NGHIÊN CỨU QUẦN THỂ VI KHUẨN CHUYỂN HOÁ ĐẠM TRONG BÙN ĐÁY AO NUÔI TÔM SÚ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

PHẠM THỊ TUYẾT NGÂN

NGHIÊN CỨU QUẦN THỂ VI KHUẨN CHUYỂN HOÁ ĐẠM
TRONG BÙN ĐÁY AO NUÔI TÔM SÚ
(Penaeus monodon)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ THỦY SẢN

Cần Thơ - 2012

i


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

PHẠM THỊ TUYẾT NGÂN

NGHIÊN CỨU QUẦN THỂ VI KHUẨN CHUYỂN HOÁ ĐẠM
TRONG BÙN ĐÁY AO NUÔI TÔM SÚ
(Penaeus monodon)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ THỦY SẢN
Chuyên ngành: Nuôi trồng Thủy sản nước Mặn, Lợ
Mã số:

62 62 70 05

Người hướng dẫn khoa học:
PGs. Ts. NGUYỄN HỮU HIỆP
PGs. Ts. TRƯƠNG QUỐC PHÚ

Cần Thơ – 2012

ii


LỜI CAM KẾT KẾT QUẢ

Tôi xin cam kết luận án này được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên
cứu của tôi. Tất cả các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực và
chưa từng được công bố trong thời gian trước đây bởi tác giả khác.
Cần Thơ, ngày …. tháng ….năm 2012
TÁC GIẢ

PHẠM THỊ TUYẾT NGÂN

i


LỜI CẢM TẠ

Trước hết tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Cần
Thơ, Ban Chủ nhiệm Khoa Thủy sản, Bộ môn Thủy sinh học Ứng dụng, Khoa
Thủy sản; Phòng Đào tạo; Phòng Quản lý Khoa học và Phòng Tài vụ Trường Đại
học Cần Thơ đã tạo mọi điều kiện cho tôi được thực hiện chương trình Nghiên
cứu sinh trong những năm qua.
Tôi xin trân trọng và bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Thầy hướng dẫn

PGs.Ts. Nguyễn Hữu Hiệp và PGs.Ts. Trương Quốc Phú trong thời gian qua đã
tận tình hướng dẫn, động viên, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi học
tập, nghiên cứu, chăm bồi kiến thức và hoàn thành luận án này.
Xin cảm ơn sâu sắc đến PGs.Ts. Nguyễn Thanh Phương và PGs.Ts.
Nguyễn Hữu Hiệp đã hướng dẫn chuyên đề nghiên cứu cho tôi. Đặc biệt, trong
quá trình nghiên cứu, thực hiện luận án, tôi đã nhận được những lời khuyên,
những kinh nghiệm quí báu và sự giúp đỡ nhiệt tình về mặt chuyên môn từ
PGs.Ts. Đặng Thị Hoàng Oanh, Ts. Trần Nhân Dũng, Ths. Huỳnh Trường Giang.
Sự giúp đỡ một số vật liệu thí nghiệm từ Ths. Nguyễn Thị Hồng Vân, Ts. Nguyễn
Thị Thu Thảo, Ths. Huỳnh Thanh Tới (Khoa Thủy sản); Ths. Đỗ Tấn Khang,
Trần Văn Bé Năm (Viện NC & PT Công nghệ Sinh học); và Ts. Dương Minh
Viễn (Bộ môn Khoa học đất, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng), Trường
Đại học Cần Thơ.
Đặc biệt, chân thành cảm ơn PGs.Ts. Vũ Ngọc Út và tập thể quí thầy cô
thuộc Bộ môn Thủy sinh học Ứng dụng đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ
tôi hoàn thành luận án này. Hơn nữa, kết quả của luận án cũng nhờ vào sự đóng
góp không nhỏ của các em sinh viên Châu Ngọc Sơn, Lê Mỹ Phương, Liễu Như
Ý (Bệnh học Thủy sản K30). Nguyễn Thanh Tâm, Lâm Trung Tính (Lớp Bệnh
học Thủy sản K31). Lê Đông Cung, Nguyễn Hoàng Trong, Trương Minh Trường,

ii


Đào Như Ý, Nguyễn Thị Mỹ Tú (Lớp Bệnh học Thủy sản K32). Nguyễn Hữu
Anh Duy, Nguyễn Thị Thanh Tâm, Lê Văn Nhiều (Lớp Nuôi trồng Thủy sản
Liên thông khóa 2009), Ngô Thị Huyền (Lớp Sinh học biển K34) và Mai Bé Túy
(Lớp Bệnh học Thủy sản K33). Đặc biệt chân thành cám ơn Bác sĩ Trần Văn
Dũng (ấp Trà Niên, xã Vĩnh Hiệp, huyện Vĩnh Châu, tỉnh Sóc Trăng) chủ trại
nuôi tôm đã tào điều kiện giúp đở chúng tôi được phép thu mẫu trong ao vào giai
đoạn đầu của quá trình thực hiện luận án này.

Cuối cùng, xin được biết ơn sâu sắc đến gia đình tôi, bạn bè và những
người thân đã chia sẻ, giúp đỡ và động viên để tôi có thêm nghị lực hoàn thành
luận án này.
PHẠM THỊ TUYẾT NGÂN

iii


ABSTRACT
Nitrogen accumulation affects the quality and sustainability of many
aquaculture products. Using beneficial bacteria to reduce nitrogen accumulation
has been widely used for many decades. Thus, study on nitrifying bacterial
population in intensive shrimp pond sediments has been made. The study was
conducted from 2008 to 2011. Sampling was made before and after the seed
stocking and then every 2 weeks post stocking until the end of the crop. The steps
were listed below: (1) three groups of Bacillus, Nitrosomonas and Nitrobacter
were isolated from selective culture medium. The bacterial strains were identified
by biochemical tests and molecular technique. (2) Water quality and sediment in
the pond were analyzed by standard methods (APHA et al., 1995). Densities of
some groups of bacteria (total bacteria, Vibrio, Nitrosomonas and Nitrobacter)
were also determined. (3) The isolated strains were selected based on the ability
to improved water quality. These strains were tested in 2 stages of shrimp. The
first experiments tested on shrimp larvae using three bacterial species: B. cereus
(B37), Nitrosomonas nitrosa (S8) and Nitrobacter winogradskyi (N10). Bacillus
additional density is 106, 105 and 104 CFU/mL; Nitrosomonas and Nitrobacter
density added is 104 CFU/mL. The second experiment tested on postlarvae stage
in the tank 500 L with 3 different kinds of bacteria Bacillus cereus (B9), Bacillus
amyloliquefaciens (B41) and Bacillus subtilis (B67). The density of bacteria
added was 105 - 106 CFU/g. The third experiment was arranged similar to
experiment 2 with the addition of Bacillus cereus (B8), B37 and B38 at the

