Xác định một số đặc điểm phân tử của các chủng vi khuẩn lao ở việt nam

ĐẶT VẤN ĐỀ
Xã hội loài người ngày càng phát triển, cùng với nó là sự bùng nổ của
các đại dịch mà nổi bật nhất là lao, HIV và sốt rét. Theo thống kê của tổ chức
Y tế Thế giới (WHO), tỉ lệ nhiễm lao hiện nay chiếm 1/3 dân số thế giới. Mỗi
năm theo ước tính có khoảng 9 triệu người mắc lao mới và có khoảng 3 triệu
người chết vì lao, tuy nhiên, tỷ lệ phát hiện bệnh chỉ đạt 37%. Như vậy còn
rất nhiều bệnh nhân mắc lao không được phát hiện và chữa trị kịp thời, đây sẽ
là nguồn lây nhiễm rất khó kiểm soát. Việt Nam hiện đứng thứ 12 trong tổng
số 22 nước có tỉ lệ nhiễm lao lớn nhất trên Thế giới, trong khu vực Tây Thái
Bình Dương đứng thứ 3 sau Trung Quốc và Philippin [2, 10, 54].
Ngày nay bệnh lao càng trở nên nguy hiểm hơn do tính kháng thuốc,
đặc biệt là lao kháng đa thuốc gây tử vong rất lớn, do vậy, việc phát hiện để
điều trị sớm càng trở nên cần thiết. Tuy nhiên việc chẩn đoán còn gặp rất
nhiều khó khăn. Ở Việt Nam, phương pháp nhuộm Ziehl - Neelsen hiện nay
vẫn được coi là phổ biến nhất. Hạn chế của phương pháp này là chỉ có khả
năng phát hiện trong trường hợp số lượng vi khuẩn lao ≥ 104 AFB/1ml bệnh
phẩm, do vậy nếu chỉ áp dụng phương pháp này sẽ để sót nhiều bệnh nhân.
Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn lao trên môi trường Lowenstein-Jensen được
coi là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán, tuy nhiên phải mất 4 đến 8 tuần nuôi cấy
mới cho kết quả. Ngay cả trên môi trường nuôi cấy cải tiến MGIT, BACTEC
cũng mất đến 2 tuần, điều này khó đáp ứng được mục tiêu phát hiện nhanh để
kiểm soát bệnh lao [4, 18].
Trước yêu cầu bức thiết đó đòi hỏi phải có một phương pháp chẩn đoán
đáp ứng được hai yêu cầu nhanh và chính xác. Ngày nay sự phát triển mạnh
mẽ của sinh học phân tử đã tạo ra một bước đột phá trong việc chẩn đoán lao.
Nhờ ứng dụng công nghệ sinh học phân tử trong chẩn đoán lao đã rút ngắn

1


thời gian chẩn đoán từ vài tuần xuống còn hai ngày với độ nhạy và độ đặc

hiệu cao, ngoài ra phương pháp này còn cho phép phân biệt chính xác các loài
có khả năng gây bệnh lao cũng như phát hiện khả năng kháng thuốc thông
qua các gen đặc trưng. Hiện nay, trên thế giới và một số cơ sở trong nước
đang ứng dụng phản ứng PCR nhằm khuếch đại các đoạn gen IS6110, đây là
trình tự đặc trưng ở vi khuẩn lao.
Tuy nhiên một số nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng có những chủng
lao ở Đông Nam Á trong đó có Việt Nam có một tỉ lệ nhất định khuyết các
gen đích này, cụ thể là IS6110 có tỷ lệ khuyết từ 5% đến 8% [25, 30, 32. 40].
Một số nghiên cứu đề xuất chọn các gen đích khác là IS1081 và 23S rDNA
thay cho gen đích IS6110 nhưng chúng ta chưa có một nghiên cứu rộng khắp
các chủng lao ở Việt Nam để khẳng định rằng có hay không hiện tượng
khuyết gen đích, và nếu có thì tỷ lệ đó là bao nhiêu. Điều này rất quan trọng
vì khi khuyết gen đích thì phản ứng PCR nhằm vào gen đó không có giá trị
chẩn đoán. Nghiên cứu về các gen đích này đồng thời cũng góp phần xây
dựng nên sự hoàn thiện trong việc xác định đặc điểm phân tử của vi khuẩn lao
ở Việt Nam [13, 30].
Nhận thấy vấn đề này có vai trò quan trọng trong hướng phát triển sinh
học phân tử trong việc chẩn đoán lao để có thể thiết kế các bộ kit PCR phù
hợp với đặc điểm riêng của các chủng lao trong cả nước để tránh trường hợp
bỏ sót bệnh nhân.
Từ những vấn đề trên chúng tôi đã tiến hành đề tài nghiên cứu: “Xác
định một số đặc điểm phân tử của các chủng vi khuẩn lao ở Việt Nam”. Đề
tài tiến hành khảo sát trên số lượng lớn các chủng vi khuẩn lao được thu thập
ở ba miền Bắc – Trung – Nam Việt Nam với hai mục tiêu sau:

2


1. Xác định tỷ lệ xuất hiện các trình tự đặc trưng IS6110, IS1081 và 23S
rDNA trên các chủng vi khuẩn lao.

2. So sánh tỷ lệ xuất hiện các trình tự IS6110, IS1081 và 23S rDNA trên
các chủng lao ở ba miền Bắc – Trung – Nam tại Việt Nam.

