THỰC HÀNH PHÂN TÍCH HÓA LÝ THỰC PHẦM

Báo cáo Thực Hành phân Tích Hóa Lý Hiện Đại

GVHD: Vũ Hoàng Yến

BÀI 1: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NITRIT, NITRAT TRONG MẪU RAU BẰNG
PHƯƠNG PHÁP UV - VIS
Nguyên tắc:

I.

Trong môi trường acid (pH = 2) nitrit sẽ bị diazo hoá acid sulphanilic, sau đó kết
hợp với alpha naphthylamin cho hợp chất naphathylamino azobenzen sulphonic có màu
đỏ không bền.
Nitrat trong nước, sản phẩm thịt và rau được cadimi khử thành nitrit. Đánh giá
nitrit trước và sau khi khử nitrat thành nitrit thì chúng ta có thể tính toán hàm lượng nitrat
bằng phép so sánh giữa nitrit trước và sau khi khử.
Quá trình tổng hợp này diễn ra theo 2 bước:
Bước 1: Sự tạo thành muối diazonium từ phản ứng giữa HNO 2 và muối của amin thơm
bậc nhất
Bước 2: Sự ghép cặp muối của diazonium là tác nhân than điện tử với hợp chất thơm có
tính than hạch tương đối cao như các amin,phenol để tạo hợp chất azo có màu
Đầu tiên nitrit phản ứng với axit sunfanilic tạo thành muối điazo:

Sau đó muối này phản ứng với α- naphtylamin tạo thành hợp chất azo có màu hồng.

NHÓM 1

1


Báo cáo Thực Hành phân Tích Hóa Lý Hiện Đại

GVHD: Vũ Hoàng Yến

Thiết bị, dụng cụ, hoá chất:ơ

II.

Thiết bị

Dụng cụ

Máy UV-Vis

Bình định mức 50ml, 100ml, 250ml, 1000ml

Cân phân tích có độ chính xác 0,1mg

Cốc thuỷ tinh 50ml, 100ml, 200ml

Máy xay hoặc đồng nhất

Ống đong 100ml

Máy lắc

Chai lọ đựng thuốc thử

Cân kĩ thuật
Bếp điện

Pipet 1ml, 2ml, 5ml, 10ml
Quả bóp cao su
Bình tia
Phễu thuỷ tinh
Giấy lọc

Hoá chất:


Dung dịch kali ferrocyanua trihydrat 10 % hòa tan 10,6g kali ferrocyanua trihydrat

vào nước,pha loãng tới 100ml với nước. (thuốc thử 1)
 Dung dịch kẽm acetat dihydrat 21,9 % : hòa tan 21,9g kẽm acetat dihydrat trong
nước,thêm 2ml acid acetic băng và pha loãng tới 100ml với nước (thuốc thử 2)
 Dung dịch dinatri tetraborat decahydrat 5 % : hòa tan 50 g dinatri tetraborat
decahydrat trong 1000ml nước (thuốc thử 3)

NHÓM 1

2


Báo cáo Thực Hành phân Tích Hóa Lý Hiện Đại



GVHD: Vũ Hoàng Yến

Dung dịch sulphanilamin 0,2%. Cách pha: hoà tan 2g sulphanilamin trong 800ml
nước nóng, lọc, thêm 100ml acid hydrochloric đặc, khuấy kỹ và pha loãng tới

1000ml với nước cất (thuốc thử 4).
 Dung dịch N-1 naphthylethylen diamin dihydrochlorua 0,1%. Cách pha: hoà tan
0,25g N-1 naphthylethylen diamin dihydrochlorua trong nước. Pha loãng tới
250ml với nước cất. Bảo quản trong lọ nâu nút kín và giữ trong tủ lạnh (thuốc thử


5).
Dung dịch acid HCL 18,9 %. Cách pha: pha loãng 445ml acid hydrochloric đặc

tới 1000ml với nước (thuốc thử 6)
 Dung dịch chuẩn gốc natri nitrit nồng độ 1000mg/l. Cách pha: hoà tan 1g natri
nitrit trong nước và pha loãng tới 1000ml (thuốc thử 7).
 Dung dịch làm việc natri nitrit nồng độ 50mg/l. Cách pha: pha loãng 5ml dung


dịch gốc tới 1000ml với nước (thuốc thử 8).
Dung dịch dihydrogen dinatri ethylene diamine tetra acetat dihydrat 1%. Cách
pha: hoà tan 20ml acid hydrochloric đặc với 500ml nước cất, thêm 10g
dihydrogen dinatri ethylene diamine tetra acetat dihydrat và 55ml dung dịch

