NẤM TRONG CÔNG NGHỆ CHUYỂN HÓA MÔI TRƯỜNG

LÊ XN THÁM, Ph. D.
Assoc. Professor

NẤM

TRONG
CÔNG NGHỆ &
CHUYỂN HÓA
MÔI TRƯỜNG

Linh Chi
Ganodermataceae Donk

NHÀ XUẤT BẢN
KHOA HỌC &
KỸ THUẬT


Lê Xn Thám, Ph.D.
Assoc. Professor

NẤM
TRONG
CÔNG NGHỆ &
CHUY ỂN HÓA
MÔI TRƯ ỜN G

Linh Chi
Ganodermataceae Donk

NHÀ XUẤT BẢN KHOA HỌC & KỸ THUẬT

Hà nội – 2010


SỞ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ
TỈNH ĐỒNG NAI

VIỆN NĂNG LƯNG NGUYÊN TỬ VIỆT NAM

Chuyên luận III trong Đề tài:
“Phát triển sản xuất nấm trên cơ sở điều tra tài nguyên
xây dựng Bảo tàng Nấm Vườn Quốc gia Cát tiên”

Cùng GSTS. JM Moncalvo tại tuyến Cây tung, Nam Cát tiên, 4/2008


MỞ ĐẦU
Từ lâu, nấm Linh chi (Ganoderma) được biết tới như một loại thuốc dân gian có tác
dụng tăng cường sức khoẻ và chữa trị nhiều loại bệnh. Trong những năm gần đây các
nghiên cứu y và dược học cũng cho thấy rằng các chế phẩm từ nấm Ganoderma còn kìm
hãm sự tổng hợp ADN mới của tế bào ung thư và hạn chế quá trình di căn,…. Các loài
Ganoderma khác nhau cũng có thể sản sinh ra các loại hợp chất sinh học có hoạt tính
khác nhau, tác dụng tốt trên hệ tim mạch, bảo vệ gan, tăng cường miễn dịch,….
Cách đây tròn 60 năm (1948), Donk M.A. - nhà nấm học Hà Lan nổi tiếng đã xác lập
họ Linh chi Ganodermataceae Donk trên cở sở tính đặc thù của bào tử đảm – là yếu tố
sinh sản hữu tính của nấm Đảm (Basidiomycetes) mà ngày nay hầu hết các nhà nấm học
đều công nhận. Tuy nhiên trong những năm qua tình trạng phân loại - hệ thống học của họ
Ganodermataceae Donk như cố Giáo sư Zhao Ji-Ding (1916-1995) nêu rõ là đang rơi vào
những khó khăn và hỗn độn trong toàn bộ các loài nấm nhiều lỗ (Đa khổng khuẩn Polyporoid). Trên thực tế việc định loại các loài Linh chi rất dễ nhầm lẫn bởi những biến
hóa đa dạng hình thái thể quả và cấu trúc hệ sợi.
Trên thế giới cũng như nước ta, trong những năm gần đây, đã và đang trong tiến trình

tích hợp phân tích nhiều dẫn liệu cấu trúc gen ribosom cho nghiên cứu đa dạng sinh học.
Gen được sử dụng phổ biến nhất trong nghiên cứu phân loại nấm nói chung và phân loại
các loài Linh chi Ganoderma nói riêng là các gen ribosom (rADN) nhân và ty thể bao gồm
các vùng ITS (Internal Transcribed Spacers) và vùng phân ly D2 của gen mã hoá cho
rRNA tiểu đơn vị lớn (LSU-D2). Đây là một phương pháp phân tích hệ gen tương đối đơn
giản và nhanh chóng. Do vậy nhằm mục đích định loại chính xác hơn và đánh giá quan hệ
phát sinh chủng loại của họ Ganodermataceae, chúng tôi kết hợp phương pháp phân loại
dựa vào dẫn liệu hình thái kinh điển và phân tích cấu trúc DNA nhằm làm sáng tỏ hệ thống
phân loại phức tạp của họ này.
Chính vì vậy, Chuyên luận “Xây dựng hệ thống học chủng loại phát sinh của họ nấm
Linh chi Ganodermataceae Donk”, trên cơ sở hình thái giải phẫu và cấu trúc gene
(rDNA): thẩm định vị trí của nhóm Hoàng chi Tomophagus (tách ra từ chi Ganoderma)
với 1 đại diện mới phát hiện ở Vườn Quốc gia Cát Tiên, phân tích quan hệ của loài Linh
chi đỏ tím Humphreya endertii ở Thác trời Cát tiên (= Ganoderma endertii) - phát hiện bổ
sung mới ở Việt Nam, Linh chi đỏ ống to Haddowia longipes (= Amauroderma longipes)
vùng Nam Cát tiên – Mã đà và với các taxon gần gũi thuộc chi Ganoderma,
Amauroderma,… của họ nấm Linh chi Ganodermataceae được tiến hành. Qua đó xác định
củng cố mức bậc taxon của chúng. Đồng thời nghiên cứu xây dựng quy trình nuôi trồng
công nghệ hóa chủ động trên các nguồn cơ chất phụ phế liệu nhằm bảo tồn nguồn gen,
cung cấp dược liệu quý và góp phần giải quyết ô nhiễm môi trường.
Các cộng tác viên tham gia ít nhiều đã đóng góp cho chuyên luận này: Lý Xuân Quang,
Hoàng Tấn Lộc, Lê Viết Ngọc, Trần Hữu Độ, Phạm Ngọc Dương, Nguyễn Thị Thường
Anh, Nguyễn Mạnh Hùng, Nguyễn Văn Huấn, Bùi Thị Minh Hải, Huỳnh Tấn Mẫn, Nguyễn
Lê Quốc Hùng, TS. Lê Thị Thanh Huyền, GS.TS. Jean-Marc Moncalvo, TS. Dentinger M
Bryn và TS. Dirk Stubbe từ các cơ quan phối hợp: Trung tâm Hạt nhân Tp. Hồ Chí Minh,
Sở Khoa học & Công nghệ Lâm đồng, Đại học Nha trang, Đại học Dalat, Vườn Quốc gia
Cát tiên, Đại học Toronto, Canada, Đại học Gent, Vương quốc Bỉ. Đặc biệt sự giúp đỡ tận
tình và hiệu quả của Công ty Sinh học Công Thành, Long khánh, Đồng nai và trực tiếp cá
nhân ông Bùi Quang Trung Chủ tịch Hội đồng quản trị đã góp phần cho nhiều kết quả tốt.
Công trình này là một trong những dấu ấn tri ân cho một thời cộng tác của chúng tôi.