3


Chương 1
TỔNG QUAN
1.1. TÌNH HÌNH BỆNH LAO
1.1.1. Tình hình bệnh lao trên thế gới
Lao là một bệnh truyền nhiễm và đã từng được Tổ chức Y tế Thế giới
(WHO) khuyến cáo về tình trạng khẩn cấp toàn cầu của căn bệnh này. Hiện
nay, bệnh lao đang được khuyến cáo là một trong ba bệnh truyền nhiễm nguy
hiểm nhất trên thế giới cùng với hội chứng suy giảm miễn dịch AIDS và sốt
rét. Hiện có tới hơn 2 tỷ người nhiễm lao chiếm gần 1/3 dân số thế giới, mỗi
năm có khoảng 9 triệu bệnh nhân mới được phát hiện và trên 3 triệu người
chết vì lao [2]. Tình hình cũng diễn biến xấu hơn ở những nước đang phát
triển, nơi chiếm 95% số người mắc lao. Bệnh lao chiếm 25% nguyên nhân tử
vong ở những nước này. Khoảng 80% số bệnh nhân lao toàn cầu thuộc 22
quốc gia có gánh nặng bênh tật cao. Đặc biệt trong những năm gần đây tình
hình lao đồng nhiễm với HIV – AIDS và lao kháng thuốc đang nổi lên như
một vấn đề nhức nhối, đặc biệt là ở các nước kém và đang phát triển, điều này
đòi hỏi sự vào cuộc của toàn xã hội. Theo thống kê năm 2005 toàn thế giới có
gần 8,8 triệu người mắc bệnh lao và đã dẫn tới 1,6 triệu người bị chết.
Khoảng 95% số bệnh nhân lao và 98% số người chết do lao ở các nước có thu
nhập vừa và thấp, 75% số bệnh nhân lao cả nam và nữ ở độ tuổi lao động.
Trong đó có khoảng 80% số bệnh nhân lao toàn cầu thuộc 22 nước có gánh
nặng bệnh lao [54, 69]. Vào năm 2007, WHO ước tính khu vực Đông Nam Á
có số người nhiễm lao chiếm 34% trên toàn thế giới.
Thông báo gần đây nhất năm 2007 của WHO cho biết bệnh lao bước đầu

đã ổn định và giảm đi ở cả 6 vùng trên thế giới. Tuy nhiên số lượng các ca
mới nhiễm trên toàn cầu vẫn tăng lên và tập trung ở các khu vực châu Phi,

4


Đông Địa Trung Hải và Đông Nam Á. Tình hình trên cho thấy là bệnh lao vẫn
là mối nguy hại hàng đầu đối với loài người [54].
1.1.2. Tình hình bệnh lao ở Việt Nam
Theo đánh giá của WHO, Việt Nam đứng hàng thứ 12 trong 22 nước có
số bệnh nhân lao cao nhất thế giới. Tại khu vực Tây Thái Bình Dương,
Việt Nam đứng hàng thứ 3 sau Trung Quốc và Phillipin. Tỷ lệ mắc bệnh
lao tại Việt Nam cao hơn 1,6 lần so với ước tính của WHO, nghĩa là có
khoảng 150.000 bệnh nhân lao các thể. Theo WHO thì Việt Nam là nước có
gánh nặng bệnh lao cao với khoảng 44% dân số nhiễm lao. Trong đó tỷ lệ lao
mới mắc các thể là 173/100.000 dân, tỷ lệ hiện mắc các thể là 225/100.000
dân, tỷ lệ tử vong là 26/100.000 dân, tỷ lệ đồng nhiễm lao/HIV trong các bệnh
nhân lao mới là 5% [2].
Theo báo cáo của Chương trình Phòng chống lao quốc gia, hàng năm Việt
Nam phát hiện và điều trị khoảng 100.000 bệnh nhân lao, trong đó 65% là lao
phổi và tập trung ở các vùng đông dân cư và thành phố lớn. Bệnh lao ở Việt
Nam đang có xu hướng trẻ hóa, rất nhiều thanh niên và người trong độ tuổi
lao động mắc lao. Trong giai đoạn 1997 đến 2000, chương trình chống lao
Quốc Gia đã phát hiện hơn 532.703 bệnh nhân lao các thể, tỷ lệ phát hiện ước
tính đạt 82% số bệnh nhân. Đã điều trị 260.698 bệnh nhân lao phổi với tỷ lệ
khỏi 92% [2, 9, 42]. Đáng ngại là tỷ lệ lao kháng thuốc ở Việt Nam, tỷ lệ lao
kháng đa thuốc trong bệnh nhân lao mới là 2,7% và tỷ lệ lao kháng đa thuốc
trong số bệnh nhân điều trị lại là 19%. Nguy cơ nhiễm lao hàng năm ở nước
ta ước tính là 1,5% [2].
Những năm gần đây việc áp dụng kĩ thuật sinh học phân tử như PCR vào