density of 105 - 106 CFU/g. The water quality, bacterial density were determined
7 days/times until the end of experiment; survival and growth of the shrimp is
determined at the end of the experiment.
Nine strains of Bacillus, eight strains of Nitrosomonas and eight strains of
Nitrobacter were selected. The collection of nitrifying bacteria in sediments of

iv


intensive shrimp ponds was stored in the freezer at -80 º C in the college of
Aquaculture and Fisheries, Can Tho University. Based on physiological,
biochemical tests and sequencing results strains B8, B9, B37 and B38 were
identified Bacillus cereus; strain B41 and B67 were

identified as Bacillus

amyloliquefaciens and Bacillus subtilis respectively. Strains S8 and S12 were
identified as Nitrosomonas nitrosa and strains N10 and N12 were identified as
Nitrobacter winogradskyi.
Most of the environmental parameters and sediment in intensive shrimp
ponds were suitable for shrimp culture. The density of total bacteria on pond
sediment ranged from 104 - 106 CFU/g. Bacillus ranging from 104 to 105 CFU/g
tended to be stable during the culture. Nitrosomonas ranging from 7 to 2.6 × 103
MPN/g. Nitrobacter had the lowest density and ranged from 5.5 to 1.9 × 103
MPN/g and total Vibrio tended to increase and range from 2.1 × 102 to 1.5 × 105
CFU/g.
The results from laboratory conditions showed that, the appropriate
bacterial density added in tank at larvae stage was 105 CFU/mL for Bacillus. This
was the optimal density of bacteria on biodegradation of organic matter and
suppression of other bacteria, especially Vibrio and survival of larval was

improved significantly. Six strains tested on shrimp tanks in the laboratory
conditions had better results in all parameters compared to control without
addition of bacteria. Two strains Bacillus cereus (B37 and B9) were the most
dominant in the environment, maintained at high density, improved water quality,
decomposed organic mater, improved survival of shrimp and increased shrimp
growth. The survival rate of shrimp in treatments supplemented with Bacillus
higher (93 to 97.2%) compared to no added bacteria (70.8%). Absolute growth
rate of shrimp increased in the Bacillus bacterial treatments (10.7; 8.5 and 7.8
g/ind. compared to controls (5.3 g/ind.). In shrimp culture when Bacillus was
introduced the development of natural nitrification bacteria were stimulated due

v


to the products NH4+/NH3 created by Bacillus. Survival rate of shrimp was
highest at Bacillus B37 treatment (93.3%), and lowest at control (70%). Absolute
growth in weight was highest in B37 (16.6 g/ind.), while in control was the
lowest (5.2 g/ ind). Compared to strains B38; B8; strain B37 had better effect
based on improvement of water quality, survival and growth of shrimp.
Key words: Bacillus, Nitrosomonas, Nitrobacter, water quality, Penaeus monodon.

vi


TÓM TẮT
Tích lũy đạm ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng các đối tượng nuôi
thủy sản. Sử dụng vi sinh vật hữu ích để giảm thiểu tích lũy đạm đã được sử dụng
rộng rãi trong nhiều thập kỹ qua. Do vậy, nghiên cứu quần thể vi khuẩn chuyển
hóa đạm trong bùn đáy ao nuôi tôm sú đã được thực hiện. Nghiên cứu được tiến
hành từ năm 2008 đến 2011. Nhịp thu mẫu được thực hiện trước và sau khi thả

tôm và sau đó 2 tuần/lần cho đến khi kết thúc vụ nuôi. Các bước thực hiện lần
lượt được liệt kê dưới đây: (1) ba nhóm vi khuẩn Bacillus, Nitrosomonas và
Nitrobacter được phân lập trên môi trường chuyên biệt. Các chủng vi khuẩn này
được định danh bằng phép thử sinh hóa và sinh học phân tử. (2) Chất lượng nước
và bùn đáy ao đã được phân tích theo phương pháp chuẩn (APHA et al., 1995).
Mật độ một số nhóm vi khuẩn (vi khuẩn tổng, Vibrio, Bacillus, Nitrosomonas và
Nitrobacter) đã được xác định (3) Các chủng vi khuẩn phân lập được chọn lọc
dựa trên khả năng cải thiện chất lượng nước. Các chủng này được thử nghiệm ở 2
giai đoạn. Ba thí nghiệm đã được bố trí thử nghiêm như sau. Thí nghiệm thứ nhất
thử nghiệm trên ấu trùng tôm sú có sử dụng 3 loài vi khuẩn: B. cereus (B37), N.
nitrosa (S8) và N. winogradskyi (N10). Mật độ Bacillus bổ sung là 106, 105 và
104 CFU/mL; mật độ Nitrosomonas và Nitrobacter được bổ sung là 104
MPN/mL. Thí nghiệm thứ 2 thử nghiệm ở giai đoạn tôm giống trong bể 500 L
với 3 dòng vi khuẩn khác nhau B. cereus (B9), B. amyloliquefaciens (B41) và B.
subtilis (B67). Mật độ vi khuẩn được bổ sung là 105 - 106 CFU/g. Thí nghiệm 3
được bố trí tương tự như thí nghiệm 2, nhưng bổ sung vi khuẩn B. cereus (B8),
B37 và B38, với mật độ bổ sung là 105 - 106 CFU/g. Các chỉ tiêu chất lượng môi
trường nước, mật độ vi khuẩn, được xác định 7 ngày/lần cho đến khi kết thúc thí
nghiệm; tỉ lệ sống và tăng trưởng của tôm được xác định vào cuối thí nghiệm.
Kết quả đã sưu tập được 9 chủng vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus, 8 chủng
thuộc nhóm Nitrosomonas và 8 chủng thuộc nhóm Nitrobacter. Bộ sưu tập vi
khuẩn chuyển hóa đạm trong bùn đáy ao nuôi tôm thâm canh hiện đang được lưu

