Nghiên cứu khả năng sử dụng vi sinh vật để ức chế quá trình quorum sensing của các vi khuẩn vibrio gây bệnh trên động vật thủy sản

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
----------------------------

NGUYỄN THỊ KIM THU

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SỬ DỤNG VI SINH VẬT
ĐỂ ỨC CHẾ QUÁ TRÌNH QUORUM SENSING CỦA
CÁC VI KHUẨN VIBRIO GÂY BỆNH TRÊN
ĐỘNG VẬT THUỶ SẢN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2015


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
----------------------------

Nguyễn Thị Kim Thu

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SỬ DỤNG VI SINH VẬT
ĐỂ ỨC CHẾ QUÁ TRÌNH QUORUM SENSING CỦA
CÁC VI KHUẨN VIBRIO GÂY BỆNH TRÊN
ĐỘNG VẬT THUỶ SẢN
Chuyên ngành : Vi sinh vâ ̣t ho ̣c
Mã số

: 60420107

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. Phạm Thế Hải

Hà Nội - 2015


LỜI CẢM ƠN
Trong suố t quá trình ho ̣c tâ ̣p và thực hiê ̣n đề tài , em đã nhâ ̣n đươ ̣c sự giúp đỡ
và ủng hộ nhiệt tình của nhiều tập thể và cá nhân.
Đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biế t ơn chân thành và sâu sắ c nhấ t đế n người
thầy hướng dẫn khoa ho ̣c : TS. Phạm Thế Hải , người thầ y tâm huyế t , đã tâ ̣n tình
hướng dẫn , chỉ bảo và giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đề tài và

hoàn thành

luâ ̣n văn này.
Em cũng xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ , tạo điều kiện của cô Đỗ Minh
Phƣơng cùng các anh chị, các bạn thuộc phòng thí nghiệm bộ môn Vi sinh vật học
trong suốt quá trình hoàn thành luận văn.
Em xin gửi lời cảm ơn tới quý thầ y cô ta ̣i Khoa Sinh ho ̣c , đă ̣c biê ̣t là các thầ y
cô ở Bô ̣ môn Vi sinh vâ ̣t ho ̣c, trường Đa ̣i ho ̣c Khoa ho ̣c Tự nhiên đã nhiê ̣t tin
̀ h giảng
dạy và truyền đạt cho em những kiến thức bổ ích , phương pháp luâ ̣n và nghiên cứu
khoa ho ̣c, làm hành trang quý báu cho sự phát triển công việc của em .
Cuố i cùng, xin bày tỏ lòng biế t ơn chân thành và sâu sắc nhấ t đế n gia đình

,

người thân , bạn bè đã luôn động viên , giúp đỡ , tạo điều kiện và dành những tin

̀ h
cảm thân thương - đó là nguồ n đô ̣ng lực ma ̣nh mẽ nhất để tôi có thể hoàn thành bản
luâ ̣n văn này.
Hà Nội, ngày tháng năm 2015
HỌC VIÊN

Nguyễn Thị Kim Thu


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH
MỞ ĐẦU ........................................................................................................ 5
1.1.Tổng quan vi khuẩn Vibrio ............................................................................3
1.1.1. Đặc điểm chung của chi Vibrio ....................................................................3
1.1.2. Môi trường nuôi cấy các loài vi khuẩn Vibrio ..............................................3
1.1.3. Đặc điểm sinh hoá của chi Vibrio ................................................................4
1.1.4. Một số Vibrio gây bệnh trên người và động vật thuỷ sản ............................4
1.1.5. Phân loại Vibrio bằng các đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hoá ..............6
1.2. Hiện tƣợng cảm ứng mật độ (Quorum sensing) .........................................8
1.2.1. Lịch sử phát hiện quá trình quorum sensing .................................................8
1.2.2. Khái niệm quorum sensing ...........................................................................8
1.2.3. Cơ chế phân tử của quá trình QS ở một số vi khuẩn Vibrio .........................8
1.2.4. Quorum sensing điều khiển sự sản xuất các yếu tố gây độc của các vi
khuẩn Vibrio ..............................................................................................................11
1.3. Các phƣơng pháp ức chế quá trình QS đƣợc sử dụng hiện nay .............12
1.3.1. Sử dụng chất đối kháng quorum sensing ....................................................12

1.3.2. Bất hoạt phân tử tín hiệu dựa vào enzym ...................................................13
1.4. Nghiên cứu về vi khuẩn ức chế quorum sensing và đối kháng với một số vi
khuẩn Vibrio ............................................................................................................14
CHƢƠNG 2. NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ...................... 16
2.1. Nội dung nghiên cứu ............................................................................. 16
2.2. Vật liệu nghiên cứu ................................................................................ 16
2.2.1. Nguồn và chủng vi sinh vật sử dụng trong nghiên cứu ..............................16
2.2.2. Hóa chất và thiết bị .....................................................................................17
2.2.3. Thành phần môi trường sử dụng trong nghiên cứu: ...................................18
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ....................................................................... 20


2.3.1. Phân lập và tuyển chọn vi sinh vật có khả năng ức chế quá trình phát quang
sinh học liên quan đến quorum sensing của vi khuẩn Vibrio harveyi ......................20
2.3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện môi trường tới khả năng ức
chế sự phát sáng ở Vibrio harveyi của các chủng VSV đối kháng ...........................22
2.3.3. Nghiên cứu một số đặc tính hình thái, phân loại của các chủng vi khuẩn có
hoạt tính ức chế phát sáng sinh học (liên quan đến QS) của Vibrio harveyi ............23
2.3.4. Phân tích gen 16S rRNA của vi khuẩn .......................................................26
2.3.5. Chỉ tiêu theo dõi chung ...............................................................................29
2.3.6. Phương pháp tính toán thống kê xử lý số liệu ............................................29
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................. 30
3.1. Xác định mối tƣơng quan giữa mật độ tế bào và cƣờng độ phát quang đo
đƣợc của Vibrio harveyi tại cùng một thời điểm ............................................. 30
3.2. Phân lập và tuyển chọn một số vi sinh vật có khả năng ức chế quá trình
phát quang sinh học liên quan đến quorum sensing của vi khuẩn Vibrio

harveyi ......................................................................................................... 31
3.2.1. Phân lập các vi sinh vật ở các vùng ao nuôi tôm, rừng ngập mặn, đất, bùn
của tỉnh Nam Định và Ninh Bình. .............................................................................31