chẩn đoán lao đã mang lại nhiều kết quả khả quan, với các kĩ thuật trên đã rút
ngắn thời gian chẩn đoán và cho độ chính xác cao. Tuy vậy cần có các nghiên

5


cứu nhằm hiểu rõ hơn về đặc điểm phân tử của vi khuẩn lao nhằm hoàn thiện
hơn kĩ thuật chẩn đoán lao bằng phương pháp phân tử.
1.2. ĐẠI CƯƠNG VỀ VI KHUẨN LAO
1.2.1. Đặc điểm phân loại
Vi khuẩn lao thuộc giới Bacteria, ngành Actinobacteria, bộ
Actinomycetales, phân bộ Corynebacterineae, họ Mycobacteriaceae, giống
Mycobacterium. Vi khuẩn lao có tên khoa học là: Mycobacterium
tuberculosis [15].
Các chủng vi khuẩn thuộc giống Mycobacterium được chia làm 2 nhóm
• Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) gồm:
M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. microti. Trong đó M.
tuberculosis và M. bovis gây bệnh lao điển hình.
• Mycobacterium other than tuberculosis (MOTT) gồm:
M. avium, M. ortuitum, M. govdovac, M. kansasii... Nhóm này không
gây bệnh lao.
1.2.2. Đặc điểm cấu trúc
1.2.2.1. Cấu trúc hình thái
Vi khuẩn lao được phát hiện bởi Robert Koch khoảng 100 năm trước
đây. Trực khuẩn lao có hình que, kích thước 2-3 µm, dày 0,3 µm. Khi nhuộm
Ziel-Nellsen trực khuẩn lao bắt màu đỏ thẫm, không bị cồn và axit làm mất
màu fucsin, do vậy chúng được gọi là trực khuẩn kháng cồn, kháng toan (acid
fast bacilli-AFB). Đây là đặc điểm nổi bật của Mycobacteria có thể giúp phát
hiện vi khuẩn lao trong các mẫu bệnh phẩm. Trực khuẩn lao trong dịch huyền
phù duy trì tính kháng axit trong khoảng thời gian rất dài kể cả khi chịu tác

dụng của nhiệt. Trực khuẩn lao có khả năng thực hiện tất cả các cơ chế cần
6


thiết để tổng hợp các vitamin, axit amin và các enzyme co-factor thiết yếu cho
tế bào [3, 4, 5, 10]

Hình 1.1. Trực khuẩn M. tuberculosis

Hình 1.2. Trực khuẩn M. tuberculosis

[55]

sau khi nhuộm Ziehl – Nielsen [55]

1.2.2.2. Cấu trúc thành tế bào
Cấu trúc thành tế bào của M. tuberculosis chia thành 4 lớp, nhờ đó giúp
bảo vệ tế bào khỏi áp suất thẩm thấu, kiểm soát con đường hoà tan giữa tế bào
chất và môi trường.
Lớp trong cùng là cấu trúc màng sinh chất có thành phần chủ yếu là các
phospholipid. Các phân tử phospholipid bao gồm hai nhóm, nhóm ưa nước
hướng về bên trong và nhóm kị nước hướng về bên ngoài, quay ra phía vỏ
[1]. Màng sinh chất của mycobacteria điều hoà sự thẩm thấu giữa nguyên sinh
chất và môi trường, màng chứa các protein có chức năng khác nhau như phân
tử nhạy với nồng độ của các phân tử trong môi trường, các protein truyền tín
hiệu đến bộ máy trao đổi chất và di truyền trong nguyên sinh chất, các
enzyme liên quan đến quá trình trao đổi chất và sinh năng lượng, các chất
mang làm trung gian cho vận chuyển các chất dinh dưỡng và các ion. Các
enzyme xuyên màng và tổng hợp màng, tạo thành vách ngăn trong phân chia
tế bào, tập hợp và tiết một số protein ngoại bào, sao chép DNA [3, 4, 11].