Trong sách này chúng tôi tạm thời dẫn ra khỏang 50 lòai đã được nghiên cứu, nuôi trồng ít
nhiều để thể hiện phần nào đa dạng sinh vật – tài nguyên nấm Linh chi ở Việt nam. Theo ước
tính của chúng tôi, nước ta có khỏang >60 lòai nấm Linh chi, vì chỉ riêng vùng Cao nguyên
Lâm đồng và Đồng nai (chưa tính hết Tây nguyên) đã có >50 lòai; vùng Thừa Thiên Huế (chưa
tính hết miền Trung bộ) đã có >30 lòai; vùng Bắc bộ (nhất là vùng Tây bắc, Việt bắc và Đông
bắc) cũng không ít hơn 30 lòai. Nếu tính các vùng sinh thái – đòa lý khác nữa và cứ dự kiến độ
trùng lặp khỏang 50-60%, thì con số 60 lòai là hòan tòan tin cậy trong tầm tay, nếu được khảo
cứu đầy đủ từ nay đến năm 2010 (xin lưu ý là tòan Trung quốc cũng chỉ có liệt kê khỏang 100
lòai, với độ trùng lặp được ước tính là 35%, nghóa là cũng chỉ có 60-70 lòai thực – chỉ tương
đương với Việt nam mà thôi!). Thật ấn tượng khi so với thế giới: ~200 lòai, với >400 tên gọi,
mà theo Moncalvo & Ryvarden (1997) bò nhầm lẫn, trùng lắp rất nhiều, thực tế các bộ mẫu vật
chỉ bao hàm trong khỏang 150-200 lòai là tối đa. Như thế Việt nam chiếm khỏang 1/3 với
không ít lòai mới, đặc hữu! Nghiên cứu tài nguyên nấm Linh chi ở Việt nam sẽ là một công
trình rất khó khăn, song tuyệt thú và có giá trò khoa học, kinh tế to lớn.
Những sơ sót, khiếm khuyết trong quá trình khảo cứu nấm Linh chi ở Việt nam của các nhà
nghiên cứu đương nhiên là khó tránh khỏi, kể cả trong quá trình biên soạn tập chuyên khảo
này. Kính mong nhận được sự chỉ dẫn, hợp tác chân thành và trợ giúp xa gần.

Trở lại Dalat, 8/2008
Nhớ về Hà nội – dâng tặng 1000 năm Thăng long 10/10/2010


CHƯƠNG I
ĐA DẠNG SINH HỌC NẤM LINH CHI
GANODERMATACEAE DONK
HỆ THỐNG HỌC PHÂN TỬ TRONG NẤM HỌC
Từ nửa cuối thế kỷ 20 trở lại đây và đặc biệt là từ thập niên 80, sự phát triển mạnh mẽ
của sinh học phân tử đã mở ra hàng lọat phương pháp nghiên cứu cho phân loại học, đó là

phân loại học phân tử. Phân loại học phân tử là sự phát hiện, mô tả và giải thích đa dạng
sinh học ở mức độ phân tử giữa các loài và trong phạm vi loài. Đây là những ứng dụng các
kỹ thuật hiện đại của sinh học phân tử, chủ yếu là hóa sinh và công nghệ gen vào mục đích
nghiên cứu đa dạng sinh học, nghiên cứu mối quan hệ tiến hoá giữa các loài, hình thành
chủng loại phát sinh,… Mặc dù mới ra đời nhưng các hướng này đã sớm trở thành hệ
thống phương pháp nghiên cứu hiệu quả, khắc phục được những hạn chế của các phương
pháp cổ điển, bổ sung xác định các dẫn liệu khoa học có tính bản chất và tính quy luật hơn
(Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002). Nghĩa là chúng ta có thể tiến gần hơn đến các hệ thống tự
nhiên.