vii


trũ trong tủ đông (-80 ºC) tại Khoa Thủy sản, Đaị học Cần Thơ. Căn cứ vào các
chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa và trình tự gen đã định danh được 4 dòng B8, B9, B37
và B38 là Bacillus cereus; B41 là Bacillus amyloliquefaciens và B67 là Bacillus
subtilis; S8 và S12 là Nitrosomonas nitrosa và N10 và N12 là Nitrobacter

winogradskyi.
Hầu hết các chỉ tiêu môi trường nước và bùn đáy ao nuôi tôm thâm canh
tăng dần theo thời gian nuôi và thích hợp cho tôm nuôi. Các chỉ tiêu vi sinh trong
bùn đáy ao như mật độ vi khuẩn tổng số dao động từ 104 - 106 CFU/g. Bacillus
dao động 104 - 105 CFU/g có khuynh hướng ổn định trong suốt vụ nuôi.
Nitrosomonas dao động 7 - 2,6 × 103 MPN/g. Nitrobacter có mật độ thấp nhất và
dao động từ 5,5 - 1,9 × 103 MPN/g và tổng Vibrio có khuynh hướng tăng dần và
dao động từ 2,1 × 102 - 1,5 × 105 CFU/g.
Những kết quả trong điều kiện phòng thí nghiệm cho thấy mật độ bổ sung
thích hợp trong ương tôm sú ở giai đoạn ấu trùng là 105 CFU/mL đối với
Bacillus. Mật độ này là tối ưu về khả năng phân hủy vật chất hữu cơ và khả năng
lấn át các dòng vi khuẩn khác đặc biệt là vi khuẩn Vibrio và tỉ lệ sống của ấu
trùng đã được cải thiện đáng kể. Tất cả sáu dòng vi khuẩn thử nghiệm trên tôm
trong điều kiện phòng thí nghiệm đều cho kết quả tốt hơn về mọi mặt so với bể
đối chứng không bổ sung vi khuẩn. Hai dòng Bacillus cereus (B37 và B9) là nổi
trội nhất về khả năng tồn lưu trong môi trường, duy trì ở mật độ cao, cải thiện
chất lượng nước, phân hũy hữu cơ, cải thiện tỉ lệ sống và tăng tăng trưởng của
tôm nuôi. Tỉ lệ sống của tôm ở các nghiệm thức có bổ sung vi khuẩn Bacillus cao
hơn (93 - 97,2%) so với không bổ sung vi khuẩn (70,8%). Tốc độ tăng trưởng
tuyệt đối của tôm tăng cao ở các nghiệm thức bổ sung vi khuẩn (10,7; 8,5 và 7,8
g/con so với đối chứng (5,3 g/con). Trong nuôi tôm nếu bổ sung vi khuẩn
Bacillus sẽ kích thích nhóm vi khuẩn nitrate hóa phát triển tự nhiên do Bacillus
tạo ra sản phẩm NH4+/NH3. Tỉ lệ sống của tôm khi bổ sung Bacillus B37 cao nhất
(93,3%), còn đối chứng thấp nhất (70%). Tốc độ tăng trưởng tuyệt đối về trọng

viii


lượng cao nhất ở B37 (16,6 g/con), trong khi đó ở nghiệm thức đối chứng là thấp
nhất (5,2 g/con). So với chủng B38; B8; chủng B37 có hiệu quả tốt hơn dựa trên

các chỉ tiêu về chất lượng nước, tỉ lệ sống và tốc độ tăng trưởng.
Từ khóa: Bacillus, Nitrosomonas, Nitrobacter, chất lượng nước, tôm sú.

ix


MỤC LỤC
Trang
LỜI CAM KẾT KẾT QUẢ
LỜI CẢM TẠ ................................................................................................
ABSTRACT ..................................................................................................
TÓM TẮT......................................................................................................
MỤC LỤC .....................................................................................................
DANH SÁCH BẢNG....................................................................................
DANH SÁCH HÌNH .....................................................................................
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ........................................................................
Chương 1: GIỚI THIỆU...............................................................................

i
ii
iv
vii
x
xv

xvii
xx
1
1.1 Giới thiệu ...................................................................................................
1

1.2 Mục tiêu của nghiên cứu..........................................................................
4
1.2.1 Mục tiêu tổng quát .....................................................................................
4
1.2.2 Mục tiêu cụ thể .......................................................................................
4
1.3 Nội dung nghiên cứu..................................................................................
4
1.4 Ý nghĩa của luận án....................................................................................
6
1.5 Điểm mới của luận án ................................................................................
6
Chương 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ................................................................ 7
2.1 Khái quát về tôm sú, hiện trạng môi trường và dịch bệnh trong nuôi
tôm sú.........................................................................................................
7
2.1.1 Khái quát về tôm sú ...............................................................................7
2.1.1.1
Vị trí phân loại tôm sú ................................................................7
2.1.1.2
Sơ lược về đặc điểm sinh học của tôm sú ................................ 7
2.1.1.3
Các yếu tố ảnh hưởng đến điều kiện sống của tôm ................................
9
2.1.2 Hiện trạng ô nhiễm môi trường và dịch bệnh trong nuôi tôm
thâm canh................................................................................................
12
2.1.2.1
Hiện trạng ô nhiễm môi trường trong ao nuôi tôm thâm
canh ................................................................................................

