PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN NGUỒN TÀI NGUYÊN MỘT SỐ LOÀI CÂY DƯỢC LIỆU Ở VIỆT NAM BẰNG CHỈ THỊ ADN
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (6.13 MB, 95 trang )
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
Nguyễn Cẩm Dương
PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN NGUỒN
TÀI NGUYÊN MỘT SỐ LOÀI CÂY DƯỢC LIỆU
Ở VIỆT NAM BẰNG CHỈ THỊ ADN
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Hà Nội - 2010
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
Nguyễn Cẩm Dương
PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN NGUỒN
TÀI NGUYÊN MỘT SỐ LOÀI CÂY DƯỢC LIỆU
Ở VIỆT NAM BẰNG CHỈ THỊ ADN
Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 60 42 70
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Đinh Đoàn Long
Hà Nội - 2010
LỜI CẢM ƠN
Để có thể hồn thành luận văn này, trước tiên tôi xin gửi lời cảm ơn sâu
sắc tới TS. Đinh Đồn Long, Chủ nhiệm bộ mơn Di truyền học, Khoa Sinh học đã
trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tôi trong công tác nghiên cứu khoa học. Đồng thời,
tôi cũng muốn trân trọng cảm ơn các cán bộ thuộc Khoa tài nguyên dược liệu,
Viện Dược liệu (Bộ Y tế), đã cung cấp và giúp tôi phân loại mẫu thực vật sử dụng
trong nghiên cứu này.
Qua đây tôi muốn được bày tỏ lòng biết ơn chân thành nhất tới các thầy, cô
giáo của bộ môn Di truyền học, Khoa Sinh học trong đó đặc biệt là Th.S Trần Thị
Thùy Anh đã tạo điều kiện thuận lợi và động viên tôi trong suốt q trình học tập
tại bộ mơn. Tơi xin được gửi lời cảm ơn tới Ban giám độc PTNTĐ Công nghệ
Enzyme và Protein thuộc Khoa Sinh học đã luôn tạo điều kiện thuận lợi cho tôi về
trang thiết bị và cơ sở vật chất trong quá trình học tập và nghiên cứu. Đề tài
nghiên cứu của tôi được hỗ trợ một phần tài chính từ đề tài Klept.09.05 thuộc
PTNTĐ Công nghệ Enzym và Protein.
Cuối cùng tôi xin bày tỏ lịng biết ơn vơ cùng sâu sắc tới bố mẹ, các bác và
đặc biệt là anh chị tôi, những người đã luôn hỗ trợ tôi về mọi mặt trong suốt quá
trình học tập tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên (ĐHQG Hà Nội). Nhân dịp
này, tôi trân trọng gửi lời cảm ơn tới các anh chị khóa trên, bạn bè thân thiết luôn
cổ vũ, động viên và sát cánh bên tơi trong suốt q trình học tập vừa qua.
Hà Nội, tháng 12 năm 2010
Học viên
Nguyễn Cẩm Dương
DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết tắt
Nghĩa tiếng Việt
Nghĩa tiếng Anh
ADN
Axit deoxyribonucleic
Deoxyribonucleic acid
ADNts
ADN tổng số
Total DNA
ARN
Axit ribonucleic
Ribonucleic acid
ASSOCHAM
Hiệp hội thương mại và công nghiệp
Ấn Độ
The Associated Chambers of
Commerce and Industry of India
cs
cộng sự
Co-workers
CTAB
Cetyltrimethylammonium bromide
Cetyltrimethylammonium bromide
bp
Cặp bazơ nitơ
base pair
ddH2O
Nước cất khử trùng hai lần
Double distilled water
DDT
Thuốc trừ sâu dichloro-diphenyltrichloroethane
Dichloro-Diphenyl-Trichloroethane
dNTP
Deoxyribonucleotit triphosphat
Deoxyribonucleotide triphosphate
EDTA
Ethylene diamine tetraacetat
Ethylene diamine tetraacetate
HPLC
Sắc ký lỏng cao áp
High pressure liquid chromatography
IUCN
Liên minh bảo tồn thiên nhiên thế
giới
International Union for Conservation
of Nature
kb
Kilo bazơ
Kilo base
NTSYS
Phần mềm hệ thống phân loại số
Numerical Taxonomy System
M
Thang ADN chuẩn
Marker
OD
Mật độ quang phổ hấp thụ
Optical Density
OPA,OPC
Các mồi oligonucleotit
PCR
Phản ứng chuỗi trùng hợp ADN
Polymerase Chain Reaction
RAPD
Đa hình phân đoạn ADN nhân bản
ngẫu nhiên
Random Amplified Polymorphic
DNA
RAPD-PCR
Tương tự như RAPD
Rb1
Nhóm ginsenoside Rb1 (có mặt của
protopanaxadiol)
The ginsenoside Rb1 group
RFLP
Đa hình độ dài các đoạn giới hạn
Restriction fragment length
polymorphism
i
Từ viết tắt
Nghĩa tiếng Việt
Nghĩa tiếng Anh
Rg1
Ginsenoside nhóm Rg1 (có chứa
protopanaxatriol)
The ginsenoside Rg1 group
STR/SSR
Trình tự vi vệ tinh
Microsatellite/simple tandem repeats
TBE
Đệm gồm Tris, Borate và EDTA
Tris/Borate/EDTA buffer
TE
Đệm gồm có Tris và EDTA
UPGMA
Thuật tốn phân cặp dựa trên giá trị
trung bình
Unweighted pair group with arthmetic
means
V
Vol
Volte
v/v
Tỉ lệ pha theo thể tích/thể tích
Volume/volume
WHO
Tổ chức Y tế thế giới
World Health Organization
ii
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .................................................................................................................. 1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU...................................................................... 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY DƯỢC LIỆU .................................................................... 3
1.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................... 7
1.3. LÝ DO THỰC HIỆN ĐỀ TÀI................................................................................ 12
1.3.1. Thực trạng nghiên cứu về cây dược liệu ở Việt Nam hiện nay ..................... 12
1.3.1.1. Nghiên cứu về chi Acanthopanax .......................................................... 12
1.3.1.2. Nghiên cứu về chi Illicium ................................................................... 14
1.3.1.3. Nghiên cứu về chi Morinda .................................................................. 15
1.3.1.4. Nghiên cứu về chi Panax L. .................................................................. 16
1.3.2. Chỉ thị ADN – Chỉ thị RAPD-PCR .............................................................. 19
1.3.3. Mục tiêu của đề tài ...................................................................................... 22
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................. 24
2.1. VẬT LIỆU THỰC VẬT ........................................................................................ 24
2.1.1. Chi Acanthopanax ....................................................................................... 24
2.1.2. Chi Illicium.................................................................................................. 26
2.1.3. Chi Morinda ................................................................................................ 27
2.1.4. Chi Panax L. ............................................................................................... 28
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................................... 31
2.2.1. Tách chiết ADN tổng số bằng phương pháp Mini-CTAB cải tiến ................ 31
2.2.2. Phân tích di truyền bằng kỹ thuật RAPD-PCR ............................................. 33
2.2.3. Điện di ADN trên gel agarose ...................................................................... 34
2.2.4. Dựng cây quan hệ di truyền bằng phần mềm NTSYSpc 2.02h ..................... 35
