Tuyển chọn nuôi cấy chủng aspergillus awamori sinh tổng hợp endo β 1, 4 glucanase và đánh giá tính chất lý hóa của endo β 1, 4 glucanase

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
---------------------------------

NGUYỄN VĂN TUÂN

TUYỂN CHỌN, NUÔI CẤY CHỦNG ASPERGILLUS AWAMORI
SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE VÀ ĐÁNH GIÁ
TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC

THÁI NGUYÊN- 2009

Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
---------------------------------

NGUYỄN VĂN TUÂN

TUYỂN CHỌN, NUÔI CẤY CHỦNG ASPERGILLUS AWAMORI
SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE VÀ ĐÁNH GIÁ
TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60. 42. 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS. Quyền Đình Thi
Thực hiện tại: Viện Công nghệ Sinh họcViện Khoa học và Công nghệ Việt Nam
THÁI NGUYÊN - 2009

Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




LỜI CẢM ƠN!
Trƣớc hết tôi xin gửi lời cảm Sâu sắc tới TS. Quyền Đình Thi, Trƣởng
phòng Công nghệ Sinh học Enzyme, Phó viện trƣởng Viện Công nghệ Sinh
học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã định hƣớng nghiên cứu,
hƣớng dẫn thí nghiệm, sửa luận văn và tạo mọi điều kiện về hoá chất cũng
nhƣ trang thiết bị nghiên cứu để tôi hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Phòng Công nghệ Sinh học
Enzyme, Viện Công nghệ Sinh học đã giúp đỡ tôi tận tình trong suốt quá trình
làm luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn Khoa Sinh học, Khoa Sau đại học, trƣờng
Đại học Sƣ phạm, Đại học Thái Nguyên cùng các thầy cô giáo đã nhiệt tình
giảng dạy và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khoá học.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Bộ môn Hoá- Sinh học, Ban chủ nhiệm
khoa Khoa học Cơ bản, Trƣờng đại học Nông Lâm, Đại học Thái Nguyên đã
tạo điều kiện cho tôi đi học.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn những ngƣời thân trong gia đình
và bạn bè đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian học tập.

Thái Nguyên tháng 9 năm 2009
Học viên

Nguyễn Văn Tuân

Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




CÁC CHỮ VIẾT TẮT
APS

Ammonium persulphate

BSA

Bovine serum albumin

CMC

Carboxyl methyl cellulose

cs

Cộng sự

DNA

Deoxyribonucleic acid

DEAE

Diethylaminoethyl

ĐC

Đối chứng

EDTA

Ethylene diamine tetraacetic acid

IU

International unit

kb

Kilo base

kDa

Kilo Dalton

LB

Luria and Bertani

M

Marker

Nxb

Nhà xuất bản

OD

Optical density

PCR

Polymerase chain reaction

rRNA

Ribosome ribonucleic acid

SDS-PAGE

Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis

TBE

Tris base-Boric acid-EDTA

TE

Tris-EDTA

v/v

Volume/volume

w/v

Weight/volume

Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3
1.1

KHÁI NIỆM VỀ CELLULASE VÀ ENDO-β-1,4-GLUCANASE ............ 3

1.2

NGUỒN GỐC VÀ PHÂN LOẠI ENDO-β-1,4-GLUCANASE .................. 4
1.2.1 Nguồn gốc ............................................................................................. 4
1.2.2 Phân loại................................................................................................ 6

1.3

CẤU TRÚC CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE .......................................... 7
1.3.1 Cấu trúc bậc một.................................................................................... 7
1.3.2 Cấu trúc không gian ............................................................................... 9
1.3.3 Cấu trúc của trung tâm xúc tác và vùng liên kết cơ chất......................... 9

1.4

CƠ CHẾ XÚC TÁC CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE ........................... 11