3.2.2 Xác định khả năng ức chế sự phát sáng liên quan đến quorum sensing ở
Vibrio harveyi của các vi sinh vật phân lập ..............................................................32
3.3. Kết quả phân tích định lƣợng khả năng ức chế sự phát sáng liên quan đến
quorum sensing ở Vibrio harveyi của các VSV phân lập đƣợc ........................ 36
3.4. Nghiên cứu ảnh hƣởng của một số điều kiện môi trƣờng tới khả năng ức
chế sự phát sáng ở Vibrio harveyi của các chủng VSV đối kháng ................... 38
3.4.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ ..............................................................................38
3.4.2 Ảnh hưởng của độ pH môi trường nuôi cấy ................................................39
3.4.3. Ảnh hưởng của nồng độ muối (NaCl) trong môi trường nuôi cấy .............40
3.5. Xác định đặc điểm hình thái và một số đặc điểm phân loại học khác của
các vi khuẩn có hoạt tính ức chế phát quang sinh học liên quan đến quorum
sensing ở Vibrio harveyi ..........................................................................................41


3.5.1. Quan sát hình dạng tế bào của các chủng vi khuẩn có khả năng ức chế sự
phát quang sinh học liên quan đến quorum sensing ở Vibrio harveyi ......................42
3.5.2. Hình thái khuẩn lạc của hai chủng vi khuẩn tuyển chọn được ...................42
3.5.3. Khả năng lên men yếm khí của các chủng vi khuẩn có khả năng ức chế sự
phát quang sinh học liên quan đến quorum sensing ở Vibrio harveyi ......................43
3.5.4. Khả năng di động của các chủng vi khuẩn triển vọng ................................44
3.5.5. Kết quả phân tích các đặc điểm sinh hoá của XTS1. .................................45
3.6. Phân tích trình tự gen 16S rRNA của chủng XTS1 ................................. 48
3.6.1. Khuếch đại gen 16S rRNA .........................................................................48
3.6.2. Kết quả xác định loài vi khuẩn XTS1 ức chế sự phát sáng sinh học liên
quan đến quorum sensing ở Vibrio harvei bằng kỹ thuật sinh học phân tử. .............49
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 52
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 53
PHỤ LỤC ................................................................................................................ 58

DANH MỤC CÁC CHƢ̃ VIẾT TẮT

Viết tắt

Cụm từ

AHL

Chất N-Acyl homoserine lactone

Cs

Cộng sự

DNA

Deoxyribonucleic acid

ĐC

Đối chứng

DN

Dịch nuôi

Epps

Eppendorf

HCD

Mật độ tế bào cao (High cell density)

LCD

Mật độ tế bào thấp (Low cell density)

LB

Môi trường Luria-Bertani

MQSR

Master quorum sensing regulator

MR

Methyl red

NCBI

Cơ sở dữ liệu về công nghệ sinh học

OD

Optical density (mật độ quang)

ONPG

O-Nitrophenyl-β-D-galactopyranoside

PCR

Phản ứng chuỗi trùng hợp

QS

Quorum sensing

Rpm

revolutions per minute (số vòng trên phút)

sp.

Một loài bất kỳ

spp.

Nhiều loài bất kỳ

sRNA

Small RNA

VSV

Vi sinh vật

V. harveyi

Vibrio harveyi

V. parahaemolyticus

Vibrio parahaemolyticus

VP

Voges–Proskauer

VK

Vi khuẩn

RNA

Ribonucleic acid


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Hình thái một số khuẩn lạc Vibrio điển hình trên môi trường .............. 4
Bảng 2.1. Thành phần môi trường LB 0.5% NaCl nuôi cấy các VSV phân lập.. 19
Bảng 2.2. Thành phần môi trường TCBS để chọn lọc vi khuẩn Vibrio............... 19
Bảng 3.1. Số chủng VSV phân lập được từ 2 tỉnh Nam Định và Ninh Bình....... 31
Bảng 3.2. Kết quả phân lập được một số chủng vi khuẩn nghi ngờ có hoạt
tính ức chế sự phát quang sinh học ở Vibrio harveyi ........................................... 32
Bảng 3.3 . Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng ức chế sự phát quang sinh
học ở Vibrio harveyi của các chủng XTS1 và CP1 .............................................. 38

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của pH môi trường tới khả năng ức chế phát quang sinh
học liên quan đến QS ở Vibrio harveyi của 2 chủng vi khuẩn XTS1 và CP1 .... 39
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ muối (NaCl) đến khả năng ức chế của 2 chủng
XTS1 và CP1 tới sự phát quang sinh học(QS) của Vibrio harveyi ...................... 41
Bảng 3.6. Khả năng lên men yếm khí của một số chủng vi khuẩn có triển
vọng ức chế phát quang sinh học ở Vibrio harveyi .............................................. 43
Bảng 3.7 Kết quả thử nghiệm MR phân loại vi khuẩn dựa vào khả năng lên men
đường glucose tạo sản phẩm acid bền .................................................................. 45
Bảng 3.8. Kết quả thử nghiệm VP chủng vi khuẩn XTS1 ................................... 46
Bảng 3.9. Kết quả thử nghiệm ONPG chủng vi khuẩn XTS1 ............................. 47
Bảng 3.10. Kết quả xác định loài vi khuẩn ức chế sự phát sáng liên quan
đến QS ở Vibrio harveyi bằng kỹ thuật sinh học phân tử ................................... 49