12
2.1.2.2
Các bệnh thường xảy ra cho tôm khi ao nuôi thâm canh
bị nhiễm bẩn ..............................................................................................
13
2.1.2.3
Các chất độc sinh ra từ quá trình phân hủy chất thải
trong ao nuôi thâm canh ................................................................
14
2.1.3
Xử lý ô nhiễm môi trường bằng phương pháp sinh học............................
17
2.1.3.1
Sử dụng vi sinh vật hữu ích (Probiotic)................................ 17
2.1.3.2
Các ứng dụng của vi sinh vật hữu ích trong nuôi tôm...............................
18
2.2 Các cơ chế tác động của chế phẩm vi sinh (Probiotic) .............................. 19
2.2.1
Sản sinh ra các hợp chất ức chế................................................................
19

x


2.2.2
Cạnh tranh chất dinh dưỡng và năng lượng ................................
20
2.2.3
Cạnh tranh chổ cư trú ................................................................20

2.2.4
Tăng cường các phản ứng miễn dịch................................
21
2.2.5
Cải thiện chất lượng nước ................................................................
22
2.3 Vai trò của vi khuẩn phân hủy hữu cơ và chuyển hóa đạm ...................... 24
2.3.1
Quá trình ammon hóa ................................................................24
2.3.1.1
Đặc điểm và vai trò của vi khuẩn tham gia phân hũy
hữu cơ ................................................................................................
24
2.3.1.2
Đặc điểm sinh học của vi khuẩn Bacillus................................ 26
2.3.2
Các quá trình chuyển hoá nitơ vô cơ và vai trò các
nhóm vi khuẩn nitrate hóa ................................................................
31
2.3.2.1 Quá trình nitrate hóa ................................................................ 32
2.3.2.2 Đặc điểm sinh học và vai trò của vi khuẩn
Nitrosomonas.............................................................................................
36
2.3.3 Kỹ thuật PCR và ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản ..............................
40
2.3.3.1 Kỹ thuật PCR.............................................................................................
40
2.3.3.2 Kỹ thuật điện di ADN trên gel agarose ................................ 42
2.3.3.3 Kỹ thuật giải trình tự Nucleotid trong AND ................................
42

2.3.3.4 Ứng dụng kỹ thuật PCR để định danh vi khuẩn trong
NTTS ................................................................................................
44
Chương 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................47
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ............................................................. 47
3.2 Đối tượng nghiên cứu ................................................................................ 47
3.3 Chu kỳ thu mẫu .......................................................................................... 47
3.4 Đặc điểm ao nuôi, chế độ chăm sóc tôm và bón vi sinh trong ao thu
mẫu............................................................................................................. 47
3.5 Các bước chuẩn bị trước khi thu mẫu ........................................................ 49
3.6 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất ..................................................................... 49
3.6.1 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm ................................................................
49
3.6.2 Môi trường và hóa chất ................................................................
51
3.7 Phương pháp phân lập và định danh vi khuẩn trong ao............................. 51
3.7.1 Phương pháp thu mẫu nền đáy................................................................
51
3.7.2 Phương pháp phân lập và định danh vi khuẩn ................................ 52
3.7.2.1 Phương pháp phân lập và định danh vi khuẩn Bacillus sp........................
52
3.7.2.2 Phương pháp phân lập và định danh vi khuẩn
Nitrosomonas sp ........................................................................................
58
3.7.2.3 Phương pháp phân lập và định danh vi khuẩn
Nitrobacter sp............................................................................................
60
3.8 Phương pháp xác định biến động chất lượng nước và vi khuẩn trong
ao nuôi tôm sú ............................................................................................ 63
3.8.1 Phương pháp thu mẫu và xác định chất lượng nước

và bùn đáy ao ................................................................................................
63
3.8.1.1
63
Phương pháp thu mẫu. ................................................................
xi


3.2.1.2
63
Phương pháp phân tích chất lượng nước................................
3.8.1.3
64
Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn ................................
3.9 Các thí nghiệm đánh giá hiệu quả xử lý nước của vi khuẩn chọn lọc ....... 68
3.9.1 Thanh lọc vi khuẩn … ...............................................................................
68
3.9.1.1
Bacillus ................................................................................................
68
3.9.1.2
Nitrosomonas ............................................................................................
68
3.9.1.3
Nitrobacter................................................................................................
69
3.9.2 Điều kiện bố trí thí nghiệm................................................................ 69
3.9.3 Ảnh hưởng của vi khuẩn B37, S8 và N10 lên ấu trùng tôm sú
trong hệ thống ương tuần hoàn ................................................................
69

3.9.3.1
Vật liệu thí nghiệm ................................................................ 69
3.9.3.2
Bố trí thí nghiệm................................................................
70
3.9.3.3
Phương pháp nuôi tăng sinh vi khuẩn ................................ 71
3.9.3.4
Các chỉ tiêu theo dõi ................................................................72
3.9.3.5
Phương pháp thu và phân tích mẫu chất lượng nước ................................
72
3.9.3.6
Phương pháp thu và phân tích mẫu vi khuẩn ................................
72
3.9.3.7
Phương pháp phân tích mẫu tôm ...............................................................
72
3.9.4 Ảnh hưởng của vi khuẩn Bacillus B9, B41, B67 lên chất
lượng nước bể nuôi tôm sú ................................................................ 73
3.9.4.1
Vật liệu thí nghiệm ................................................................ 73
3.9.4.2
Bố trí thí nghiệm................................................................
73
3.9.4.3
Phương pháp nuôi tăng sinh vi khuẩn ................................ 74
3.9.4.4
Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn ................................ 74
3.9.4.5

Phương pháp thu và phân tích chất lượng nước ................................
74
3.9.4.6
Cách cho ăn và quản lý tôm nuôi thí nghiệm ................................
74
3.9.4.7
Phương pháp phân tích mẫu tôm ...............................................................
75
3.9.5 Ảnh hưởng của vi khuẩn Bacillus B8, B37, B38 lên chất
lượng nước bể nuôi tôm sú ................................................................75
3.9.5.1
Vật liệu thí nghiệm ................................................................ 75
3.9.5.2
Phương pháp bố trí thí nghiệm ................................................................
76
3.9.5.3
Phương pháp xác định mật độ các nhóm vi khuẩn................................
76
3.9.6
Phương pháp xử lý số liệu ................................................................
76
Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.............................................................77
4.1 Phân lập và định danh vi khuẩn chuyển hóa đạm từ bùn đáy ao nuôi
tôm ............................................................................................................. 77
4.1.1 Phân lập và định danh vi khuẩn Bacillus ..................................................
77
4.1.1.1
Phân lập vi khuẩn Bacillus ................................................................
77
4.1.1.2