7


Lớp tiếp theo là peptidoglican liên kết với đường arabinose và các phân
tử axit mycolic tạo nên một bộ khung định hình cho vi khuẩn đảm bảo cho vỏ
vi khuẩn có độ cứng nhất định [1]. Thành tế bào của Mycobacteria là cấu trúc
phức tạp nhất được biết ở prokaryote, có một số thành phần hoá học và nhiều
liên kết chéo bất thường, mức độ liên kết giữa peptidoglycan ở thành tế bào
M. tuberculosis là 70-80% trong khi ở E. coli là 20-30% [45].
Lớp ngoài là lớp được tạo nên bởi sự liên kết giữa các axit mycolic và
các lipid phức tạp, đây là lớp tạo nên độc tính của vi khuẩn lao và có cấu trúc
làm tăng khả năng chống thấm nước của thành vi khuẩn giúp trực khuẩn tồn
tại lâu với môi trường bên ngoài, chống khả năng bị huỷ diệt bởi đại thực bào
và các tế bào miễn dịch [1]. Bám với peptidoglycan là một polysaccharide
phân nhánh, arabinogalactan, đầu ngoài của các phân tử này được ester hoá
với axit béo có khối lượng phân tử cao là axit mycolic. Sự sắp xếp của các
axit mycolic có tính đặc hiệu loài cho phép xác định loài mycobacteria bằng
sắc ký lớp mỏng, sắc ký lỏng hiệu năng cao, sắc ký khí-lỏng. Các axit
mycolic đặc hiệu M. tuberculosis là alpha-keto và mythoxymycolate chứa 76
đến 82, 84 đến 89 và 83 đến 90 carbon. Lớp ngoài của thành tế bào có các
phân tử lipid tự do như phthiocerol dimycoserosates (PDIM), phenolic
glycolipids (PGL), trehalose-containing glycolipids và sulfolipids (SL). Nằm
ngang qua toàn bộ lớp màng là một số glycolipid như phosphatidylmyoinositol mannosides, lipomannan (LM) và lipoarabinomannan (LAM),
được đính vào màng sinh chất và mở rộng ra bên ngoài thành tế bào trong đó
LAM có tính đặc hiệu loài. Thành tế bào mycobacteria chứa các protein nằm
rải rác, một vài protein này có tác dụng cấu trúc thành tế bào, một số protein
porin hình thành các kênh ưa nước cho phép vận chuyển tích cực các chất tan
trong nước thông qua lớp axit mycolic. Porin ở mycobacteria khác so với các
vi khuẩn Gram âm [44, 51].

8


Lớp ngoài cùng có cấu trúc peptidoglycolipid, đây là lớp chỉ thấy ở vi
khuẩn lao phát triển bên trong tế bào, nó có tác dụng tăng cường như một lớp áo
giáp cho các vi khuẩn nằm trong tế bào chống được các enzyme phân giải từ các
lysozyme của tế bào [1]. Khi phát triển trong môi trường nuôi cấy lỏng hoặc
trong đại thực bào, M. tuberculosis tích luỹ một capsule giả không bám. Thành
phần của capsule chứa protein, polysaccharide và lượng nhỏ lipid. Cấu thành của
capsule có thể bung ra trong in vivo bên trong các đại thực bào. Màng tế bào của
vi khuẩn lao gây bệnh đa phần giống với màng của các mycobacteria trong cùng
một giống bao gồm cả mycobacteria không gây bệnh.
Màng tế bào của vi khuẩn lao là một cấu trúc linh động có thể thay đổi
khi phát triển hoặc tồn tại trong các môi trường khác nhau. Trong điều kiện
thiếu oxy thành tế bào sẽ dày lên, sự biểu hiện của các gen mã hoá cho các
porin dường như được điều hoà ngược trong các điều kiện môi trường nhất
định như trong môi trường nuôi cấy axit nhẹ cũng như trong khoang đại thực
bào. Ngoài ra sự hình thành cấu trúc cord liên quan đến Trehalose 6, 6’dimycolate là một glycolipid chứa hai phân tử axit mycolic bám lỏng lẻo ở
lớp ngoài của thành tế bào. Rất nhiều các hoạt tính sinh học liên quan đến khả
năng gây bệnh, tính sinh độc tố và bảo vệ chống lại đáp ứng của tế bào chủ [3,
4, 11].
Ở điều kiện tự nhiên vi khuẩn lao có thể tồn tại trong 3 đến 4 tháng.
Trong điều kiện phòng thí nghiệm vi khuẩn lao có thể được bảo quản trong
nhiều năm. Tuy nhiên dưới ánh sáng mặt trời trực tiếp thì sau 5 phút vi khuẩn
lao sẽ bị tiêu diệt. Dưới ánh sáng của tia cực tím, vi khuẩn lao chỉ tồn tại được
2 đến 3 phút. Ở nhiệt độ 42o C vi khuẩn lao ngừng phát triển, ở nhiệt độ 80o C
vi khuẩn lao chết sau 10 phút [1, 8].

