Nghiên cứu định lượng paraquat trong mẫu huyết tương người bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (tóm tắt)

ĐẶT VẤN ĐỀ
Paraquat (viết tắt của paraquaternary bipyridyl) là một
thuốc diệt cỏ hiện đang được sử dụng rộng rãi ở Việt Nam. Tuy
nhiên, paraquat (PQ) lại là một chất hóa học vô cùng độc với
người. Tại Trung tâm Chống độc bệnh viện Bạch Mai, trong
những năm gần đây, số lượng bệnh nhân ngộ độc PQ không
ngừng gia tăng và trở thành một vấn nạn vô cùng nghiêm trọng. Tỉ
lệ tử vong do ngộ độc PQ rất cao, thường khoảng 70-80%.
Trong chẩn đoán và điều trị ngộ độc cấp PQ, xét nghiệm
định lượng PQ trong huyết tương đóng vai trò đặc biệt quan
trọng, giúp xác định mức độ nặng của ngộ độc, tiên lượng bệnh
nhân cũng như đánh giá hiệu quả của các biện pháp điều trị,
đặc biệt là lọc máu hấp phụ. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên
cứu đề tài “Nghiên cứu định lượng Paraquat trong mẫu
huyết tương người bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu
năng cao” với hai mục tiêu:
1.

Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết tách Paraquat
trong huyết tương người và phân tích bằng HPLC để
định lượng paraquat.

2.

Xác định giá trị sử dụng của phương pháp và áp dụng
định lượng paraquat trong huyết tương bệnh nhân ngộ

Vũ Anh Phương

1
nhiên

Trường ĐHKH Tự


độc paraquat tại Trung tâm chống độc bệnh viện Bạch
Mai, Hà Nội.
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
Paraquat là từ viết tắt của paraquaternary bipyridyl, tên
khoa học là 1,1'-dimethyl-4,4' bipyridilium.
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao xác định
paraquat trong huyết tương
Có rất nhều tác giả đã sử dụng phương pháp HPLC để định
lượng PQ trong dịch sinh học.
Paixão P. định lượng PQ trong huyết thanh và huyết tương
người được làm đơn giản và nhanh bằng phương pháp HPLC
sử dụng 1,19-diethyl-4,49- bipyridyldiylium (diethyl paraquat)
làm nội chuẩn. Hệ thống HPLC gồm bơm mẫu model 1100, ổn
định nhiệt, detector UV-VIS. Vòng bơm mẫu 50 µl, cột
NovaPar C18 (150×4,6 mm, 5µm). Tiền cột C18 (100×4,6 mm,
10µm). PQ và chất nội chuẩn được rửa giải ở 25 oC với tốc độ
dòng 0,8 ml/phút và bước sóng hấp thụ 258 nm. Pha động gồm
acid 1 - octanesulphonic 3,0 mM; acid orthophosphoric 0,1 M
trong 900 ml nước khử khoáng điều chỉnh pH đến 3,0 bằng
diethylamine. Acetonitrile nồng độ 10% (v/v).

Vũ Anh Phương

2
nhiên

Trường ĐHKH Tự


Chen Lu và cộng sự đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng
hiệu năng cao để xác định PQ trong huyết thanh người. Pha
động acetonitrile-đệm (10:90), dung dịch đệm chứa natri
heptanesulfonate 0,02 M và acid phosphoric 0,26 M, điều chỉnh
pH đến 2,0 bằng triethylamine. Tốc độ dòng 1,2 ml/phút, bước
sóng phát hiện 256 nm, nhiệt độ cột 40oC. Đường chuẩn tuyến
tính với nồng độ PQ huyết thanh từ 0,1 - 40 mg/l (r = 0,9999).
Giới hạn phát hiện là 0,1 mg/l (S/N = 3).
Các phương pháp xử lý mẫu huyết tương phân tích
Paraquat
Một trong những yếu tố quyết định đến hiệu quả của
phương pháp định lượng đó là phương pháp xử lý mẫu.
Có rất nhiều nghiên cứu sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn để
xử lý mẫu sinh học trong phân tích PQ. Một số tác giả dùng
đệm phosphate để thêm vào mẫu thử trước khi cho qua cột chiết
pha rắn.
Kyoko KATO, P. Paixão đều dùng acid perchloric để loại
protein. Tuy nhiên, một số công trình khác sử dụng acid
trichloracetic để kết tủa protein trong mẫu huyết tương rất đơn
giản và cho hiệu quả cao vì vậy có thể áp dụng rộng rãi ở các
đơn vị xét nghiệm.