I.1. HỆ THỐNG HỌC NẤM ĐẢM BASIDIOMYCETES TRÊN CƠ SỞ
TỔNG HỢP CÁC DẪN LIỆU VỚI GIẢI TRÌNH TỰ ADN
Có lẽ Giải Nobel Sinh – Y học vào năm 1980 trao cho Woese về thành tựu ứng dụng
phương pháp giải trình tự ADN trong nghiên cứu chủng lọai tiến hóa làm sáng tỏ nguồn
gốc và sự phân hóa các nhóm vi sinh vật (theo Woese, Kandler và Wheelis, 1992) đã mở
đầu cho kỷ nguyên hệ thống học phân tử. Có thể nói cách đây 25 năm phương pháp giải
trình tự acid nucleic đã mở đầu cho kỷ nguyên hệ thống học phân tử – hệ thống học chủng
loại phát sinh, đặc biệt cho nấm Đảm (Basidiomycetes).
Công trình tiên phong công bố trên Nature của Walker và Doolittle (1982) về giải trình
tự đoạn 5S của gene ribosome (rARN) ở 8 loài thuộc hai nhóm Dị đảm
(heterobasidiomycetes) và Đồng đảm (homobasidiomycetes), đã phác họa được quá trình
tiến hóa phân ly của chúng trong giới nấm (Hình 1.1). Những thành tựu này được thừa
nhận là thuyết phục và phù hợp với các dẫn liệu phân tích hình thái giải phẫu tinh vi mô tế
bào, đặc biệt là thể hiện rõ có bước nhảy tách ly trong phân hóa kiểu lỗ và vách ngăn trong
sợi nấm.
Ngay sau đó, Templeton ở Đại học Washington, Missouri (USA) đã phân tích trên
Nature (1983) tính cách mạng của công trình này, sau khi được Walker và Doolittle kiểm
chứng thêm với hơn 20 loài nữa. Họ chứng minh được bản chất tổ tiên chung của chúng.

Hình 1.1. Quan hệ chủng lọai phát sinh của các nhóm nấm Đảm
(trên cơ sở các dẫn liệu 5S rADN, Walker và Doolittle, 1983)
Trong 25 năm qua hệ thống học chủng loại phát sinh phân tử trên cơ sở các dẫn liệu
ADN đã trở thành trụ cột của nấm học hiện đại. Thực vậy, hãy điểm qua tổng quan cơ sở lý
luận trong các công trình của Bruns et al. (1991) ở Đại học Berkeley, California (USA),
Hibbett et al. (1992) ở Đại học Harvard (USA) vào thập niên 90 về tiến trình này.
Bruns, White và Taylor (1991) ở Đại học Berkeley, California (USA) đã tổng quan về
nền tảng của lĩnh vực hệ thống học chủng loại tiến hóa trên cơ sở giải trình tự ADN. Đây là
dấu ấn hết sức quan trọng vì sau 10 năm hàng loạt thành tựu gần như một cuộc cách mạng
trong toàn bộ các nhóm sinh vật với những kết quả rất thuyết phục và thậm chí bất ngờ.


Hình 1.2. Quan hệ chủng loại phát sinh của các nhóm sinh vật (có nấm Đảm)
(trên cơ sở các dẫn liệu 18S rADN: Bruns, White và Taylor, 1991)
Bức tranh chung về tiến hoá của Giới Nấm và vị trí của chúng trong các quần hệ sinh
vật trên cơ sở giải trình tự tiểu đơn vị 18S rARN nhỏ trong nhân được đưa ra trong Hình
1.2, đồng thời cung cấp một cái nhìn tổng quát giúp chúng ta nắm bắt được sự phù hợp
giữa hiệu quả của các phương pháp phân tích và các mức độ phân loại thích hợp.
Toàn bộ các nghiên cứu này nhấn mạnh tầm quan trọng của kiểm tra bằng thống kê của
giả thuyết phát sinh hình thái. Sự tương quan với giả thiết phát sinh hình thái trước hết dựa
trên hình thái học, sinh thái học, sinh lý học và dẫn liệu phân tử khác có thể cung cấp thêm
để xác minh sự phát sinh chủng loại ở mức phân tử. Qua đây cũng cho chúng ta thấy tiềm
năng của kỹ thuật phân tích ADN trong nghiên cứu quan hệ chủng loại phát sinh của các
bậc taxon sinh giới (Hình 1.3).


