zebra fish và các loài cá khác
Phòng thí nghiệm Collodi chuyên về nuôi cấy ES zebra fish và đã nuôi cấy
được tế bào từ giai đoạn phôi nang bằng cách sử dụng kỹ thuật lớp nuôi dưỡng như ở
chuột. Những tế bào nuôi dưỡng được sử dụng bao gồm nguyên bào sợi của phôi zebra

fish [12], tế bào gan chuột [32] và dòng tế bào lá lách cá hồi RTS34st [33, 34]. Họ còn
Page 8


Nuôi cấy tế bào gốc của cá
chứng minh được rằng nuôi cấy tế bào phôi zebra fish ngắn ngày có thể sản xuất ra
dòng tế bào mầm thể khảm [34]. Chức năng của dòng tế bào mầm còn được kéo dài
đến vài tuần và các giai đoạn khác trong nuôi cấy [35]. Nhờ sử dụng điều kiện nuôi
cấy nuôi dưỡng tự do, chúng tôi cũng tạo ra được dòng tế bào zebra fish từ giai đoạn
phôi nang, và kiểm tra tính toàn năng của chúng (dữ liệu không được cung cấp). Vì
vậy, lớp tế bào nuôi dưỡng và điều kiện nuôi dưỡng tự do dường như hữu ích trong
nuôi cấy ES zebra fish.
Ứng dụng của hệ thống nuôi cấy nuôi dưỡng tự do dẫn đến việc tạo ra những tế
bào giống ES trong một vài loài cá biển, bao gồm cá tráp biển (Sparus aurata) [36], cá
hanh Nhật Bản (Pagrus major) [37], cá vược (Lateolabrax japonicus) [38], cá chẽm
(Lates calcarifer) [39], và cá tuyết Đại Tây Dương (Gadus morhua) [40]. Nuôi cấy dài
ngày những tế bào giống ES cá bơn (Scophtalmus maximus) trên chất nền có phủ
gelatin cũng được chỉ ra [41].
3.3. Nuôi cấy tế bào gốc của cá
Tế bào gốc bao gồm các tế bào gốc nguyên thủy (primordial germ cells PGCs)
và tế bào gốc mầm sinh dục: tinh nguyên bào trong tinh hoàn và túi noãn trong buồng
trứng, đã thu hút được sự quan tâm đáng kể trong sự phát triển của dòng tế bào mầm
do có đủ khả năng nuôi cấy tế bào gốc. Thành công đầu tiên trong nuôi cấy tế bào gốc
cá là ở SG3, một dòng tế bào của tế bào gốc mầm ở con đực là tinh nguyên bào, thu
được từ tinh hoàn của loài cá medaka đã trưởng thành [42]. SG3 (hình 1B) có nguồn
gốc từ các tinh nguyên bào bình thường không bất tử, đây như là một điều kiện tiên
quyết cho nuôi cấy tinh nguyên bào [43]. SG3 có sự phát triển ổn định, kiểu nhân
lưỡng bội, kiểu hình và kiểu biểu hiện gen thể hiện đặc tính chung của một tế bào gốc
tinh nguyên bào. Dưới điều kiện nuôi cấy thích hợp, SG3 trải qua các quá trình giảm
phân, sinh tinh để tạo ra các tinh trùng di động trong ống nghiệm [42]. Do đó, khả

năng phát triển tiếp tục và tạo tinh trùng trong nuôi cấy là một đặc tính nội tại của tế
bào gốc tinh nguyên bào và sự không bất tử là không cần thiết trong nuôi cấy tế bào
gốc con đực. Điều kiện nuôi cấy sử dụng cho sự tạo thành SG3 cũng tương tự như cho
Page 9