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................... 38
3.1. KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT ADN TỔNG SỐ ............................................................. 38
iii
3.1.1. Kết quả tách chiết ADNts từ các mẫu thực vật thuộc chi Acanthopanax ...... 38
3.1.2. Kết quả tách chiết ADNts từ các mẫu thực vật thuộc chi Illicium................. 38
3.1.3. Kết quả tách chiết ADNts từ cây Ba kích (Morinda officinalis How) ........... 39
3.1.4. Kết quả tách chiết ADNts các mẫu thực vật thuộc chi Panax L. .................. 39
3.2. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÁC LOÀI CÂY
THUỐC TRONG NGHIÊN CỨU ................................................................................ 41
3.2.1. Sự đa dạng di truyền giữa các loài cây thuốc thuộc chi Acanthopanax .... 42
3.2.1.1. Phân tích đa hình lồi ngũ gia bì gai (A. trifoliatus) ............................. 43
3.2.1.2. Phân tích đa hình lồi ngũ gia bì hương (A. gracilistylus) .................... 46
3.2.2. Sự đa dạng di truyền giữa loài cây thuốc thuộc chi Illicium. .................... 48
3.2.2.1. Phân tích đa dạng di truyền lồi hồi hương ....................................... 48
3.2.2.2. Phân tích đa dạng di truyền của các loài hồi núi .................................. 51
3.2.3. Sự đa dạng di truyền của lồi cây thuốc Ba kích ....................................... 53
3.2.4. Sự đa dạng di truyền của loài cây thuốc thuộc chi Panax L ...................... 56
3.2.5. Bước đầu xác định tập hợp một số chỉ thị RAPD-PCR giúp phân biệt
nhanh nguồn nguyên liệu từ các loài thực vật trong nghiên cứu ......................... 61
3.2.5.1. Chỉ thị ADN giúp phân biệt nguồn dược liệu từ các lồi dược liệu
Ngũ gia bì gai và Ngũ gia bì hương ................................................................ 61
3.2.5.2. Chỉ thị ADN (RAPD-PCR) giúp phân biệt nguồn dược liệu từ loài
hồi hương với các loài hồi núi ......................................................................... 63
3.2.5.3. Chỉ thị ADN (RAPD-PCR) giúp phân biệt các dạng hình thái khác
nhau của lồi Ba kích ...................................................................................... 64
3.2.5.4. Chỉ thị ADN (RAPD-PCR) giúp phân biệt các loài Sâm Việt Nam,
Sam Vũ Diệp và Tam thất hoang ..................................................................... 66
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................. 68
KẾT LUẬN........................................................................................................... 68
KIẾN NGHỊ .......................................................................................................... 69
TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 70
iv
DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1. Thế hệ chỉ thị ADN đầu tiên
Bảng 3. Thế hệ chỉ thị ADN mới
7
7
10
Bảng 4. Danh sách mẫu cây dược liệu được thu thập và phân tích trong nghiên cứu
25
Bảng 2. Thế hệ chỉ thị ADN thứ hai
Bảng 5. Thành phần (bảng bên trái) và quy trình nhiệt (bảng bên phải) của phản ứng
RAPD-PCR
Bảng 6. Số băng RAPD đa hình thu được từ các mẫu quần thể lồi Acanthopanax
trifoliatus và A. gracilistylus phân tích với 16 mồi ngẫu nhiên.
Bảng 7. Số băng ADN đa hình thu được từ các mẫu quần thể loài Ngũ gia bì gai (A.
trifoliatus) (ký hiệu G) thu tại Lào Cai, Cao Bằng và Lạng Sơn được phân tích theo từng
mồi RAPD.
Bảng 8. Số băng RAPD đa hình thu được từ các mẫu quần thể loài Illicium verum và các
loài hồi núi phân tích với 15 mồi ngẫu nhiên.
Bảng 9. Số băng RAPD đa hình thu được từ các mẫu quần thể lồi Ba kích (Morinda
officinalis) với các dạng hình thái khác nhau: dạng thân có lơng (L); dạng thân khơng có
lơng (K); dạng quả tụ (T) và dạng quả rời (R) với 12 mồi ngẫu nhiên.
Bảng 10. Số băng RAPD đa hình thu được từ các mẫu thuộc ba lồi Sâm Việt Nam
(SVN), Sâm Vũ Diệp (SVD) và Tam thất hoang (TTH) phân tích với 13 mồi ngẫu nhiên.
Bảng 11. Tập hợp các chỉ thị ADN (chỉ thị RAPD-PCR) đặc trưng có thể giúp phân biệt
các lồi dược liệu trong nghiên cứu.
v
34
42
45
48
53
57
67
DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1. Ảnh các lồi thực vật thuộc chi Acanthopanax trong nghiên cứu: a-b) Bụi cây, lá và
hoa cây Ngũ gia bì gai; c-d) Bụi cây, lá và hoa cây Ngũ gia bì hương.
26
Hình 2. a-b) Hình thái lá và quả cây Hồi hương (Illicium verum Hook.f); c-d) hình thái lái
và quả của cây hồi núi (I. anasitum).
27
Hình 3. Hình thái các loại kiểu hình của cây Ba kích sử dụng trong nghiên cứu: a) quả tụ;
b) quả rời; c) thân có lơng; d) thân khơng có lơng.
28
Hình 4. Các lồi thực vật thuộc chi Panax L. trong nghiên cứu: a) Sâm Việt Nam (P.
vietnamensis); b) Sâm Vũ Diệp (P. bipinnatididus); c) dạng trung gian giữa Sâm Vũ DiệpTam thất hoang; d) Tam thất hoang (P. stipulenatus).
29
Hình 5. Bản đồ các địa phương thu mẫu dược liệu trong nghiên cứu
30
Hình 6. ADNts tách chiết từ các phần mơ khác nhau: hình bên trái - ADNts từ các mẫu cây
Hồi hương (I); hình bên phải - ADNts từ các phần mô khác nhau ở cây sâm (V). M: thang
ADN chuẩn. Nguồn gốc và đặc điểm các mẫu nêu ở Bảng 4.
40
Hình 7. Ảnh điện di ADN tổng số các mẫu dược liệu được thu thập trong nghiên cứu:
a) mẫu các lồi Ngũ gia bì gai (G) và Ngũ gia bì hương (H); b) mẫu các lồi Hồi
hương (I) và Hồi núi (N); c) mẫu các lồi Ba kích (K); d) mẫu các loài Sâm Việt Nam
(S), Sâm Vũ Diệp (V), Tam thất hoang (T) và dạng trung gian Sâm Vũ Diệp-Tam thất
hoang (VT). M: thang ADN chuẩn. Nguồn gốc và đặc điểm các mẫu nêu ở Bảng 4.
40
Hình 8. Hình ảnh điện di một số sản phẩm RAPD-PCR ở các mẫu Ngũ gia bì gai (G) và
Ngũ gia bì hương (H) trong nghiên cứu: a) Sản phẩm điện di với mồi OPC9; b) Sản phẩm
điện di với mồi OPA5. M: thang ADN chuẩn. Nguồn gốc và đặc điểm các mẫu nêu ở Bảng
4.
43
Hình 9. Sơ đồ hình cây về quan hệ di truyền giữa các mẫu thuộc hai lồi cây thuốc Ngũ gia
bì gai (Acanthopanax trifoliatus – ký hiệu G) và Ngũ gia bì hương (A. gracilistylus – ký
hiệu H) thu thập được ở Việt Nam trên cơ sở phân tích chỉ thị RAPD-PCR. Nguồn gốc và
đặc điểm của các mẫu nêu ở Bảng 4.
44
Hình 10. Sơ đồ cây quan hệ di truyền của 39 mẫu Hồi hương với 11 mẫu Hồi núi trong
nghiên cứu. Nguồn gốc và đặc điểm của các mẫu được nêu tại Bảng 4.
52
Hình 11. Sơ đồ hình cây phản ánh mối quan hệ di truyền giữa 25 dịng Ba kích trong
nghiên cứu. Nguồn gốc và đặc điểm của các mẫu được trình bày tại Bảng 4.
54
vi
Hình 12. Băng đồng hình (chỉ ra bởi hình đầu mũi tên) của các mẫu Sâm Việt Nam (S),
Sâm Vũ Diệp (V), Tam thất hoang (T) và dạng trung gian giữa Sâm Vũ Diệp-Tam thất
hoang (VT) tương ứng với mồi OPA14, OPC1 và OPA7.