Định danh vi khuẩn Bacillus ................................................................
77
4.1.2 Phân lập và định danh vi khuẩn Nitrosomonas ................................ 89
4.1.2.1
Phân lập vi khuẩn Nitrosomonas ...............................................................
89
4.1.2.2
Định danh vi khuẩn Nitrosomonas ................................................................
90
4.1.3 Phân lập và định danh vi khuẩn Nitrobacter ................................ 95
4.1.3.1
Phân lập vi khuẩn Nitrobacter ..........................................................
95
xii


4.1.3.2
Định danh vi khuẩn Nitrobacter ......................................................
96
4.2 Biến động các yếu tố môi trường và vi khuẩn trong ao nuôi................................
99
4.2.1 Biến động các yếu tố môi trường trong ao nuôi tôm thâm
canh................................................................................................ 99
4.2.1.1
Nhiệt độ ................................................................................................
99
4.2.1.2
Độ mặn ................................................................................................
100
4.2.1.3

pH ................................................................................................
101
4.2.1.4
Tổng vật chất lơ lững TSS................................................................
102
4.2.1.5
Oxy hòa tan................................................................................................
103
+
4.2.1.6
Tổng đạm amon TAN-NH3/NH4 ................................................................
104
4.2.1.7
Nitrite
106
4.2.1.8
Nitrate ................................................................................................
107
4.2.1.9
Khí độc H2S ................................................................................................
108
4.2.1.10 Tổng đạm TN đáy ao ................................................................
110
4.2.1.11 Sự tích lũy hữu cơ dưới đáy ao................................................................
111
4.2.2 Biến động mật độ vi khuẩn trong ao nuôi tôm thâm canh................................
112
4.2.2.1
Tổng vi khuẩn và Vibrio trong bùn đáy ao................................
113

4.2.2.2
Mật độ vi khuẩn Bacillus trong bùn đáy ao................................
113
4.2.2.3
Mật đọ vi khuản Nitrosomonas và Nitrobacter trong
bùn đáy ao................................................................................................
113
4.3 Đánh giá khả năng chuyển hóa đạm của nhóm vi khuẩn phân lập và
vai trò của chúng trong việc cải thiện chất lượng nước ở quy mô
phòng thí nghiệm ................................................................................................
115
4.3.1 Ảnh hưởng của vi khuẩn Bacillus chọn lọc B37,
Nitrosomonas S8 và Nitrobacter N10 lên chất lượng nước
trong hệ thống ương tôm sú tuần hoàn ................................................................
115
4.3.1.1
Biến động các chỉ tiêu môi trường ................................................................
116
4.3.1.2
Biến động mật số vi khuẩn trong nước và trong giá thể ................................
123
4.3.1.3
Tỷ lệ sống của ấu trùng ................................................................
126
4.3.2
Ảnh hưởng của vi khuẩn Bacillus chọn lọc B9, B41,
B67 lên chất lượng nước bể nuôi tôm sú thương phẩm
127
4.3.2.1
Biến động các yếu tố môi trường ................................................................

127
4.3.2.2
Biến động mật độ vi sinh................................................................
134
4.3.2.3
Chất lượng tôm nuôi ................................................................137
4.3.3 Ảnh hưởng của vi khuẩn Bacillus chọn lọc B8, B37 và B38
lên chất lượng nước trong bể nuôi tôm thương phẩm ...............................
139
139
4.3.3.1 Điều kiện thí nghiệm................................................................
139
4.3.3.2 Biến động các yếu tố môi trường.........................................................
4.3.3.3 Biến động mật độ vi khuẩn trong bùn ................................ 146
4.3.3.4 Chất lượng tôm nuôi ................................................................149
4.4 Thảo luận chung......................................................................................... 151
4.4.1 Thành phần loài vi khuẩn định danhtrong ao nuôi tôm .............................
151
4.4.2 Ảnh hưởng của các dòng vi khuẩn chọn lọc lên chất lượng
153
xiii


nước trong bể nuôi tôm trong điều kiện phòng thí nghiệm .......................
4.4.3 Nhận xét ................................................................................................
155
Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT................................................................156
5.1 Kết luận .....................................................................................................................
156
5.2 ĐỀ XUẤT .................................................................................................. 157

TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................
I-XXI
PHỤ LỤC
AGG

xiv


DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1
Bảng 2.2
Bảng 2.3

Bảng 3.1
Bảng 4.1
Bảng 4.2
Bảng 4.3
Bảng 4.4

Bảng 4.5
Bảng 4.6

Bảng 4.7
Bảng 4.8
Bảng 4.9
Bảng 4.10

Bảng 4.11

Bảng 4.12
Bảng 4.13

Trang
Tuổi và kích cỡ các giai đoạn ấu trùng tôm sú ................................ 9
Một số dòng Bacillus trong chế phẩm sinh học và công dụng
của chúng................................................................................................
25
Kết quả định danh bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự 16S
rDNA và kết quả định lượng các vi khuẩn có trong các
Probiotics sử dụng trong thủy sản. ................................................................
46
Các chỉ tiêu môi trường và phương pháp phân tích ................................
64
Danh mục các chủng Bacillus chọn lọc.............................................................
79
Kết quả xác định đặc tính sinh lý, sinh hóa vi khuẩn Bacillus..........................
79
Kết quả so sánh trình tự của các dòng vi khuẩn Bacillus đã
phân lập................................................................................................
82
So sánh trình tự của Bacillus B9 và B38 trên ngân hàng gen
(DQ339674.1 - B. cereus) sử dụng cặp mồi chung 16F8 và
16R1391 ................................................................................................
83
So sánh trình tự của Bacillus B8 và B37 trên ngân hàng gen
(DQ339674.1 - B. cereus) sử dụng cặp mồi 16F và 16R ................................
85
So sánh trình tự của Bacillus B41 trên ngân hàng gen
(AYO55219.1 - B.amyloliquefaciens) sử dụng cặp bắt mồi