9

1- Lipid ngoài
2- Axit mycolic
3- polysaccharides
(arabinogalactan)
4- peptidoglycan
5- màng sinh chất
6- lipoarabinomannan (LAM)
7- phosphatidylinositol
mannoside
8- Khung thành tế bào
Hình 1.3. Thành tế bào Mycobacteria
[ />
1.2.3. Đặc điểm nuôi cấy
Trực khuẩn lao là vi khuẩn ưa khí bắt buộc, không mọc được ở điều
kiện kị khí. Nhiệt độ thích hợp để mọc là 37oC. Hầu như không mọc ở nhiệt
độ dưới 37oC hoặc trên 42oC.
Vi khuẩn lao phát triển trong môi trường đặc biệt giàu chất dinh dưỡng,
chứa trứng, khoai tây, xitrat, glixerol, asparagin, xanh malachit. Môi trường
thường dùng là môi trường đặc Loewenstein được cải tiến bởi Jensen; (hoặc
môi trường lỏng Sauton).
Trực khuẩn lao là vi khuẩn mọc chậm, phải 4-6 tuần sau mới hình
thành khuẩn lạc điển hình, dạng R.

10


Hình 1.4. Khuẩn lạc M. tuberculosis trên môi trường Lowenstein - Jensen
[www.stanford.edu/.../tb%20culture.jpg]

Trực khuẩn M. tuberculosis gây bệnh phát triển thành các khuẩn lạc xù xì bề
mặt ngoài dính và uốn khúc. Trong khi đó các Mycobacteria không gây bệnh và
các trực khuẩn lao bị làm yếu đi trong nuôi cấy kéo dài thường mọc khuẩn lạc
nhẵn, tạo thành đám trong môi trường nuôi cấy [3, 4, 11, 45].
Thời gian phân chia: Ở điều kiện phòng thí nghiệm, M. tuberculosis cứ
12 đến 24 giờ phân chia một lần. Tốc độ phân chia chậm này có thể do tính
thẩm thấu của thành tế bào hạn chế trong việc hấp thụ các chất dinh dưỡng và
liên quan đến tốc độ tổng hợp ribosome. Harshey và Ramakrishnan đã xác
định rằng sự tổng hợp RNA là một tác nhân chính liên quan đến thời gian
sống dài của trực khuẩn. Tỷ lệ RNA/DNA, tốc độ kéo dài chuỗi RNA chậm
hơn 10 lần so với E. coli. Hơn nữa, khi trực khuẩn chuyển từ trạng thái ổn
định sang pha phân chia thì RNA tổng số chỉ tăng lên hai lần. Kết quả là tổng
hợp protein bị chậm lại [45].

11


1.2.4. Hệ gen vi khuẩn lao
1.2.4.1. Đặc điểm hệ gen Mycobacteria tuberculosis

Hình 1.5. Hệ gen vi khuẩn lao

M. tuberculosis H37Rv (Cole 1998a) chứa một trình tự gồm 4.411.529
bp, có đặc tính chứa nhiều Guanine và Cytosine (G+C 65,61%) không thay
đổi ở các vị trí khác nhau trong toàn bộ hệ gen, kiểm chứng cho giả thuyết là
không có các nhân tố chuyển gen theo phương ngang trong hệ gen M.
tuberculosis [22, 29, 45].
Ở Mycobacteria có một nhóm gen với tỷ lệ G+C cao (>80%) mã hoá
cho họ protein PE (Pro-Glu) hoặc PPE (Pro-Pro-Glu). Trình tự PE và PPE có
ở vùng đầu N và bảo thủ trong từng họ protein, chiều dài lần lượt xấp xỉ 110

và 180 amino axit. Trong 172 gen thì có 104 gen mã hoá PE và 68 mã hoá
PPE chiếm hơn 4% các gen của M. tuberculosis. Các protein PE và PPE đóng
một vai trò quan trọng trong quá trình nhân lên và sống sót của mycobacteria
trong các môi trường khác nhau. Họ PE được chia thành 3 phân họ, họ quan
trọng nhất chứa các trình tự đa hình giàu G-C (PGRS) và có 61 thành viên.
Các protein được mã hoá bởi các gen 104 PE được chia nhỏ hơn thành 3 lớp,
lớp thứ nhất chứa 29 protein chỉ với vùng PE, lớp thứ hai gồm 8 protein trong
đó vùng PE đi kèm với các trình tự đầu C độc lập, và lớp thứ ba gồm 67
12