Hình 1.3. Tiềm năng kỹ thuật phân tích ADN trong nghiên cứu quan hệ chủng lọai phát
sinh của các bậc taxon sinh giới (Bruns, White và Taylor ,1991)
Tổng quan của nhóm các nhà khoa học ở Đại học Harvard (USA) Hibbett D.S. et
al., 1992, 1994, 1995 sau hơn 10 năm kể từ thành cơng của Walker và Doolittle (1982), với

hàng loạt thành tựu mới đã cho chúng ta những phân tích khái qt và sâu sắc về hệ thống
chủng loại phát sinh nấm trên cơ sở các phương pháp phân tích ADN.
Cũng chính nhóm Hibbett et al. (1997) đã phát triển tiếp các thành tựu này lần đầu tiên
xây dựng những nhóm cơ bản chủng loại phát sinh các nấm nhiều lỗ (Polyporoid fungi),
trên cơ sở khảo cứu 62 lồi, sử dụng phân tích tối thiểu tiểu đơn vị nhỏ của gene ribosome
ty thể (mt-rADN) để đánh giá quan hệ phát sinh chủng loại của nấm lỗ Polyporaceae và
phương hướng tiến hố của nấm lỗ trong những taxon khác.
Trong đó lần đầu tiên thấy được tương quan hệ thống học của nấm Linh chi chuẩn
Ganoderma lucidum (sinh trưởng hàng niên) trong các taxon liên hệ (Hình 1.4), theo đó đã
thấy sự phân hóa đa tạp của các chủng địa lý.
Giáo sư Vilgalys ở Đại học Duke, North Carolina (USA) là chuyên gia hàng đầu về
xây dựng và hoàn thiện phương pháp phân tích ADN trong nấm học đã nêu ra các
nguyên lý chặt chẽ và những kỹ thuật chuẩn về phân tích gene ribosome. Trong nghiên
cứu này đã đưa ra giới thiệu bộ sưu tập một danh sách các của trình tự mồi được dùng


cho phản ứng khuếch đại và giải trình tự của rADN trong nhân cho tất cả các vùng
của một đơn vò lặp lại của rADN từ hầu hết các nhóm chủ yếu của nấm (đặc biệt là
nhóm nấm thực Eumycota) cũng như các Eukaryota khác. Tất cả những mồi này đã
được xác đònh và đã được thử nghiệm dựa trên giải trình tự tiểu đơn vò lớn và nhỏ của
ADN từ nấm, các thực vật và các Eukaryota khác. Đồng thời, hầu hết những cặp mồi
này của các vùng mã hoá nhân rADN (Hình 6) cho phép khuếch đại bất cứ vùng nào
mong muốn.

Hình 6. Sơ đồ tiêu biểu chỉ rõ các vùng rARN và các mồi đặc hiệu cho từng vùng
(Vilgalys, 2001)

Hình 7. Các mồi xuôi và mồi ngược dùng cho phản ứng khuếch đại và giải trình tự của
tiểu đơn vị nhỏ của rADN (17-18S) (Vilgalys, 2001)
.

Hình 8. Các mồi xuôi và mồi ngược dùng cho phản ứng khuếch đại và giải trình tự của
tiểu đơn vò lớn của ARN 25-28S (Vilgalys, 2001)
Internal transcribed spacer (ITS) region primers

Hình 9. Các mồi xuôi và ngược dùng cho phản ứng khuếch đại và giải trình tự vùng
khoảng cách nội phiên mã ITS (Vilgalys, 2001)
Các đoạn rADN thường được chọn đọc trình tự nucleotide là: rADN 5S, rADN 5,8S,
rADN 18S, rADN 26S, và ITS. Trong đó, vùng ITS có lẽ là vùng ADN được giải trình
tự rộng rãi nhất trong giới nấm. Nó là vùng tiêu biểu được sử dụng nhiều nhất đối với
hệ thống hệ thống học phân tử ở mức độ loài, và thậm chí là trong các loài (ví dụ để
xác đònh các loài đòa lý). Bởi vì mức độ biến đổi của vùng ITS cao hơn các vùng gen
khác của rADN.
Gần đây, để đánh giá tiến trình phát triển của hệ thống học phân tử của nấm, các
nhà khoa học Australia đứng đầu là Glen M. (2006) đã nghiên cứu chuẩn hóa các kỹ
thuật phân tích ADN cơ bản áp dụng cho thẩm đònh phân loại và chủng loại phát sinh.
Từ sau công trình nghiên cứu của Brun, White và Taylor, nghiên cứu này đã chỉ ra một
loạt các kỹ thuật phân tích ADN là một công cụ rất hữu hiệu trong phân tích giới Nấm.
Các kỹ thuật này không chỉ giúp thẩm đònh phân loại nấm mà còn được ứng dụng rộng
rãi trong đời sống con người, có thể xác đònh nhanh chóng và chính xác mầm bệnh


nấm. Chúng còn được sử dụng để kiểm tra chất lượng lương thực để phát hiện nấm
nhiễm bệnh và xác minh các loài nấm có giá trò cao. Bao gồm các phương pháp sau:
* Phương pháp lai Southern blotting:
Phương pháp Southern blotting hoặc dot blotting đòi hỏi phải gắn ghép hệ gen ADN
lên một màng, gây biến tính liên kết ADN, sau đó lai với mẫu dò có đánh dấu phóng
xạ. Phương pháp này cho phép xác đònh được sự có mặt của những trình tự nucleotide
trên một đoạn ADN nào đó trong một hỗn hợp các đoạn ADN khác nhau dựa trên sự

bắt cặp của mẫu dò (ADN mẫu dò) đã được đánh dấu (P32) với đoạn ADN có chứa trình
tự bổ sung với mẫu đó. Đây là một phương pháp chuẩn xác được áp dụng rất thành
công trong việc đánh giá tính đa hình của các đoạn giới hạn. Do yêu cầu về số lượng
tương đối lớn của ADN, phương pháp này không dùng ở quy mô lớn thay thế bằng
phương pháp PCR (Glen M., 2006).

