Câu hỏi và trả lời thực hành vi sinh

SALMONELLA
Câu 2: Tại sao phải tiến hành tăng sinh? Vai trò của môi trường tăng sinh BPW?
Đây là khâu quan trọng không thể thiếu trong quy trình kiểm nghiệm đối
với mẫu kiểm nghiệm không phải là mẫu bệnh phẩm. Người ta thường sử dụng
môi trường tiền tăng sinh không chọn lọc, giàu dinh dưỡng, không chứa các chất
ức chế đặc hiệu tạo điều kiện cho sự phục hồi sức sống và tăng trưởng của nhiều
vi sinh vật hiện diện trong mẫu đã bị tổn thương trong quá trình chế biến và bảo
quản thực phẩm. Nước peptone đệm Buffered Peptone Water (BPW) là môi
trường tiền tăng sinh được khuyến khích sử dụng trong môi trường kiểm tra nhiều
loại vi sinh vật gây bệnh thuộc họ Enterobacteriaceae. Tùy theo đặc tính thành
phần hóa học của mẫu cần chọn quy trình tiền tăng sinh phù hợp. Thông thường tỉ
lệ giữa mẫu và môi trường tiền tăng sinh là 1:9, tuy nhiên tùy trường hợp cụ thể tỉ
lệ này có thể thay đổi.
Môi trường tăng sinh BPW là môi trường tiền tăng sinh không chọn lọc để
phân lập Salmonella từ mẫu thực phẩm. Đặc biệt khi số lượng Salmonella hiện
diện trong mẫu ít, hoặc bị tổn thương, thì môi trường này gíup chúng tăng lên và
phục hồi trước khi mang đi cấy phân lập chọn lọc.
Câu 3: Môi trường tăng sinh chọn lọc dùng trong phân tích salmonella là gì?
Selenite broth base (lactose)
Sodium biselenite (sodium hydrogen selenite)
Rappaport vassiliadis (RV)
Selenite cystein broth
Tetrathionate mueler Kauffmann broth (TT)
Câu 4: Vai trò của môi trường tăng sinh chọn lọc? Tại sao lại chọn 2 môi trường
tăng sinh chọn lọc?
Giai đoạn này làm tăng mật độ Salmonella so với các vi sinh vật khác bằng
cách ức chế hoặc ngăn chặn sự sinh trưởng của một số nhóm vi sinh vật khác, tạo
thuận lợi cho việc phát hiện vi khuẩn này trong bước phân lập.
Mỗi loại môi trường chỉ có tác dụng chọn lọc trên một đặc điểm phát triển
của Salmonella, một số dòng Salmonella tăng trưởng được trong môi trường này
nhưng lại không tăng trưởng được trong môi trường khác.

Do vậy, để tăng khả năng phát hiện tất cả các dòng Salmonella hiện diện
trong mẫu thực phẩm cần phải dùng ít nhất hai loại môi trường tăng sinh chọn lọc
khác nhau cho cùng một mẫu.
Câu 5: Tại sao lại phải dùng 2 môi trường phân lập? Khuẩn lạc Salmonella cho
màu gì trên từng môi trường?


Đây là bước tách biệt Salmonella trong canh khuẩn ra khỏi quần thể của
chúng. Cường độ chọn lọc và mức độ phân biệt thể hiện ở hình thái khuẩn lạc của
Salmonella trên từng môi trường cũng khác nhau
Trên môi trường XLD: khuẩn lạc màu hồng tròn, trong suốt, có hay không
có tâm đen. Một số dòng Salmonella có khả năng sinh H 2S, trừ S.typhi thì khuẩn
lạc trong suốt và không có tâm đen.
Trên môi trường HE: khuẩn lạc Salmonella có màu xanh dương đến màu
xanh lục, có hay không có tâm đen. Một số loài Salmonella có thể phát triển thành
khuẩn lạc có các chấm màu đen bóng, lớn hay phần lớn các khuẩn lạc hoàn toàn
có màu đen. Một cách điển hình, có một số ít loại là Salmonella sinh ra khuẩn lạc
có màu vàng có hoặc không có tâm đen
Cũng như bước tăng sinh chọn lọc việc sử dụng 2 hay nhiều môi trường
phân lập sẽ cho phép gia tăng sự phát hiện số lượng các kiểu huyết thanh khác
nhau trong mẫu, trong đó môi trường XLD được khuyến khích sử dụng.
Câu 6: Tại sao lại có bước khẳng định TSA rồi mới có bước phản ứng sinh hóa và
kháng huyết thanh? Nếu không có bước khẳng định có được không? Tại sao?
Qua các bước tiền tăng sinh, tăng sinh chọn lọc và phân lập thì tế bào
Salmonella bị già và suy thoái, vì vậy cần phải phục hồi chúng bằng một trong các
môi trường như Tryticase Soya Agar (TSA) hay Brain Heart Infusion (BHI) để
nhân sinh khối và được dùng tiếp cho các phản ứng sinh hóa và phản ứng ngưng
kết kháng huyết thanh về sau.
Nhằm xác định lại các khuẩn lạc đặc trưng của Salmonella xuất hiện trong
môi trường phân lập.