16F và 16R ................................................................................................
86
So sánh trình tự của Bacillus B67 trên ngân hàng gen
(JN585706.1-B.subtilis) sử dụng cặp bắt mồi 16F và 16R ...............................
87
Danh mục các chủng vi khuẩn Nitrosomonas đã phân lập
được và phép thử sinh hóa................................................................ 91
Kết quả so sánh trình tự của các dòng vi khuẩn
Nitrosomonas phân lập ................................................................ 93
So sánh trình tự của Nitrosomonas S6, S10 trên ngân hàng
gen (AF272404.1-N. nitrosa) sử dụng cặp mồi đặt hiệu
94
AmoaA 1F và AmoA ........................................................................................
So sánh trình tự của Nitrosomonas S12 trên ngân hàng gen
(AF272404.1-N. nitrosa) sử dụng cặp mồi đặc hiệu AmoA
95
1F và AmoA ................................................................................................
Danh mục các chủng vi khuẩn Nitrobacter đã phân lập ................................
96
So sánh trình tự của Nitrobacter N10 và N12 trên ngân hàng
gen sử dụng cặp mồi đặc hiệu PNTG 2R và PNTG 1F................................
99
xv


Bảng 4.14 Tỉ lệ sống của tôm giai đoạn ấu trùng đến giai đoạn biến thái
postlarvae................................................................................................
127
Bảng 4.15 Tốc độ tăng trưởng của tôm sú ................................................................
138

Bảng 4.16 Tỉ lệ sống của tôm sú vào cuối thí nghiệm ........................................................
139
Bảng 4.17 Tốc độ tăng trưởng về khối lượng của tôm thí nghiệm ................................
149
Bảng 4.18 Tỉ lệ sống của tôm vào cuối thí nghiệm.............................................................
150

xvi


DANH SÁCH HÌNH

Hình 1.1

Trang
Sơ đồ nội dung nghiên cứu của đề tài................................................................
5

Hình 2.1

Vòng đời tôm biển ................................................................................................
8

Hình 2.2

Hình dạng tế bào vi khuẩn Bacillus................................................................
26

Hình 2.3

Vòng tuần hoàn nitơ ................................................................................................
32

Hình 2.4

Phương pháp Enzyme giải trình tự ADN ................................................................
45

Hình 3.1

Ao thu mẫu và sản phẩm vi sinh................................................................
48

Hình 3.2

Kính hiển vi và các dụng cụ phan tích chất lượng nước ................................
50

Hình 3.3

Một số thiết bị trích ADN................................................................ 50

Hình 3.4

Một số thiết bị PCR, điện di và giải trình tự................................

Hình 3.5

Phương pháp thu mẫu bùn đáy ao ................................................................
52

Hình 3.6

Sơ đồ hệ thống lọc tuần hoàn ................................................................
70

Hình 3.7

Nuôi tăng sinh vi khuẩn và hệ thống thí nghiệm.................................
74

Hình 4.1

Hình dạng vi khuẩn Bacillus. ................................................................
78

Hình 4.2

Bảng ứng thủy phân tinh bột, Gelatin và Casein.................................
80

Hình 4.3a

Kết quả điện di sản phẩm PCR ứng dụng qui trình PCR định
danh vi khuẩn Bacillus B9................................................................81

Hình 4.3b

Kết quả điện di sản phẩm PCR ứng dụng qui trình PCR định
81

danh vi khuẩn Bacillus B38................................................................

Hình 4.4

Kết quả điện di sản phẩm PCR ứng dụng qui trình PCR định
danh Bacillus ................................................................................................
81

Hình 4.5

Kết quả kiểm tra đặc điểm sinh hóa Nitrosomonas sp ................................
92

Hình 4.6

Kết quả điện di PCR ứng dụng qui trình PCR................................ 92

Hình 4.7

Kết quả nhuộm Gram và kiểm tra đặc điểm sinh hóa
Nitrobacter ................................................................................................
97

Hình 4.8

Kết quả điện di sản phẩm PCR ứng dụng qui trình PCR ................................
98

Hình 4.9

Sự biến động nhiệt độ trong thời gian thu mẫu ................................
100

Hình 4.10

Sự biến động độ mặn trong thời gian thu mẫu ................................101

Hình 4.11

Sự biến động pH trong thời gian thu mẫu................................................................
102

xvii

50


Hình 4.12

Sự biến động tổng vật chất lơ lững (TSS) trong thời gian thu
mẫu ................................................................................................ 103

Hình 4.13

Sự biến động DO trong thời gian thu mẫu ...............................................................
104

Hình 4.14

Sự biến động TAN trong thời gian thu mẫu................................ 105

Hình 4.15

Sự biến động NO2- trong thời gian thu mẫu ................................ 106

Hình 4.16

Sự biến động NO3- trong thời gian thu mẫu ................................ 108

Hình 4.17

Sự biến động H2S trong thời gian thu mẫu...............................................................
109

Hình 4.18

Sự biến động TN trong bùn đáy ao................................................................
110

Hình 4.19

Sự tích lũy hữu cơ trong bùn đáy ao................................................................
111

Hình 4.20

Sự biến động tổng vi khuẩn và Vibrio trong bùn đáy ao................................
112

Hình 4.21

Mật độ vi khuẩn Bacillus, Nitrosomonas, Nitrobacter trong
bùn đáy ao ................................................................................................
115

Hình 4.22

Biến động hàm lượng COD ................................................................
117

Hình 4.23

Biến động hàm lượng TAN ................................................................
118

Hình 4.24

Biến động hàm lượng NO2- ................................................................
119

Hình 4.25

Biến động hàm lượng NO3- ................................................................
120

Hình 4.26

Biến động hàm lượng TN ................................................................121

Hình 4.27

Biến động hàm lượng TSS ................................................................
122

Hình 4.28

Biến động mật độ vi khuẩn Bacillus................................................................
124

Hình 4.29

Biến động mật độ vi khuẩn Vibrio................................................................
124

Hình 4.30

Biến động mật độ tổng vi khuẩn trong nước ................................ 125

Hình 4.31

Biến động TSS trong quá trình thí nghiệm...............................................................
128

Hình 4.32

Biến động Oxy hòa tan trong thời gian thí nghiệm ................................
129

Hình 4.33

Biến động COD trong thời gian thí nghiệm ................................ 130

Hình 4.34

Biến động H2S trong thời gian thí nghiệm ...............................................................
131

Hình 4.35

Biến động TAN trong thời gian thu mẫu................................................................
132

Hình 4.36

Biến động NO2- trong thời gian thí nghiệm..............................................................
133

Hình 4.37

Biến động NO3- trong thời gian thí nghiệm..............................................................
133

Hình 4.38

Biến động TN trong thời gian thí nghiệm ................................................................
134

Hình 4.39

Biến động mật độ Bacillus trong thời gian thí nghiệm................................