Nuôi cấy tế bào gốc của cá
sự tạo thành tế bào ES của medaka, cho thấy rõ sự phù hợp của các điều kiện nuôi cấy
nuôi dưỡng tự do để nuôi cấy tế bào gốc cá từ các nguồn khác nhau.
Sự thành công trong việc nuôi cấy tinh nguyên bào gốc của medaka làm cho
nhiều nhà khoa học quan tâm hơn đến việc nuôi cấy tinh nguyên bào của các loài khác.
Chẳng hạn như, chỉ sau 2 năm khi việc nuôi cấy SG3 được công bố, những tế bào gốc
tinh nguyên bào đa năng đã được phân tách từ tinh hoàn chuột trưởng thành không bất
tử [44]. Ở cá, những tinh nguyên bào loại A được phân lập từ một dòng cá hồi chuyển
gen được cấy vào để duy trì sự sống và hoạt đông phân bào trong nuôi cấy [45]. Gần
đây nhất, những tế bào gốc sinh dục cái của loài medaka cũng đã được nhận biết trong
buồng trứng [46], điều này làm tăng khả năng phát triển nuôi cấy tế bào gốc sinh dục
cái trong cơ quan này. Thêm vào đó, sự quan tâm ngày càng được gia tăng theo hướng
nuôi cấy các tế bào soma tuyến sinh dục. Ví dụ, một dòng tế bào soma đã được thiết
lập từ tinh hoàn mới sinh của một loài cá bơn, Cynoglossus semilaevis [47].
Các tế bào gốc đầu tiên của dòng tế bào mầm là PGC phát triển sớm về một bên
[48]. Chúng chỉ có một tuyến sinh dục để tạo trứng hay tạo tinh trùng. PGC có thể có
tiềm năng phát triển trong nuôi cấy tế bào gốc đa năng. Kể từ khi vasa của loài zebra
fish được nhận biết như là một marker phân tử của tế bào mầm cá, những quan tâm và
tiến bộ trong sinh học tế bào mầm cá không ngừng tăng lên. Đồng hợp tử của đặc tính
vasa như boule,dazl, dead end và nanos được xác định ở một vài loài cá [50]. Quan
trọng hơn, vasa và/hoặc promoter nanos được sử dụng thành công để sản sinh dòng
chuyển gene trong một vài loài cá bao gồm medaka [51], zebra fish [52] và cá bơn
[53]. Những loài cá chuyển gen này biểu hiện protein huỳnh quang màu xanh (GFP)
hay màu đỏ (RFP), đặc biệt là trong các tế bào mầm bao gồm PGC, cho phép quan sát

thấy PGC trong quá trình phát triển của phôi và quan trọng hơn là nó dễ dàng được
phân lập trong nuôi cấy. Chúng tôi đã chỉ ra rằng PGC của medaka có nguồn gốc từ
phôi vị sớm có thể tồn tại, phân chia và di chuyển [51]. PGC của vasa zebra fish: dòng
chuyển gene RFP có thể được nuôi cấy trong 4 tháng [52]. Ở loài medaka, tế bào phân
chia từ phôi vị sớm cho PGC sống sót, tăng trưởng và linh động [51]. Việc làm cần

Page 10


Nuôi cấy tế bào gốc của cá
thiết trong tương lai là xác định xem PGC cá có thể làm phát sinh các tế bào nuôi cấy
ổn định và duy trì khả năng truyền dòng tế bào mầm hay không.

4. Công nghệ tế bào gốc
Các tế bào gốc cá có tiềm năng lớn trong việc ứng dụng vào các lĩnh vực khác
nhau của công nghệ sinh học. Trong số đó, định hướng gene, cấy ghép tế bào mầm và
semi-cloning bằng chuyển nhân đã thu hút sự quan tâm đáng kể và đạt được nhiều tiến
bộ.
4.1. Định hướng gene (GT)
GT kết hợp với các tế bào ES của chuột là cơ sở của kỹ thuật knockout. Mặc dù
GT được mong đợi nhiều nhưng chúng hiếm xảy ra hơn so với sự kết hợp ngẫu nhiên.
Một quy trình được gọi là chọn lọc dương - âm (positive-negative selection PNS) dựa
trên cơ sở của sự chọn lọc thuốc có thể tạo thuận lợi cho việc loại bỏ những trường
hợp kết hợp ngẫu nhiên, dẫn tới làm giàu những thể tái tổ hợp tương đồng trong tế bào
ES của chuột [54]. Điều kiện cho việc chuyển gen và chọn lọc thuốc ở MES1 đã được
tối ưu hóa như là một bước hướng tới việc định hướng gene trong cá. Có thể thấy rằng,
sự biểu hiện của các gen chọn lọc mã hóa cho sự kháng neomycin (neo), hygromycin
(hyg) hay puromycin (pac) đã được thể hiện trong chọn lọc dương tính, trong khi đó,
sự biểu hiện của thymidine kinase trong virus herpes đơn hình thể hiện sự nhạy cảm
với gancyclovir trong chọn lọc âm tính. Do đó, PNS cũng thực hiện được trên MES1