57
Hình 13. Cây quan hệ di truyền giữa các mẫu Sâm Việt Nam (ký hiệu S), Sâm Vũ Diệp (ký
hiệu V), dạng trung gian của Sâm Vũ Diệp và Tam thất hoang (ký hiệu VT) và Tam thất
hoang (ký hiệu T) trong nghiên cứu lập bởi số liệu thu được từ phân tích RAPD-PCR.
Nguồn gốc và đặc điểm của các mẫu được nêu ở Bảng 4.
59
Hình 14. Băng đồng hình (chỉ ra bởi hình mũi tên) của các mẫu ngũ gia bì gai (G) và ngũ
gia bì hương (H) trong nghiên cứu với mồi OPA10. Nguồn gốc và đặc điểm các mẫu được
nêu ở bảng 4.
62
Hình 15. Băng đặc trưng phân biệt (chỉ ra bởi hình mũi tên) của các mẫu Ngũ gia bì gai
(G) và Ngũ gia bì hương (H) trong nghiên cứu với mồi OPA12 (hình bên trái) và mồi
OPA1 (hình bên phải). M: thang ADN chuẩn. Trong đó, chỉ thị OPA12750 và OPA1500 đặc
trưng cho các mẫu thuộc lồi Ngũ gia bì gai; chỉ thị OPA12950 và OPA1300 đặc trưng cho
các mẫu thuộc loài Ngũ gia bì hương. Nguồn gốc và đặc điểm các mẫu được nêu ở Bảng 4.
62
Hình 16. Băng đồng hình (chỉ ra bởi hình mũi tên) của các mẫu thuộc nhóm lồi Hồi
hương (I) (hình bên phải) và các lồi Hồi núi (N) trong nghiên cứu với mồi OPA7 (hình
bên trái). M: thang ADN chuẩn. Băng đặc trưng phân biệt của hồi núi là băng có kích
thước 1800 bp. Nguồn gốc và đặc điểm các mẫu được nêu ở Bảng 4.
63
Hình 17. Băng đồng hình (chỉ ra bởi hình mũi tên) ở tất cả 25 mẫu Ba kích trong nghiên
cứu với chỉ thị OPA17. Dạng hình thái thân có lơng (L), khơng có lơng (K), dạng hình thái
quả tụ (T) và hình thái quả rời (R). Nguồn gốc và đặc điểm các mẫu được nêu ở Bảng 4. M:
64
thang ADN chuẩn.
Hình 18. Hình ảnh điện di các mẫu Ba kích với mồi OPA1. Băng đồng hình giữa hai dạng
hình thái thân có lơng (L) và khơng có lơng (K) có kích thước 600 bp và 300 bp (chỉ ra bởi
hình mũi tên). Băng đặc trưng phân biệt của kiểu hình thái thân khơng có lơng có kích
thước 1100 bp. Nguồn gốc và đặc điểm các mẫu được nêu ở Bảng 4. M: thang ADN chuẩn.
65
Hình 19. Ảnh điện di các mẫu Sâm Việt Nam (S), Sâm vũ diệp (V), dạng trung gian (VT) và
Tam thất hoang (T) với mồi OPA14 và OPC16, hình mũi tên chỉ ra các băng đặc hiệu phân biệt
cịn hình đầu mũi tên chỉ ra các băng chung. M: thang ADN chuẩn (1kb marker). Nguồn gốc và
66
đặc điểm của các mẫu được nêu ở Bảng 4.
vii
LUẬN VĂN THẠC SĨ
MỞ ĐẦU
Theo ước tính hơn 80% dân số trên toàn thế giới hiện nay vẫn phụ thuộc vào
các loại thuốc có nguồn gốc thảo dược trong việc chăm sóc sức khỏe. Các liệu pháp
chữa bệnh dựa vào thảo dược được đánh giá thơng qua tính khả dụng và dựa vào
kinh nghiệm lưu truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác. Phần lớn các loài cây thuốc
hiện nay chủ yếu được thu hái từ tự nhiên. Việc thu hái như vậy nếu khơng có sự
kiểm sốt chặt chẽ dễ gây nên sự suy kiệt tài nguyên di truyền của các lồi cây
thuốc nói riêng cũng như của nguồn tài nguyên thực vật nói chung. Đây cũng là
nguyên nhân có thể dẫn tới chất lượng sản phẩm kém ổn định. Bên cạnh đó, nhiều
lồi dược liệu q hiếm có thể bị làm giả hoặc thay thế bằng các dạng dược liệu có
hình thái tương tự, dẫn tới những tác dụng khơng mong muốn khi sử dụng.
Việt Nam có gần 4.000 loài cây thuốc. Với thế mạnh về tài nguyên dược liệu
dồi dào như vậy, chúng ta có thể hy vọng phát hiện và phát triển được thuốc mới từ
nguồn tài nguyên tự nhiên phong phú này. Tuy vậy, hiện nay cơng tác bảo tồn, gìn
giữ, chọn tạo giống và phát triển nguồn gen cây thuốc vẫn chưa phát huy hết tiềm
năng. Nhiều loài cây thuốc quý hiếm đang có nguy cơ tuyệt chủng do bị khai thác ồ
ạt và thiếu kế hoạch.
Những vấn đề trên đặt ra một yêu cầu cấp thiết là cần có các biện pháp bảo tồn
và phát triển nguồn tài nguyên dược liệu của nước ta, cũng như cần phát triển công
tác kiểm định dược liệu nhằm đánh giá hiệu quả nguồn nguyên liệu ban đầu bảo
đảm chất lượng sản phẩm phục vụ ngành công nghiệp dược trong nước về lâu dài.
Trên thế giới, việc sử dụng các chỉ thị ADN (RAPD-PCR, RFLP-PCR, AFLP,
SSR, ...) ngày càng được dùng rộng rãi trong các nghiên cứu phân loại, phân tích đa
dạng sinh học, xác định khoảng cách di truyền và đặc trưng cá thể và quần thể thực
vật nhằm mục đích bảo tồn và chọn giống. So với các chỉ thị truyền thống (chỉ thị
hình thái và chỉ thị hóa học), thì chỉ thị ADN mang những ưu điểm nổi bật: dễ thực
hiện trong điều kiện phịng thí nghiệm, khơng phụ thuộc vào các yếu tố mơi trường
và hiện tượng tương tác gen, có thể xác định được các biến dị ADN trong các giai
đoạn khác nhau và ở các cơ quan khác nhau ở thực vật. Việc phân tích các chỉ thị
1
LUẬN VĂN THẠC SĨ
ADN cho phép đánh giá một cách chính xác mức độ đa dạng di truyền của một lồi
cây thuốc nào đó nhằm định hướng bảo tồn, chọn, tạo và nhân giống phù hợp, đáp
ứng yêu cầu của q trình phát triển một nền cơng nghiệp chế biến dược liệu bền
vững.
Trên cơ sở đó, chúng tơi đã tiến hành nghiên cứu phân tích tính đa dạng di
truyền của một số loài cây thuốc quý ở nước ta hoặc đang bị đe dọa cần được ưu
tiên bảo tồn, hoặc có đặc điểm hình thái giống nhau cần có sự hỗ trợ của các kỹ
thuật sinh học phân tử trong cơng tác phân loại.
Luận văn này trình bày kết quả phân tích chỉ thị ADN (chủ yếu dựa trên kỹ
thuật RAPD-PCR) của 4 nhóm lồi cây thuốc được thu thập ở nước ta, đó là: 1) chi
Acanthopanax (họ Araliaceae) gồm 2 lồi là Ngũ gia bì gai (Acanthopanax
trifoliatus (L.) Merr.) và Ngũ gia bì hương (A. gracilistylus W.W. Smith); 2) chi
Illicium gồm loài Hồi hương (Illicium verum Hook.f) và một số lồi Hồi núi
(Illicium spp.); 3) một số dạng hình thái khác nhau về đặc điểm thân và quả của lồi
Ba kích (Morinda officinalis How.); 4) chi Nhân sâm (Panax; họ Ngũ gia bì
Araliaceae) gồm 3 lồi là Sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv), Sâm
Vũ Diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus
H.T. Tsai et K.M. Feng).