Hình 10. Sơ đồ quy trình kỹ thuật Southern Blot (Glen 2006)


* Kỹ Thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)
Kỹ thuật PCR đã được phát triển từ những năm 1980 và đã chuyển sang một bước
ngoặc mới cùng với sự phát hiện enzyme ADN polymerase chòu nhiệt được tách từ một
vi khuẩn chòu nhiệt để cho enzyme có thể chòu đựng nhiệt độ yêu cầu cho chu kỳ phản
ứng PCR. Bản chất của kỹ thuật PCR (phản ứng chuỗi trùng hợp, phản ứng chuỗi
polymerase) là kỹ thuật tổng hợp nhân tạo các đoạn ADN với tốc độ nhanh chưa từng
thấy và độ chính xác cao được thực hiện trong máy chu trình nhiệt (máy PCR). Từ khi
ra đời kỹ thuật PCR, người ta đã áp dụng thành công kỹ thuật PCR trong việc đánh giá
tính đa hình ADN của sinh vật. Đáng chú ý là các phương pháp RAPD, AFLP và Micro
satelite. Các phương pháp này sử dụng kỹ thuật PCR làm nền nhưng khác ở chỗ là sử
dụng các mồi được thiết kế khác nhau.

Hình 11. Sơ đồ chu trình PCR (Glen 2006)


Hình 12. Sơ đồ quá trình nhân bản một đoạn ADN xác đònh bằng PCR
(Glen 2006)
* Giải trình tự ADN (DNA sequencing)
Cuối những năm 70 của thế kỷ trước, các nhà khoa học đã hoàn thiện phương pháp
phân tích nhanh trình tự ADN và đã phổ biến rộng rãi trong các phòng thí nghiệm sinh
học phân tử trên thế giới. Theo phương pháp này, trình tự của hàng trăm bazơ có thể

được xác đònh trên một đoạn gene riêng biệt. Sau đó các thông số về trình tự được so
sánh và xem xét bằng máy vi tính. Phương pháp này đã và đang được sử dụng rộng rãi


để xác đònh loài và mối quan hệ phát sinh chủng loại của hầu hết các nhóm vi sinh vật
và nấm. Sau đây là một kết quả giải trình tự ADN ở đoạn tiêu biểu từ 350- 370
nucleotide (Glen M., 2006)

Hình 13. Phổ sơ cấp đọc trình tự cấu trúc ADN (Glen M, 2006)
Cho đến nay đã có hàng loạt kỹ thuật sinh học phân tử được áp dụng trong nghiên
cứu chủng loại phát sinh ở các nhóm VSV, nó bao gồm các kỹ thuật như phân tích trình
tự axit amin, thành phần bazơ nitơ của ADN, lai axit nucleic, phân tích đoạn ADN dựa
trên sự đa hình về độ dài các đoạn giới hạn (RFLP), RAPD (đa hình các đoạn ADN
nhân bản ngẫu nhiên, ALFP (sự đa hình chiều dài của các phân đoạn ADN được nhân
bản), microsatelite (vi vệ tinh).... Sau đây chúng tôi xin điểm qua một số phương pháp
đã và đang được áp dụng trong phân loại nấm.
* Phương pháp xác đònh tỷ lệ GC: tỷ lệ (G+C)/(A+T+G+C) có xu hướng không đổi
đối với các loài nhất đònh và khác nhau giữa các loài. Do vậy thành phần (G+C) phản
ánh mối quan hệ phát sinh loài. Tuy nhiên thành phần (G+C) chỉ giúp phân biệt được
hai loài khác nhau mà không xác đònh được hai chủng có cùng loài hay không vì nếu tỷ
lệ (G+C) giống nhau nhưng trình tự khác nhau thì chúng thuộc hai loài khác nhau
(Kurtzman C. P và Blanz P. A, 1998).
* Kỹ thuật RAPD-PCR (Randomly Amplified Polymorphic ADN – đa hình các đoạn
ADN nhân bản ngẫu nhiên)