aminiac đặc. Pha loãng tới 1000ml với nước. Chỉnh pH = 9,6 – 9,7 (thuốc thử 9).
 Cadimi kim loại (thuốc thử 10).
III. Cách tiến hành:
1. Chuẩn bị mẫu: Chiết nitrit và nitrat từ sản phẩm thịt
Lấy 200g mẫu đại diện của mẫu, đồng nhất mẫu bằng cách dùng dao xắt nhuyễn.
Cân chính xác khoảng 9g-10g mẫu đã đồng nhất vài bình tam giác và thấm ướt với 5ml
dung dịch thuốc thử borax (thuốc thử 3)cho vào cốc 200ml, thêm vào 150 ml nước cất
đun nóng (>70oC). Đun trong nồi cách thuỷ sôi khoảng 30 phút để chiết nitrit và nitrat
trong mẫu thịt. Để nguội, cho vào bình định mức 250ml và thêm tuần tự 2ml thuốc thử 1

sau đó 2ml thuốc thử 2 và lắc. Định mức tới vạch bằng nước cất. Để dung dịch trong 30
phút sau đó chắt cẩn thận lớp chất lỏng ở trên, lọc qua giấy lọc (không có nitrit và nitrat),
thu lấy dịch lọc trong.
2. Xây dựng đường chuẩn:

NHÓM 1

3


Báo cáo Thực Hành phân Tích Hóa Lý Hiện Đại

GVHD: Vũ Hoàng Yến

Hút lần lượt 0; 5; 10; 20 và 25ml dung dịch chuẩn gốc natri nitrit nồng độ 50mg/l
cho vào 5 bình định mức 100ml, các dung dịch này có nồng độ tương ứng là 0; 2,5; 5,0;
7,5 và 10mg/l natri nitrit, sử dụng dung dich này để xây dựng đường chuẩn như sau:
Hút 10ml mỗi dung dịch chuẩn cho vào các bình định mức 100ml tương ứng,thêm
khoảng 50ml nước cất, 10ml thuốc thử 4 và 6ml thuốc thử 6 vào mỗi bình.để dung dịch
này vào bóng tối trong 5 phút. Tiếp thêm 2ml thuốc thử 5 vào và trộn đều hỗn hợp, để
vào chỗ tối 3 phút. Pha loãng dung dịch tới vạch mức bằng nước cất nồng độ nitrit của
các dung dịch này sẽ là 0 ;0,25 ;0,5 ;0,75 ;1,0 ml/l trộn đều hỗn hợ và đo độ hấp thu ở
bước sóng 538nm.
3. Định lượng nitrit:

Hút 10ml dịch lọc từ mẫu thịt cho vào bình định mức 100ml. Thêm vào khoảng
50ml nước cất, , 10ml thuốc thử 4 và 6ml thuốc thử 6 vào mỗi bình. Để dung dịch này
trong chỗ tối 5 phút. Tiếp theo thêm 2ml thuốc thử 5 vào và lắc đều hỗn hợp, để vào chỗ
tối 3 phút. Sau 3 phút lấy ra và định mức tới vạch bằng nước cất, lắc đều hỗn hợp và đo
độ hấp thu ở bước sóng 538nm. Căn cứ vào đường chuẩn dung dịch đo được có nồng độ

Cx (mg/l).
4. Đối với mẫu để định lượng nitrat:

Hút 5ml thuốc thử 9 và khoảng 1g cadimi ướt cho vào bình định mức 100ml, cho
cadimi vào bình định mức bằng phễu nhỏ và sử dụng một lượng nhỏ nước cất tráng phễu.
Thêm 25ml dịch lọc, đậy nút và lắc đều trong 10 phút trên máy lắc. Pha loãng tới vạch
bằng nước cất, trộn thật kỹ hỗn hợp và để yên khoảng 10 phút cho cadimi lắng. Hút 20ml
của dung dịch này (đã xử lý với cadimi để khử nitrat thành nitrit) cho vào bình định mức
100ml và tạo màu như xác định nitrit ở trên.
IV.
KẾT QUẢ
1. Kết quả đo quang.
NHÓM 1

4


Báo cáo Thực Hành phân Tích Hóa Lý Hiện Đại

GVHD: Vũ Hoàng Yến

Bình định mức

1

2

3

4

5

Mẫu 1

Mẫu 2

C(ppm)

0

0.4

0.8

1.6

2.4

Cx1

Cx2

Abs

0

0.095

0.192

0.381

0.599

0.002

0.011

2. Vẽ phương trình hồi qui tuyến tính.

Từ kết quả Abs đã đo được vẽ phương trình hồi qui tuyến tính thể hiện mối tương
quan giữa nồng độ và độ hấp thu.