2
Chng 1. T ng quan tài li u
NCD
LUẬN VĂN THẠC SĨ
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY DƯỢC LIỆU
Việc sử dụng các loài cây dược liệu làm thuốc nhằm phòng chống và điều trị
bệnh đã được áp dụng từ lâu trong lịch sử loài người [61]. Việc sử dụng cây dược
liệu có lẽ đã được bắt đầu ngay từ thời cổ đại (Bensky và Gamble, 1993). Trong nền
văn hóa cổ xưa, con người tổng hợp những thơng tin về cây dược liệu dựa trên các
bài thuốc được lưu truyền trong dân gian qua đó phát triển lên thành các cuốn dược
điển về cây dược liệu. Những minh chứng sớm nhất cho những hiểu biết của con
người được ghi chép lại về dược liệu được ghi nhận tại Ấn Độ, Trung Quốc, Ai
Cập, Hi Lạp, La Mã và Xy-ri khoảng 5000 năm trước. Ví dụ như những thơng tin
cổ xưa nhất về cây dược liệu của người Ai Cập được tổng hợp trong 2 cuốn sách là
Charak Samhita và Sushruta Samhita [59].
Ước tính có khoảng 25% các loại thuốc được sử dụng hiện nay trên thế giới có
nguồn gốc từ thực vật và có khoảng 121 hợp chất có hoạt tính đang được sử dụng.
Trong tổng số 252 loại thuốc thiết yếu mà WHO đã liệt kê thì có tới 11% có nguồn
gốc từ thực vật [68]. Gần như 80% dân số Châu Phi và Châu Á phụ thuộc vào các
loại thuốc cổ truyền để chăm sóc sức khỏe [56, 81, 92].
Khoảng 3 thập kỷ trước đây, theo Lipp (1996) chỉ có một lượng nhỏ các sản
phẩm có nguồn gốc từ cây thảo mộc được kiểm nghiệm trên một số bệnh cụ thể
[59]. Tính đến nay, trên thế giới hiện vẫn còn nhiều người ưa dùng các sản phẩm có
nguồn gốc từ thiên nhiên để điều trị một số loại bệnh tật (theo Nazma và cộng sự,
2010). Các sản phẩm được chế biến từ cây dược liệu thường được sử dụng ở các
bệnh nhân mắc một số bệnh mạn tính, bao gồm ung thư vú (12%; Burstein, 1999),
các bệnh về phổi (21%; Strader, 2002), virut gây suy giảm miễn dịch ở người (HIV)
(22%; Kassler, 1991), bệnh hen suyễn (24%; Blanc, 2001) và rối loạn thấp khớp
(26%; Rao, 1999).
Khoảng 960 loài thực vật đã được sử dụng bởi ngành cơng nghiệp thảo dược ở
Ấn Độ thì có tới 178 loài thực vật vượt qua sản lượng 100 tấn mỗi năm [41]. Thị
trường dược liệu tại Ấn Độ đang biểu lộ một sự tăng trưởng đặc biệt có thể đạt
3
Chng 1. T ng quan tài li u
NCD
LUẬN VĂN THẠC SĨ
doanh thu là 145.000 triệu rubi (tương đương khoảng 3,1 tỉ đôla Mỹ) vào năm 2010.
Đồng thời việc xuất khẩu dược liệu của quốc gia này có thể đạt doanh thu là 90.000
triệu rubi (tương đương 2 tỉ đô la Mỹ) (theo thống kê của tổ chức ASSOCHAM,
2008 [59]).
Ảnh hưởng của cây dược liệu tới sức khỏe con người
Thông thường mọi người thường tin rằng nguy cơ gây hại của các loại thảo
dược là rất ít, tuy nhiên trong thực tế nhiều báo cáo đã chỉ ra rằng sản phẩm từ cây
dược liệu có thể dẫn tới những hậu quả nghiêm trọng. Việc dùng sai các loại dược
liệu hay các sản phẩm dược liệu giả mạo đã đặt ra một vấn đề vơ cùng quan trọng
về độ an tồn cũng như tính hiệu quả của các sản phẩm dược liệu. Nhiều loại dược
phẩm phổ biến thậm chí có giá thành đắt hiện nay thực chất là những sản phẩm thay
thế kém chất lượng hoặc là các sản phẩm dược liệu thô đã được làm giả [19]. Việc
làm giả các sản phẩm từ dược liệu cũng như việc dùng sai chúng có thể dẫn tới
nhiều bệnh như suy thận, tim mạch, … đã được ghi nhận tại nhiều nơi trên thế giới
như Anh quốc [19, 59], Mỹ [59, 97], Ấn Độ [59], Việt Nam [2]…
Một vấn đề khác trong việc sử dụng các lồi dược liệu đó chính là sự có mặt
của kim loại nặng (thủy ngân, chì , arsen, …) có khả năng gây độc [19, 26, 54, 72].
Việc nhiễm độc đã được ghi nhận ở tất cả các bước từ bước khởi đầu là thu thập
dược liệu thô cho tới công đoạn sản xuất [19, 54]. Ghi nhận đầu tiên về trường hợp
nhiễm độc kim loại nặng vào năm 1978 tại Anh. Sau đó đã có hơn 50 trường hợp
nhiễm độc kim loại nặng từ nhiều vùng khác nhau trên thế giới bao gồm trong đó có
lục địa Ấn Độ, Bắc Mỹ, Trung Đông, Tây Âu và Australia [26, 72]. Sự lắng đọng
cặn thuốc diệt cỏ trong các cây dược liệu cũng là một vấn đề gây ảnh hưởng nghiêm
trọng trong quá trình phát triển và đẩy mạnh việc quốc tế hóa các sản phẩm dược
liệu truyền thống. Sự nhiễm độc từ các cây dược liệu thô cũng như các sản phẩm
hay chế phẩm của nó (sự pha chế, sắc thuốc,…) được ghi nhận là ngày càng tăng.
Một nghiên cứu gần đây với 280 mẫu có nguồn gốc từ 30 loài dược liệu Trung
Quốc về độ lắng đọng cặn thuốc trừ sâu cho thấy có tới 78,5% mẫu có chứa tối
thiểu một loại thuốc trừ sâu organochlorine như PCNB, aldrin, BHC hay DDT [94],
4
Chng 1. T ng quan tài li u
NCD
LUẬN VĂN THẠC SĨ
đều là những chất có nguy cơ ảnh hưởng tới sức khỏe người sử dụng [92]. Các loài
cây dược liệu thường có thành phần các chất rất phức tạp chính là ngun nhân dẫn
tới khó khăn trong việc tìm ra phương pháp loại bỏ triệt để các chất lắng đọng bất
lợi mà khơng làm mất di các thành phần có hoạt tính có trong các lồi cây này [59].
Bên cạnh đó, đã có những báo cáo tổng hợp lại vấn đề nhiễm nấm trong quá trình
thu hái, bảo quản, sản xuất và phân phối các sản phẩm dược liệu trên thế giới [59].
Việc thu hái trên quy mô rộng và khơng có tính kiểm sốt các lồi thực vật là
ngun nhân dẫn tới việc làm suy kiệt nguồn tài nguyên di truyền, bao gồm trong
đó là các lồi cây dược liệu [59]. Ví dụ như, lồi anh đào Châu Phi (Pygeum hay
Prunus africanum) được sử dụng rộng rãi để điều trị bệnh liên quan tới u tiền liệt
tuyến, đang phải đứng trước nguy cơ cạn kiệt nguồn tài nguyên, dẫn tới hệ sinh thái
bị ảnh hưởng nghiêm trọng do việc khai thác q mức lồi cây này ở châu Phi.