[55]. Quan trọng hơn nữa, tế bào MES1 sau chuyển gen và chọn lọc thuốc lâu dài duy
trì khả năng phát triển đa năng [56]. Người ta đã chứng minh được có hoạt động tái tổ
hợp tương đồng (homologous recombination HR) trong các tế bào MES1 bằng cách
nhuộm màu khác biệt các sợi nhiễm sắc thể chị em và thấy có sự trao đổi chéo giữa
chúng. Sự tái tổ hợp tương đồng được xem là một điều kiện tiên quyết cho GT. Gần
đây, chúng tôi đã chỉ ra được rằng, việc sử dụng baculovirus làm công cụ chuyển gen
mong muốn vào trong tế bào ES của medaka đạt hiệu quả cao mà không làm ảnh
hưởng tới tính đa năng của chúng [57]. Bằng cách sử dụng một vector GT chứa gen
Page 11


Nuôi cấy tế bào gốc của cá
p53 medaka làm mô hình, người ta đã tạo được dòng tái tổ hợp tương đồng, chứng
minh tiềm năng của kỹ thuật tế bào ES ở medaka. Collodi và cộng sự đã tạo dòng gen
đích thành công bằng tái tổ hợp tương đồng trong tế bào ES zebra fish.
4.2. Cấy ghép tế bào mầm
Phòng thí nghiệm chuyên ngành Yoshizaki đã tiến hành cấy ghép tế bào mầm
cho sản xuất thay thế trong họ cá hồi. Họ nhân bản vô tính vasa cá hồi, và sử dụng các
promoter vasa để biểu hiện GFP độc lập trong PGC và các tế bào mầm sinh dục để tạo
ra một dòng chuyển gen. Họ đã thiết lập những phương thức phân lập PGC từ ấu trùng
biến đổi gen và các tế bào mầm trưởng thành từ tinh hoàn và buồng trứng để cấy ghép
trong cá hồi và các loài trong họ cá hồi. Họ cấy ghép những tế bào mầm này vào trong
những đường di trú của PGC của phôi cá hồi và những loài thuộc họ cá hồi đang phát
triển, từ đó thu được những thế hệ con cháu mang thể khảm dòng tế bào mầm từ các tế
bào mầm cấy chuyển trong những vật chủ đồng hợp và dị hợp. Điều thú vị là các tế
bào mầm chuyển gen này sản xuất ra tinh trùng hay trứng theo giới tính của vật chủ
nhưng độc lập với giới tính của cá thể bắt nguồn. Những thí nghiệm tiên phong này đã
chứng minh khả năng sản xuất thay thế cá giống trong nuôi trồng thủy sản bằng cấy
ghép tế bào gốc. Việc làm trong tương lai là phải nhấn mạnh hơn tầm quan trọng của
các phương pháp này bằng cách thiết lập khả năng nuôi cấy và bảo quản tế bào mầm.

Ví dụ, tế bào mầm có thể được cấy ghép giữa hai loài khác nhau trong cùng họ cá hồi,
kết quả là tạo ra các cá thể con từ các cá thể cho [59]. Những tế bào mầm tinh hoàn có
chứa tế bào gốc tinh nguyên bào phân lập từ cá hồi vân đực trưởng thành
(Oncorhynchus mykiss) được cấy vào khoang phúc mạc của cá con đực hay cái mới
nở. Bằng cách biệt hóa thành tinh trùng ở con đực nhận và trứng với đầy đủ chức năng
ở con cái nhận, chúng có thể sinh sản bình thường tạo các cá thể con [60]. Hướng phát
triển trong tương lai là cấy ghép tinh nguyên bào của loài cá hồi vân để tạo ra thể tam
bội. Những tinh nguyên bào cấy ghép trải qua quá trình sinh tinh trong cơ thể đực
nhận nhưng lại xảy ra quá trình sinh trứng ở thể cái nhận. Những thể cá hồi nhận tam
bội bất dục nhưng sản sinh ra chỉ tinh trùng hoặc trứng có nguồn gốc từ thể cho và tạo
Page 12