DANH MỤC HÌ NH
Trang
Hình 1.1. Sơ đồ phân loại các loài Vibrio bằng các phản ứng sinh hoá ..................... 7
Hình 1.2. Quá trình quorum sensing ở Vibrio fisheri .................................................9
Hình 1.3. Quorum sensing ở vi khuẩn Vibrio harveyi ............................................. 10
Hình 1.4. Hai enzym AHL lactonase và AHL cyclase phân huỷ AHL .................... 13
Hình 3.1. Đồ thị mô tả sự tương quan giữa giá trị OD600nm và lượng phát
quang của Vibrio harveyi tại các thời điểm 0h, 6h, 12h và 18h ................................ 30
Hình 3.2. Kết quả thử hoạt tính ức chế phát quang sinh học ở Vibrio harveyi
của các chủng XTS1, CP1, CP10. ............................................................................. 33
Hình 3.3. Đồ thị sinh trưởng của các chủng VSV ...................................................... 34
Hình 3.4. Kết quả khảo sát tính đối kháng giữa các chủng Vibrio harveyi và 3
chủng VSV phân lập được bằng phương pháp cấy vạch vuông góc ........................ 35
Hình 3.5. Kết quả khảo sát sự ức chế sinh trưởng giữa các chủng XTS1 và
CP1 với V.harveyi bằng phương pháp đục lỗ thạch .................................................. 36
Hình 3.6. Đồ thị biểu thị cường độ phát quang của Vibrio harveyi ở các giếng

thí nghiệm................................................................................................................. .37
Hình 3.7. Hiệu quả ức chế phát quang sinh học ở Vibrio harveyi của hai chủng vi
khuẩn XTS1 và CP1 .................................................................................................. 37
Hình 3.8. Hình dạng tế bào XTS1 quan sát dưới vật kính 100x ................................ 42
Hình 3.9. Quan sát hình dạng tế bào CP1 dưới vật kính 100x ................................. 42
Hình 3.10. Hình ảnh khuẩn lạc của chủng vi khuẩn XTS1 trên môi trường LB 3%
NaCl và TCBS........................................................................................................... 43
Hình 3.11. Khả năng lên men yếm khí của 2 chủng vi khuẩn có khả năng ức chế sự
phát quang sinh học liên quan đến quorum sensing của Vibrio harveyi ................... 44
Hình 3.12. Khả năng di động của XTS1 và CP1 ...................................................... 45
Hình 3.13. Kết quả thử nghiệm MR .......................................................................... 46
Hình 3.14. Thử nghiệm VP của chủng vi khuẩn XTS1 ............................................ 47
Hình 3.15. Kết quả thử nghiệm ONPG của chủng vi khuẩn XTS1 ......................... 48
Hình 3.16. Kết quả quả PCR khuếch đại đoạn 16S rADN của XTS1 ...................... 49
Hình 3.17. Kết quả so sánh trình tự 16S rDNA của XTS1 trên GenBank ................ 50


MỞ ĐẦU
Ngành thuỷ sản đóng một vai trò quan trọng trong sự phát triển kinh tế của
đất nước ta. Quy mô của ngành thuỷ sản ngày càng mở rộng và vai trò của ngành
cũng tăng lên không ngừng trong nền kinh tế quốc dân. Động vật thuỷ sản là một
trong những nguồn cung cấp lương thực, thực phẩm và các sản phẩm tiêu dùng
phong phú cho con người. Trong đó, bao gồm các loại tôm, cua, cá,…
Tuy nhiên, mỗi năm ngành thuỷ sản nước ta lại bị thiệt hại nặng nề vì dịch
bệnh, chủ yếu trên tôm nước lợ, cá nước ngọt, cá biển, nhuyễn thể… Các yếu tố
ngoại cảnh tác động lên động vật thuỷ sản bao gồm môi trường sống và tác nhân
gây bệnh. Trong đó, dịch bệnh trên động vật thuỷ sản gây thiệt hại lớn chủ yếu là do
các tác nhân gây bệnh (vi khuẩn, virus, nấm, tác nhân gây bệnh kí sinh…). Một
trong những vi khuẩn gây bệnh trên động vật thuỷ sản điển hình đó là các vi khuẩn
thuộc chi Vibrio [2 ; 22]. Thiệt hại do bệnh thủy sản, đặc biệt là tôm lên đến 60000

ha (năm 2014) ảnh hưởng rất lớn đến người nuôi trồng thủy sản và nền kinh tế.
Các vi khuẩn Vibrio sống trong môi trường nước, đặc biệt là nước biển và
cửa sông, một số loài là tác nhân gây bệnh cho người và động vật biển. Đối với cá,
Vibrio spp. chủ yếu gây bệnh nhiễm trùng máu, đối với tôm Vibrio spp. gây bệnh
phát sáng, đỏ dọc thân, ăn mòn vỏ kittin. Những vi khuẩn này thường là tác nhân
gây bệnh cơ hội, khi động vật thuỷ sản chịu sự bất lợi từ yếu tố môi trường hoặc bị
nhiễm các bệnh khác như virus, nấm, kí sinh trùng. Động vật thuỷ sản yếu không có
sức đề kháng, các loài vi khuẩn Vibrio cơ hội gây bệnh nặng làm động vật này chết
rải rác tới hàng loạt [2].
Nhiều giải pháp để phòng, trừ bệnh do nhóm vi khuẩn này gây ra trên động
vật thuỷ sản như sử dụng kháng sinh, chế phẩm sinh học. Tuy nhiên, hiệu quả của
các biện pháp này còn thấp. Hơn nữa, do sử dụng nhiều kháng sinh mà các vi khuẩn
Vibrio đa phần đều kháng kháng sinh gây ảnh hưởng đến môi trường và càng làm
giảm hiệu quả của thuốc kháng sinh. Trong những năm gần đây, các nghiên cứu tập
trung vào việc làm rối loạn hệ thống “quorum sensing” – một dạng “giao tiếp của vi
khuẩn”. Quorum sensing (QS) là cơ chế thông tin liên lạc giữa các tế bào và đáp
1


ứng lại mật độ tế bào bằng cách sản xuất, giải phóng, dò tìm các phân tử tín hiệu.
Vai trò của quorum sensing là điều khiển một số quá trình ở vi khuẩn gây bệnh như:
sự phát sáng, sự tiếp hợp, sự hình thành biofilm, swarming… [1; 9]. Việc ngăn chặn
hệ thống giao tiếp QS của vi khuẩn nói chung và vi khuẩn Vibrio nói riêng là hướng
đi mới nhằm ngăn ngừa khả năng gây bệnh của chúng mà không cần đặt chúng dưới
áp lực chọn lọc (chẳng hạn như dùng kháng sinh hoặc chất hoá học để tiêu diệt
chúng).
Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi chọn đề tài “Nghiên cứu khả năng sử
dụng vi sinh vật để ức chế quá trình quorum sensing của các vi khuẩn Vibrio gây
bệnh trên động vật thuỷ sản”.