Chính vì lẽ đó, kể từ năm 1995, trong Cơng ước Thương mại về động vật và thực
vật hoang dã - CITES (Convention of International Trade in Endangered Species),
loài thực vật này đã được thêm vào phần phụ lục dành cho các lồi cần được bảo vệ
[59, 79]. Theo sau đó Tổ chức IUCN cũng đưa loài dược liệu này vào trong danh
sách các lồi có nguy cơ tiệt chủng (Sách Đỏ). Loài đàn hương (Santalum spp.)
phân bố ở Nam Á, Indonesia, Australia và Nam Thái Bình Dương dùng để sản xuất
các sản phẩm gỗ và dầu thơm, cũng gặp trường hợp tương tự.
Từ những nghiên cứu trên, chúng ta nhận thấy việc phát triển một hệ thống
đánh giá hiệu quả các loài cây dược liệu và các thành phần của nó là một việc làm
thiết yếu. Những phương pháp đảm bảo chất lượng cũng như độ an toàn của các sản
phẩm này đã và đang được phát triển trên toàn thế giới, thơng qua đó đẩy mạnh việc
tiêu chuẩn hóa sản phẩm đầu ra, góp phần tồn cầu hóa các sản phẩm có nguồn gốc
từ dược liệu. Bên cạnh đó việc tiêu chuẩn hóa nguồn dược liệu đang được phát triển
rộng khắp trên phạm vi toàn thế giới. Đây là một việc làm có tính khả thi, nhưng lại
rất khó để thực hiện. Vì rằng, quá trình kiểm định các loại dược liệu không được
thực hiện một cách đồng bộ trên tồn bộ các quốc gia. Do đó, hiện nay trên thế giới
5
Chng 1. T ng quan tài li u
NCD
LUẬN VĂN THẠC SĨ
có rất nhiều phương pháp được áp dụng để kiểm định nguồn dược liệu và các sản
phẩm của chúng [59].
Tiêu chuẩn hóa dược liệu
Tính phức tạp của q trình tiêu chuẩn hóa dược liệu
Cây dược liệu có rất nhiều đặc tính riêng, chính điều này làm cho các sản
phẩm từ cây dược liệu khác với các loại thuốc tổng hợp [59]. Chúng thường chứa
đồng thời nhiều hợp. Ví dụ như dược phẩm Huang-qin (Scutellaria baicalensis) có
tới hơn 2000 hợp chất [73]. Những đặc điểm về mặt hóa học của các loài cây dược
liệu bị ảnh hưởng bởi các điều kiện về thu hái, qui trình sản xuất và phân bố. Những
đặc điểm về mặt sinh lý, di truyền cũng như những biến đổi về mơi trường (quang
chu kỳ, khí hậu, điều kiện đất, dinh dưỡng) đều có thể gây ảnh huởng tới các đặc
điểm hóa sinh và khả năng tích lũy các hợp chất thứ cấp ở thực vật. Thành phần các
hợp chất thức cấp trong dược liệu còn phụ thuộc vào thời gian thu hái, các phương
pháp bảo quản, sấy khơ, tách chiết để thu được sản phẩm đóng gói cuối cùng [59].
Tính ổn định ở tất cả các giai đoạn của quy trình sản xuất có ý nghĩa quan trọng để
đảm bảo hiệu quả chữa bệnh và độ an tồn cho người sử dụng.
Có rất nhiều loại chỉ thị như chỉ thị hình thái, hóa học, chỉ thị liên quan tới hệ
gen (ADN), chỉ thị liên quan tới các protein (izozym), đều là những cơng cụ có thể
dùng để xác định các thành phần có trong cây dược liệu [59, 76].
Dược điển Trung Quốc (ấn bản năm 2005) thống kê có tất cả 282 chỉ thị hóa
học được sử dụng cho các loài cây thuốc [59]. Đây là một cơng cụ hữu ích dùng để
xác định sự làm giả cũng như sự khác biệt của các sản phẩm dược liệu có nguồn gốc
khác nhau, kiểm tra tính ổn định của các sản phẩm có tính chất độc quyền [59]. Các
thành phần có độc tính có thể sử dụng như là các chỉ thị hóa học trong các phương
pháp sàng lọc [49]. Tính cho tới thời điểm hiện tại, vẫn cịn có rất nhiều lồi dược
liệu khơng có chỉ thị hóa học phù hợp để kiểm định chất lượng. Theo cuốn Dược
điển Trung Quốc, chỉ có 282 trong tổng số 551 lồi dược liệu có 1 hoặc 2 chỉ thị
hóa học để kiểm định chất lượng. Thiếu những chỉ thị hóa học, mức độ tinh sạch
6
Chng 1. T ng quan tài li u
NCD
LUẬN VĂN THẠC SĨ
của các chỉ thị đang có chính là ngun chính cản trở việc kiểm định chất lượng của
các sản phẩm dược liệu.
Các hợp chất trao đổi thứ cấp là các chỉ thị được sử dụng rộng rãi trong việc
kiểm định và tiêu chuẩn hóa các lồi cây dược liệu. Do không bị ảnh hưởng bởi độ
tuổi, điều kiện sinh lý và các nhân tố môi trường, nên các chỉ thị dựa trên phân tử
ADN còn được sử dụng để phân biệt những biến dị giữa và trong loài với nhau. Chỉ
thị đa hình phân đoạn ADN được nhân bản ngẫu nhiên (RAPD) là chị thị được áp
dụng thành công trong việc đánh giá sự khác biệt giữa các loài Taxus wallichiana
Neem, Juniperus communis L., Codonopsis pilosula, Allium schoenoprasum L., A.
paniculata được thu thập từ nhiều vùng địa lý khác nhau [39]. Phân tích RAPD và
Eastern blotting sử dụng 2 kháng thể đơn dòng ginsenoside Rb1 và Rgl đã được áp
dụng thành cơng trong viêc xác định 3 lồi sâm là: Panax notoginseng, P.
quinquefolius và P. japonicus. Đầu tiên, người ta sử dụng chỉ thị RAPD để phân
biệt các loài Panax spp. với nhau. Sau đó bằng kỹ thuật Eastern Blot xác định sự có
hay khơng có mặt chất ginsenoide Rc trong các sản phẩm tách chiết để định loại tên
loài P. notoginseng trong phân tích Eastern blotting [76].
Mức độ an toàn và hiệu quả sử dụng của các loài dược liệu được hình thành
thơng qua q trình sử dụng lâu dài của chúng. Mặc dù đã có những phép thử
nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên trên một số loài dược liệu, nhưng để có thể kiểm định
một cách triệt để thì cần phải có những nghiên cứu lâm sàng đầy đủ cùng với các
nghiên cứu về mặt độc tính học trên các loài dược liệu này [59].
1.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Những tiến bộ gần đây trong lĩnh vực sinh học phân tử đã cung cấp những
công cụ mới áp dụng vào việc làm sáng tỏ những nghi vấn cịn tồn tại trong các
nghiên cứu về tiến hóa, hình thái học và phân loại học. Những chỉ thị ADN có nhiều
ưu điểm so với các chỉ thị hình thái vì chúng gắn liền với vật chất di truyền, tương
đối dễ phân tích trong phịng thí nghiệm và ít bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi
trường [24].