Câu 7: Trình bày các phản ứng sinh hóa dùng trong phân tích salmonella: tên môi
trường, hóa chất, kết quả, giải thích kết quả?
 Thử nghiệm sinh H2S ( KIA/TSI)
Môi trường KIA, môi trường TSI được sử dụng để kết hợp thử nghiệm
đồng thời khả năng sử dụng các nguồn carbon khác nhau (glucose, lactose)
và khả năng sinh H2S của chủng vi sinh vật.
Kết quả: thử nghiệm sinh H2S: thử nghiêm là (+) nếu xuất hiện tủa màu nâu
đen bên trong môi trường, là (-) nếu không xuất hiện tủa màu nâu đen
 Thử nghiệm LDC (+): sau khi nuôi cấy môi trường chuyển thành
kiềm, màu môi trường được chuyển thành màu như ban đầu (màu
tím hay xanh)
 Thử nghiệm urea
Môi trường urea lỏng rustigian – stuart’s urea broth


Môi trường rắn Christensen urea
Kết quả: Salmonella không phân giải urea nên không làm thay đổi pH của
môi trường, sau khi nuôi cấy môi trường vẫn giữ nguyên màu vàng cam
 Lên men mannitol, sorbitol (+)
Môi trường mannitol (phenol red broth base)
Môi trường sorbitol (phenol red broth base)
Kết quả: môi trường sau nuôi cấy bị acid hóa và chuyển thành màu vàng
Câu 8: Nếu dùng phản ứng sinh hóa không dùng kháng huyết thanh OMA, OMB
có được không? Tại sao?
Salmonella có 3 loại kháng nguyên: kháng nguyên O bền với nhiệt, được
dùng để chia thành nhóm, kháng nguyên H không bền với nhiệt dùng để định loại,
kháng nguyên vi không bền với nhiệt thường che lấp ngăn chặn phản ứng kháng
nguyên O. Từ những mẫu phân lập dương tính Salmonella, tiến hành định
serotype để xác định những nhóm nào thường hiện diện trong các loại nhóm thực
phẩm cũng như cung cấp thêm những thông tin đánh giá về tình hình vệ sinh do

những nhóm vi khuẩn Salmonella nào nhiễm nhiều nhất từ đó có ý nghĩa trong
vấn để vệ sinh an toàn thực phẩm.
Trước hết ta dùng kháng huyết thanh ngưng kết đa giá (Polyvalent O
antiserum), loại này chứa tất cả kháng thể O của Salmonella từ A đến F, ngưng kết
nhanh, hoàn toàn hầu hết vi khuẩn thuộc giống Salmonella. Nếu dương tính, sau
đó tiếp tục làm phản ứng gốc vi khuẩn đó với huyết thanh ngưng kết nhóm từ A
đến F, sự ngưng kết này sẽ xảy ra nhanh và hoàn toàn nếu huyết thanh ngưng kết
và gốc vi khuẩn cùng nhóm.
Nếu làm phản ứng với huyết thanh ngưng kết đa giá vô nghiệm ta phải thực
hiện phản ứng với huyết thanh ngưng kết Vi. Trường hợp kết quả phản ứng dương
tính với huyết thanh ngưng kết Vi, chứng tỏ gốc vi khuẩn có kháng nguyên Vi che
lấp phản ứng của kháng nguyên O với kháng thể O, do đó ta phải đun nóng cách
thủy huyền trọc vi khuẩn ở nhiệt độ 100 0C trong 30 phút để loại bỏ kháng nguyên
Vi khỏi bề mặt tế bào. Sau khi để nguội, làm phản ứng với huyết thanh ngưng kết
đa giá và huyết thanh ngưng kết nhóm C và D. Nếu kết quả âm tính với cả hai loại
huyết thanh ngưng kết đa giá và Vi, gốc vi khuẩn không phải là Salmonella.

TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ
Câu 1: Tại sao môi trường nuôi cấy tổng vi khuẩn hiếu khí được coi là môi trường
dinh dưỡng?


Vì môi trường nuôi cấy tổng vi khuẩn hiếu khí là một hỗn hợp các chất
dinh dưỡng, chất khoáng đa lượng và vi lượng, đôi khi bổ sung thêm một số dung
dịch đệm…cần thiết để cho vi khuẩn hiếu khí tồn tại và phát triển một cách thuận
lợi nhất, góp phần cho quá trình phân tích mẫu được chính xác hơn
Câu 2: Kể tên một số thương hiệu môi trường nuôi cấy vi sinh vật mà em biết?
Chromagar
Oxoid
Câu 3: Tại sao lại phải pha loãng mẫu?