2


Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan vi khuẩn Vibrio
1.1.1. Đặc điểm chung của chi Vibrio
Vibrio có vị trí phân loại như sau:
Giới: Bacteria
Ngành: Proteobacteria
Lớp: Gammaproteobacteria
Bộ: Vibrionales
Họ: Vibrionaceae
Chi: Vibrio
Chi Vibrio là một nhóm vi khuẩn đa dạng bao gồm ít nhất 74 loài riêng biệt.
Vibrio thuộc lớp Gammaproteobacteria và là vi khuẩn Gram âm, hình que thẳng
hoặc hơi uốn cong, kích thước từ 0,3-0,5 x 1,4-2,6µm di động nhờ tiên mao, không
hình thành bào tử. Đa số các Vibrio đều là các vi khuẩn yếm khí tuỳ tiện. Hầu hết
chúng đều phát triển trong môi trường nước biển (Na+ cần cho sự phát triển của
chúng, là nhu cầu tuyệt đối) và không phát triển trên môi trường không có muối. Đa
số các loài Vibrio sống hoại sinh, một số gây bệnh cho người và động vật; ví dụ như
Vibrio cholerae gây bệnh tả trên người, Vibrio harveyi gây bệnh phát sáng trên tôm,
Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan trên cá. Đặc trưng của các loài
Vibrio là khả năng sống trong điều kiện pH cao (8,5 – 9,5) và bị tiêu diệt nhanh ở
môi trường axít. Một số loài có thể phát triển rất nhanh (tăng gấp đôi trong 10 phút)
[6; 7; 8; 40].

1.1.2. Môi trƣờng nuôi cấy các loài vi khuẩn Vibrio
Môi trường chọn lọc để phân lập các loài vi khuẩn Vibrio là môi trường
thạch TCBS (Thiosulphate citrate bile salt agar). TCBS có tính chọn lọc cao, đáp

ứng nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn Vibrio. Tuy nhiên, môi trường TCBS chỉ có
thể giúp phân loại vi khuẩn Vibrio thành hai nhóm: có sử dụng và không sử dụng
đường sucrose. Các vi khuẩn có khả năng lên men sucrose sẽ cho khuẩn lạc màu
vàng (Vibrio cholerae, Vibrio alginolyticus,…) và ngược lại, các vi khuẩn không có
3


khả năng sử dụng sucrose sẽ cho khuẩn lạc màu xanh (Vibrio parahaemolyticus,
Vibrio vulnificus…) [7 ; 8.]
Bảng 1.1 Hình thái một số khuẩn lạc Vibrio điển hình trên môi trƣờng
thạch TCBS
Hình thái khuẩn lạc trên môi trường thạch TCBS
Loài

Màu khuẩn lạc

Vibrio cholera

Khuẩn lạc màu vàng

Vibrio parahaemolyticus

Xanh

Vibrio anguillarum

Vàng

Vibrio harveyi

Màu xanh ở trung tâm, xung quanh vàng

V. alginolyticus

Vàng

Vibrio vulnificus

Vàng lục

1.1.3. Đặc điểm sinh hoá của chi Vibrio
Các vi khuẩn Vibrio cho phản ứng oxidase và catalase dương tính, lên men
yếm khí, các chủng vi khuẩn phát sáng đều phát triển tốt ở môi trường có 3% NaCl,
sinh indole và có khả năng tạo axít từ mannitol và trehalose, không sinh H2S và
Urease. Chúng mẫn cảm với thuốc thử Vibriostat 0/129. Hầu hết các vi khuẩn thuộc
nhóm Vibrio có thể tồn tại và nhân rộng ở các vùng nước bị tăng độ nhiễm mặn
(nồng độ muối cao, có thể lên tới 6% NaCl) và ở nhiệt độ 10-30oC. Khi sinh trưởng
trong môi trường TCBS, một số loài Vibrio có khả năng lên men đường sucrose
(Vibrio cholerae, Vibrio alginolyticus…) nên cho khuẩn lạc màu vàng [6; 8; 45].
1.1.4. Một số Vibrio gây bệnh trên ngƣời và động vật thuỷ sản
1.1.4.1. Lịch sử phát hiện bệnh gây ra do Vibrio
Vào những năm 1970, bệnh do vi khuẩn Vibrio đã được phát hiện bởi
Tukiash. Vào thời gian này, dịch bệnh gây chết với tỷ lệ >50% ở động vật thuỷ sản
như cua xanh (Callinectes sapidus). Sau đó, năm 1977, Fisher đã công bố kết quả
nghiên cứu bệnh trên các loài tôm hùm châu Mỹ (Homarus americarus), châu Á
(Panulirus homarus) và công bố nguyên nhân bệnh là do nhiễm phải nhóm vi khuẩn
Vibrio [20].
4

Năm 1990, Hasawai cho rằng tác nhân gây bệnh đỏ thân ở tôm Sú (Thái Lan)
là do phẩy khuẩn. Còn ở Việt Nam, một số nhà nghiên cứu cho rằng nguyên nhân
của bệnh đỏ thân là do tôm ăn Artemia và tảo già. Tuy nhiên, theo nghiên cứu của
Viện nuôi trồng thuỷ sản 3 thì bệnh đỏ thân ở tôm là do vi khuẩn Vibrio
alginolyticus (1 loài vi khuẩn thuộc chi Vibrio) [42; 43; 44].
Bệnh vibriosis (bệnh do các vi khuẩn Vibrio gây ra) có thể quan sát được ở
khắp mọi nơi có nghề nuôi trồng thuỷ sản nước lợ và nước mặn. Từ mẫu tôm, cá bị
mắc bệnh, thậm chí là mẫu đất nơi mà Vibrio thường có mặt, ta có thể phân lập
được nhiều loài vi khuẩn Vibrio.
1.1.4.2. Vi khuẩn Vibrio harveyi
Vibrio harveyi là vi khuẩn thuộc chi Vibrio, họ Vibrionaceae. Đặc điểm của
vi khuẩn này là: hình que, Gram âm, phát quang sinh học, di động nhờ roi cực, ưa
mặn và có khả năng trao đổi chất lên men và hô hấp. Chúng không phát triển ở
nhiệt độ 4°C hoặc trên 35°C. Có thể tìm thấy Vibrio harveyi sống tự do trong vùng
biển nhiệt đới, trong ruột của động vật biển và là mầm bệnh cơ hội của tôm, cá bơn,
tôm hùm…Chúng gây ra hiện tượng phát sáng sinh học trên tôm trong môi trường
biển.
Tôm khi nhiễm vi khuẩn này thường phát bệnh sau khi nuôi một tháng. Tôm
nhiễm bệnh có đặc điểm là bơi lội không định hướng, phản xạ chậm, khả năng bắt
mồi giảm, một số con dạt vào bờ. Quan sát vỏ và thân thấy màu cáu bẩn, cơ có màu
đục, gan teo, ruột rỗng; trong bóng tối phát ánh sáng xanh. Vi khuẩn Vibrio harveyi
có thể sống được ở độ mặn từ 0 - 40‰, phát triển mạnh ở độ mặn 20 - 30‰. Khi
xâm nhập cơ thể tôm, vi khuẩn tấn công tế bào gan, dẫn tới viêm loét gan, suy giảm
chức năng gan [21; 27].
1.1.4.3. Vi khuẩn Vibrio cholerae
Giống như Vibrio harveyi, Vibrio cholerae là vi khuẩn thuộc chi Vibrio,
nhóm Gram âm. Đặc điểm của vi khuẩn này là: hình dấu phẩy, có một roi ở một cực
tế bào. V. cholerae lần đầu tiên được phân lập từ mẫu bệnh dịch tả bởi nhà giải phẫu
học người Ý Filippo Pacini năm 1854. Vibrio cholerae thường gây bệnh tả cho
người [13 ; 14]