protein tạo thành dưới họ PE-PGRS. PGRS (polymorphic GC-rich repetitive
sequences) là nhóm các protein có vùng PE bảo thủ và đầu C mở rộng với sự
lặp lại nhiều lần Gly-Gly-Ala hoặc Gly-Gly-Asn. Chức năng của các họ này
vẫn chưa biết rõ nhưng có một số giả thuyết cho rằng một số protein này có
liên quan đến tính đa dạng kháng nguyên của M. tuberculosis trong quá trình
lây nhiễm [29, 45, 49]. Các protein PE-PGRS đặc trưng cho M. tuberculosis
có chức năng ức chế trình diện kháng nguyên thông qua phức hệ hoà hợp tổ
chức (MHC) lớp I [45]. Một số gen PE mã hoá cho các protein chỉ chứa vùng
110 axit amin được đi kèm gần với một gen mã hoá một protein PPE. Trong
một số trường hợp, cặp PE-PPE (Rv2431c-Rv2430c) biểu hiện cùng nhau và
có thể tạo thành một phức hệ [45, 46, 50].
Trong hệ gen của H37Rv có ít gene với tỷ lệ G+C thấp (<50%) mã hoá
cho các protein xuyên màng hoặc enzyme polyketide synthase. Hơn 6% các
gen đã được nghiên cứu mã hóa cho các enzyme của quá trình trao đổi axit
béo. Trong số này có khoảng 3% gen được dự đoán về chức năng trong oxy
hoá β của các axit béo, trong khi E. coli chỉ có 50 enzyme liên quan đến
chuyển hoá axit béo. Phần lớn các enzyme ở M. tuberculosis được cho là sử
dụng axit béo có thể liên quan đến khả năng gây bệnh phát triển trong mô của
vật chủ nơi mà axit béo có thể là nguồn carbon chính [29, 45, 49].

Trong số 50 gen mã hoá cho các RNA chức năng thì chỉ có một operon
RNA ribosome, operon này nằm ở vị trí cách 1,5 Mbp so với vị trí khởi đầu
sao mã (losus oriC). Đa số vi khuẩn có nhiều hơn một operon rrn định vị gần
locus oriC để tăng quá trình sao mã. Vi khuẩn lao chỉ có một operon rrn đơn
ở một vị trí tương đối xa so với oriC do đó gây ra kiểu hình phát triển chậm.
Phát hiện hai thể tiền thực khuẩn trong genome, cả hai giống nhau về độ dài
và cách tổ chức. Một là prophage PhiRv1 có trong hệ gen của M. tuberculosis
H37Rv phá vỡ trình tự lặp lại của họ 13E12. Hệ gen của M. tuberculosis chứa

13


7 vị trí cho PhiRv1 chèn vào do đó các chủng có những vị trí biến đổi cao
trong hệ gen. Prophage thứ hai PhiRv2 ổn định hơn, ít biến đổi hơn giữa các
chủng. Các gen mã hoá protein ở M. tuberculosis H37Rv mã hoá cho 3.924
ORF (Open Reading Frame), sự khởi đầu khác ở codon GTG được sử dụng
trong 35% trường hợp so với 14% hoặc 9% trong Bacillus subtilis hoặc
Escherichia coli. Từ trình tự hệ gen cho thấy M. tuberculosis có khả năng
chuyển từ một con đường trao đổi chất này thành con đường trao đổi chất
khác bao gồm cả hiếu khí và hô hấp kỵ khí . Tính mềm dẻo này rất có lợi cho
sự sống sót trong các môi trường khác nhau bên trong cơ thể người cả trong
trạng thái áp lực oxy cao trong phế nang và các điều kiện kỵ khí, vi kỵ khí
trong các nang lao. Một đặc tính nữa của hệ gen M. tuberculosis là có các gen
tổng hợp và phân huỷ hầu như tất cả các loại lipid như các axit béo và các
phân tử phức như axit mycolic. M. tuberculosis có các gen mã hoá cho 250
enzyme khác nhau liên quan đến trao đổi axit béo, so với 50 loại trong hệ gen
của E. coli [35]. Trong số các protein điều khiển, M. tuberculosis có 13 yếu tố
sigma (protein liên quan đến tính đặc hiệu sao mã trên RNA polymerase)
tương ứng 0,3% tổng số gen và 22 protein điều khiển khác bao gồm 13 nhân
tố điều khiển đáp ứng hai thành phần, tương ứng 0,6% tổng số. Số lượng

tương ứng trong M. tuberculosis là 125 gen được nghiên cứu cho các chức
năng vận chuyển, tương ứng 3% tổng số [50].
Trong hệ thống trao đổi chất DNA của M. tuberculosis có một hệ thống
sửa chữa DNA rất hiệu quả, bộ máy sao chép có độ chính xác cao. Hệ gen của
M. tuberculosis không có hệ thống sửa chữa bắt cặp sai dựa trên mutS nhưng
được khắc phục bởi sự có mặt của gần 45 gene liên quan đến các cơ chế sửa
chữa DNA, bao gồm 3 bản copy của gen mutT. Gen này mã hoá cho enzyme
chịu trách nhiệm loại bỏ các Guanine đã bị oxy hoá gây ra sự bắt cặp sai giữa
các cặp base trong quá trình sao chép [22, 29, 45].