Vũ Anh Phương

3
nhiên

Trường ĐHKH Tự


Qua tài liệu tham khảo cho thấy việc định lượng PQ
trong mẫu huyết tương được thực hiện bằng phương pháp
HPLC. Trong đó mẫu huyết tương được loại bỏ protein bằng
cách kết tủa với TCA và định lượng trên hệ HPLC cột tách
C8 dung môi pha động theo thể tích (5:95) gồm ACN – Đệm
photphat pH=2,5 gồm (natri heptanesulfonate; KCl; PEG ;
triethylamine; MeOH).
CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
-

Mẫu trắng: là huyết tương người của viện Huyết học và
truyền máu trung ương.

-

Mẫu chuẩn: là mẫu trắng được thêm lượng xác định PQ
tạo thành mẫu.

-

Mẫu thử: là huyết tương bệnh nhân ngộ độc PQ thu
được từ mẫu máu, ly tâm lấy phần huyết tương.

2.2. Chất chuẩn, hoá chất, thiết bị
2.2.1 Chất chuẩn

Chất chuẩn Paraquat dichloride.x-hydrate của hãng Sigma
- Aldrich độ tinh khiết 99,5%.

Vũ Anh Phương

4
nhiên

Trường ĐHKH Tự


2.2.2. Thiết bị,
-

Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1200, detector mảng
Diode (DAD), thư viện phổ độc chất sử dụng detector mảng
Diode.Cột pha đảo Agilent C8 (150 mm x 4,6 mm; 5 µm)
và cột bảo vệ C8 (20 mm x 4,0 mm, 5 μm).
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng paraquat.
2.3.1.1. Chuẩn bị mẫu chuẩn
2.3.1.2. Phương pháp tách PQ từ huyết tương
Để đánh giá khả năng tách PQ ra khỏi nền mẫu huyết
tương, các mẫu chuẩn chiết PQ trong nền mẫu được chuẩn bị
bằng cách cho TCA, lắc xoáy, ly tâm, lọc rồi chạy sắc ký. Dựa
trên tR, AS, RSD đánh giá tính phù hợp của điều kiện đo.
* Cột sắc ký: sử dụng cột pha đảo Agilent C8 (150 mm x
4,6 mm; 5 µm) và cột bảo vệ C8 (20 mm x 4,0 mm, 5 μm).
* Bước sóng (λ): trong khoảng 210 - 400 nm theo máy sắc
ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1200, detector DAD.

* Thể tích tiêm mẫu: thay đổi thể tích tiêm mẫu từ 10 - 50 µl.
* Pha động:
- Hệ A: Kênh 1 là hỗn hợp dung dịch NaOH 0,0125M
trong nước và kênh 2 là dung dịch NaOH 0,0125M trong