3. Tính kết quả:

Căn cứ vào độ hấp thu của dung dịch mẫu từ đường chuẩn, tính ra nồng độ nitrat
và nitrit trong mẫu. Ta có Abs của mẫu 1 là 0.002, mẫu 2 là 0.0007 và phương trình
đường chuẩn có dạng y = 0.2481x - 0.0047 với R 2 = 0.9990 từ đó ta có thể tính được
Cx1 ,Cx2 của mẫu bằng cách thế vào phương trình đường chuẩn:
<=> y = 0.2481x - 0.0047

NHÓM 1

5


Báo cáo Thực Hành phân Tích Hóa Lý Hiện Đại

GVHD: Vũ Hoàng Yến

<=>

0.002 = 0.2481x1 – 0.0047

=> Cx1 = 0.0270

<=>

0.011 = 0.2481x2 – 0.0047

=> Cx2 = 0.0633

Hàm lượng nitrit (mg/kg) trong mẫu tính theo công thức sau:
C1 (mg / kg ) =

C X 1 ×100 × 250 C1 × 2500
=
10 × m
m

<=> C1(mg/kg)

=

= 0.3375 (mg/kg)

Hàm lượng tổng nitrit (mg/kg) trong mẫu sau khi khử nitrat tính theo công thức sau:
C2 (mg / kg ) =

C X 2 × 100 × 100 × 250 C X 2 × 5000
=
25 × 20 × m
m

<=> C2(mg/kg) = = 1.5825 (mg/kg)
Hàm lượng nitrit trong mẫu = (tổng nitrit sau khi khử nitrat-nitrit trước khi khử nitrat).
=>Hàm lượng nitrit trong mẫu = 1.5825 – 0.3375 = 1.2450 (mg/kg)
Trong đó:
CX1: Nồng độ nitrit trong mẫu tính theo đường chuẩn (mg/l)
CX2: Nồng độ tổng nitrit trong mẫu sau khi khử nitrat tính theo đường chuẩn (mg/l)
m :khối lượng mẫu lấy phân tích
4. Nhận xét:

NHÓM 1

6


Báo cáo Thực Hành phân Tích Hóa Lý Hiện Đại

GVHD: Vũ Hoàng Yến

So với Thông tư 27/2012/BYT thì hàm lượng muối Nitrit và muối Nitrat không
vượt quá giới hạn quy định của thông tư là 168 mg/kg. . Hàm lượng nitrit trong mẫu
1.2450 (mg/kg) , Vậy hàm lượng nitrit trong mẫu đạt mức cho phép.
R2 của đường chuẩn đáng tin cậy (R2 = 0.9990)
Các kết quả có độ tin cậy không cao do quá trình chuẩn bị mẫu và đo độ hấp thu
có sai số.

NHÓM 1

7


Báo cáo Thực Hành phân Tích Hóa Lý Hiện Đại

GVHD: Vũ Hoàng Yến

BÀI 2: ĐỊNH LƯỢNG FE TRONG SỮA VÀ NƯỚC MẮM BẰNG PHƯƠNG
PHÁP UV-VIS.
I. Nguyên tắc:

Fe(II) trong dung dịch, kết hợp với 1,10-phenaltroline thành một phức chất màu
cam đỏ bền trong môi trường pH 3-9. Nếu muốn màu này không bị ảnh hưởng của thuốc
thử dư và có mặt của các ion khác, phản ứng cần tiến hành ở pH 3,5-4,5.
Phức chất này gồm 3 phân tử 1,10-phenaltroline kết hợp với 1 ion Fe(II). Phản
ứng đặc hiệu cho Fe(II) nên phải chuyển hết Fe(III) về Fe(II) bằng cách khử với
hydroquinone hay hydroxylamine clohydic.
2NH2OH + 4Fe3+

N2O + 4Fe2+ + 4H+ + H2O

II. Thiết bị, dụng cụ, hoá chất:

Thiết bị

Dụng cụ

Hóa chất

Máy UV-Vis

Bình định mức 50ml, 100ml,
250ml, 500ml, 1000ml

Dung dịch hydroxylamine clohydric 1%

Cân phân tích

Cốc thuỷ tinh 50ml, 100ml,200ml Dung dịch đệm pH 4,0

Cân kĩ thuật

Ống đong 100ml

Dung dịch 1,10-phenalthroline 0,1%

Bếp điện

Chai lọ đựng thuốc thử

Dung dịch HCl tinh khiết

Lò nung

Pipet 1ml, 2ml, 5ml, 10ml

Dung dịch HCl 20%

Chén nung

Quả bóp cao su

Giấy lọc
Dung dịch Fe2+ chuẩn

Bình tia
Phễu thuỷ tinh

NHÓM 1

Dung dịch hydroxylamine clohydric 1%

8


Báo cáo Thực Hành phân Tích Hóa Lý Hiện Đại

GVHD: Vũ Hoàng Yến

II.
Cách tiến hành.
1. Chuẩn bị mẫu:

Đồng nhất mẫu và cân chính xác 1g mẫu sữa cần phân tích, sau đó tiến hành vô cơ
hoá trên bếp điện đến khi than hoá đen, nung thành tro trắng ở nhiệt độ 500 oC trong
khoảng 2g giờ. Hoà tan tro bằng 5ml HCl tinh khiết , đun cách thuỷ tới khô ở nồi cách
thuỷ sôi. Làm lại lần thứ 2 như trên và thứ 3 hòa tan trong 5ml HCl 20%, Lọc trên giấy
lọc không tro. Rửa nhiều lần cặn, giấy lọc, chén nung và phễu bằng nước cất nóng để thu