1.5

ỨNG DỤNG CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE ....................................... 12
1.5.1 Trong công nghiệp thực phẩm ............................................................. 12
1.5.2 Trong công nghiệp sản xuất thức ăn gia súc ......................................... 13
1.5.3 Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ...................................... 15
1.5.4 Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy ....................................... 15
1.5.5 Trong công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa .............................................. 16
1.5.6 Trong công nghệ xử lý rác thải sản xuất phân bón vi sinh .................... 16

1.6

ẢNH HƢỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN MÔI TRƢỜNG ĐẾN KHẢ NĂNG

SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE ....................................................... 17
1.7

TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE ...................... 20

1.8

MỘT SỐ NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN Ở VIỆT NAM ...................... 22

CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ........................................ 25
2.1

NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT ............................................................... 25
2.1.1 Chủng nấm .......................................................................................... 25
2.1.2 Thiết bị thí nghiệm .............................................................................. 25
2.1.3 Hóa chất .............................................................................................. 26
2.1.4 Môi trƣờng .......................................................................................... 26

Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




2.1.5 Dung dịch và đệm................................................................................ 27
2.2

PHƢƠNG PHÁP ........................................................................................... 28
2.2.1 Nuôi cấy vi sinh vật ............................................................................. 28
2.2.2 Xác định hoạt tính endoglucanase ........................................................ 28
2.2.3 Khảo sát ảnh hƣởng của một số yếu tố lên khả năng sinh tổng hợp
endoglucanase ................................................................................................ 30
2.2.4 Tinh sạch enzyme ................................................................................ 32
2.2.5 Điện di SDS-PAGE ............................................................................. 33
2.2.6 Xác định tính chất lý hóa của endoglucanase ....................................... 34
2.2.7 Xác định hàm lƣợng protein tổng số ..................................................... 35
2.2.8 Các phƣơng pháp sinh học phân tử ...................................................... 36
2.2.9 Xử lý số liệu ........................................................................................ 41

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 42
3.1

TUYỂN CHỌN VÀ PHÂN LOẠI CHỦNG ASPERGILLUS AWAMORI

SINH TỔNG HỢP ENDOGLUCANASE CAO ........................................................ 42
3.1.1 Tuyển chọn .......................................................................................... 42
3.1.2 Phân loại chủng nấm sợi dựa vào phân đoạn gene 28S rRNA .............. 43
3.2

TỐI ƢU CÁC ĐIỀU KIỆN SINH TỔNG HỢP ENDOGLUCANASE .... 45
3.2.1 Khả năng sinh tổng hợp endoglucanase theo thời gian ......................... 45
3.2.2 Nhiệt độ nuôi cấy ................................................................................ 47
3.2.3 Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất cảm ứng ............................................ 48
3.2.4 Ảnh hƣởng của nguồn carbon và nồng độ nguồn carbon ...................... 50
3.2.5 Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen và nồng độ nguồn nitrogen ................. 52
3.2.6 pH môi trƣờng nuôi cấy ban đầu .......................................................... 54

3.3

TINH SẠCH ENDOGLUCANASE ............................................................ 55
3.3.1 Tinh sạch qua cột sắc ký lọc gel sephadex G-100 ................................ 55
3.3.2 Tinh sạch qua cột sắc ký trao đổi ion DEAE ........................................ 56

3.4

NHỮNG TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENDOGLUCANASE ................. 57
3.4.1 Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất .......................................................... 57

Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




3.4.2 Nhiệt độ phản ứng tối ƣu ..................................................................... 58
3.4.3 pH phản ứng tối ƣu .............................................................................. 60
3.4.4 Độ bền nhiệt độ ................................................................................... 61
3.4.5 Độ bền pH ........................................................................................... 63
3.4.6 Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ ......................................................... 64
3.4.7 Ảnh hƣởng của ion kim loại................................................................. 65
3.4.8 Ảnh hƣởng của một số chất tẩy rửa...................................................... 67
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................. 69
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 71
PHỤ LỤC ............................................................................................................. 79

Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Các thiết bị chính đƣợc sử dụng trong thí nghiệm ................................. 25
Bảng 2.2. Danh sách hóa chất chính đƣợc sử dụng trong thí nghiệm ..................... 26
Bảng 2.3. Danh sách dung dịch và đệm sử dụng trong thí nghiệm ......................... 27
Bảng 2.4. Thành phần gel điện di biến tính protein ............................................... 33
Bảng 3.1. Hoạt tính endoglucanase của 26 chủng A. awamori ............................... 43
Bảng

3.2.