Nuôi cấy tế bào gốc của cá
ra con cái [61]. Những phương pháp này có thể được mở rộng để ứng dụng phục vụ
cho công tác phục hồi những loài nguy cấp trong bảo tồn sinh học.
4.3. Semi-cloning
Mặc dù nuôi cấy ES zebra fish ngắn ngày đã được sử dụng để tạo thể khảm
dòng tế bào mầm [34] nhưng sự truyền dẫn dòng tế bào mầm của nuôi cấy ES dài ngày
vẫn chưa đạt được ở cá. PGC zebra fish là tế bào độc lập đặc hiệu ở giai đoạn sớm 4 tế
bào [49]. Ở medaka cũng có PGC tế bào độc lập [62]. Điều đó đặt ra câu hỏi tế bào ES
cá có bị mất khả năng hay không hoặc dòng tế bào mầm cá không thể tiếp cận để tạo
ES hay không. Do các chuyển đổi tạo thể khảm dòng tế bào mầm nên việc cấy nhân
được phát triển ở zebra fish [63, 64] và medaka [65]. Cấy nhân biểu mô từ nòng nọc
vào trứng đã lấy nhân của Xenopus dẫn đến ếch được thụ tinh [66, 67]. Ở cá, nhân
được chuyển bằng cách sử dụng tế bào nuôi cấy và đã thành công ở cá chép vào năm
1986 [68], đúng 10 năm trước khi tạo ra Dolly – con cừu nhân bản đầu tiên [69]. Ở
medaka, sự sản xuất tinh trùng trong ống nghiệm từ nuôi cấy dài ngày tinh nguyên bào
cũng có thể thực hiện được [42], dẫn đến khả năng thụ tinh nhân tạo trong tương lai.
Nghiên cứu gần đây về tế bào ES đơn bội medaka cung cấp một cơ hội tuyệt vời cho

việc chuyển nhân trực tiếp vào trứng bình thường mà không cần phải loại bỏ nhân.
Đây chính là semi-cloning (SC). SC đã được đề xuất như là một kỹ thuật sinh sản nhân
tạo mới nhằm khắc phục sự vô sinh của con người [70]. Trong phương pháp này, một
nhân đơn bội được chuyển vào trứng trưởng thành không loại bỏ nhân, dẫn đến việc
kết hợp một nhân đơn bội của tế bào soma từ một con bố mẹ và một nhân đơn bội của
giao tử từ con bố mẹ kia. Đây là một trứng thể khảm. Bằng việc cấy nhân tế bào ES
đơn bội vào tế bào trứng trưởng thành không loại bỏ nhân, chúng tôi đã tạo ra Holly,
con cá bán nhân bản vô tính đầu tiên trên thế giới. Holly có khả năng sinh sản bình
thường và dẫn truyền dòng tế bào mầm hơn 3 thế hệ, cung cấp bằng chứng rằng tế bào
trứng thể khảm có thể tạo ra thế hệ con cái có khả năng sinh sản. Quan trọng là chuyển
gene bền vững không ảnh hưởng đến khả năng của tế bào ES đơn bội khi tạo Holly
[20]. Ở cá, SC đại diện cho phương pháp tiếp cận đầu tiên trong chuyển dòng tế bào
Page 13


Nuôi cấy tế bào gốc của cá
mầm của tế bào nuôi cấy thậm chí sau khi biến đổi gene. Về vấn đề này cần lưu ý rằng
hiệu quả của SC khi chuyển nhân tế bào ES đơn bội được so sánh với khi chuyển nhân
tinh trùng [71]. So với việc tạo dòng truyền thống thông qua chuyển nhân tế bào soma
(somatic cell nuclear transfer SCNT), SC có tính năng hiệu quả cao (hình 3).

Hình 3. Kỹ thuật sinh sản (trên). Sơ đồ minh họa thụ tinh, nhân bản truyền thống và semi-cloning.
(dưới). Mối quan hệ cha-con.

Sự thụ tinh liên quan đến sự kết hợp giữa một nhân tinh trùng với một nhân
trứng. Trong SCNT, một nhân soma được chuyển vào một trứng đã loại bỏ nhân.
Dolly được tạo ra theo cách này. Trong quy trình SC, một nhân đơn bội giảm nhiễm
được chuyển vào một trứng không loại nhân, tạo ra trứng thể khảm giữa nguyên
nhiễm-giảm nhiễm (hình 3, ở trên), Holly được tạo ra theo phương pháp này. Sự thụ
tinh liên quan đến việc tạo 2 bố mẹ, với con cái có 50% đặc tính di truyền của mỗi con

bố hoặc mẹ và chúng giống nhau 50%. SCNT liên quan đến sự sinh sản vô tính, tạo
con cái có 100% đặc điểm giống con nhận và chúng giống nhau 100%. SC kết hợp
một nhân từ 1 con bố mẹ và 1 nhân từ con kia, tạo ra con có 50% đặc điểm của cả bố
Page 14