14


1.2.4.2. Các trình tự chèn
• Cấu tạo:
Một trong những đặc tính được nghiên cứu kỹ lưỡng nhất của M.
tuberculosis là sự có mặt và phân bố của trình tự chèn (IS), trong đó đặc biệt
là trình tự IS6110 là một trình tự thuộc họ IS3 được sử dụng rộng rãi trong
nghiên cứu dịch tễ học phân tử vì sự thay đổi ở vị trí chèn và số lượng bản
copy trong bộ gen. Các trình tự chèn không có chức năng mã hoá mà chỉ liên
quan đến đặc tính biến đổi và di chuyển. Chúng gồm các yếu tố cis, các trình
tự DNA hoạt động ở hai đầu và enzyme Tpase, enzyme này được mã hoá
bởi một hoặc hai khung đọc mở và sử dụng hầu như toàn bộ độ dài của trình
tự chèn.

Hình 1.6. Cấu trúc của IS
- IRL - left inverted repeat: Trình tự lặp lại ngược chiều bên trái
- IRR - right inverted repeat: Trình tự lặp lại ngược chiều bên phải
- Khung đọc mở mã hoá transposase bao gồm toàn bộ độ dài của IS và trình
tự IRR.

- XYZ chứa các trình tự lặp lại trực tiếp ngắn được sinh ra do quá trình chèn
của IS vào vị trí đích
- p: Promotor định vị trong IRL có hai vùng. Vùng I chứa các cặp base ở tận
đầu của IS cần thiết cho sự nhận biết các trình tự chèn thông qua Tpase.
Vùng II chứa các cặp base cần thiết cho quá trình nhận ra các trình tự đặc
hiệu và gắn của Tpase

15


• Các trình tự lặp lại đảo ngược ở hai đầu:
Trừ một vài trường hợp đáng chú ý (IS91, IS110 và họ IS200/605) đa số
các trình tự chèn có các trình tự lặp lại ngược chiều ở hai đầu (IR-Inverted
Repeat) khoảng 10 đến 40 bp. IR được phân thành hai vùng chức năng, một
định vị trong IR và liên quan đến chức năng gắn Tpase, vùng chức năng kia
gồm 2 hoặc 3bp ở cuối liên quan đến sự phân cắt và các phản ứng chuyển
chuỗi dẫn đến chuyển vị trí của các trình tự chèn. Các promoter của IS thường
định vị một phần bên trong trình tự IR về phía đầu gen Tpase, sự sắp xếp này
có thể cung cấp một cơ chế tự điều hoà sự tổng hợp Tpase bằng cách gắn
Tpase. Các vị trí gắn các protein đặc hiệu cũng được tìm thấy bên trong hoặc
ở gần đầu IR, và đóng vai trò kích hoạt tính di chuyển hoặc biểu hiện Tpase.
• Cấu trúc vùng Tpase:
Hoạt tính gắn vào các trình tự DNA đặc hiệu của các protein được quy
định ở vùng đầu N trong khi vùng xúc tác thường được quy định ở vùng C.
Cấu trúc này tạo nên sự tương tác của phân tử protein mới sinh với các trình
tự đích trên IS.
• Các đoạn lặp lại trực tiếp:
Đặc điểm khác của IS là có khả năng chèn, đa số tạo nên các trình tự DNA
ngắn lặp lại trực tiếp (DR-Direct Repeat), độ dài của DR vào khoảng từ 2 đến
14bp, chèn vào chuỗi DNA tại các vị trí nhất định.

• Chức năng của IS:
Một số trình tự chèn có tác dụng hoạt hoá sự biểu hiện của các gen lân
cận, trong trường hợp di chuyển tạo nên vị trí thích hợp thì các promoter mới
có khả năng điều khiển sự biểu hiện của các gen bên cạnh.
Thông qua biểu hiện và hoạt động của Tpase như cô lập các tín hiệu khởi
đầu dịch mã, thay đổi khung dịch mã, kết thúc dịch mã, tác động đến sao mã
và độ bền của Tpase [45].