7
Chng 1. T ng quan tài li u
NCD
LUẬN VĂN THẠC SĨ
Trong hai thập kỉ gần đây, một số kỹ thuật chỉ thị phân tử đã được phát triển
để phân tích về các hệ gen, phần lớn là để xác định những khác biệt giữa các cá thể
trong cùng một loài (đa hình di truyền) hoặc để tìm mối tương quan giữa đa hình di
truyền với các tính trạng nhất định. Tuy nhiên, vì giá thành tương đối cao tăng lên
cùng với sự phát triển của các chỉ thị phân tử, cho nên những phương pháp này mới
chỉ được áp dụng trên một số lượng hữu hạn các loài, và đa số là mới chỉ được tiến
hành ở các nước phát triển. Việc ứng dụng các chỉ thị phân tử còn có xu hướng khu
trú vào một lượng nhỏ các tính trạng hoặc một số vùng của hệ gen. Việc kết hợp các
phương pháp và sự phát triển của việc lập bản đồ đã đưa ra triển vọng áp dụng các
chỉ thị phân tử trên quy mô rộng, với số lượng lớn, qua đó làm giảm chi phí đầu tư
[24].
Theo Maheswaran (2004) tổng kết, sự phát triển của các chỉ thị ADN có thể
chia làm 3 thế hệ: (i) thế hệ chỉ thị ADN đầu tiên bắt đầu từ năm 1975 tới năm
1989; (ii) thế hệ chỉ thị ADN thứ hai bắt đầu từ năm 1990 đến năm 1993; (iii) thế hệ
chỉ thị ADN hiện nay bắt đầu từ năm 1994 cho tới nay. Việc ra đời của kỹ thuật đa
hình độ dài các đoạn cắt giới hạn (RFLP; Grodzicker và cs, 1974) đã đánh dấu khởi
điểm của thế hệ chỉ thị ADN đầu tiên. Ban đầu, chỉ thị RFLP được thu từ các lồi
virut [31], sau đó đã được kiểm chứng khi phân tích nhóm gen globin ở người [36].
Tiếp theo chỉ thị RFLP, một loạt các chỉ thị ADN được phát triển như: VNTRVariable Number Tandem Repeats (Các mảnh lặp lại có thứ tự với một tần số khác
nhau; Jeffreys, 1985); ASO-Allele Specific Oligonucleotides (xác định một trong
hai dạng sơi đơn của một phân tử ADN sợi kép bằng các oligonucleotide; Saiki và
cs, 1985); … Bảng 1 liệt kê một số chỉ thị ADN được phát triển trong thế hệ chỉ thị
ADN đầu tiên.
Cuộc cách mạng trong lĩnh vực nghiên cứu về di truyền học phân tử trên các
vi vệ tinh – dãy trình tự ADN lặp lại của 2-, 3-, 4- và 5 nucleotide xuất hiện rải rác
suốt hệ gen của các sinh vật nhân chuẩn đã đánh dấu sự ra đời của thế hệ chỉ thị
ADN thứ hai. Các trình tự lặp lại đơn giản (SSR) này gần đây đã được xác định là
những chỉ thị phân tử được dùng trong việc lập bản đồ hệ gen của một quần xã và
8
Chng 1. T ng quan tài li u
NCD
LUẬN VĂN THẠC SĨ
được ưa dùng trong các nghiên cứu trên đối tượng thực vật. Một số chỉ thị khác
được phát triển trong giai đoạn này được liệt kê tại Bảng 2.
Bảng 1. Thế hệ chỉ thị ADN đầu tiên
Năm
Ký hiệu
Tên đầy đủ (tiếng Anh)
Tài liệu tham khảo
1974
RFLP
Restriction Fragment Length Polymorphism
Grofzicker và cs. (1974)
1985
VNTR
Variable Number Tandem Repeats
Jeffreys và cs. (1985)
1986
ASO
Allele Specific Oligonucleotides
Saiki và cs. (1986)
1988
AS-PCR
Allele Specific Polymerase Chain Reaction
Landegren và cs. (1988)
1988
OP
Oligonucleotide Polymorphism
Beckmann (1988)
1989
SSCP
Single Stranded Conformational Polymorphism
Orita và cs. (1989)
Bảng 2. Thế hệ chỉ thị ADN thứ hai
Năm Ký hiệu
Tên đầy đủ (tiếng Anh)
Tài liệu tham khảo
1990
RAPD
Randomly Amplified Polymorphic DNA
Williams và cs. (1990)
1990
AP-PCR
Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction
Welsh và McClelland (1990)
1990
STMS
Sequence Tagged Micro Satellite Sites
Beckmann and Soller (1990)
1991
RLGS
Restriction Landmark Genome Scanning
Hatada và cs. (1991)
1992
CAPS
Cleaved Amplified Polymorphic Sequence
Akopyanz và cs. (1992)
1992
DOP-PCR
Degenerate Oligonucleotide Primer - PCR
Telenius (1992)
1992
SSR
Simple Sequence Repeats
Akkaya và cs. (1992)
1993
MAAP
Multiple Arbitrary Amplicon Profiling
Caeteno-Anolles và cs.
(1993)
1993
SCAR
Sequence Characterized Amplified Region
Paran và Michelmore (1993)
Với sự phát triển gần đây của sinh học phân tử mở ra triển vọng áp dụng nhiều
loại kỹ thuật phân tử để xác định cũng như dùng để cải tiến hệ gen của nhiều lồi
sinh vật khác nhau. Thơng tin liên quan tới nền tảng của những kỹ thuật này cũng
như ứng dụng của chúng đều có nguồn gốc từ việc áp dụng công nghệ lên những dự
án hệ gen. Khoảng 10 năm gần đây khoa học đã chứng kiến sự hình thành của một
dãy các chỉ thị phân tử với khả năng thực hiện cao được kết hợp với sự thay đổi từ
phương thức thủ cơng cho tới sự tự động hóa một cách hồn chỉnh. Theo đó thế hệ
chỉ thị này sẽ có khả năng tiềm tàng vơ cùng to lớn trong sự tìm hiểu những biến dị
ở mức độ ADN. Trong thế hệ chỉ thị ADN mới này có thể kể đến các chỉ thị như
9
Chng 1. T ng quan tài li u
NCD
LUẬN VĂN THẠC SĨ
ISSR, là chỉ thị được phát triển trên nền tảng thế hệ chỉ thị SSR; hay SNP (đa hình
các đơn nucleotide)… là các chỉ thị có hiệu quả cao trong việc phân tích đa hình di
truyền.
Bảng 3. Thế hệ chỉ thị ADN mới
Năm Ký hiệu
Tên đầy đủ (tiếng Anh)
Tài liệu tham khảo
1994
ISSR
Inter Simple Sequence Repeats
Zietkiewicz và cs. (1994)
1994
SAMPL
Selective Amplification Of Micro Satellite
Morgante và Vogel (1994)
Polymorphic Loci
1994
SNP
Single Nuleotide Polymorphism
Jordan và Humphries (1994)
1995
AFLP
Amplified Fragment Length Polymorphism
Vos và cs. (1995)
(SRFA)
(Selective Restriction Fragment Amplification)
1996
ISTR
Inverse Sequence-tagged Repeats
1997
DAMD-
Directed Amplification Of Mini Satellite Bebeli và cs. 1997
PCR
DNA-PCR
IRAP
Inter-retrotransposon
1999
Rohde (1996)
Kalendar và cs. (1999)
Đặc điểm của các chỉ thị phân tử nói chung và chỉ thị ADN nói riêng
Mức độ đa hình
Kỹ thuật sử dụng chính xác chỉ thị di truyền có mức độ đa hình cao nên được
áp dụng trong việc lập bản đồ hệ gen. Mức độ đa hình trong số các chỉ thị di truyền
phụ thuộc vào loại chỉ thị và phương pháp được sử dụng để xác định ra nó.
Số lượng các alen
Có hai kiểu chỉ thị: chỉ thị liên quan tới 2 alen và chỉ thị liên quan tới nhiều
alen (đa alen).