5


1.1.4.4. Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus
Vi khuẩn này có dạng hình uốn cong, Gram âm, được tìm thấy trong nước lợ
và nước mặn. Vibrio parahaemolyticus bao gồm các chủng có độc tố có khả năng
gây bệnh và các chủng không gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính. V.
parahaemolyticus có khả năng chịu đựng với các độ mặn, pH, nhiệt độ và dễ dàng
đeo bám trên các sinh vật phù du di chuyển theo dòng chảy. V. parahaemolyticus
rất phổ biến trong môi trường ở các vùng cửa sông, và một số ít hiện diện trong môi
trường nước ngọt.
Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tuỵ trên tôm do Lightner (Đại
học Arizona, Mỹ) nghiên cứu phát hiện ra. Tôm mắc bệnh này thường bị sưng gan
tuỵ dẫn đến chết. Ngoài ra, vi khuẩn này còn gây bệnh phồng đuôi ở tôm, tuy không
lan thành dịch lớn nhưng cũng ảnh hưởng đến năng suất nuôi [23].
1.1.4.5. Vi khuẩn Vibrio alginolyticus
Vibrio alginolyticus là những vi khuẩn hình que ngắn, Gram âm, khi nuôi cấy
trên TCBS cho khuẩn lạc màu vàng do có khả năng lên men sucrose. Vibrio
alginolyticus thường gây bệnh đỏ thân ở tôm làm tôm và ấu trùng chết hàng loạt và
bệnh xuất huyết, lở loét ở cá chẽm. Vi khuẩn gây bệnh khi môi trường sống của
thuỷ sản bị ô nhiễm nặng, thức ăn thừa quá nhiều, công tác vệ sinh kém [37 ; 39].
1.1.5. Phân loại Vibrio bằng các đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hoá
Dựa vào các đặc điểm hình thái (hình dạng, kích thước…) và các đặc điểm
sinh lý, sinh hoá, người ta có thể phân loại Vibrio thành các loài khác nhau. Theo
C.V.L. Jayasinghe và cs, các loài Vibrio được phân loại dựa vào màu sắc khuẩn lạc
mọc trên TCBS (xanh hay vàng), phản ứng oxidase và VP test, khả năng mọc trên
môi trường 0% NaCl, phản ứng ONPG, phản ứng D-cellobiose, phản ứng Lysine
Decarboxylase (hình 1.1) [25].

6

Hình 1.1 Sơ đồ phân loại các loài Vibrio bằng các phản ứng sinh hoá [25]. Chú thích:Growth on TCBS (Sinh trƣởng trên
môi trƣờng TCBS, Y (màu vàng), G (màu xanh)
7


1.2. Hiện tƣợng cảm ứng mật độ (Quorum sensing)
1.2.1. Lịch sử phát hiện quá trình quorum sensing
Nghiên cứu đầu tiên về quorum sensing trên vi khuẩn Vibrio fischeri được
thực hiện vào năm 1960. Kết quả nghiên cứu này cho thấy hiện tượng phát sáng xảy
ra khi có mặt số lượng lớn tế bào vi khuẩn. Giả thuyết ban đầu của các nhà nghiên
cứu là: môi trường chứa chất ức chế sự phát sáng và chất này bị loại bỏ khi vi khuẩn
hiện diện với số lượng lớn.
Các nghiên cứu tiếp theo đã chứng minh rằng: Sự phát sáng do tích lũy phân
tử hoạt hóa gọi là autoinducer. Autoinducer do vi khuẩn tạo ra và hoạt hóa sự phát
sáng khi nó ở nồng độ cao. Vi khuẩn có thể cảm nhận được mật độ tế bào thông qua
nồng độ autoinducer [48].
Sau đó, một loạt nghiên cứu đã tìm ra hệ thống quorum sensing trên các loài
vi khuẩn khác như Vibrio harveyi, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio alginolyticus…
1.2.2. Khái niệm quorum sensing
Quorum sensing là cơ chế thông tin liên lạc giữa tế bào với tế bào, phối hợp
với sự biểu hiện gen trong tế bào vi khuẩn để đáp ứng lại mật độ tế bào bằng cách
sản xuất, giải phóng và dò tìm các phân tử tín hiệu nhỏ, được gọi là các phân tử
autoinducer.
Quorum sensing ảnh hưởng tới sự biểu hiện của nhiều quá trình tế bào, bao
gồm các quá trình hoạt động của các gen gây bệnh như phát quang sinh học, quá
trình swarming, sự hình thành bào tử, hình thành biofilm, sản xuất các chất kháng
sinh, sự tạo thành độc tố, siderophore… Ở Vibrio harveyi, sự biểu hiện của các
protein huỳnh quang sinh học được mã hoá bởi operon lux bị ảnh hưởng bởi mật độ

vi khuẩn qua hiện tượng cảm ứng mật độ [1].
1.2.3. Cơ chế phân tử của quá trình QS ở một số vi khuẩn Vibrio
Quá trình quorum sensing được phát hiện lần đầu tiên ở vi khuẩn Vibrio
fisheri, và là nền tảng để khám phá hệ thống quorum sensing ở các Vibrio khác. Tín
hiệu tham gia vào quá trình quorum sensing ở vi khuẩn Gram âm nói chung đó là
các phân tử hoá học nhỏ, ví dụ như N-acyl homoserine lactones (AHLs), alkyl
quinolones (AQs),…
8