135

Hình 4.40

Biến động Vibrio trong thời gian thí nghiệm ................................ 136
xviii


Hình 4.41

Biến động mật độ tổng vi khuẩn trong thời gian thí nghiệm................................
137

Hình 4.42

Biến động oxy hòa tan trong thí nghiệm ................................................................
140

Hình 4.43

Biến động COD trong thí nghiệm................................................................
141

Hình 4.44

Biến động H2S trong thí nghiệm................................................................
142

Hình 4.45

Biến động TAN trong thí nghiệm................................................................
143

Hình 4.46

Biến động NO2- trong thí nghiệm ................................................................
144

Hình 4.47

Biến động NO3- trong thí nghiệm ................................................................
144

Hình 4.48

Biến động TN ở bùn trong thí nghiệm ................................................................
145

Hình 4.49

Tỉ lệ (%) vật chất hữu cơ trong bùn đáy bể thí nghiệm................................
146

Hình 4.50

Biến động mật độ Bacillus trong bùn ................................................................
147

Hình 4.51

Biến động mật độ Vibrio trong bùn ................................................................
147

Hình 4.52

Biến động mật độ Nitrosomonas trong bùn..............................................................
148

Hình 4.53

Biến động mật độ Nitrobacter trong bùn ................................................................
149

xix


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

AOB:

Ammonia-Oxidizing-Bacteria (vi khuẩn oxi hóa ammonium)

CFU:

Colony Forming Unit (đơn vị hình thành khuẩn lạc)

ĐBSCL:

Đồng bằng sông Cửu Long

ĐC:

Đối chứng

DO:

Dissolved oxygen (oxy hòa tan)

FAO:

Food and Agriculture Organization (tổ chức Lương thực và
Nông nghiệp Liên Hợp Quốc)

MPN:

Most Probable Number (số khả hữu)

NOB:

Nitrite- oxidizing- bacteria (vi khuẩn oxy hóa nitrite)

NA:

Nutrient Agar

NTTS:

Nuôi trồng Thủy sản

NT:

Nghiệm thức

LB:

Luria - Bertani

OD:

Optical Density (mật độ quang)

PCR:

Polymerase Chain Reaction (phản ứng tổng hợp dây chuyền
nhờ polymerase)

DGGE:

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (điện di biến tính)

OSS:

Organic Suspended Solids (tổng vật chất hữu cơ lơ lửng)

TAN:

Total ammonia nitrogen (tổng đạm nitơ)

TCBS:

Thiosulphate Citrate Bile Sucrose Agar

TN:

Total nitrogen (tổng đạm)

TOM:

Total organic mater (tổng vật chất hữu cơ)

TSA:

Tripticase Soya Agar

TSB:

Tripticase Soya Broth

TSS:

Total suspended solids (tổng vật chất lơ lửng)

xx


Chương 1:
GIỚI THIỆU
1.1 Giới thiệu
Theo FAO (2006) thì sản lượng tôm nuôi trên thế giới tăng bình quân hàng
năm 10% trong suốt 3 thập niên qua. Trong đó tôm biển là đối tượng nuôi tăng

nhanh nhất trong hoạt động nuôi thủy sản trên thế giới. Năm 2008 sản lượng tôm
chiếm khoảng 15,4% tổng giá trị sản lượng thủy sản (FAO, 2010a). Sự phát triển
nhanh của nghề nuôi tôm biển đã mang lại việc làm cho người dân và tạo nguồn
thu nhập ngoại tệ của nhiều quốc gia thuộc Châu Á, Châu Mỹ và Châu Phi
(Trung quốc, Thái Lan, Việt Nam, Indonesia, Ecuador, Bangladesh, Ấn Độ,
Mexico và Brazil). Năm 2009, mặc dù giá tôm trên thị trường có nhiều biến động
nhưng sản lượng tôm vẫn duy trì ở mức ổn định. Những thị trường tiêu thụ tôm
lớn nhất bao gồm Hoa Kỳ, Nhật Bản, Tây Ban Nha và các nước cộng đồng Châu
Âu (FAO, 2010b). Tôm sú là loài tôm biển được ưa chuộng và được nuôi ở hơn
22 quốc gia trên thế giới (FAO, 2002). Năm 2008, tổng sản lượng tôm sú nuôi
trên thế giới đạt 721.867 tấn, với giá trị gần 3,35 tỷ đô la. Riêng ở Việt Nam,
nghề nuôi tôm sú phát triển mạnh mẽ đặc biệt là các tỉnh ven biển thuộc vùng
Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL). Theo Tổng cục Thống kê Việt Nam
(2010), diện tích nuôi tôm biển của Việt Nam là 623.300 ha, chiếm hơn 88% tổng
diện tích mặt nước mặn lợ của cả nước, với sản lượng tôm nuôi là 413,1 ngàn tấn
và tổng giá trị xấp xỉ 1,5 tỉ USD vào năm 2009.
Tuy nhiên, hệ lụy của tốc độ phát triển nuôi tôm công nghiệp đã dẫn đến
tình trạng ô nhiễm môi trường và dịch bệnh, do vậy nghề nuôi tôm biển ở các
nước trên thế giới cũng như Việt Nam đã gặp những trở ngại lớn. Sản lượng tôm
nuôi của nhiều quốc gia suy giảm, ảnh hưởng lớn đến đời sống kinh tế của nhiều
dân cư. Trong đa số trường hợp, dịch bệnh xảy ra là kết quả của sự suy thoái môi
trường và tôm bị sốc, bao gồm cả bệnh do vi khuẩn và bệnh do virus. Để giải