được hết lượng mẫu. Dịch lọc và nước rửa cho tất cả vào bình định mức 100ml, thêm
nước cất đến khoảng 80-90ml. Điều chỉnh đến pH 3.5 -4.5 bằng CH 3COONa 2M rồi với
CH3COONa 0.2M. Sau đó cho them nước cất tới vạch và lắc đều.
2. Xây dựng đường chuẩn:

Dung dịch Fe chuẩn có nồng độ 1000ppm nên pha loãng xuống nồng độ 10ppm để
dễ dàng phân tích. Hút 1ml dung dịch Fe chuẩn 1000ppm cho vào bình định mức 100ml,
định mức tới vạch sau đó lắc đều, ta được dung dịch sắt chuẩn 10ppm để xây dựng
đường chuẩn. Hút lần lượt 0; 1; 2; 3 và 4ml dung dịch Fe chuẩn 10ppm vào các bình định
mức đã chuẩn bị sẵn. thêm vào mỗi bình 1ml hydroxylamine 10% và lắc đều, tiếp theo
thêm vào 5ml đệm pH 5, 1ml 1,10-phenontroline 0.1% vào từng bình, lắc nhẹ và để yên
trong 5 phút, sau đó dùng nước cất định mức tới vạch ta được nồng độ tương ứng mỗi
bình là 0; 0.2; 0.4; 0.6 và 0.8ppm. Mang các bình định mức đo độ hấp thu ở λ = 510nm.
KẾT QUẢ
1. Kết quả đo quang:
III.

Bình định mức

1

2

3

4

5

mẫu

Fe(II) 10ppm

0

1

2

3

4

0

NHÓM 1

9


Báo cáo Thực Hành phân Tích Hóa Lý Hiện Đại

Mẫu
Hydroxylamin
10%
Đệm pH 5

GVHD: Vũ Hoàng Yến

0

0

0

0

0

10

1

1

1

1

1

5

5

5

5

5

5

1

1

1

1

1

1

1 (lắc 1
phút)

1,10phenantroline
0,1%
Nước cất
C(ppm)

Lắc nhẹ, sau 5 phút dùng nước cất định mức tới vạch
0

10

20

30

40

Cx

0,325

0.002

Sau 15 phút đem đo ở λ = 510nm
Abs

0

0,077

0,164

0,245

2. Vẽ phương trình hồi qui tuyến tính:

Từ kết quả Abs đã đo được vẽ phương trình hồi qui tuyến tính thể hiện mối tương
quan giữa nồng độ và độ hấp thu.

NHÓM 1

10

Báo cáo Thực Hành phân Tích Hóa Lý Hiện Đại

GVHD: Vũ Hoàng Yến

3. Tính kết quả:

Căn cứ vào độ hấp thu của dung dịch mẫu từ đường chuẩn, tính ra nồng độ Fe(II).
Ta có Abs của mẫu là 0,002 và phương trình đường chuẩn có dạng với R 2 = 0.9997 từ đó
ta có thể tính được Cx của mẫu bằng cách thế vào phương trình đường chuẩn:
<=> y = 0.0082x – 0.0014
<=>

0.002 = 0.0082x – 0.0014

=> x = 0,4146

Hàm lượng Fe(II) trong mẫu tính theo công thức sau:
XFe (mg/100g) = Cx.10-3...

= 0,4146.10-3..

= 0.2073 (mg/100g)
Trong đó:
o
NHÓM 1

Cx : nồng độ của mẫu (ppm)
11

Báo cáo Thực Hành phân Tích Hóa Lý Hiện Đại

GVHD: Vũ Hoàng Yến

Vbđm : thể tích bình định mức (ml)
Vhút : thể tích mẫu hút (ml)
m : khối lượng mẫu dùng để phân tích (g)
4. Nhận xét:
o
o
o

R2 đáng tin cậy
Các kết quả có độ tin cậy không cao do quá trình chuẩn bị mẫu và đo độ hấp thu có sai
số.

BÀI 3:XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG Fe VÀ Mn BẰNG PHƯƠNG PHÁP ASS
A.GIỚI THIỆU
1. Phạm vi áp dụng

Phương pháp này được áp dụng để định lượng Cu, Fe trong thực phẩm bằng phương
pháp phổ hấp thu nguyên tử ngọn lửa.
2.

Nguyên tắc:
Mẫu thực phẩm sau khi được chiết các kim loại được định lượng kim loại trong

dung dịch bằng kỹ thuật quang phổ hấp thu nguyên tử ngọn lửa
3. Tài liệu tham khảo

AOAC Official Method 965.09 Nutrients (Minor) in Fertilizers, Atomic Absorption
Spectrophotometric Method.
NHÓM 1

12


Báo cáo Thực Hành phân Tích Hóa Lý Hiện Đại

GVHD: Vũ Hoàng Yến

AOAC Official Method 929.02 Preparation of Fertilizers Test Sample
B.