RAPD (Randomly Amplified Polymorphic ADN - đa hình các đoạn ADN nhân bản
ngẫu nhiên) là những đoạn ADN được khuếch đại bằng phản ứng PCR sử dụng trình tự
mồi tổng hợp ngẫu nhiên ngắn (thường gồm 10bp). Các oligonucleotide này được sử
dụng như cả mồi xuôi và mồi ngược. Những phân đoạn được khuếch đại thường có kích

thước từ vài trăm đến vài ngàn cặp bazơ nitơ (bp). Khi phân tích bằng điện di, sự đa
hình của các trình tự ADN giữa các cá thể (Hình 14) sẽ được biểu hiện bằng các băng
điện di tương ứng với kích thước và tốc độ di chuyển trên điện trường khác nhau. Sự đa
hình được xem là do hoặc sự khác nhau về vò trí gắn mồi là chính, nhưng cũng có thể do
các đoạn dài, ngắn khác nhau nằm giữa các vò trí gắn mồi (Spooner D. et al., 2005)
Ưu điểm chính của chỉ thò RAPD-PCR là kỹ thuật phân tích tương đối đơn giản và
nhanh chóng, chỉ cần một lượng mẫu rất nhỏ cho mỗi phản ứng PCR, trình tự các mồi là
ngẫu nhiên ngắn, nên thường có sự đa dạng hệ gen cao. Tuy vậy, chỉ thò RAPD-PCR
cũng có một số nhược điểm như độ lặp lại thấp. Đôi khi tính lặp lại thấp này làm việc
trao đổi hoặc so sánh kết quả giữa các nhóm nghiên cứu khác nhau gặp khó khăn.
Cũng như các kỹ thuật phân tích nhiều locut khác, chỉ thò RAPD không có đặc trưng
locut (Spooner D. et al., 2005; Schierwater B. và Ender A., 1993).

H×nh 14. S¬ ®å nguyªn lý cđa kü tht RAPD-PCR
(Spooner D. et al., 2005)
* Kỹ thuật RFLP
Chỉ thò đa hình độ dài các đoạn cắt giới hạn RFLP là một trong những kỹ thuật đầu
tiên được sử dụng trong nghiên cứu tính đa dạng của các trình tự ADN. Kỹ thuật này
gần đây được cải tiến dựa trên PCR, gọi là phương pháp RFLP-PCR. Cả hai phương
pháp truyền thống và dựa trên PCR là dựa trên khả năng so sánh các băng thu được
sau khi xử lý ADN của các cá thể khác nhau bằng enzyme giới hạn. Các đột biến khác
nhau xảy ra trên trình tự ADN tại các vò trí cắt giới hạn tạo ra các phân đoạn ADN có
chiều dài khác nhau. Sự khác nhau này có thể thấy được nhờ điện di, tiến hành lai với


mẫu dò (probe) và quan sát. Nguyên lý của kỹ thuật được tóm tắt như trên hình
15(IPGRI and Cornell University, 2003).
Phương pháp này có thể được sử dụng trong đánh giá đa dạng di truyền, xác đònh
quan hệ di truyền, nghiên cứu chủng loại phát sinh, lập bản đồ gen… Tuy vậy, nhược
điểm thường gặp của phương pháp này là cần một mẫu phân tích lớn hơn, chi phí phân

tích cao và thời gian phân tích dài hơn .

H×nh 15. Nguyªn lý cđa kü tht RFLP
(IPGRI and Cornell University, 2003)

1.
2.
3.
4.

* Kỹ thuật AFLP
Đa hình độ dài các đoạn khuếch đại AFLP cũng là một phương pháp kết hợp giữa
nguyên lý RFLP và PCR. Kỹ thuật này cho phép hiện được tính đa dạng về chiều dài
các đoạn ADN được nhân bản chọn lọc. Nguyên tắc của phương pháp dựa trên việc
chọn lọc khuyếc đại bằng PCR những phân đoạn ADN đã được xử lý bằng enzym cắt
giới hạn. Phương pháp được tiến hành dựa trên 4 bước cơ bản được tóm tắc ởõ Hình 16
như sau:
ADN hệ gen hoặc ADNđược xử lý bằng hai ezym cắt giới hạn
Gắn oligonucleotide adpter vào hai đầu của ADN đã bò cắt
Sử dụng các mồi được lựa chọn khuếch đại ADN đã xử lý đặc hiệu
Xác đònh đa hình bằng phương pháp đồng vò phóng xạ, thuốc nhuộm huỳnh
quang hoặc bằng phương pháp nhuộm bạc
Phương pháp này có thể được sử dụng trong đánh giá đa dạng di truyền, xác đònh
khoảng cách di truyền, lập bản đồ di truyền,... Mặc dù có tính đặc hiệu cao nhưng
AFLP cũng thường đòi hỏi nhiều thời gian tích dài, nhiều công đoạn và chi phí phân
tích cao.