1.2.3.1. Quá trình quorum sensing ở Vibrio fisheri
Khi mật độ tế bào V.fischeri thấp, autoinducer (3-oxo-C6-HSL, một AHL) ở
nồng độ thấp. Ở mật độ tế bào cao, mức độ của autoinducer trở nên đủ để hoạt hoá
sự phiên mã của các gen sản xuất các enzyme luciferase, dẫn đến phát quang sinh
học (Hình 1.2). Thật vậy, một tế bào đơn lẻ không có khả năng sản xuất đủ
luciferase để gây hiện tượng phát quang có thể nhìn thấy được. Sử dụng quorum
sensing, các tế bào có thể tiết kiệm năng lượng của mình cho đến khi các tế bào
tương tự hội tụ đủ xung quanh, sau đó kết hợp hoạt động tạo ra ánh sáng có thể nhìn
thấy được [9;10].

Hình 1.2 Quá trình quorum sensing ở Vibrio fisheri. Chú thích: Target genes
(gen đích); protein I (protein sản xuất), protein R (protein điều hoà).
Các phân tử tín hiệu AHL được tạo ra bởi protein sản xuất, sau đó AHL sản sinh từ
các tế bào xung quanh được gắn vào protein điều hoà, protein điều hoà cùng với
phân tử tín hiệu này hoạt hoá phiên mã các gen đích.
1.2.3.2. Quorum sensing ở Vibrio harveyi
Quorum sensing ở V. harveyi sử dụng 3 hệ thống phân tử tín hiệu tế bào mà
có chức năng song song để điều hoà tích cực sự phát quang sinh học, sản xuất
metalloprotease, siderophore, exopolysaccharide và điều hoà âm hệ thống tiết loại
III theo cách thức phụ thuộc mật độ tế bào. Hệ thống LuxM/N dựa vào HAI-1 được

tổng hợp bởi LuxM. Hệ thống LuxS/PQ sử dụng phân tử tín hiệu AI-2 và được tổng
hợp bởi LuxS. Hệ thống CqsA/S sử dụng phân tử tín hiệu CAI-1 mà phụ thuộc vào
9


CqsA để tổng hợp chính nó. Ba phân tử tín hiệu này là riêng biệt và làm việc “hợp
tác” trong quá trình điều hoà gen. Các protein cảm biến (sensors) cho HAI-1, AI-2
và CAI-1 gọi là LuxN, LuxQ và CqsS tương ứng, là những protein thuộc hệ thống
tín hiệu hai thành phần. Ở mật độ tế bào thấp, nồng độ phân tử tín hiệu thấp, LuxO
bị phosphoryl hoá kích hoạt sự biểu hiện của các sRNA đi kèm với Hfq gây bất ổn
mRNA mã hoá protein LuxR – yếu tố điều hoà tổng thể quorum sensing (Master
quorum sensing regulator - MQSR). Ở mật độ tế bào cao, các phân tử tín hiểu sản
xuất bởi LuxM, LuxS và CqsA được tích luỹ và bám vào các sensor tương ứng của
chúng. Tín hiệu liên kết được chuyển tới LuxN, LuxQ và CqsS thành phosphatase,
dẫn tới LuxO bị dephosphoryl hoá. Kết quả, LuxO bị bất hoạt, các sRNA không
được sao chép, mRNA của luxR được ổn định và dịch mã. LuxR sản xuất phát
quang sinh học và sản xuất exopolysaccharide, siderophore và metalooprotease và
ức chế hệ thống tiết loại III (hình 1.3)[9;15;16;18;19;28;29;33;38].
1.2.3.3. Quorum sensing ở Vibrio parahaemolyticus

Hình 1.3 Quorum sensing ở vi khuẩn Vibrio harveyi [9]. Chú thích: At low cell
density (mật độ tế bào cao); at high cell density (mật độ tế bào thấp).
Quá trình quorum sensing ở Vibrio parahaemolitycus cũng tương tự như ở
Vibrio harveyi, tuy nhiên yếu tố điều hoà tổng thể quorum sensing ở V.
parahaemolyticus là opaR (một homolog của luxR V.harveyi) (Hình 1.3).
10


1.2.4. Quorum sensing điều khiển sự sản xuất các yếu tố gây độc của các vi
khuẩn Vibrio

Quorum sensing là quá trình phổ biến và được bảo tồn ở các loài Vibrio,
tham gia vào nhiều quá trình sinh lý khác nhau và đặc biệt ảnh hưởng đến hệ thống
độc lực của nhiều vi khuẩn thuộc loài này.
1.2.4.1. Quorum sensing điều khiển sự sản xuất các yếu tố gây độc của các vi
khuẩn Vibrio
Ngoại độc tố (Exotoxin) đóng vai trò quan trọng trong việc gây bệnh của vi
khuẩn bằng cách tạo ra các enzyme phân huỷ và tạo lỗ thủng trên màng tế bào vật
chủ, do đó cho phép vi khuẩn xâm nhập và lây lan sang các tế bào, mô xung quanh.
Ở vi khuẩn Vibrio harveyi, độc lực của V. harveyi (chủng 47.666-1) liên quan đến
việc sản xuất một protein ngoại bào được gọi là độc tố T1 với một khối lượng phân
tử khoảng 100 kDa. Các protein ngoại bào được sản xuất trong giai đoạn giữa pha
log và có độc lực tương tự liên quan đến các protein trong Salmonella, Shigella, và
các loài Bacillus. Ngoài ra, quá trình quorum sensing ở vi khuẩn phát sáng này còn
điều hoà âm sự sản xuất các chitinase, phospholipase, siderophore, hệ thống tiết loại
III [30]. Đối với Vibrio alginolyticus, yếu tố gây độc chính của vi khuẩn này là một
serine protease kiềm ngoại bào – Asp có liên quan mật thiết với hệ thống quorum
sensing và cách thức sản xuất của độc tố này phụ thuộc vào mật độ tế bào. Thực tế,
sự biểu hiện ở mức độ thấp của yếu tố điều hoà tổng thể quorum sensing LuxR, gây
giảm biểu hiện của Asp. Giả thuyết đặt ra là: LuxR kích hoạt phiên mã của gen asp
bằng cách trực tiếp bám vào vùng promoter của nó. Ở V. cholerae, hai yếu tố độc
lực chính là độc tố cholerae (CT) và các sợi phối hợp điều hoà độc tố (toxin
coregulated pilus - TCP), mã hóa tương ứng bởi cụm gen ctx và gen tcp được gián
tiếp hoạt hoá bởi AphA. Ở mật độ tế bào thấp, các sRNA (small RNA) được phiên
mã khi LuxO bị phosphoryl hoá. Các sRNA gây bất ổn mRNA của hapR nhưng
thúc đẩy sự biểu hiện của AphA. Ở mật độ tế bào cao, HapR được biểu hiện và ức
chế sự phiên mã AphA, dẫn đến ức chế sự hình thành các yếu tố độc lực [32; 35].