Thiết bị, dụng cụ.
1.Thiết bị:
-

Cân phân tích có độ chính xác 0,1mg

-

Tủ sấy có thể hiệu chỉnh được nhiệt độ

-

Bình định mức : 50,100ml

-

Pipet vạch

-

Pipet bầu

-

Dụng cụ thủy tinh các loại : Becher, Erlen...

: 0.1ml, 0.2ml, 5ml
: 1ml, 2ml, 5ml

µm
-

Giấy lọc

-

Rây thí nghiệm

-

Bình phản ứng

: 0.45

: 250ml

2. Hệ thống máy AAS
−

Máy AAS

−

Máy quang phổ hấp thu nguyên tử sử dụng ngọn lửa acetylene-không khí

C. Hoá chất:
-

Nước cất 1 lần, 2 lần

NHÓM 1

13


Báo cáo Thực Hành phân Tích Hóa Lý Hiện Đại

GVHD: Vũ Hoàng Yến

-

Acid nitric đậm đặc 65%

-

Acid clohidric đậm đặc 37%

-

Dung dịch acid nitric o,5 mol/l : pha 32ml acid nitric (C.2) bằng nước (C.1) định
mức lên 1 lít

D.

-

Chuẩn Mn, Fe 1000mg/l (Merk)

-

Dung dịch acid nitric 0,1N
Cách tiến hành:
Định lương mẫu thử: Đồng nhất mẫu, cân chính xác 1g sữa cần phân tích, sau đó

tiến hành vô cơ hoá trên bếp điện đến khi than hoá đen (không còn khói), nung thành tro
trắng ở nhiệt độ 500oC trong khoảng 2 giờ. Hoà tan tro bằng 5ml HCl tinh khiết, đun
cách thuỷ tới khô ở nồi cách thủy sôi. Làm lại lần thứ 2 như trên. Lần thứ 3 hòa tan trong
5ml HCl 20%,. Lọc trên giấy lọc, rửa nhiều lần cặn, giấy lọc, chén nung và phễu cũng
tráng bằng nước cất ấm để thu được hết lượng mẫu. Dịch lọc và nước rửa cho tất cả vào
bình định mức 100ml, thêm nước cất tới vạch và lắc đều.
Dung dịch chuẩn:
±

a.Dung dịch chuẩn gốc 1000 2mg/l, Merck
b. Dung dịch chuẩn thứ cấp

b.1.1 Dung dịch chuẩn Cu,Fe 100mg/l
Hút 10ml dung dịch chuẩn gốc 1000mg/l vào bình mức 100ml. Định mức đến vạch bằng
acid nitric 0.1N
Dung dịch chuẩn 10mg/l:
NHÓM 1

14


Báo cáo Thực Hành phân Tích Hóa Lý Hiện Đại

GVHD: Vũ Hoàng Yến

Hút 10ml dung dịch chuẩn gốc 100mg/l vào bình mức 100ml. Định mức đến vạch bằng
acid nitric 0.1N

µg / l
Dung dịch chuẩn 1000
Hút 10ml dung dịch chuẩn gốc 10mg/l vào bình mức 100ml. Định mức đến vạch bằng
acid nitric 0.1N
Dung dịch chuẩn 100

µg / l

:

µg / l
Hút 10ml dung dịch chuẩn gốc 1000
bằng acid nitric 0.1N

vào bình mức 100ml. Định mức đến vạch

b.1.2 dãy chuẩn làm việc của Fe

Bình định mức

1

2

3

4

5

C (ppm)

0

0.5

1

2

4

Abs

0

0.0496

0.1012

0.1878

0.3247

(50ml)

Mẫu

0.3976

Vẽ phương trình hồi qui tuyến tính:
Từ kết quả Abs đã đo được vẽ phương trình hồi qui tuyến tính thể hiện mối tương
quan giữa nồng độ và độ hấp thu.

NHÓM 1

15


Báo cáo Thực Hành phân Tích Hóa Lý Hiện Đại

GVHD: Vũ Hoàng Yến

2. Bảo quản

a. Tất cả các dung dịch chuẩn phải được bảo quản trong ống thủy tinh có nắp đậy kín

và đặt nơi thoáng mát,khô ráo,không có ánh sáng chiếu trực tiếp vào, nhiệt độ
không quá 300C
b. Thời gian sử dụng của dung dịch chuẩn gốc tùy thuộc vào nhà sản xuất
c. Dãu chuẩn làm việc pha và sử dụng trong ngày
d. Chuẩn thứ cấp chỉ pha lại khi xây dựng đường chuẩn mới.
3. Điều kiện phân tích

Theo thông số của máy
F. TÍNH KẾT QUẢ
Ta có phương trình y = 0,0805x + 0,0118 → x=( 0,3976 -0,0118)/0,0805 = 4,79 mg/l
NHÓM 1