1


quyết vấn đề này chất hoá học và kháng sinh đã được thường xuyên sử dụng
trong hoạt động nuôi tôm (Gomez-Gil et al., 2000; Gräslund và Bengtsson, 2001).
Việc sử dụng thuốc kháng sinh không đúng cách đã dẫn đến sự kháng thuốc của
những dòng vi khuẩn này (Weston, 1996). Mặt khác sản phẩm thủy sản xuất khẩu

không đạt tiêu chuẩn do dư lượng thuốc kháng sinh, thuốc bảo vệ thực vật và vi
sinh vật gây bệnh (Đặng Đình Kim và ctv., 2006).
Chính vì vậy giải pháp trong phòng trị bệnh đã và đang được đặt ra bao
gồm việc quản lý bệnh, địch hại tổng hợp (Li, 2008), đặc biệt là việc sử dụng các
vi sinh vật hữu ích (Probiotics) nhằm cải thiện môi trường nuôi và tăng năng suất
vật nuôi đã được thực hiện và đem lại nhiều kết quả đáng kể. Sử dụng vi sinh vật
hữu ích là một giải pháp tích cực, có nhiều triển vọng để quản lý vi sinh trong ao
nuôi thâm canh, hạn chế tối đa thuốc kháng sinh để bảo đảm an toàn vệ sinh thực
phẩm, hạn chế đáng kể lượng chất hữu cơ thải ra môi trường góp phần phát triển
nghề nuôi thủy sản một cách bền vững. Theo Bao và Shen (2005) thì nuôi thủy
sản bền vững đòi hỏi phải thiết lập các mô hình nuôi sạch bằng việc sử dụng vi
sinh vật hữu ích không có độc tố, không có phản ứng phụ, không có dư lượng và
không có sự kháng thuốc, đồng thời có hiệu quả trong việc cải thiện môi trường
và gia tăng sức đề kháng cho vật nuôi trong việc giảm bệnh và duy trì cân bằng
sinh thái.
Trong tình hình này nhiều quốc gia trên thế giới đã áp dụng các quy trình
sử dụng chế phẩm vi sinh như Hoa Kỳ, Nhật Bản, các nước trong Cộng đồng
Châu Âu, Indonesia, Thái Lan với nhiều kết quả đạt được đáng khích lệ.
Probiotics ngày nay đã trở thành hàng hóa ở một số nước và đang hình thành
ngành công nghiệp sản xuất vi sinh giống như các ngành công nghiệp khác phục
vụ cho nuôi trồng thủy sản (Zhou et al., 2009). Nhiều kết quả ứng dụng vi sinh
vật hữu ích rất có ý nghĩa về nhiều mặt như cải thiện chất lượng nước, nâng cao tỉ
lệ sống, tăng tăng trưởng và giảm hệ số chuyển hóa thức ăn FCR (Austin et al.,
1995; Fuller, 1998; Rengpipat et al., 1998; Dalmin et al., 2001; Irianto và Austin,

2


2002; Wang, 2005). Một số kết quả nghiên cứu khác cũng đã chứng minh được
hiệu quả sử dụng Probiotic mang lại các lợi ích về kinh tế, kỹ thuật, bảo vệ môi

trường và đặc biệt trong lĩnh vực an toàn vệ sinh thực phẩm (Montes và Pugh,
1993).
Ở Việt Nam, nhất là vùng ĐBSCL, chế phẩm vi sinh cũng đã và đang
được sử dụng rộng khắp trong nuôi thủy sản, nhất là tôm sú từ nhiều năm qua.
Tuy nhiên hiệu quả sử dụng chế phẩm vẫn chưa được đánh giá đầy đủ nhất là
hiệu quả kinh tế khi sử dụng đại trà ngoài thực địa (Vũ Ngọc Út, 2011). Ngoài ra,
hầu hết các chế phẩm vi sinh có mặt trên thị trường hiện nay ở Việt Nam nói
chung và ĐBSCL nói riêng, có nguồn gốc nhập nội với chất lượng không ổn định
và nhất là giá bán rất cao. Sự khác biệt về điều kiện sinh thái có thể là một trong
những nguyên nhân chủ yếu dẫn đến hiệu quả xử lý môi trường và tác động tích
cực lên đối tượng nuôi của các chủng vi khuẩn hữu ích trong các chế phẩm vi
sinh nhập nội bị hạn chế. Zhou et al. (2009) cũng nhận định rằng ở Trung Quốc
việc sử dụng chế phẩm vi sinh trong các ao nuôi tôm, cua cũng gặp nhiều khó
khăn và hiệu quả chưa cao do người sử dụng không nắm được nhu cầu về điều
kiện sinh thái của các nhóm vi khuẩn có lợi khi đưa vào trong hệ thống nuôi. Các
tác giả này cũng đề xuất tốt nhất là cần phải phân lập các dòng vi khuẩn tại chỗ từ
các vùng nuôi nước ngọt hoặc mặn để thích ứng với điều kiện sinh thái địa
phương.
Ngoài sự khác biệt về điều kiện sinh thái, các loại chế phẩm vi sinh nhập
nội thường có giá bán cao nên càng ảnh hưởng đến hiệu quả nuôi. Việc phát triển
các chế phẩm vi sinh “bản địa” từ các chủng vi khuẩn hữu ích được phân lập tại
chỗ sẽ giúp giải quyết được những hạn chế nêu trên. Vi khuẩn hữu ích có nguồn
gốc từ vùng ĐBSCL sẽ thích nghi tốt với điều kiện sinh thái trong vùng và hiệu
quả xử lý của chúng sẽ cao và ổn định khi được sử dụng trong môi trường có
cùng điều kiện sinh thái. Ngoài ra, giá thành của chế phẩm vi sinh được sản xuất
tại chỗ thấp sẽ góp phần đáng kể trong việc tăng hiệu quả sản xuất cho người

3