Hình 16. Nguyên lý của kỹ thuật AFLP
(IPGRI and Cornell University, 2003)

* Kỹ thuật SSR
Chỉ thò các đoạn trình tự lặp lại đơn giản SSR hay còn gọi là vi vệ tinh
(Microsatellites) là một đoạn ADN có sự lặp lại của một trình tự nucleotide đơn giản
nào đó. Phương pháp này cho phép phát hiện được tính đa hình về độ dài các trật tự
nucleotide đơn giản. SSR cũng dựa trên nguyên tắc của PCR và phương pháp điện di
trên gel. Do sự khác nhau về số lượng nucleotide trong mỗi đơn vò lặp lại và số đơn vò
lặp lại mà sự đa hình về độ dài của SSR được nhân bản sẽ được phát hiện sau khi điện
di trên gel.
Phương pháp SSR có thể được sử dụng trong nhiều nghiên cứu di truyền của các
quần thể, từ mức độ cá thể đến mức độ loài. Tuy nhiên, chỉ thò SSR cũng gặp khó khăn
trong nghiên cứu đa hình trên các đối tượng mới vì phải xác đònh được trình tự ở hai
vùng biên đoạn ADN cần phân tích (Spooner D. et al., 2005)
Kỹ thuật ISSR
Chỉ thò ISSR tương ứng với đoạn trình tự ADN khoảng 100 - 3000 bp nằm ở giữa hai
vùng SSR gần nhau. Nguyên tắc của kỹ thuật này là khuếch đại PCR sử dụng mồi dựa
trên trình tự của SSR với một số nucleotide được lựa chọn để có thể liên kết được với
trình tự ngay sát vùng không lặp lại (khoảng 16 – 18 bp). Các phân đoạn ADN được tạo
thành sẽ được phân tách trên gel điện di và được ghi lại bằng sự có mặt hay vắng mặt
của các phân đoạn ADN với các kích thước nhất đònh.
ISSR thường được sử dụng trong phân loại học, xác lập quan hệ và bản đồ di truyền.
Giống với RAPD-PCR, chỉ thò ISSR có nhược điểm là khó phân biệt các phân đoạn
khác nhau có kích thước giống nhau và đôi khi độ lặp lại không cao. Ưu điểm của
phương pháp này cũng là chỉ cần một lượng mẫu nhỏ (Spooner D. et al., 2005)


* Kỹ thuật Microarray (microscofic arrays)
Là một kỹ thuật mới rất hiện đại, cho phép cùng một lúc xác đònh được sự hiện diện
và biểu hiện của các gen ở những mô, tế bào đặc trưng.
Nguyên lý: gen sẽ được gắn vào lam kính hiển vi (đóa microarray) ở dạng sợi đơn.
Mỗi đóa gắn hàng ngàn gen đến hàng chục ngàn gen. Tách ARN thông tin ở các mô tế

bào đặc thù được đánh dấu bằng chất nhuộm màu có khả năng phát quang. Tiến hành
phản ứng lai hỗn hợp ARN thông tin với gen trên đóa micro array. Sau phản ứng lai, rửa
sạch các mARN không lai rồi quan sát qua sự phát màu ở điểm lai dưới kình hiển vi.
Dựa vào kết quả phản ứng lai ta biết được mARN của gen nào đã được xuất hiện trong
các điều kiện thí nghiệm. Kết quả sẽ phát hiện sược gen nào hoạt động, gen nào không
hoạt động (ở các mô tế bào khác nhau cũng như dưới tác động của môi trường khác
nhau)
Khả năng ứng dụng: microarray là một công cụ cực kỳ hữu hiệu phục vụ lónh vực
genom học chức năng (functional genomics), nghiên cứu và xác đònh chức năng của
gen trong genom cho biết tính trạng quan tâm do những gen nào kiểm soát, chức năng
của các gen đó ra sao?. Tuy nhiên phương pháp này rất tốn đắc tiền. Tuy nhiên phổ
biến nhất hiện nay là kỹ thuật phân tích trình tự gen rADN đang được sử dụng rộng
rãi nhất (Nguyễn Quang Thạch, 2005).


Hình 1.4. Quan hệ chủng loại phát sinh của Linh chi chuẩn Ganoderma lucidum trong
các nấm nhiều lỗ (Polypores) theo dẫn liệu ADN
(Hibbett và Donoghue, 1994)


Hình 1.5. Quan hệ chủng loại phát sinh của Linh chi đa niên Ganoderma australe với
các nấm đồng đảm theo dẫn liệu cấu trúc ADN (Hibbett et al., 1997)
Tiếp đó Hibbett et al. (1997) trong Kỷ yếu Viện Hàn lâm Khoa học Quốc gia Hoa Kỳ
lại xác định vị trí chủng loại phát sinh của nấm Cổ Linh chi đa niên Ganoderma australe
trong 81 loài nấm đồng đảm liên hệ trên cơ sở các dẫn liệu giải trình tự ADN gene trong
nhân (nu rADN) và gene ty thể (mt rADN) (Hình 1.5).


I.2. HỆ THỐNG HỌC NẤM LINH CHI GANODERMATACEAE DONK
TRÊN CƠ SỞ TỔNG HỢP CÁC DẪN LIỆU VỚI GIẢI TRÌNH TỰ ADN.