16


Báo cáo Thực Hành phân Tích Hóa Lý Hiện Đại

GVHD: Vũ Hoàng Yến

Vậy nồng độ kim lại Fe tính từ đường chuẩn bằng 4,79 mg/l
Hàm lượng kim loại Fe trong mẫu





C ∗V
C ( mg / kg ) =  d / c dm ∗ f 



mm



Trong đó:
- C: Nồng độ kim loại Fe trong mẫu, tính theo mg/kg
- Cd/c: nồng độ kim lại M tính từ đường chuẩn mg/l
- m: khối lượng mẫu (g)
- Vm: thể tích mẫu phân tích (ml)
- f: hệ số pha loãng (nếu có)
Tính toán:
 4,79 × 50 
C ( mg / kg ) = 
× 1 = 239,5mg / kg
1



5.5

Nhận xét:

Hàm lượng Fe trong sữa bột là 239,5 mg/kg

Bài 4: PHƯƠNG PHÁP CHUẨN XÁC ĐỊNH ACID BENZOIC – AICD SORBIC
BẰNG KỸ THUẬT HPLC
NHÓM 1

17


Báo cáo Thực Hành phân Tích Hóa Lý Hiện Đại

GVHD: Vũ Hoàng Yến

Nguyên lý

I.

Aicd sorbic, acid benzoic được tách chiết ra khỏi thực phẩm bằng phương pháp
thủy phân với NaOH trước và sau đó tách chiết methanol. Hàm lượng acid sorbic, acid
benzoic được xác định bằng kỹ thuật sắc ký lỏng cao cấp (HPLC). Giới hạn phát hiện của
phương pháp với benzoic acid là 2mg/kg (2ppm) và acid sorbic là 6mg/kg (6ppm) ở bước
sóng λ = 230nm.
II.


-

Dụng cụ - Hóa chất – Thiết bị
Dụng cụ
Cốc có mỏ dung tích 50ml, 100ml, 250ml.
Bình định mức 10ml, 25ml, 50ml, 100ml.
Pipet 1ml, 10ml.
Giấy lọc.
Thiết bị
Cân phân tích.
Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): gồm bơm cao áp, bô bơm mẫu,

dectector UV.
- Cột sắc ký lỏng: C18(4,6mm x 150mm x 5µm).
 Hóa chất
Chất chuẩn



Acid benzoic tinh khiết 99% trở lên
Acid sorbic tinh khiết 99% trở lên

Pha dung dịch chuẩn ban đầu
Chuẩn bị dung dịch ban đầu 1mg/ml: Cân chính xác 0,1g của mỗi loại chuẩn trên
cho vào cốc có mỏ 50ml, hóa tan trong 2 – 3ml methanol cho đến khi tan hoàn toàn.
Chuyển vào bình định mức 100ml, tráng rửa cốc và thêm nước cất đến vạch định mức
(chỉ pha khi dùng).
Dung dịch chuẩn trong ngày
Cho lần lượt vào 5 bình định mức 100ml dung dịch chuẩn ban đầu như sau:
NHÓM 1

18


Báo cáo Thực Hành phân Tích Hóa Lý Hiện Đại

Bình 1

Bình 2

Bình 3

Định mức
50
50
50
(ml)
V(ml) ở
chuẩn 100
0.5
2
5
ppm
Nồng độ
CBenzoic(ppm
1
5
10
)
Peak area
2629.79053 1.31433e4 2.59936e4
(mAu)
Thuốc thử




GVHD: Vũ Hoàng Yến

Bình 4

Bình 5

Mẫu

50

50

50

10

15

20

50

5.498811e
4

1.02760e5

1.12898e4

Methanol dùng cho sắc ký lỏng (độ tinh khiết >99%)
Acid phosphoric: có chứa hàm lượng H3PO4 98%
Natri hydroxyd (NaOH): dùng loại tinh khiết phân tích có chứa hàm lượng kiềm
toàn phần không nhỏ hơn 97% tính theo NaOH và không được có quá 2%

Na2CO3.
 Dung dịch NaOH 1N
Hòa tan 45g NaOH trong 100ml nước lắc cho tan hoàn toàn. Đậy kín bình chứa
bằng nút cao su, để yên 1 ngày rồi gạn lấy dung dịch trong ở phía trên và pha loãng với
nước cất mới đun sôi để nguội đến vừa đủ 1 lít.


Dung dịch NaOH 0,1N
Hòa tan 4,5g NaOH trong 100ml nước lắc cho tan hoàn toàn. Đậy kín bình chứa

bằng nút cao su, để yên 1 ngày rồi gạn lấy dung dịch trong ở phía trên và pha loãng với
nước cất mới đun sôi để nguội đến vừa đủ 1 lít.