Vì trong mẫu thực phẩm có rất nhiều nấm men, nấm mốc mà ta sẽ không
đếm được. Vì vậy pha loãng mẫu mẩu để giảm nồng độ xuống sẽ làm cho số vi
khuẩn hiện diện trong mẫu giảm bớt đi thì chúng ta có thể dễ dàng đếm được số vi
khuẩn có trong đĩa. Tuy nhiên nếu pha loãng mẫu ở nồng độ quá cao sẽ dẫn đến
làm cho kết quả sai số nhiều.
Câu 4: Phân tích tổng vi khuẩn hiếu khí bằng kỹ thuật gì?
Phân tích bằng kỹ thuật hộp đổ.
Câu 5: Tại sao lại dùng môi trường SPW để pha loãng mẫu?
Vì SPW là môi trường dinh dưỡng tốt để khuẩn lạc phát triển. Pepton là
chất dinh dưỡng để cho vi khuẩn phát triển tốt, nước muối là để tạo áp suất thẩm
thấu. Nếu cho nhiều pepton thì nó sẽ tiến hành tăng sinh làm cho vi khuẩn phát
triển nhiều.
Câu 6: Tại sao khi ủ mẫu lại phải úp ngược đĩa?
Đĩa được đặt ngửa để tạo độ ẩm thích hợp cho sự phát triển của nấm men
nấm mốc và hạn chế làm khô thạch, trách cho nước từ bên ngoài nhiễm vào trong
đĩa. Vì vậy cần được giữ ở điều kiện nhiệt độ và độ ẩm thấp để đảm bảo môi
trường phát triển tốt, tạo điều kiện nuôi cấy men mốc và nhận diện chính sát số
lượng men mốc.

TỔNG SỐ NẤM MEN NẤM MỐC
Câu 1: Em cho biết ngoài môi trường DRBC, các môi trường nào khác được sử
dụng để nuôi cấy tổng số nấm men, nấm mốc?
Môi trường thạch dichloran glycerol agar (DG18)
Môi trường thạch malt extract agar (MEA)
Môi trường thạch potato dextrose agar (PDA)
Môi trường thạch sabouraud dextrose agar (SDA)
Môi trường canh sabouraud dextrose broth (SDB)
Câu 2: Tại sao đa số các vi khuẩn không mọc được trong môi trường nuôi cấy
DRBC?

DRBC là một môi trường biến đổi của môi trường Rose-Bengal
Chloramphenicol Medium3, nó khác biệt ở chỗ: pH thấp xuống 5.6, công thức môi
trường Rose-Bengal giảm xuống 50% và Dicloran được thêm vào.
Ảnh hưởng của việc thay đổi này chính là ức chế sự phát triển mạnh hơn
của vi khuẩn, ức chế sự lan toả của các loài nấm mốc như Rhizopus và Mucor
đồng thời có khả năng hỗ trợ sự phát triển của các loài không được chọn lọc khi sử
dụng môi trường Rose-Bengal Chloramphenicol Agar hay acidified Potato
Dextrose Agar1.
Sự ức chế của việc lan rộng các loài nấm mốc và hạn chế kích cở các khuẩn
lạc là kết quả của việc cải tiến sự tăng sinh và phát triển của các loài nấm mốc
mycotoxigenic và những loài khác gây hư hỏng thực phẩm.
Câu 3: Tại sao lại phải pha loãng mẫu?
Vì trong mẫu thực phẩm có rất nhiều nấm men, nấm mốc mà ta sẽ không
đếm được. Vì vậy pha loãng mẫu mẩu để giảm nồng độ xuống sẽ làm cho số vi
khuẩn hiện diện trong mẫu giảm bớt đi thì chúng ta có thể dễ dàng đếm được số vi
khuẩn có trong đĩa. Tuy nhiên nếu pha loãng mẫu ở nồng độ quá cao sẽ dẫn đến
làm cho kết quả sai số nhiều.
Câu 4: Phân tích nấm men, nấm mốc bằng kỹ thuật gì? Vì sao?
Phân tích bằng kỹ thuật hộp trải.
Câu 5: Tại sao lại dùng môi trường SPW để pha loãng mẫu?
Vì SPW là môi trường dinh dưỡng tốt để khuẩn lạc phát triển. Pepton là
chất dinh dưỡng để cho vi khuẩn phát triển tốt, nước muối là để tạo áp suất thẩm
thấu. Nếu cho nhiều pepton thì nó sẽ tiến hành tăng sinh làm cho vi khuẩn phát
triển nhiều.
Câu 6: Môi trường DRBC gồm những thành phần nào? Thành phần nào làm cho
khuẩn lạc phát triển?
Thành phần:
Enzymatic Digest of Animal Tissue......................................................5g
Glucose...................................................................................................10g