Nuôi cấy tế bào gốc của cá
và mẹ nhưng chúng giống nhau 75% đặc điểm (hình 3, ở dưới). Đây là sinh sản bán
hữu tính, giống quá trình thụ tinh tự nhiên hơn. Điều quan trọng là SC thiết lập mối
quan hệ cha-con rõ ràng, do đó người ta dường như có thể ít quan tâm đến vấn đề đạo
đức trong việc hỗ trợ sinh sản để điều trị vô sinh ở người.

5. Triển vọng
Các tế bào chuột biệt hóa có thể lập trình lại trong các tế bào gốc đa năng cảm
ứng (iPS) nhờ sự biểu hiện bắt buộc của các yếu tố phiên mã đa năng [72]. Các nhà
nghiên cứu đã thành công trong việc tạo ra iPS ở nguyên bào sợi người [73]. iPS một
lần nữa lại có thể biệt hóa trực tiếp, ví dụ: ở tế bào gan khi sử dụng 1 lượng cytokine
giới hạn [74]. Điều thú vị là quan sát thấy sự biểu hiện của các yếu tố phiên mã cũng
có thể sản xuất ra tế bào iPS ở cá. Sinh học và công nghệ sinh học nghiên cứu tế bào
gốc của cá sẽ tiếp tục phát triển trong tương lai gần và đạt đến sự nuôi cấy ổn định có
khả năng biến đổi gene và dẫn truyền dòng tế bào mầm. Dự kiến rằng GT sẽ phát triển
đầy đủ ở cá, đặc biệt ở medaka nhờ sử dụng những tế bào ES lưỡng bội của chúng
trong những phân tích kiểu hình di truyền trực tiếp các đột biến lặn in vitro. Và có thể
giải thích rõ chức năng sinh lý gene theo sau quá trình sinh sản nhờ SC. Tiến bộ gần
đây trong nuôi cấy tế bào gốc ở cá và cấy ghép sẽ cung cấp hệ thống và công cụ hữu
ích cho nghiên cứu và ứng dụng cơ bản trong nuôi trồng thủy sản bền vững.
Tế bào ES chuột chỉ ra sự khác biệt nổi bật trong nhu cầu sinh trưởng so với ở
người. Một vài sinh vật với vị trí khác nhau trong quá trình tiến hóa ở động vật có
xương sống được đòi hỏi phải chỉ ra các nhân tố đặc trưng loài và cơ chế chung kiểm
soát sự đa năng. Trong vấn đề này, các mô hình cá, được xem như là động vật có

xương sống bậc thấp hơn, đại diện cho nghiên cứu quan trọng về cơ chế bảo tồn sự tự
đổi mới cơ bản và sự biệt hóa (hình 4). Nghiên cứu tương lai về phân tích tổng sản
phẩm phiên mã và hệ protein của tế bào gốc ở cá với các nguồn gốc khác nhau sẽ cung
cấp thông tin có giá trị cho nghiên cứu và ứng dụng tế bào gốc.

Page 15


Nuôi cấy tế bào gốc của cá

Hình 4. Tế bào gốc và kỹ thuật tế bào gốc ở người và sinh vật mô hình.
ES: tế bào gốc phôi; GS: tế bào phôi; tế bào ES lưỡng bội, tế bào ES đơn bội; GT: định hướng gene;
SC: semi-cloning

Page 16


Nuôi cấy tế bào gốc của cá

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Alvarez MC, Bejar J, Chen S, Hong Y. Fish es cells and applications to biotechnology.
Mar Biotechnol (NY). 2007;9:117-127
2. Barnes DW, Parton A, Tomana M, Hwang JH. et al. Stem cells from cartilaginous and
bony fish. Methods Cell Biol. 2008;86:343-367
3. Fan L, Collodi P. Zebrafish embryonic stem cells. Methods Enzymol. 2006;418:64-77
4. Martin GR, Evans MJ. Differentiation of clonal lines of teratocarcinoma cells: Formation
of embryoid bodies in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 1975;72:1441-1445
5. Martin GR. Teratocarcinomas and mammalian embryogenesis. Science. 1980;209:768-776
6. Evans MJ, Kaufman MH. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse
embryos. Nature. 1981;292:154-156