Acid sunfuric (H2SO4): tinh khiết phân tích có chứa hàm lượng H 2SO4 khoảng

96%
 Dung dịch H2SO4 10%:
Cho từ từ, cẩn thận và khuấy nhẹ 6ml acid sunfuric vào 50ml nước. Làm nguội định mức
nước vừa đủ 100ml.
NHÓM 1

19


Báo cáo Thực Hành phân Tích Hóa Lý Hiện Đại



GVHD: Vũ Hoàng Yến

Kali fericyanid K3Fe(CN)6

Sử dụng loại tinh khiết phân tích có chứa hàm lượng K3Fe(CN)6 từ 98% trở lên.


Pha dung dịch K3Fe(CN)6
Hòa tan 10,6g K3Fe(CN)6 trong 50ml nước lắc cho tan hoàn toàn, định mức nước

vừa đủ 100ml.


Pha dung dịch kẽm acetat (CH3COO)2Zn 1M
Hòa tan 21,9g (CH3COO)2Zn trong 50ml nước và 3,2ml acid acetic lắc cho tan

hoàn toàn. Định mức vừa đủ 100ml.


Dikali hydrophosphat K2HPO4: tinh khiết phân tích có chứa hàm lượng K2HPO4 từ

98% trở lên.
 Dung dịch Carreez I 10 -15%: cân 15g K 4(Fe(CN)6).3H2O, hòa tan bằng nước cất


và định mức 100ml.
Dung dịch Carreez II 30%: Cân 30g kẽm sunphat (ZnSO 4.7H2O), hòa tan bằng

nước cất và định mức 100ml.
 Pha dung dịch K2HPO4 dùng làm pha động:
Hòa tan 2,5g K2HPO4 trong 500ml nước cất mới đun sôi để nguội đến khi hóa tan

hoàn toàn, thêm nước cất đến khoảng 980ml, điều chỉnh pH = 6,7 bằng H 3PO4 , vừa đủ
bằng 1 lít nước cất, lọc qua giấy lọc 0,45µl.
III.

Các bước tiến hành

1. Chuẩn bị mẫu
 Đối với mẫu là thực phẩm dạng lỏng:

Hút chính xác 20-50 ml mẫu cho vào cốc có mỏ 250ml, thêm 2,5ml NaOH 1N thủy
phân cách thủy trong nước ở 70 0C trong 30 phút, làm nguội về nhiệt độ phòng và chuyển
vào bình định mức 100ml, trung hòa mẫu bằng H 2SO4 10% với chỉ thị phenolphthalein
NHÓM 1

20


Báo cáo Thực Hành phân Tích Hóa Lý Hiện Đại

GVHD: Vũ Hoàng Yến

đến khi mẫu mất màu hoàn toàn (pH của mẫu lúc này khoảng 8). Thêm 2 ml dung dịch
kali fericyanid, lắc, thêm 2ml dung dịch kẽm acetat để loại tạp. Dùng methanol tráng rửa
cốc cho vào bình định mức, lắc kỹ và làm vừa đủ 100ml bằng methanol. Lọc mẫu qua
giấy lọc thường, sau đó lọc qua giấy lọc 0,45µm để loại tạp trước khi bơm vào máy.
 Đối với mẫu là thực phẩm dạng rắn:

Cân chính xác 5-10g mẫu đã được đồng nhất và xay nhỏ cho vào cốc có mỏ 250ml,
thêm 25ml NaOH 0,1N, thủy phân cách thủy trong nước ở 70 0C trong vòng 30 phút, làm
nguội về nhiệt độ phòng và chuyển vào bình định mức 100ml, trung hòa mẫu bằng H 2SO4

10% với chỉ thị phenolphthalein đến khi mẫu mất màu hoàn toàn (pH của mẫu lúc này
khoảng 8). Thêm 2 ml dung dịch kali fericyanid, lắc, thêm 2ml dung dịch kẽm acetat để
loại tạp. Dùng methanol tráng rửa cốc cho vào bình định mức, lắc kỹ và làm vừa đủ
100ml bằng methanol. Lọc mẫu qua giấy lọc thường, sau đó lọc qua giấy lọc 0,45µm để
loại tạp trước khi bơm vào máy.
Xử lí mẫu kham khảo
-

Với mẫu dạng lỏng: hút chính xác 5-20 ml mẫu vào ống li tâm 50ml. Thêm 2ml
dung dịch Carreez I, 2ml đung dịch Carreez II và 2ml dung dịch (CH 3COO)2Zn
1M.

-

Sau đó tất cả đem lắc Vortex và định mức thành 50ml tiếp tục lắc Vortex, lọc mẫu
qua giấy lọc thường và lọc qua màng lọc 0,45µm trước khi bơm vào HPLC.

2. Điều kiện máy
-

Pha động: dung dịch dikali hydrophosphat: methanol (90:10)
Thời gian chạy: 10 phút
Thể tích bơm mẫu: 20µl
Chạy đẳng dòng
Tốc độ dòng: 1ml/phút
Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng

NHÓM 1

21

Báo cáo Thực Hành phân Tích Hóa Lý Hiện Đại

-

GVHD: Vũ Hoàng Yến

Detector: UV bước sóng λ = 230nm (với detector đặt được ở 2 bước sóng thì đặt
detector ở λ = 193nm cho xác định acid benzoic, λ = 254nm cho xác định acid
sorbic).