Trình

tự

nucleotide

đoạn

gene

28S

rRNA

chủng

A. awamori VTCC-F-099 ...................................................................................... 79
Bảng 3.3. Khả năng sinh tổng hợp endoglucanase theo thời gian .......................... 79
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy .......................................................... 80
Bảng 3.5. Ảnh hƣởng nồng độ cơ chất cảm ứng .................................................... 80
Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của nguồn carbon ................................................................ 50
Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của nồng độ lõi ngô ............................................................ 80
Bảng 3.8. Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen ............................................................. 52
Bảng 3.9. Ảnh hƣởng của nồng độ ammonium acetate .......................................... 81
Bảng 3.10. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng nuôi cấy ban đầu ................................ 81
Bảng 3.11. Hoạt tính endoglucanase các phân đoạn qua cột Sephadex G-100 ....... 81
Bảng 3.12. Hoạt tính endoglucanase các phân đoạn qua cột sắc ký DEAE ............ 82
Bảng

3.13.

Tóm

tắt

quá

trình

tinh

sạch

endoglucanase

từ

chủng

A. awamori VTCC-F-099 ...................................................................................... 57
Bảng 3.14. Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính endoglucanase ............. 82
Bảng 3.15. Ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng đến hoạt tính endoglucanase .......... 82
Bảng 3.16. Ảnh hƣởng của pH hỗn hợp phản ứng đến hoạt tính endoglucanase .... 83
Bảng 3.17. Độ bền nhiệt độ của endoglucanase ..................................................... 83
Bảng 3.18. Độ bền pH của endoglucanase ............................................................. 84
Bảng 3.19. Độ bền pH theo thời gian của endoglucanase ...................................... 85
Bảng 3.20. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ đến hoạt tính endoglucanase............ 86
Bảng 3.21. Ảnh hƣởng của ion kim loại ................................................................ 66
Bảng 3.22. Ảnh hƣởng của một số chất tẩy rửa đến hoạt tính endoglucanase ........ 86

Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Sơ đồ thủy phân liên kết -1,4-O-glucoside của cellulase ........................ 3
Hình 1.2. Trình tự amino acid tƣơng ứng với cấu trúc bậc 2 của Cel12A từ một số
chủng vi sinh vật .................................................................................................... 8
Hình 1.3. Mô hình cấu trúc không gian (A); Sơ đồ trung tâm xúc tác (B)
của Cel12A từ H. grisea ......................................................................................... 9
Hình 1.4. Cấu trúc vùng CBD của Cel12A từ Humicola grisea ............................. 10
Hình 1.5. Cơ chế thủy phân phân tử cellulose (A) và phức hệ cellulose (B) của các
enzyme thuộc phức hệ cellulase ............................................................................. 11
Hình 2.1. Đƣờng chuẩn nồng độ glucose............................................................... 30
Hình 2.2. Quy trình tinh sạch endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099 . 33
Hình 2.3. Đƣờng chuẩn Bradford dùng BSA làm chuẩn ........................................ 36
Hình 3.1. Hoạt tính endoglucanase của 26 chủng A. awamori nghiên cứu ............. 42
Hình 3.2. Điện di đồ DNA tổng số (A); Sản phẩm PCR (B): với khuôn DNA
tách chiết từ chủng A. awamori VTCC-F-099; Sản phẩm cắt vector tái tổ hợp bằng
XbaI và XhoI (C). ................................................................................................. 44
Hình 3.3. Cây phân loại chủng A. awamori VTCC-F-099 ..................................... 45
Hình 3.4. Khả năng sinh tổng hợp endoglucanase theo thời gian của chủng
A. awamori VTCC-F-099 ..................................................................................... 46
Hình 3.5. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp
endoglucanase của chủng A. awamori VTCC-F-099 ............................................. 48
Hình 3.6. Ảnh hƣởng của nồng độ CMC đến khả năng sinh tổng hợp endoglucanase
của chủng A. awamori VTCC-F-099 .................................................................... 49
Hình 3.7. Ảnh hƣởng của nồng độ lõi ngô đến khả năng sinh tổng hợp