11

1.2.4.2. Quorum sensing ảnh hƣởng đến kiểu hình liên quan tới độc lực khác
nhau trong các vi khuẩn Vibrio
Quorum sensing trong các vi khuẩn Vibrio cũng tham gia vào sự điều hoà
của nhiều yếu tố độc lực khác liên quan, như hình thành màng sinh học, khả năng
vận động, siderophore... Trong V. cholerae, trái ngược với các vi khuẩn khác khi
kích thích hình thành biofilm (màng sinh học) ở mật độ cao, vi khuẩn này sản xuất
màng sinh học dày hơn khi mật độ tế bào thấp. CqsA hoạt động thông qua HapR ức
chế sự biểu hiện của các operon tổng hợp polysaccharide [13].
Sự biểu hiện của hiện tượng phát quang sinh học trong V. harveyi từ lâu đã
gắn liền với độc lực ở các chủng gây bệnh của loài này. Biểu hiện kiểu hình phát
quang của V. harveyi được kiểm soát ở mức độ phiên mã bởi một hệ thống quorum
sensing không điển hình (không hoàn toàn giống hệ thống ở các Vibrio khác). Kiểu
hình phát sáng liên quan đến QS ở V. harveyi có tương quan mật thiết đến sự sản
xuất của metalloprotease và độc tố ngoại bào [30].
1.3. Các phƣơng pháp ức chế quá trình quorum sensing đƣợc sử dụng hiện nay
Việc sử dụng các chất kháng sinh để tiêu diệt mầm bệnh trong nuôi trồng
thuỷ sản đã làm cho vi khuẩn gây bệnh trở nên kháng thuốc. Hiện nay, không những
một số thuốc kháng sinh không còn hiệu quả mà còn gây ô nhiễm môi trường sống
của thuỷ sản, làm mất cân bằng sinh thái. Do đó, nhiều phương pháp hữu hiệu hơn
đã được nghiên cứu, đặc biệt là việc ứng dụng các hiểu biết về quá trình quorum
sensing trên vi khuẩn Vibrio. Việc ngăn chặn quá trình này nhằm làm bất hoạt khả
năng gây độc của vi khuẩn mà không ảnh hưởng đến chúng sẽ là một hướng tiếp
cận mới. Một số hướng tiếp cận làm gián đoạn quorum sensing đã được nghiên
cứu, bao gồm:
- Ức chế tổng hợp các phân tử tín hiệu autoinducer
- Sử dụng chất đối kháng quorum sensing
- Gây bất hoạt quorum sensing dựa vào enzyme
- Ứng dụng các chất tương đồng kích thích quorum sensing
1.3.1. Sử dụng chất đối kháng quorum sensing
Dựa vào các phân tử tín hiệu như AI-2 và AHL để ứng dụng chất đối kháng

quorum sensing. Đối với phân tử AHL, người ta đã tìm ra hợp chất furanone chứa
12


halogen ở tảo đỏ có cấu trúc tương tự. Dựa vào sự tương đồng này, đưa furanone
gắn lên chất đáp ứng điều hoà khiến cho gen đích không được hoạt hoá. Ngoài ra,
các nhà nghiên cứu trước đây còn sử dụng phân tử AHL đối kháng (những AHL có
kích thước 8C trở xuống để kích thích, còn những AHL có kích thước 10C trở lên
dùng để ức chế) và phân tử AHL tổng hợp (sử dụng AHL tổng hợp (5Z)-4-bromo5-(bromomethylene)-2(5H)-furanone để ức chế QS và qua đó làm tăng mức độ mẫn
cảm của biofilm đối với kháng sinh) [11; 12; 34].
Đối với phân tử AI-2, một số nghiên cứu đã tìm ra một furanone chứa
halogen thứ 2 chứa trong tảo đỏ Delisea pulchra. Chất này có tác dụng giảm khả
năng điều hoà AI-2, giảm sự hình thành biofilm ở E.coli và giảm khả năng phát
sáng ở Vibrio harveyi.
1.3.2. Bất hoạt phân tử tín hiệu dựa vào enzym
Phân tử tín hiệu AHL hầu như phổ biến ở các vi khuẩn. Những enzyme có
khả năng ức chế phân tử AHL đã được khám phá ở các loài vi khuẩn thuộc nhóm ßProteobacteria, α-Proteobacteria và γ-Proteobacteria cũng như ở một số loài thuộc
nhóm vi khuẩn Gram dương. Các enzym có khả năng phân huỷ sinh học phân tử tín
hiệu AHL đó là AHL lactonase và AHL cyclase. [31; 36]

Hình 1.4 Hai enzym AHL lactonase và AHL cyclase phân huỷ AHL.
Dưới xúc tác của enzym AHL acylase, phân tử tín hiệu AHL bị bẻ gãy mạch
carbon và phân tách thành axít béo và homoserine lactone, nhưng không làm thay
đổi nhiều đến cấu trúc của AHL. Còn enzyme AHL lactonase xúc tác mở vòng
lactone tạo thành N-acyl homoserine (hình 1.4).