Khởi đầu ứng dụng phương pháp phân tích ADN trong nghiên cứu các taxon nấm Linh
chi có thể coi như bắt đầu cách đây 15 năm, tính từ đầu thập niên 90, với hai luận án Tiến
sĩ ở Đại học Quốc gia Đài Bắc, Đài loan.
Hseu (1991) trong luận án của mình lần đầu tiên áp dụng phân tích ADN và bào tử cho
8 loài Ganoderma và 1 loài Amauroderma. Đồng thời các dẫn liệu phổ isozyme cũng được
khảo cứu. Sau đó nhóm này xác định quan hệ chủng loại phát sinh của Linh chi chuẩn G.
lucidum complex (Hseu et al., 1995).
Năm 1996, Hseu và cộng sự đã sử dụng trình tự ITS để phân biệt, nhận dạng các mẫu G.
lucidum và so sánh với sự phân loại bằng RAPD. Một số mẫu có trình tự ITS giống hệt
nhau, nhưng lại được phân biệt bằng phổ băng nhân bản đặc trưng tạo ra bởi RAPD. Chỉ
thị RAPD có thể phân loại hệ thống học ở mức độ phân loại thấp hơn mà không thể phân
tích bằng dữ liệu giải trình tự ITS. Mặc dù đoạn trình tự ITS của ADN ở ribosom được sử
dụng phổ biến trong nghiên cứu phân loại Ganoderma.

Hình 1.6. Phân tích đa hình ADN bằng RAPD cho 5 loài Ganoderma
(Hseu et al., 1995)
Tuy nhiên, thông tin về trình tự vùng ITS nhiều khi không thay đổi ở một số taxon gần
nhau. Do vậy, nếu chỉ sử dụng kết quả đoạn ITS sẽ không đảm bảo có sự chính xác cao
trong phân loại Ganoderma. Chỉ thị RAPD-PCR là kỹ thuật phân tích tương đối đơn giản
và nhanh chóng, có thể sử dụng để phân biệt những taxon không thể phân biệt bằng ITS
(Trịnh Tam Kiệt et al., 2005).
Tiếp đó Yeh et al. (1995, 1996) ở Đài Loan - cũng trình luận án Tiến sĩ năm 1991, đã
xác định mối quan hệ giữa các loài Linh chi hàng niên Ganoderma neo-japonicum với
Linh chi đa niên G. australe, cũng phân tích kết hợp hình thái bào tử và dẫn liệu trình tự
ADN (Hình 1.7).


Hình 1.7. So sánh loài đa niên (G. australe) với loài hàng niên (G. neo-japonicum)
(Yeh et al., 1996)
Có thể nhận thấy các công trình của Moncalvo Jean-Marc et al. vào giữa thập niên 90

đã xác lập những cơ sở quyết định cho phân tích ADN trong nghiên cứu chủng lọai phát
sinh các nhóm Linh chi. Cho đến nay đây vẫn là những thành tựu kinh điển nhất về phân
tích ADN các lòai thuộc chi Ganoderma Karst., góp phần kiểm định các quan điểm phân
lọai cổ điển và hệ thống học truyền thống trong họ Linh chi Ganodermataceae Donk. Ngay
từ 1994 Moncalvo et al. tại Đại hội Nấm học Quốc tế ở Vancouver, Canada đã xác định
vùng rADN được tập trung nghiên cứu - phân tích giải trình tự là ITS1, ITS2 và vùng phân
ly D2.

Hình 1.8. Sơ đồ gene ribosom (rADN) chỉ rõ vị trí các vùng bia cho phản ứng khuếch
đại PCR và sequencing (Moncalvo et al., 1995)
Đó là khoảng cách được nội phiên mã 1 (ITS1) và 2 (ITS2) và vùng phân hoá D2 của
gene cho tiểu đơn vị lớn (large ribosomal subunit- LSU-D2)


Dựa vào những vùng bảo thủ trong gen mã hóa phân tử rADN các nhà khoa học đã
thiết kế các cặp mồi vạn năng để có thể khuếch đại các vùng biến đổi. So sánh sự khác biệt
giữa các vùng này người ta có thể chỉ ra được những sự khác biệt giữa các loài gần gũi.
Kết quả phân tích cấu trúc ADN của gen ribosom (các vùng ITS1, ITS2 và vùng phân
hoá D2 của tiểu đơn vị lớn của ribosom LSU-D2) của gần 30 loài Ganoderma và mới chỉ
một loài Amauroderma cho thấy các loài Ganoderma khác nằm rải rác gần loài linh chi
chuẩn G. lucidum. Đáng lưu ý là G. colossum (chủng Hoàng chi Ganoderma colossum lấy
từ Bắc Mỹ) tách biệt với các loài Ganoderma khác và đồng thời chỉ ra rằng các nhóm loài
Ganoderma có nguồn gốc thuần nhất (monophyletic), nếu không tính đến G. colossum
(được tách biệt hoặc loại trừ khỏi chi này). Lưu ý rằng G. colossum chứa nhiều dẫn xuất
triterpenoid – các colossolactones có hoạt tính dược lý cao.


Hình 1.9. Quan hệ chủng loại phát sinh của G. microsporum và G. colossum với các
loài Linh chi
(dẫn liệu rADN, Moncalvo et al., 1995)