endoglucanase của chủng A. awamori VTCC-F-099 ............................................. 51
Hình 3.8. Ảnh hƣởng của nồng độ ammonium acetate đến khả năng sinh tổng hợp
endoglucanase của chủng A. awamori VTCC-F-099.............................................. 53

Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Hình 3.9. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp
endoglucanase của chủng A. awamori VTCC-F-099 ............................................. 54
Hình 3.10. Điện di đồ trên gel polyacrylamide sản phẩm tinh sạch endoglucanase
từ chủng A. awamori VTCC-F-099 qua cột Sephadex G-100 ............................... 56
Hình 3.11. Điện di đồ sản phẩm tinh sạch endoglucanase trên gel
polyacrylamide....... ............................................................................................... 57
Hình 3.12. Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất lên hoạt tính endoglucanase từ chủng
A. awamori VTCC-F-099 ...................................................................................... 58
Hình 3.13. Ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng lên hoạt tính endoglucanase từ chủng
A. awamori VTCC-F-099 ...................................................................................... 60
Hình 3.14. Ảnh hƣởng của pH phản ứng lên hoạt tính endoglucanase từ chủng
A. awamori VTCC-F-099 ...................................................................................... 61
Hình 3.15. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên độ bền endoglucanase từ chủng
A. awamori VTCC-F-099 ...................................................................................... 62
Hình 3.16. Ảnh hƣởng của pH tới độ bền endoglucanase từ chủng
A. awamori VTCC-F-099 ...................................................................................... 63
Hình 3.17. Ảnh hƣởng của pH tới độ bền endoglucanase từ chủng
A. awamori VTCC-F-099 theo thời gian ................................................................ 64
Hình 3.18. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ lên hoạt tính endoglucanase từ chủng
A. awamori VTCC-F-099. ..................................................................................... 65
Hình 3.19. Ảnh hƣởng của chất tẩy rửa lên hoạt tính endoglucanase từ chủng

A. awamori VTCC-F-099. ..................................................................................... 68

Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




1

MỞ ĐẦU

Cellulose là một thành phần quan trọng cấu tạo nên lớp thành tế bào
thực vật. Đó là một loại polysaccharide có cấu trúc phức tạp. Việc phân hủy
cellulose bằng các tác nhân lý hóa gặp nhiều khó khăn, làm ảnh hƣởng đến
tốc độ của nhiều quá trình sản xuất công nghiệp.
Endo-β-1,4-glucanase (3.2.1.4) là một trong ba loại enzyme thuộc hệ
enzyme thủy phân cellulose (cellulase). Enzyme này tham gia phân cắt
ngẫu nhiên các liên kết β-1,4 glucoside từ bên trong các phân tử cellulose và
một số loại polysaccharide tƣơng tự khác tạo thành các oligosaccharide.
Endo-β-1,4-glucanase có thể đƣợc sản xuất bởi rất nhiều loại vi sinh vật
nhƣ vi khuẩn, nấm men, nấm mốc. Ngoài ra, endo-β-1,4-glucanase còn có ở
thực vật, động vật nguyên sinh và một số loài động vật không xƣơng sống
khác. Các enzyme có nguồn gốc khác nhau sẽ có cấu trúc khác nhau. Điều
này dẫn tới sự khác nhau về hoạt tính xúc tác và điều kiện phản ứng tối ƣu
của các enzyme.
Hiện nay, việc sử dụng các enzyme nhƣ endo-β-1,4-glucanase
trong một số ngành công nghiệp nhƣ: công nghiệp thực phẩm, công nghiệp
chế biến thức ăn gia súc, công nghiệp giấy, bột giặt, sản xuất dung môi hữu
cơ và xử lý môi trƣờng là rất quan trọng, mang lại nhiều giá trị to lớn.
Tuy nhiên, những enzyme và chế phẩm có liên quan đƣợc sử dụng