7. Martin GR. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in
medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 1981;78:76347638
8. Bradley A, Evans M, Kaufman MH, Robertson E. Formation of germ-line chimaeras from
embryo-derived teratocarcinoma cell lines. Nature. 1984;309:255-256
9. Capecchi MR. Altering the genome by homologous recombination. Science.
1989;244:1288-1292
10. Capecchi MR. Generating mice with targeted mutations. Nat Med. 2001;7:1086-1090
11. Prelle K, Zink N, Wolf E. Pluripotent stem cells--model of embryonic development, tool
for gene targeting, and basis of cell therapy. Anat Histol Embryol. 2002;31:169-186
12. Collodi P, Kamei Y, Ernst T, Miranda C. et al. Culture of cells from zebrafish
(brachydanio rerio) embryo and adult tissues. Cell Biol Toxicol. 1992;8:43-61
13. Wakamatsu Y, Ozato K, Sasado T. Establishment of a pluripotent cell line derived from a
medaka (oryzias latipes) blastula embryo. Mol Mar Biol Biotechnol. 1994;3:185-191
14. Hong Y, Winkler C, Schartl M. Pluripotency and differentiation of embryonic stem cell
lines from the medakafish (oryzias latipes). Mech Dev. 1996;60:33-44
15. Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, Waknitz MA. et al. Embryonic stem cell lines
derived from human blastocysts. Science. 1998;282:1145-1147

Page 17


Nuôi cấy tế bào gốc của cá
16. Bejar J, Hong Y, Schartl M. Mitf expression is sufficient to direct differentiation of
medaka blastula derived stem cells to melanocytes. Development. 2003;130:6545-6553
17. Do JT, Scholer HR. Regulatory circuits underlying pluripotency and reprogramming.
Trends Pharmacol Sci. 2009;30:296-302
18. Camp E, Sanchez-Sanchez AV, Garcia-Espana A, Desalle R. et al. Nanog regulates
proliferation during early fish development. Stem Cells. 2009;27:2081-2091
19. Sánchez-Sánchez AV, Camp E, Mullor JL. Fishing Pluripotency Mechanisms In Vivo. Int
J Biol Sci. 2011;7:410-417

20. Yi M, Hong N, Hong Y. Generation of medaka fish haploid embryonic stem cells.
Science. 2009;326:430-433
21. Wang D, Manali D, Wang T, Bhat N, Hong N, Li Z, Wang L, Yan Y, Liu R, Hong Y.
Identification of Pluripotency Genes in the Fish Medaka. Int J Biol Sci. 2011;7:440-451
22. Rao F, Wang T, Li M, Li Z, Hong N, Zhao H, Yan Y, Lu W, Yuan Y, Liu L, Guan G, Li
C, Hong Y. Medaka tert produces multiple variants with differential expression during
differentiation in vitro and in vivo. Int J Biol Sci. 2011;7:426-439
23. Wakamatsu Y, Ozato K, Hashimoto H, Kinoshita M. et al. Generation of germ-line
chimeras in medaka (Oryzias latipes). Mol Mar Biol Biotechnol. 1993;2:13
24. Hong Y, Winkler C, Schartl M. Efficiency of cell culture derivation from blastula
embryos and of chimera formation in the medaka (Oryzias latipes) depends on donor
genotype and passage number. Dev Genes Evol. 1998;208:595-602
25. Hong N, Li M, Zeng Z, Yi M. et al. Accessibility of host cell lineages to medaka stem
cells depends on genetic background and irradiation of recipient embryos. Cell Mol Life Sci.
2010;67(7):1189-1202
26. Brook FA, Gardner RL. The origin and efficient derivation of embryonic stem cells in the
mouse. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997;94:5709-5712
27. Ledermann B, Burki K. Establishment of a germ-line competent c57bl/6 embryonic stem
cell line. Exp Cell Res. 1991;197:254-258
28. Yi M, Hong N, Hong Y. Derivation and characterization of haploid embryonic stem cell
cultures in medaka fish. Nat Protoc. 2010;5:1418-1430
29. Tanaka S, Kunath T, Hadjantonakis AK, Nagy A, Rossant J. Promotion of trophoblast
stem cell proliferation by fgf4. Science. 1998;282:2072-2075
Page 18