Vũ Anh Phương

5
nhiên

Trường ĐHKH Tự


methanol. Tốc độ dòng 0,5 ml/phút. Tỷ lệ thể tích 2 kênh tương
ứng là 90 : 10.
- Hệ B: Gồm kênh 1 là ACN kênh 2 là dung dịch đệm pH =
3 (10:90, v/v). Thành phần đệm gồm acid 1 - octanesulphonic
3,0 mM; acid orthophosphoric 0,1 M trong 900 ml nước khử
khoáng điều chỉnh pH đến 3,0 bằng diethylamine.
- Hệ C: ACN – dung dịch đệm (5:95, v/v) pH = 2,5 gồm
1,1 g natri heptanesulfonate; 2 g KCl; 2 ml polyetylenglycol
400; 0,5 ml triethylamine; 200 ml MeOH thêm nước xấp xỉ
1000 ml. Điều chỉnh pH bằng H3PO4 đặc. Định mức vừa đủ
1000 ml bằng nước deion.
* Giá trị pH pha động cũng được khảo sát trong khoảng từ
2,5 đến 4,5.
* Khảo sát thành phần dung dịch đệm: nồng độ natri
heptanesulfonate, KCl & polyethylenglycol.
* Tốc độ dòng: thay đổi tốc độ pha động từ 0,2 - 0,8
ml/phút để xác định được tốc độ phù hợp cho một thời gian lưu

tối ưu.
2.3.2 Đánh giá phương pháp phân tích PQ trong huyết tương

- Tính chọn lọc
- Khoảng nồng độ tuyến tính
Vũ Anh Phương

6
nhiên

Trường ĐHKH Tự


- Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
- Đánh giá độ đúng (độ thu hồi) và độ chụm (độ lặp lại)
- Độ ổn định
2.3.3. Phân tích PQ trong mẫu huyết tương bệnh nhân - áp
dụng thực tế tiên lượng bệnh nhân và đánh giá hiệu
quả lọc máu hấp phụ

- Đối tượng nghiên cứu: 31 bệnh nhân ngộ độc PQ điều trị tại
Trung tâm Chống độc bệnh viện Bạch Mai từ tháng 3 đến
tháng 5 năm 2015.
-

Thu thập các số liệu bệnh nhân khi nhập viện từ bệnh án

-

Lấy mẫu định lượng PQ huyết tương khi vào viện, trước và

sau các lần lọc máu hấp phụ.
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Vũ Anh Phương

7
nhiên

Trường ĐHKH Tự


3.1. Tối ưu hóa các điều kiện chạy sắc lý lỏng hiệu năng cao
3.1.1. Xác định bước sóng phát hiện chất phân tích với
detector DAD
Kết quả trên cho thấy PQ hấp thụ ánh sáng cực đại tại
bước sóng 259 nm. Do đó chúng tôi chọn bước sóng phát hiện
chất phân tích đối với PQ là 259 nm.
3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của thể tích mẫu tiêm vào cột
Kết quả cho thấy, với lượng mẫu tiêm vào cột là 30 μl
thì cho kết quả tách tốt nhất. Vì vậy, chúng tôi chọn thể tích
mẫu tiêm vào cột là 30 μl cho các khảo sát tiếp theo.
3.1.3. Khảo sát lựa chọn loại pha động

Hình 1: Sắc đồ phân tích PQ với hệ dung môi C
(ACN - dung dịch đệm tỷ lệ 5:95, v/v).

Vũ Anh Phương

8

nhiên

Trường ĐHKH Tự


Kết quả khảo sát cho thấy sử dụng hệ pha động ACN
- đệm (5:95, v/v) pha tĩnh cột C8 là phù hợp nhất, có khả
năng tách tốt và chọn lọc đối với PQ trong huyết tương, cho
pic cân đối và có thời gian lưu hợp lý.
3.1.4. Khảo sát thành phần pha động
-

Pha động: ACN – Đệm (5:95, v/v). Đệm gồm 1,10 g natri
heptanesulfonate; 2,00 g KCl; 2,00 ml polyethylenglycol
400; 0,05% triethylamine; 200 ml MeOH; thêm nước xấp
xỉ 1000 ml. Điều chỉnh pH đến 2,5 bằng dung dịch H3PO4
đặc. Định mức vừa đủ 1000 ml bằng nước deion.

-

Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút.