trong các ngành công nghiệp ở Việt Nam và một số nƣớc hiện nay chủ yếu
đƣợc nhập khẩu từ nƣớc ngoài với giá thành cao. Vì thế, việc nghiên cứu, sản
xuất ra các chế phẩm enzyme có nguồn gốc tự nhiên đang là một đòi hỏi cấp
thiết đối với nhiều quốc gia trên thế giới trong đó có Việt Nam. Nƣớc ta là
một nƣớc sản xuất nông nghiệp nên nguồn nguyên liệu dùng để sản xuất các
enzyme nhƣ endo-β-1,4-glucanase là rất phong phú. Xuất phát từ những lý do
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

1




trên và tình hình nghiên cứu tại Việt Nam, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề
tài: “Tuyển chọn, nuôi cấy chủng Aspergillus awamori sinh tổng hợp
endo-β-1,4-glucanase và đánh giá tính chất lý hóa của endo-β-1,4glucanase” với các mục tiêu: (1) Tuyển chọn các chủng Aspergillus awamori
sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase cao và tìm môi trƣờng nuôi cấy thích hợp
để tạo endo-β-1,4-glucanase ngoại bào, (2) Tinh sạch đƣợc endo-β-1,4glucanase và đánh giá một số tính chất lý hóa của nó.

Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

2




2

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 KHÁI NIỆM VỀ CELLULASE VÀ ENDO-β-1,4-GLUCANASE
Cellulase là nhóm enzyme thủy phân có khả năng cắt mối liên kết
-1,4-O-glucoside trong phân tử cellulose và một số cơ chất tƣơng tự khác.
Đó là một phức hệ gồm nhiều loại enzyme khác nhau và đƣợc xếp thành
3 nhóm cơ bản: endo-β-1,4-glucanase hay carboxymethyl cellulase (CMCase)
(EC 3.2.1.4), exo-β-1,4-glucanase hay cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) và
β-glucosidase hay β-D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21) [30], [39].
Mỗi loại enzyme tham gia thủy phân cơ chất theo một cơ chế nhất định và
nhờ có sự phối hợp hoạt động của các enzyme đó mà phân tử cơ chất đƣợc
thủy phân hoàn toàn tạo thành các sản phẩm đơn giản nhất.
Endo-β-1,4-glucanase là loại enzyme tham gia xúc tác phản ứng
thủy phân các liên kết β-1,4 glucoside ở bên trong các phân tử cellulose và
một số cơ chất tƣơng tự khác thành các sản phẩm đơn giản hơn (các
oligosaccharide).

Hình 1.1. Sơ đồ thủy phân liên kết -1,4-O-glucoside của cellulase

Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

3




2.2 NGUỒN GỐC VÀ PHÂN LOẠI ENDO-β-1,4-GLUCANASE
2.2.1 Nguồn gốc
Endo-β-1,4-glucanase có thể đƣợc tổng hợp từ rất nhiều nguồn khác
nhau trong tự nhiên, trong đó chủ yếu có nguồn gốc từ vi sinh vật. Trong
tự nhiên có rất nhiều chủng vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc và một số loại nấm
men có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase.