Nuôi cấy tế bào gốc của cá
30. Debeb BG, Galat V, Epple-Farmer J, Iannaccone S. et al. Isolation of oct4-expressing
extraembryonic endoderm precursor cell lines. PLoS One. 2009;4:e7216
31. Li Z, Bhat N, Manali D, Wang D, Hong N, Yi M, Ge R, Hong Y. Medaka Cleavage

Embryos Are Capable of Generating ES-Like Cell Cultures. Int J Biol Sci. 2011;7:418-425
32. Sun L, Bradford CS, Ghosh C, Collodi P, Barnes DW. Es-like cell cultures derived from
early zebrafish embryos. Mol Mar Biol Biotechnol. 1995;4:193-199
33. Fan L, Crodian J, Collodi P. Culture of embryonic stem cell lines from zebrafish. Methods
Cell Biol. 2004;76:151-160
34. Ma C, Fan L, Ganassin R, Bols N, Collodi P. Production of zebrafish germ-line chimeras
from embryo cell cultures. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001;98:2461-2466
35. Fan L, Crodian J, Liu X, Alestrom A. et al. Zebrafish embryo cells remain pluripotent and
germ-line competent for multiple passages in culture. Zebrafish. 2004;1:21-26
36. Bejar J, Hong Y, Alvarez MC. An ES-like cell line from the marine fish sparus aurata:
Characterization and chimaera production. Transgenic Res. 2002;11:279-289
37. Chen SL, Ye H, Sha Q, Shi CY. Derivation of a pluripotent embryonic cell line from red
sea bream blastulas. J Fish Biol. 2003;63:10
38. Chen SL, Sha ZX, Ye HQ, Liu Y. et al. Pluripotency and chimera competence of an
embryonic stem cell line from the sea perch (Lateolabrax japonicus). Mar Biotechnol (NY).
2007;9:82-91
39. Parameswaran V, Shukla R, Bhonde R, Hameed AS. Development of a pluripotent ESlike cell line from Asian sea bass (Lates calcarifer)--an oviparous stem cell line mimicking
viviparous es cells. Mar Biotechnol (NY). 2007;9:766-775
40. Holen E, Kausland A, Skjaerven K. Embryonic stem cells isolated from atlantic cod
(Gadus morhua) and the developmental expression of a stage-specific transcription factor acpou2. Fish Physiol Biochem. 2010;36(4):1029-39
41. Holen E, Hamre K. Towards obtaining long term embryonic stem cell like cultures from a
marine flatfish, Scophthalmus maximus. Fish Physiol Biochem. 2004;29:245-252
42. Hong Y, Liu T, Zhao H, Xu H. et al. Establishment of a normal medakafish
spermatogonial cell line capable of sperm production in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A.
2004;101:8011-8016

Page 19


Nuôi cấy tế bào gốc của cá

43. Feng LX, Chen Y, Dettin L, Pera RA. et al. Generation and in vitro differentiation of a
spermatogonial cell line. Science. 2002;297:392-395
44. Guan K, Nayernia K, Maier LS, Wagner S. et al. Pluripotency of spermatogonial stem
cells from adult mouse testis. Nature. 2006;440:1199-1203
45. Shikina S, Ihara S, Yoshizaki G. Culture conditions for maintaining the survival and
mitotic activity of rainbow trout transplantable type a spermatogonia. Mol Reprod Dev.
2008;75:529-537
46. Nakamura S, Kobayashi K, Nishimura T, Higashijima S, Tanaka M. Identification of
germline stem cells in the ovary of the teleost medaka. Science. 2010;328:1561-1563
47. Zhang B, Wang X, Sha Z, Yang C, Liu S, Wang N, Chen SL. Establishment and
Characterization of a Testicular Cell Line from the Half-Smooth Tongue Sole, Cynoglossus
semilaevis. Int J Biol Sci. 2011;7:452-459
48. Wylie CC. The biology of primordial germ cells. Eur Urol. 1993;23:62-66
49. Yoon C, Kawakami K, Hopkins N. Zebrafish vasa homologue rna is localized to the
cleavage planes of 2- and 4-cell-stage embryos and is expressed in the primordial germ cells.
Development. 1997;124:3157-3165
50. Xu H, Li M, Gui J, Hong Y. Fish germ cells. Sci China Life Sci. 2010;53:435-446
51. Li M, Hong N, Xu H, Yi M. et al. Medaka vasa is required for migration but not survival
of primordial germ cells. Mech Dev. 2009;126:366-381
52. Fan L, Moon J, Wong TT, Crodian J, Collodi P. Zebrafish primordial germ cell cultures
derived from vasa::Rfp transgenic embryos. Stem Cells Dev. 2008;17:585-597
53. Yoshizaki G, Takeuchi Y, Sakatani S, Takeuchi T. Germ cell-specific expression of green
fluorescent protein in transgenic rainbow trout under control of the rainbow trout vasa-like
gene promoter. Int J Dev Biol. 2000;44:323-326
54. Mansour SL, Thomas KR, Capecchi MR. Disruption of the proto-oncogene int-2 in mouse
embryo-derived stem cells: A general strategy for targeting mutations to non-selectable genes.
Nature. 1988;336:348-352
55. Chen S, Hong Y, Schartl M. Development of a positive-negative selection procedure for
gene targeting in fish cells. Aquaculture. 2002;214:67-79