3. Tiến hành đo mẫu
Mẫu sau khi qua màng lọc 0.45 và dãy chuẩn

Bơm 20 vào máy sắc kí (HPLC)
Detecter UV (λ = 230nm)
Ghi độ hấp thụ

Chú ý Nếu mẫu phân tích cho chiều cao pic ở thời gian lưu khoảng 4 phút quá thấp nên
phân tích lại và đo ở λ = 193nm để xác định riêng acid benzoic.
Nếu mẫu phân tích cho chiều cao pic ở thời gian lưu khoảng 5 phút quá thấp nên phân
tích lại và đo ở λ = 254nm để xác định riêng acid benzoic.
Trong trường hợp này giới hạn xác định có thể tăng đến 10 lần.
Sơ đồ tóm tắt quy trình xét nghiệm

NHÓM 1

22

Báo cáo Thực Hành phân Tích Hóa Lý Hiện Đại

GVHD: Vũ Hoàng Yến

Cân mẫu
+ 25ml NaOH 0,1N (hoặc 2,5ml NaOH 1N)
Thủy phân 300C/30 phút
Nguội
Trung hòa đến Ph=8 bằng H2SO4 10%
+2ml dd K3Fe(CN)6 0,3M
Lắc kỹ

Lắc kỹ
Lọc, tráng rửa bằng MeOH
Định mức 50 ml bằng MeOH

Lọc (giấy lọc kích thước 0,45µm)
Bơm 25 vào HPLC

Kết quả

IV.

Xử lí kết quả.
Vẽ phương trình hồi qui tuyến tính:
Từ kết quả Abs và diện tích peak đã chạy mẫu được, vẽ phương trình hồi qui
tuyến tính thể hiện mối tương quan giữa nồng độ và diện tích peak.

NHÓM 1

23


Báo cáo Thực Hành phân Tích Hóa Lý Hiện Đại

GVHD: Vũ Hoàng Yến

Từ biểu đồ trên ta có phương trình hồi quy tuyến tính:
y = 2026.4x +5049.4(1)
R2 =0.9806
 R2 của mẫu khá cao => kết quả đáng tin cậy
 Mối quan hệ giữa nông độ và diện tích peak phụ thuộc vào nhau (tỉ lệ thuận với

nhau).
Thế mẫu = 1.12898= y vào (1)
 x = 3.0795(ppm)
Do mẫu ở dạng lỏng nên ta có hàm lượng acid benzoic (mg/lit)
C(mg/l)=Cx = Cx
=3.0795
Trong đó
Cx số acid benzoic trong 1 ml dung dịch chiết
R là hệ số thu hồi sau dịch chiết Cx
n là độ pha loãng
 X, tính bằng miligam trên kilogam (mg/kg), được tính dựa vào đường hồi quy
tuyến tính theo công thức sau:
X = Ci ×

V
×K

m

=3.0795=1.833 (mg/Kg)

Trong đó,
X : hàm lượng chất “i” trong mẫu phân tích (mg/kg) của acid benzoic.
C : Nồng độ chất “i” tính từ đường chuẩn
V :Thể tích dung dịch trước khi bơm vào HPLC.(ml)
m: trọng lượng mẫu phân tích(g)
K: hệ số pha loãng
Tuy nhiên trong quá trình phân tích có xảy ra sai xót dẫn đến việc sai lệch kết quả như:

NHÓM 1

24


Báo cáo Thực Hành phân Tích Hóa Lý Hiện Đại

GVHD: Vũ Hoàng Yến

 Mẫu phân tích sau khi xử lí để qua 1 thời gian quá lâu, dẫn đến kết quả chạy máy

HPLC thiếu chính xác.
 Thao tác sinh viên thực hiện chưa chuẩn xác.
 Sai số do thiết bị dụng cụ, thiết bị.
 Ảnh hưởng môi trường, hóa chất sử dụng.

BÀI 5: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CAFEIN TRONG THỰC PHẨM
5.1. Phạm vi ứng dụng

Tiêu chuẩn này qui định phương pháp xác định hàm lượng cafein trong cà phê
bột, cà phê hòa tan, cà phê nguyên liệu bằng phương pháp sắc ký lỏng kết nối với đầu dò
UV.
5.2. Tài liệu tham khảo
Phương pháp này được xây dựng trên dựa theo TCVN 6603:2000.
Giới thiệu sơ lược:
- Công thức phân tử: C8H10N4O2
- Khối lượng phân tử: 194,19
- Công thức cấu tạo:

5.3. Nguyên tắc
Cafein trong mẫu sau khi chiết bằng nước nóng sẽ được pha loãng và định lượng
bằng hệ thống HPLC với đầu dò UV ở bước sóng 272nm.
5.4. Thiết bị - dụng cụ - hóa chất
NHÓM 1

25