3.1.5. Đường chuẩn, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng.
Kết quả trên cho thấy, sự phụ thuộc diện tích pic vào
nồng độ PQ có sự tuyến tính trong khoảng từ 0,05 µg/ml đến
10 µg/ml. Trong khoảng nồng độ này, phương trình đường
chuẩn có dạng y = 0,84 + 205,06x với hệ số số tương quan R 2 =
0,9999.
b
205,06

Sy
0,89

LOD (µg/ml)
0,013

Vũ Anh Phương

9
nhiên

LOQ (µg/ml)
0,040

Trường ĐHKH Tự


3.2. Khảo sát phương pháp xử lý mẫu
Điều kiện xử lý mẫu PQ ra khỏi nền mẫu huyết tương khi
có TCA ly tâm và lọc lấy dung dịch xác định trên hệ thống
HPLC
Khảo sát độ ổn định mẫu phân tích
Nhận xét thấy, các giá trị RSD nhỏ (< 2%) chứng tỏ
phương pháp này có độ tái lặp tương đối tốt và giá trị sử dụng
cao, có thể ứng dụng để phân tích mẫu sau nhiều ngày kể từ khi
lấy mẫu.
3.3. Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp
3.3.1. Đánh giá độ chọn lọc

Hình 2: Độ chọn lọc PQ của phương pháp

Vũ Anh Phương

10
nhiên

Trường ĐHKH Tự


Trên sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng tại vị trí tương
ứng với thời gian lưu của PQ không xuất hiện pic lạ. Sắc ký đồ
huyết tương có PQ cân đối, sắc nét, tách riêng biệt. Kết quả trên
xác nhận phương pháp vừa xây dựng có tính chọn lọc tốt đối
với PQ.
3.3.2. Đánh giá độ đúng của phương pháp
3.3.2.1. Đánh giá độ thu hồi của phương pháp
Kết quả độ thu hồi của PQ khá cao, đạt 100,56%. Vì vậy có
thể kết luận rằng phương pháp xử lý mẫu này là đáng tin cậy.
3.3.2.2. Đánh giá độ đúng của phương pháp phân tích
Đối với phương pháp phân tích PQ cho kết quả ttính < tbảng
chứng tỏ sự sai khác giữa giá trị phân tích lại và giá trị thêm
chuẩn không có ý nghĩa thống kê
3.3.2. Đánh giá độ lặp lại và tái lặp lại
3.3.2.1. Đánh giá độ lặp lại của thiết bị
Kết quả cho thấy các giá trị RSD < 3% chứng tỏ điều kiện
và hệ thống sắc ký HPLC đã lựa chọn là ổn định, phù hợp để
định lượng PQ.

Vũ Anh Phương

11
nhiên

Trường ĐHKH Tự


3.3.2.2. Đánh giá độ chụm (độ lệch chuẩn lặp lại và tái lặp)
của phương pháp phân tích
Nhận xét thấy, các giá trị RSDR nhỏ (< 1%) chứng tỏ
phương pháp này có độ tái lặp tốt và giá trị sử dụng cao, có thể
ứng dụng để phân tích ở nhiều phòng thí nghiệm khác nhau.
3.3.3 Độ ổn định
Độ ổn định trong thời gian phân tích
Nhận xét thấy, các giá trị RSD nhỏ (< 1%) chứng tỏ
phương pháp này có độ tái lặp tốt và giá trị sử dụng cao, có thể
ứng dụng để phân tích ở các thời điểm khác nhau sau khi xử lý
mẫu trong vòng 5 tiếng.
3.4. Phân tích mẫu PQ trong huyết tương bệnh nhân - áp
dụng thực tế tiên lượng bệnh nhân và đánh giá hiệu
quả lọc máu hấp phụ
31 bệnh nhân ngộ độc PQ đủ tiêu chuẩn được chọn vào
nghiên cứu. Trong đó 16 bệnh nhân (BN) nam (51,6%). Tuổi
trung bình: 32,1 ± 15,2 (14-63 tuổi). Hầu hết ngộ độc do tự tử
(93,6%). Tỷ lệ tử vong 74,2%.
Kết quả biểu diễn sự phụ thuộc nồng độ PQ trong huyết
tương khi vào viện theo thời gian từ khi uống thuốc đến khi xét
nghiệm (hình 3.20) cho thấy hầu hết BN đến viện trong vòng
10 giờ có nồng độ PQ cao hơn 10 µg/ml đều tử vong.