Page 20


Nuôi cấy tế bào gốc của cá
56. Hong Y, Chen S, Gui J, Schartl M. Retention of the developmental pluripotency in
medaka embryonic stem cells after gene transfer and long-term drug selection for gene
targeting in fish. Transgenic Res. 2004;13:41-50
57. Yan Y, Du J, Chen T, Yi M. et al. Establishment of medakafish as a model for stem cellbased gene therapy: Efficient gene delivery and potential chromosomal integration by
baculoviral vectors. Exp Cell Res. 2009;315:2322-2331
58. Fan L, Moon J, Crodian J, Collodi P. Homologous recombination in zebrafish es cells.
Transgenic Res. 2006;15:21-30
59. Takeuchi Y, Yoshizaki G, Takeuchi T. Biotechnology: Surrogate broodstock produces
salmonids. Nature. 2004;430:629-630
60. Okutsu T, Suzuki K, Takeuchi Y, Takeuchi T, Yoshizaki G. Testicular germ cells can
colonize sexually undifferentiated embryonic gonad and produce functional eggs in fish. Proc
Natl Acad Sci U S A. 2006;103:2725-2729
61. Okutsu T, Shikina S, Kanno M, Takeuchi Y, Yoshizaki G. Production of trout offspring
from triploid salmon parents. Science. 2007;317:1517
62. Herpin A, Rohr S, Riedel D, Kluever N. et al. Specification of primordial germ cells in
medaka (Oryzias latipes). BMC Dev Biol. 2007;7:3
63. Lee KY, Huang H, Ju B, Yang Z, Lin S. Cloned zebrafish by nuclear transfer from longterm-cultured cells. Nat Biotechnol. 2002;20:795-799
64. Siripattarapravat K, Pinmee B, Venta PJ, Chang CC, Cibelli JB. Somatic cell nuclear
transfer in zebrafish. Nat Methods. 2009;6:733-735
65. Wakamatsu Y, Niwa K, Kani S, Ozato K. Nuclear transplantation in medaka.
Tanpakushitsu Kakusan Koso. 2000;45:2962-2966
66. Gurdon JB. The developmental capacity of nuclei taken from differentiating endoderm
cells of Xenopus laevis. J Embryol Exp Morphol. 1960;8:505-526
67. Gurdon JB, Uehlinger V. "Fertile" intestine nuclei. Nature. 1966;210:1240-1241
68. Chen H, Yi Y, Chen M, Yang X. Studies on the developmental potentiality of cultured
cell nuclei of fish. Int J Biol Sci. 2010;6:192-198

69. Campbell KH, McWhir J, Ritchie WA, Wilmut I. Sheep cloned by nuclear transfer from a
cultured cell line. Nature. 1996;380:64-66

Page 21


Nuôi cấy tế bào gốc của cá
70. Tsai MC, Takeuchi T, Bedford JM, Reis MM. et al. Alternative sources of gametes:
Reality or science fiction?. Hum Reprod. 2000;15:988-998
71. Liu T, Liu L, Wei Q, Hong Y. Sperm Nuclear Transfer and Transgenic Production in the
Fish Medaka. Int J Biol Sci. 2011;7:469-475
72. Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and
adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 2006;126:663-676
73. Takahashi K, Okita K, Nakagawa M, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells
from fibroblast cultures. Nat Protoc. 2007;2:3081-3089
74. Wada N, Wang B, Lin NH, Laslett AL. et al. Induced pluripotent stem cell lines derived
from human gingival fibroblasts and periodontal ligament fibroblasts. J Periodontal Res.
2011[Epub ahead of print]

Page 22