Tính đặc hiệu về locus
Các chỉ thị được chia ra thành hai nhóm chính: các chỉ thị liên quan tới 1 locus
(chỉ có một vị trí trên hệ gen) và chỉ thị liên quan tới đa locus (nhiều vị trí trên hệ
gen). Các chỉ thị liên quan đến đơn locus thường được áp dụng trong việc lập bản
đồ hệ gen trong khi đó các chỉ thị liên quan tới đa locus được áp dụng cho các
nghiên cứu xây dựng tàng thư ADN hoặc phân tích đa dạng di truyền chung.
Bản chất của các alen
10
Chng 1. T ng quan tài li u
NCD
LUẬN VĂN THẠC SĨ
Bản chất của các chỉ thị liên quan tới 2 alen được xác định là đồng trội khi mà
cả hai alen này đều được quan sát thấy ở con lai. Nếu chỉ có một trong hai alen
được quan sát thấy thì chỉ thị tương ứng với alen đó được xác định là trội. Các chỉ
thị đồng trội sẽ mang nhiều tính thơng tin hơn so với các chỉ thị trội bởi vì các chỉ
thị đồng trội có thể phân biệt được các kiểu gen dị hợp tử với các kiểu gen đồng hợp
tử. Chính điều này cho phép sự xác định các kiểu gen và tần số alen ở các locus một
cách chuẩn xác. Do đó, những chỉ thị đồng trội được ưa dùng hơn so với các chỉ thị
trội trong nghiên cứu lập bản đồ gen và phân tích đa dạng di truyền.
Ngoài những đặc điểm trên, khi nghiên cứu về các chỉ thị ADN, các nhà
nghiên cứu còn chú ý tới các đặc điểm về mặt kỹ thuật (các phương pháp kèm
theo); yêu cầu về mặt chất lượng của ADN; khả năng tự động hóa; các chi phí hoạt
động (tiền lương, các thiết bị phịng thí nghiệm, máy móc, hóa chất, …); chí phí
phát triển
Những đặc điểm cần có của một chỉ thị ADN lý tưởng
Một chỉ thị ADN lý tưởng là một chỉ thị hội tụ những đặc điểm cần có như
sau:
- Có thể tạo ra được một cách dễ dàng
- Phân tích đơn giản và nhanh
- Có tính đa dạng và tính lặp lại cao
- Di truyền đồng trội và có sự tái xuất hiện ở trên tồn hệ gen
- Chọn lọc một cách trung tính với những điều kiện của môi trường hoặc điều
kiện thực hiện
- Số liệu có thể được thay đổi giữa các phịng thí nghiệm khác nhau.
Việc chọn ra được một chỉ thị phân tử mang đầy đủ tất cả các tiêu chuẩn trên
là một điều hết sức khó khăn. Như vậy, mục tiêu đặt ra là cần phải phát triển được
một loại chỉ thị phân tử hội đủ các đặc điểm kể trên. Nhiều chỉ thị phân tử đã được
sử dụng để đánh giá đa hình ADN. Chúng đã được phân loại thành các chỉ thị dựa
vào các phép lai và các chỉ thị dựa trên phản ứng PCR. Những đặc điểm của các chỉ
thị dựa vào phép lai được thực hiện bởi phép lai giữa phân đoạn ADN đã được cắt
11
Chng 1. T ng quan tài li u
NCD
LUẬN VĂN THẠC SĨ
bởi enzym giới hạn endonuclease, với một đầu dò được đánh dấu. Trong kỹ thuật
PCR, các phân đoạn ADN được nhân bản trong điều kiện in vitro với sự trợ giúp
của các trình tự oligonucleotit đặc hiệu hoặc tương đồng (còn được gọi là mồi) và
các enzym ADN polymerase chịu nhiệt. Các phân đoạn ADN được nhân bản này
được phân chia nhờ điện di và các băng được xác định bởi nhiều phương pháp như
nhuộm băng (sử dụng thuốc nhuộm ethidium bromide) và phương pháp phóng xạ tự
ghi.
Cùng với những tiến bộ của enzym ADN polymerase chịu nhiệt, việc sử dụng
PCR trong các nghiên cứu và các phịng thí nghiệm lâm sàng đang tăng lên một
cách nhanh chóng. PCR có độ nhạy cao và vận hành ở một tốc độ rất nhanh. Những
ứng dụng của nó trên các mục đích phân tích sự đa dạng đã mở ra vơ số những khả
năng mới trong lĩnh vực sinh học phân tử.
1.3. LÝ DO THỰC HIỆN ĐỀ TÀI
1.3.1. Thực trạng nghiên cứu về cây dược liệu ở Việt Nam hiện nay
Theo thống kê của tổ chức IUCN, hiện Việt Nam có hơn 10.000 lồi thực vật
có vai trị cung cấp nguồn thức ăn, thuốc .... Theo điều tra của Viện Dược liệu, nước
ta có gần 4000 lồi cây thuốc. Với thế mạnh về tài nguyên dược liệu dồi dào như
vậy, chúng ta có thể hy vọng phát hiện và phát triển được thuốc mới từ nguồn tài
nguyên tự nhiên phong phú này. Tuy vậy, hiện nay cơng tác bảo tồn, gìn giữ, chọn
tạo giống và phát triển nguồn gen cây thuốc vẫn chưa phát huy hết tiềm năng. Nhiều
loài cây thuốc quý hiếm đang có nguy cơ tuyệt chủng do bị khai thác ồ ạt và thiếu
kế hoạch. Theo số liệu của các cơ quan chức năng thì có tới 50% ngun liệu dược
liệu của nước ta là nhập về từ nước ngồi. Trong hồn cảnh đó, một chiến lược khai
thác, bảo tồn cũng như gây giống hợp lý nguồn tài nguyên dược liệu nói chung và
tài nguyên cây thuốc nói riêng là vấn đề mang tính cấp thiết và có ý nghĩa thực tiễn.
1.3.1.1. Nghiên cứu về chi Acanthopanax
Trên thế giới, chi Acanthopanax có khoảng 35 lồi, hầu hết phân bố ở vùng
Đơng Á, ít lồi có ở Đơng Nam, phía Nam và Đơng Bắc châu Á. Trong đó, Trung
12
Chng 1. T ng quan tài li u
NCD
LUẬN VĂN THẠC SĨ
Quốc có tới 26 lồi, Hàn Quốc có 17 lồi, Nhật Bản có 9 lồi. Theo Đỗ Huy Bích, ở
Việt Nam chỉ có 3 lồi thuộc chi Acanthopanax đó là Acanthopanax trifoliatus (L.)
Merr., A. gracilistylus W.W. Smith và A. senticosus Harms [1, 2, 45, 50].
Ngũ gia bì hương, Ngũ gia bì gai nói riêng và các lồi thuộc chi Acanthopanax
nói chung và thường được xem có cơng dụng gần giống nhau trong y học cổ truyền.
Ở nước ta, chúng là thành phần được bổ sung trong các vị thuốc bổ gan, bổ thận,
làm mạnh gân cốt, chữa thấp khớp, lưng gối mỏi đau, trẻ em chậm biết đi, phù
thũng, kích thích tình dục, ... [2, 58, 64].
Các nghiên cứu về hóa học và dược lý học
Người ta bắt đầu chú ý nghiên cứu về các loài thuộc chi Acanthopanax từ
khoảng năm 1965, với việc tìm ra các glycosit eleuthrosid A, B, C, D và E từ vỏ rễ
của A. senticosus. Từ đó đến nay, đã có rất nhiều cơng trình nghiên cứu về các hợp
chất tự nhiên của chi Acanthopanax bao gồm: triterpenoid, triterpen glycosid,
diterpenoid, diterpen glycosid, lignan, phytosteroid, flavonoid, phenolic, curmrin và
các axit béo [1, 2, 43]. Những nghiên cứu về tác dụng dược lý của dịch chiết Ngũ
gia bì hương có tác dụng long đờm, chữa ho (Du Jianh và cs, 1992); ngăn cản và
giải phóng các yếu tố đông máu và làm tắc mạch máu (Chen và cs, 1996); điều hòa
miễn dịch, điều trị các bệnh tự miễn hay dị ứng [22, 65, 74].