Monopotassium Phosphate....................................................................1g
Magnesium Phosphate...........................................................................0.5g
Rose Bengal...........................................................................................0.025g
Dichloran................................................................................................0.002g
Chloramphenicol....................................................................................0.1g
Agar........................................................................................................15g


pH cuối: 5.6 ± 0.2 ở 25oC
Vai trò các thành phần trong môi trường:
Peptone cung cấp Nitơ, Cacbon và vitamin cho sự phát triển của vi sinh vật.
Glucose là nguồn năng lượng
Monopotassium Phosphate là chất đệm
Magnesium Sulfate là nguồn của cation hóa trị II và sulfate
Dichloran là chất kháng nấm được thêm vào để hạn chế sự lan rộng của nấm.
Nồng độ pH trung bình giảm từ 7.2 tới 5.6 nhằm hạn chế sự lan rộng của nấm.
Rose Bengal ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn và hạn chế kích cỡ,sự lan nhanh
của khóm mốc.Rose Bengal được hút bởi khóm men và mốc,khiến cho men, mốc
dễ được nhận diện và đếm.
Chloramphenical dùng để ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn hiện diện trong
môi trường và mẫu thực phẩm, hạn chế sự lan rộng, phát triển quá nhanh của nấm.
Agar là thành phần củng cố.
Câu 7: Tại sao khi ủ mẫu lại phải úp ngược đĩa?
Đĩa được đặt ngửa để tạo độ ẩm thích hợp cho sự phát triển của nấm men
nấm mốc và hạn chế làm khô thạch, trách cho nước từ bên ngoài nhiễm vào trong
đĩa. Vì vậy cần được giữ ở điều kiện nhiệt độ và độ ẩm thấp để đảm bảo môi
trường phát triển tốt, tạo điều kiện nuôi cấy men mốc và nhận diện chính sát số
lượng men mốc.

STAPHYLOCOCCUS

1. Hình thái khuẩn lạc đặc trưng của Staphylococcus aureus trên môi trường
BPA:
Thành phần môi trường BPA có lithium chloride và tellurite có tác dụng ức chế
các quần thể vi khuẩn thường hiện diện cùng Staphylococcus, trong khi đó
pyruvate va glycine kích thích sự phát triển của Staphylococcus. Khuẩn lạc
Staphylococcus có 2 đặc diểm: Khuẩn lạc có màu đen do khử telurite thành
telurium, dạng lồi và tạo vòng trong xung quanh khuẩn lạc, đường kính từ 2 –
5mm do sự thủy phân protein. Sau đó có thể xuất hiện 1 vòng đục ở trong vòng
trong (có tác động lecithinase, 1 loại lipase). Đây là 1 đặc tính thường thấy và có
thình chuyên biệt ở các tụ cầu khuẩn gây bệnh.


2. Tại sao Staphylococcus aureus có khả năng đông tụ huyết tương thỏ ?
Coagulase là enzym được tạo bởi Staphylococcus aureus, là enzym liên quan
đến khả năng bền nhiệt, có thể bền đến 60 0C trong 30 phút. Enzym này là 1
protein tự nhiên, được Staphylococcus aureus tiết ra ngoài tế bào, dễ bị bất hoạt
bởi các protease. Coagulase đóng vai trò đông tụ huyết tương, chúng kết hợp với
các cấu tử trong huyết tương thành từng khối hay từng cục. Ứng dụng nguyên tắc
này người ta sử dụng huyết tương thỏ để tiến hành phản ứng định lượng
Staphylococcus aureus.
Huyết tương Coagulase Fibsin
Cos 2 phương pháp để thực hiện thí ngiệm Coagulase là thực hiện trên lam
kính hoặc trong ống nghiệm.
3. Tại sao phải phân tích Staphylococcus aureus trong thực phẩm ?
Tại vì Staphylococcus aureus phân bố khắp nơi, có thể nhiễm vào thực phẩm
qua những công đoạn tiếp xúc với người thao tác trong quá trình chế biến thực
phẩm.
-

Staphylococcus aureus sản sinh 1 loại độc tố đường ruột enterotoxin bền

-

nhiệt, k bị phân hủy ở 1000C.
Khi ăn phải thực phẩm có chứa độc tố này (enterotoxin), sau 4 – 6 giờ người bị
ngộ độc có dấu hiệu tiêu chảy, nôn mửa kéo dài 6 – 8 giờ.