13


Tác động của enzym này khiến cho phân tử AHL bị thay đổi về cấu trúc, gây

trở ngại đến việc gắn kết của AHL với protein điều hoà phiên mã ra LuxR. Các
nghiên cứu đã phát hiện ra rằng, enzym AHL lactonase được mã hoá bởi gen aiiA.
Gen aiiA lần đầu tiên được tìm thấy ở chủng Bacillus sp 240B1. Sau đó, các
homolog (tương đồng) của gen aiiA đã được tìm thấy ở nhiều loài Bacillus khác,
gồm có Bacillus thuringiensis, B. subtilis, B. cereus, B. mycoides... Các gen này có
độ tương đồng cao (89 – 96%) so với gen aiiA của chủng 240B1.
1.4. Nghiên cứu về vi khuẩn ức chế quorum sensing và đối kháng với một số vi
khuẩn Vibrio
Như đã biết, enzyme AHL lactonase được mã hoá bởi gen aiiA, và gen này
được tìm thấy ở các chủng Bacilus. Nghiên cứu của Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh và cs sử
dụng chủng Bacillus cereus được phân lập từ nước nuôi cá tra ở Đồng Tháp để
khuếch đại gen aiiA từ chủng này bằng phương pháp PCR [40]. Gen này được gắn
vào vector, nhân dòng và biểu hiện nhờ vật chủ E.coli. Gen aiiA mã hoá cho
enzyme AHL lactonase được biểu hiện và tách chiết, sau đó được đem thử hoạt tính
trên đĩa 96 giếng theo tỉ lệ 1:1 (50µl dịch nuôi Vibrio harveyi qua đêm đã pha loãng
5000 lần và 50µl AHL lactonase tách chiết từ E.coli). Kết quả cho thấy, cường độ
phát sáng của chủng hoang dại BB120 đã bị suy giảm ngay ở thời điểm sau 2 giờ,
khi enzyme AHL-lactonase tái tổ hợp được bổ sung. Việc bổ sung enzyme AHLlactonase tái tổ hợp ở các nồng độ khác nhau đã không ảnh hưởng đến tốc độ tăng
trưởng của V. harveyi. Như vậy, protein AiiA tái tổ hợp có nguồn gốc từ chủng
Bacillus cereus có hoạt tính ức chế quá trình quorum sensing ở Vibrio harveyi mà
không ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn này.
Theo R. Chythanya và cs, Pseudomonas I-2 - một loài vi khuẩn biển, sản
xuất các hợp chất ức chế các vi khuẩn Vibrio gây bệnh cho tôm bao gồm Vibrio
harveyi, V. fluvialis, V. parahaemolyticus, V. vulnificus và V.damsela. Chất ức chế
đã được tìm thấy là một hợp chất có phân tử lượng thấp, hòa tan trong chloroform
và bền với nhiều enzym thuỷ phân protein. Pseudomonas I-2 có khả năng ứng dụng
để kiểm soát Vibrio sp. gây bệnh trên tôm trong nuôi trồng thủy sản. Ngoài ra, dịch
nổi (không có tế bào) chiết từ Pseudomonas I-2 có khả năng ức chế hoàn toàn vi
14

khuẩn Vibrio harveyi chỉ sau 12h. Như vậy, rất có thể Pseudomonas I-2 đã tạo ra
một số thành phần anti-vibrio ngoại bào. Những kết quả này là rất quan trọng vì vi
khuẩn V. harveyi là một vấn đề lớn trong sản xuất tôm giống [5].
Hiện nay, việc tìm được những chủng vi sinh vật có khả năng ức chế quá
trình quorum sensing mà các vi khuẩn Vibrio này sử dụng để “liên lạc” với nhau, để
tạo độc tố gây bệnh là rất cần thiết. Nếu tìm được những chủng VSV có hoạt tính
này sẽ hạn chế được các bệnh do Vibrio gây ra mà không làm ảnh hưởng đến cân
bằng sinh thái vi sinh vật.

15


Chƣơng 2
NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.1. Nội dung nghiên cứu
Vì quá trình quorum sensing ở các vi khuẩn Vibrio là tương đối giống nhau,
trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn Vibrio harveyi là đại diện cho các vi khuẩn
này để thực hiện các thí nghiệm. V. harveyi có một đặc điểm rất ưu việt cho việc
nghiên cứu, đó là khả năng phát quang sinh học do quorum sensing điều khiển. Các
nội dung nghiên cứu chính như sau:
- Phân lập, tuyển chọn một số vi sinh vật có khả năng ức chế quá trình phát
quang sinh học liên quan đến quá trình quorum sensing của vi khuẩn Vibrio harveyi
- Xác định một số đặc điểm hình thái, phân loại của vi sinh vật tiềm năng có
khả năng ức chế quá trình phát quang sinh học liên quan đến quorum sensing của vi
khuẩn Vibrio harveyi.
- Định danh các vi sinh vật có hoạt tính ức chế sự phát quang sinh học liên
quan đến quá trình quorum sensing của vi khuẩn Vibrio harveyi bằng kỹ thuật sinh
học phân tử.
- Xác định một số điều kiện nhiệt độ, môi trường nuôi cấy ảnh hưởng tới khả

năng ức chế sự phát quang sinh học liên quan đến quorum sensing của vi khuẩn
Vibrio harveyi
2.2. Vật liệu nghiên cứu
Các thí nghiệm sử dụng các hóa chất, dụng cụ và thiết bị chuyên môn, đạt
các tiêu chuẩn cơ bản dùng trong nghiên cứu vi sinh vật học.
2.2.1. Nguồn và chủng vi sinh vật sử dụng trong nghiên cứu
2.2.1.1. Nguồn vi sinh vật để phân lập các chủng có khả năng ức chế quorum
sensing
Để phân lập các chủng vi sinh vật có khả năng ức chế quá trình quorum
sensing, chúng tôi sử dụng nguồn mẫu đất, bùn thu thập tại:
- Vườn Quốc Gia Xuân Thuỷ, huyện Giao Thuỷ, tỉnh Nam Định.
- Vườn Quốc Gia Cúc Phương, thuộc địa giới hành chính của ba tỉnh Ninh
Bình, Thanh Hoá và Hoà Bình
16