Hiện nay, loài Ngũ gia bì hương ở Việt Nam chỉ cịn lại một vài tập hợp cá thể
ở tỉnh Hà Giang và Lào Cai, trong đó một số cá thể Ngũ gia bì hương ở Lào Cai có
nguồn gốc được đưa từ Hà Giang về trồng. Số lượng và khu phân bố của Ngũ gia bì
gai gần đây bị thu hẹp nhiều so với trước đây. Theo điều tra vào các năm 1973-1987
ở Lạng Sơn, Cao Bằng và Lai Châu, nguồn Ngũ gia bì gai ở Việt Nam tương đối
phong phú và xác định được trữ lượng đến vài trăm tấn dược liệu. Đáng tiếc, hiện
nay cả Ngũ gia bì hương và Ngũ gia bì gai chỉ cịn một số lượng ít ỏi mọc tự nhiên
và còn lại là được trồng ở một số hàng rào xung quanh nhà người dân [2].
Trên thị trường hiện nay có bày bán một số dạng dược liệu khơ gọi chung là
“Ngũ gia bì” nhưng khơng phân biệt đây là dược liệu của loài cây thuốc nào. Như
đã trình bày ở phần trên, thuật ngữ “Ngũ gia bì” được nhiều người sử dụng để gọi
13
Chng 1. T ng quan tài li u
NCD
LUẬN VĂN THẠC SĨ
cho các lồi Ngũ gia bì gai (A. trifoliatus), Ngũ gia bì hương (A. gracilistylus) và
một số lồi khác thuộc chi Acanthopanax. Trước thực trạng suy giảm nghiêm trọng
của hai lồi cây thuốc Ngũ gia bì gai và Ngũ gia bì hương ở Việt Nam, cơng tác bảo
tồn nhằm phát triển hai loài cây thuốc quý này là một việc làm có tính cấp thiết. Tuy
vậy, để đạt được mục tiêu đó, việc thăm dị và đánh giá mức độ đa dạng di truyền
của nguồn gen vốn có là một việc làm có ý nghĩa cơ bản.
1.3.1.2. Nghiên cứu về chi Illicium ở Việt Nam
Cây Hồi hương (Illicium verum Hook.f) được biết đến từ lâu trong nền y học
cổ truyền của nhiều quốc gia trên thế giới như một loại thảo dược có vị cay, mùi
thơm, tính ấm. Tại Việt Nam Hồi hương được biết đến trong các bài thuốc gây kích
thích trung tiện, tăng cường tiêu hóa, lợi sữa, lợi tiểu, chữa ngộ độc thịt cá, rắn cắn,
… Hiện nay, Hồi hương còn được biết tới là nguồn nguyên liệu ưa thích để bào chế
axit shikimic, là tiền chất của thuốc Tamiflu® - loại thuốc được đánh giá là có hiệu
quả nhất trong việc điều trị bệnh cúm gia cầm H5N1. Hồi hương lại có vùng phân
bố tương đối hẹp, hiện nay Hồi hương chỉ phân bố ở các tỉnh phía bắc Việt Nam
(Cao Bằng, Bắc Kạn, Lạng Sơn và Quảng Ninh) và một số tỉnh miền nam Trung
Quốc. Trước nhu cầu sử dụng thuốc Tamiflu ngày một tăng trên tồn thế giới
(WHO, 2005), nếu khơng có chiến lược khai thác hợp lý thì rất có khả năng dẫn đến
suy kiệt nguồn tài nguyên dược liệu này.
Các nghiên cứu về hóa học và dược lý học
Quả của cây Hồi hương có chứa cathechin, protocatechin, tinh dầu và một số
hợp chất vô cơ khác [2, 83]. Xuất phát từ những ứng dụng của Hồi hương trong nền
y học cổ truyền hiện nay, những nghiên cứu về thành phần hóa học của Hồi hương
chủ yếu tập trung vào tinh dầu hồi [2, 27, 88, 96]. Các nghiên cứu về dược lý của
tinh dầu hồi đã được thử nghiệm trên các chủng vi khuẩn Candida albicans,
Salmonella typhi, Staphylococcus aureus, Shigella flexneri, Bacillus mycoides [2].
Tinh dầu hồi đã được chứng minh có khả năng: ức chế quá trình hình thành ấu trúng
cũng như q trình nở trứng của nhiều lồi sâu bọ gây ảnh hưởng đến mùa màng
(Muskesh Kumar Chaubey, 2008); đối vận với histamine và acetylcholine, làm
14
Chng 1. T ng quan tài li u
NCD
LUẬN VĂN THẠC SĨ
giảm độ co thắt cơ trơn ruột [2]; ngăn ngừa ức chế và hình thành các chất sinh ung
thư gan (Amit Singh Yadar, 2007).
Bên cạnh loài Hồi hương (Illicium verum Hook.f) vốn có giá trị y - dược học
thì tại Việt Nam cịn tồn tại một số lồi khác thuộc họ hồi (Illiciaceae) thường được
gọi chung là hồi núi, như I. griffithii, I. majus, … (Phan Kế Lộc, 2003) vốn ít có giá
trị y dược học hơn, thậm chí một số lồi được xác định là có độc tố. Theo mơ tả của
Đỗ Huy Bích và cộng sự (2003), sự tương đồng về mặt hình thái của cây Hồi hương
với các lồi hồi núi là khá cao, chính là ngun nhân chính gây khó khăn trong việc
thu hái đúng dược liệu từ cây Hồi hương, thậm chí có thể dẫn đến việc dùng sai
dược liệu do thu hái nhầm.
1.3.1.3. Nghiên cứu về chi Morinda
Ba kích (Morinda officinalis How) là lồi cây nhiệt đới đặc hữu của Việt Nam.
Theo điều tra của Viện Dược Liệu (Bộ Y tế), cây Ba kích chỉ thấy phân bố ở một số
tỉnh trung du và miền núi thấp phía bắc, bao gồm Quảng Ninh, Lạng Sơn, Bắc
Giang, Thái Ngun, Phú Thọ, Hịa Bình và Hà Tây. Một vài địa phương khác cũng
phát hiện thấy nhưng khơng đáng kể. Ba kích thường được sử dụng phổ biến làm
thuốc bổ thần kinh, bổ gân cốt, chữa thấp khớp, giảm xơ cứng động mạch. Ba kích
có tác dụng tăng cường khả năng sinh lý đối với nam giới có hoạt động sinh dục yếu
[2]. Ba kích cịn được sử dụng để cải thiện sức khỏe, giúp ăn ngủ tốt hơn và giảm
đau mỏi khớp ở người cao tuổi.
Các nghiên cứu về mặt hóa học và dược lý học
Hợp chất được nghiên cứu nhiều nhất ở rễ cây Ba kích chính là nhóm hợp chất
anthraglucosid [2]. Bằng phương pháp nghiên cứu phổ huỳnh quang và UV, nhóm
nghiên cứu Yao H. và cs (2004) đã chứng minh hàm lượng của các anthraquinon có
mối liên quan với cấu trúc rễ của Ba kích: có mạch phloem phát triển và xylem nhỏ.
Theo tài liệu y học Trung Quốc, Ba kích có tác dụng chống lại các tác động bất lợi
của hydrocortisone đối với sự teo tuyến giáp, teo vỏ tuyến thượng thận [2]. Thêm
vào đó, Ba kích có thể được sử dụng chữa bệnh đau lưng, giảm vết thâm, đau mắt
và thậm chí cả đau răng, tác dụng tăng lực (theo nghiên cứu của Cui C. và cs
15