Nấm mốc là một trong những đối tƣợng vi sinh vật có khả năng
sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase mạnh nhất. Nhiều chủng nấm mốc thuộc
các chi Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Phanerochaete đã đƣợc
nghiên cứu là có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase mạnh nhƣ:
Aspergillus niger [25], [26], A. flavus, A. fumigatus [27] A. terreus [29]
Trichoderma reesei [53], Penicillium persicinum, P. brasilianum [33],
Penicillium sp. [10], Phanerochaete chrysosporium [34].
Bên cạnh nấm mốc, vi khuẩn cũng đƣợc xem là một trong những đối
tƣợng có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase khá phong phú. Nhiều
loài vi khuẩn hiếu khí đã đƣợc nghiên cứu là có khả năng sinh tổng hợp
endo-β-1,4-glucanase mạnh nhƣ Acidothemus cellulobuticus [22], Bacillus
pumilis [32], Cellulomonas flavigena, C. udai [20], [21], Pseudomonas
fluoressens [42]. Không chỉ có các vi khuẩn hiếu khí mà một số vi khuẩn
kỵ khí cũng có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase mạnh nhƣ
Clostridium [57].
Nhiều chủng xạ khuẩn thuộc chi Actinomyces, Streptomyces cũng có
khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase mạnh nhƣ: Actinomyces griseus
[13], Streptomyces reticuli [61].

Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

4




Ngoài ra, endo-β-1,4-glucanase còn đƣợc sinh tổng hợp ở thực vật
Arabidopsis [23], ở động vật nguyên sinh và một số động vật không xƣơng
sống khác nhƣ mối [62], ở động vật thân mềm nhƣ Mytilus edulis [63].
Trong số các nguồn sinh enzyme trên thì vi sinh vật đƣợc xem là nguồn

cung cấp enzyme với nhiều ƣu điểm nổi bật và có tính chất độc đáo vƣợt xa
so với enzyme có nguồn gốc từ động vật, thực vật. Vì thế, chúng đƣợc
sử dụng rộng rãi trong quá trình sản xuất các chế phẩm enzyme.
Trƣớc hết, vi sinh vật là nguồn nguyên liệu vô tận để sản xuất enzyme
với số lƣợng lớn. Đây cũng là nguồn nguyên liệu mà con ngƣời chủ động tạo
ra đƣợc. Chu kỳ sinh trƣởng của vi sinh vật ngắn (từ 16-100 giờ). Vi sinh vật
sinh trƣởng, phát triển với tốc độ cực kỳ nhanh chóng, khối lƣợng lại nhỏ,
kích thƣớc bé, nhƣng tỷ lệ enzyme trong tế bào tƣơng đối lớn nên quy trình
sản xuất chế phẩm enzyme khá dễ dàng, hiệu suất thu hồi cao. Hơn nữa,
enzyme từ vi sinh vật có hoạt tính rất mạnh, vƣợt xa các sinh vật khác. Đối
với một số trƣờng hợp có thể dùng 100% sinh khối vi sinh vật làm nguồn
enzyme.
Vi sinh vật rất nhạy cảm đối với tác động của môi trƣờng, thành phần
dinh dƣỡng nuôi chúng cũng nhƣ một số tác nhân lý hóa, cơ học khác. Do đó
có thể thay đổi những điều kiện nuôi cấy để chọn những chủng cho
hàm lƣợng enzyme đáng kể với hoạt tính xúc tác cao. Có thể nói rằng, với
vi sinh vật, ngƣời ta có thể điều khiển sự tổng hợp enzyme dễ dàng hơn trên
các đối tƣợng khác để tăng lƣợng enzyme đƣợc tổng hợp hoặc tổng hợp
định hƣớng enzyme. Tuy vậy, trong quá trình chọn nguồn nguyên liệu từ
vi sinh vật, cần lƣu ý một số vi sinh vật có khả năng sinh độc tố để có
biện pháp xử lý thích hợp.

Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

5




2.2.2 Phân loại

Theo Ủy ban danh pháp của Hiệp hội Hóa sinh và Sinh học phân tử
Quốc tế, cellulase thuộc lớp 3 (hydrolase): các enzyme xúc tác phản ứng
thủy phân, tổ 2 (glycosidase): thủy phân các liên kết glycoside, nhóm 1:
thủy phân liên kết O- và S-glycoside (International Union of Biochemistry
and Molecular Biology, 1992; pedro/CAZY/db.html).
Cellulase là một phức hệ gồm nhiều loại enzyme khác nhau. Tùy theo
quan điểm của từng tác giả mà các enzyme thuộc phức hệ cellulase đƣợc xếp
thành các nhóm khác nhau. Trƣớc đây, cellulase đƣợc chia làm hai nhóm:
nhóm enzyme C1 và nhóm enzyme Cx. Các enzyme C1 có khả năng thủy phân
sợi cellulose tự nhiên, có tính đặc hiệu không rõ ràng. Các enzyme Cx đƣợc
chia thành hai loại: exo -1,4-glucanase (3.2.1.21) xúc tác cho phản ứng cắt
đứt gốc glucose từ đầu không khử của chuỗi cellulose; endo -1,4-glucanase
(3.2.1.4) hoạt động tùy tiện hơn, xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết
bên trong phân tử cellulose [7].
Hiện nay, cellulase đƣợc chia làm ba dạng: dạng 1 là endoglucanase
hoặc

1,4--D-glucan-4-glucanohydrolase

hay

carboxylmethylcellulase

(CMCase) (EC 3.2.1.4), dạng 2 là exoglucanase bao gồm 1,4--D-glucan
glucanohydrolase

(còn

gọi

là

cellodextrinase)

(EC

3.2.1.74)

và

1,4--D-glucan cellobiohydrolase (cellobiohydrolase) (EC 3.2.1.91), dạng 3 là
-glucosidase hoặc -glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21). Endoglucanase
xúc tác cho phản ứng thủy phân các liên kết ở bên trong phân tử cellulose.
Exoglucanase thủy phân các liên kết ở đầu khử và đầu không khử của phân tử
cellulose. -glucosidase thủy phân các phân tử cellodextrin và cellobiose
thành glucose [30], [39], [45].

Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

6




Các cellulase có nguồn gốc khác nhau đƣợc sắp xếp thành các họ.
Trƣớc đây, dựa vào cấu trúc bậc một của phân tử protein enzyme, cellulase
đƣợc chia làm 6 họ: A, B, C, D, E và F [35]. Sau đó, cellulase đƣợc chia
thành 9 họ: A, B, C, D, E, F, G, H và I dựa vào cấu trúc của tâm xúc tác [31].
Hiện nay, các cellulase đƣợc sắp xếp trong 12 họ: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 44, 45,
48, 61 và 74 [45].

2.3 CẤU TRÚC CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE
2.3.1 Cấu trúc bậc một
Endoglucanase từ các nguồn gốc khác nhau có thành phần cấu tạo và
cấu trúc khác nhau. Sự khác nhau đó thể hiện trƣớc hết ở sự đa dạng về khối
lƣợng phân tử, thành phần và trật tự sắp xếp của các amino acid trên chuỗi
polypeptide. Chủng A. oryzae KBN616 có khả năng sinh tổng hợp hai loại
endoglucanase là Cel A và Cel B. Phân tử protein Cel A gồm 239 amino acid,
trọng lƣợng phân tử 31 kDa, đƣợc xếp vào họ cellulase H. Trong khi đó,
Cel B đƣợc xếp vào họ cellulase C với chiều dài 416 amino acid và
khối lƣợng phân tử 53 kDa [43]. Phân tử endoglucanase từ A. aculeatus
bao gồm 410 amino acid với khối lƣợng phân tử khoảng 43,7 kDa [59]. Các
endoglucanase từ chủng A. niger Z10 có khối lƣợng phân tử 83 kDa và
50 kDa [25], từ A. terreus là 25 kDa [29], từ Trichoderma reesei là 48 kDa và
55 kDa [40], [47], từ Bacillus sp. D04 có khối lƣợng 35 kDa [56].
Sandgren và cs (2003) đã có những nghiên cứu chi tiết về cấu trúc
Cel12A thuộc họ 12 (GH 12) endoglucanase từ nấm chịu nhiệt
Humicola grisea. Cel12A của H. grisea là một chuỗi polypeptide gồm 224
amino acid cấu tạo nên các chuỗi ,  và các vùng nối (Hình 1.2) [55].

Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

7




Hình 1.2. Trình tự amino acid tƣơng ứng với cấu trúc bậc 2 của
Cel12A từ một số chủng vi sinh vật [55].

Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

8




2.3.2 Cấu trúc không gian
Sự khác nhau về cấu trúc của các enzyme còn thể hiện ở sự sắp xếp
trong không gian các chuỗi polypeptide, các trung tâm xúc tác và các vùng
liên kết cơ chất. Chính nhờ sự khác nhau về cấu trúc không gian của
các protein enzyme dẫn tới sự khác nhau về các tính chất hóa lý của chúng.
Phân tử Cel12A của H. grisea cấu tạo bởi 1 chuỗi , 2 chuỗi  (A và
B). Chuỗi -A đƣợc cấu tạo bởi 6 dải xoắn  (A1-A6), chuỗi -B đƣợc cấu tạo
bởi 9 dải xoắn  (B1-B9). Các dải xoắn  đƣợc nối với nhau bởi các vùng nối,
có 4 vùng nối lớn 29-32, 40-47, 92-96, và 165-169 nối tƣơng ứng các
dải xoắn : B2-A2, A2-A3, A5-B5 và A6-B7 (Hình 1.3A) [55].
2.3.3 Cấu trúc của trung tâm xúc tác và vùng liên kết cơ chất
Trung tâm xúc tác của Cel12A từ H. grisea gồm 2 amino acid là
glutamic acid E-120 và E-205 (Hình 1.3B), còn ở Cel12A từ Trichoderma
reesei là E-116 và E-200 [55].

Hình 1.3. Mô hình cấu trúc không gian (A); Sơ đồ trung tâm xúc tác
(B) của Cel12A từ H. grisea [55]

Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

9

Vai trò liên kết cơ chất khi tham gia xúc tác thủy phân cellulose của các
cellulase đƣợc thực hiện nhờ các vùng liên kết đặc hiệu cellulose bind domain
(CBD). Các CBD có thể nằm trong trung tâm hoạt động của enzyme hoặc
không. Tùy thuộc vào từng loại enzyme mà vùng liên kết này có cấu tạo
hóa học và cấu trúc không gian khác nhau. Cel12A của H. grisea có 3 vùng
liên kết với sự tham gia của các amino acid, trong đó cystein (C175, C206,
C216) đóng vai trò trung tâm. CBD1 với C175 làm trung tâm nằm trên
dải xoắn -A6 liên kết yếu với các amino acid T85, I123, A144, F173, I177,
và F180 bằng tƣơng tác Van der Walls. Liên kết giữa các amino acid trong
CBD1 có kích thƣớc 3,5 đến 4,1 Å (Hình 1.4A). CBD2 với C206 làm
trung tâm nằm trên dải xoắn -B4 liên kết với các amino acid Q34, W52,
W54, S63, P65, Y91, A98 và T204. Liên kết giữa các amino acid trong CBD2
có kích thƣớc 3,3 đến 4,9 Å và CBD2 chứa trung tâm hoạt động (Glu 205)
(Hình 1.4B). CBD3 với C216 làm trung tâm nằm trên dải xoắn -A4 liên kết
với các amino acid W48, V87, W89, F214 và F219. Liên kết giữa các
amino acid trong CBD3 có kích thƣớc 3,3 đến 4,8 Å (Hình 1.4C) [55].

Hình 1.4. Cấu trúc vùng CBD của Cel12A từ Humicola grisea [55]

Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

10