Vũ Anh Phương

12
nhiên

Trường ĐHKH Tự


Hình 3: Kết quả định lượng nồng độ PQ khi vào viện ở bệnh nhân
sống và tử vong.
Căn cứ vào công thức tính chỉ số độ nặng của ngộ độc PQ
(hay thang điểm SIPP): SIPP=[PQ huyết tương (µg/ml)]×[thời
gian từ uống đến bắt đầu điều trị (h)], điểm SIPP của nhóm BN
nghiên cứu trung bình là 51,5 (thấp nhất: 1,1, cao nhất 354,6).
Chúng tôi khảo sát chi tiết hơn giá trị của thang điểm SIPP
được trình bày dưới dang đường cong ROC. Diện tích dưới
đường cong (AUC) của SIPP là 0,886. Như vậy, điểm SIPP có

Vũ Anh Phương

13
nhiên

Trường ĐHKH Tự


giá trị tốt dùng để tiên lượng tử vong. Giá trị thang điểm SIPP =
25 có độ nhạy và độ đặc hiệu cao nhất (tương ứng 0,82 và
0,88), điểm SIPP trên 40 có độ nhạy 0,73 và độ đặc hiệu đạt
100% có nghĩa BN có điểm SIPP trên 40 đều tử vong.

Hình 4: Thang điểm SIPP tiên lượng tử vong

Vũ Anh Phương

14
nhiên

Trường ĐHKH Tự


KẾT LUẬN
1. Đã xây dượng được quy trình phân tích PQ trong mẫu
huyết tương
-

Tối ưu hóa các điều kiện để tách PQ và xá định
bằng phương pháp HPLC, detetor DAD (λ=259
nm). Các điều kiện tối ưu bao gồm: cột pha đảo
Agilent C8 ((150 mm x 4,6 mm; 5 µm) và cột bảo
vệ C8 (20 mm x 4,0 mm, 5 μm). Pha động đệm
photphat pH = 2,5 theo thể tích (5:95) gồm ACN –
Đệm

gồm

(natri

heptanesulfonate;

KCl;

polyethylenglycol; triethylamine; MeOH)
-

Điều kiện xử lý mẫu PQ ra khỏi nền mẫu huyết
tương khi có TCA ly tâm và lọc lấy dung dịch xác
định trên hệ thống HPLC.

2. Phương pháp phân tích PQ trên nền mẫu huyết tương
thu được phương trình đường chuẩn trong khoảng nồng
độ từ 0,040 - 10 µg/ml y = (0.84±0.32) + (205.06 ±
0.08) x có LOD = 0,013 µg/ml; LOQ = 0,040 µg/ml và
hệ số tương quan R2 = 0.9999. Độ lặp lại của thiết bị và
phương pháp phân tích (RSD đều nhỏ hơn 3%) và độ tái
lặp lại (RSDR nhỏ hơn 1%); độ ổn định trong thời gian

Vũ Anh Phương

15
nhiên

Trường ĐHKH Tự


phân tích và độ ổn định trong thời gian bảo quản (RSD
đều nhỏ hơn 2%); tính tuyến tính (giá trị R2 = 0,9999);
độ thu hồi (hiệu suất thu hồi của PQ trung bình
100,56%).
3. Phương phá p định lượng PQ xây dựng được đã được

áp dụng để đị nh lượng PQ trong mẫu huyết tương trên
31 bệnh nhân ngộ độc cấp tại Trung tâm Chống độc –
Bệnh viện Bạch Mai, cho thấy giá trị của nồng độ PQ
lúc BN vào viện , trước và sau lọc hấp phụ có giá trị
trong việc tiên lượng tử vong và cung cấp công cụ rất
hữu ích để đánh giá hiệu quả của lọc máu hấp phụ.

Vũ Anh Phương

16
nhiên

Trường ĐHKH Tự