16


• Trình tự IS6110
Trình tự IS6110 (IS – Insertion Sequence) được mô tả lần đầu tiên vào
năm 1989. IS6110 có nhiều bản copy (4 đến 25 bản copy), số lượng bản
copy IS6110 có trong hệ gen thay đổi và phụ thuộc vào loài và chủng.
Genome của M. tuberculosis gồm 44.411.529 cặp base với 4000 gen, trong
đó trình tự IS6110 tồn tại rải rác nhiều nơi, nó không có chức năng mã hóa
mà chỉ liên quan tới tính biến đổi và di truyền. IS6110 là một trình tự chèn
chứa 1355 bp và thuộc về họ IS3 của các trình tự chèn. IS6110 đã được xác
định là có mặt trong các chủng M. tuberculosis, và chỉ khác nhau ở một vài
nucleotid giữa các bản copy với nhau. IS6110 có trình tự rất bảo thủ do đó
nó được chọn làm gen đích trong phản ứng multiplex PCR nhằm phát hiện
M. tuberculosis [13]. Từ lâu IS6110 đã được nghiên cứu và sử dụng rộng
rãi mặc dù trong trình tự genome của M. tuberculosis hơn 30 yếu tố lặp lại
có giá trị nhận diện [52]. Tuy nhiên một số nghiên cứu cũng chỉ ra rằng ở
một số vùng trên thế giới các chủng lao có rất ít hoặc thậm chí không có
các trình tự IS6110 [24, 32].

Hình 1.7. 6 bản copy của IS6110 trong hệ gen M. tuberculosis

Sự thay đổi về số lượng bản copy này là nền tảng của tính đa hình và
thường được sử dụng trong fingerprinting M. tuberculosis. Những chủng chứa

17


ít bản copy IS6110 hơn thì giống nhau hơn trong các mô hình fingerprint so
với các chủng chứa nhiều bản copy. Oligonucleotide có nguồn gốc từ trình tự
này được sử dụng cho phát hiện M. tuberculosis trong các bệnh phẩm lâm
sàng bằng kỹ thuật PCR [36, 52]. Nhiều tác giả đã chứng minh giá trị quan
trọng trong dịch tễ của trình tự IS6110 khi nghiên cứu về sự ổn định, tính đa
hình và số lượng bản sao của nó. Ở một số vùng số lượng bản copy IS6110
thấp (<5 copy) chiếm 25% số chủng, thậm chí có một số chủng không có
IS6110 [19, 52]. Một số nghiên cứu tiến hành trên các chủng lao có nguồn
gốc từ Châu Phi và Châu Âu cho thấy sự hiện diện của 5 đến 10 bản copy của
IS6110. Năm 1993 Das và cộng sự khi nghiên cứu các chủng có nguồn gốc từ
Hồng Kông lại thấy các chủng lao này có số lượng bản sao lớn hơn [24]. Tác
giả Dick Van Soolingen và cộng sự công bố rằng nhiều chủng lao ở Đông
Nam Á và khoảng 30% các chủng ở Ấn Độ chỉ chứa một bản sao của IS 6110
[25]. Năm 1993 Lilly K. W. Yeun và cộng sự khi nghiên cứu 41 chủng lao từ
bệnh nhân có gốc Việt Nam đã phát hiện 5 chủng chỉ có duy nhất một bản sao
của IS6110 và 4 chủng trong số đó không chứa các trình tự IS6110 [40].
Fomukong và cộng sự cũng nghiên cứu và thấy rằng một số chủng từ
Malaysia, Tanzania vad Oman cũng có duy nhất một bản sao của IS6110 [32].
• IS1081
Theo Collins và Stephens năm 1991, IS1081 là một trình tự chèn có độ dài
1324 bp có ở M. tuberculosis complex. IS1081 có từ 5 đến 6 bản copy trong
hệ gen. IS1081 có các tận cùng lặp lại ngược chiều và chứa khung đọc mở lớn
(ORF) [23]. IS1081 có độ đa hình thấp hơn so với IS6110 bởi IS1081 có hoạt
tính di chuyển yếu. Số lượng bản copy cũng thấp hơn IS6110, do đó có những

hạn chế trong việc sử dụng trong nghiên cứu dịch tễ học. Nó cũng không
được sử dụng thường xuyên để phân biệt B. bovis - BCG với các thành viên
khác thuộc M. tuberculosis complex [19]. Tuy nhiên, IS1081 cũng rất hữu ích

18


cho các thao tác di truyền và phát triển các xét nghiệm chẩn đoán phát hiện vi
khuẩn lao dựa trên phản ứng PCR [21, 31]. Một nghiên cứu cho thấy khi sử
dụng trình tự IS1081 trong PCR để chẩn đoán lao đã cho kết quả về độ nhạy
đạt 84,6% [16]
1.2.4.3. Gen 23S rDNA
Các trình tự rRNA được sử dụng như một dụng cụ để xác định sự phân
kỳ trong tiến hoá, phương pháp này có nhiều ưu điểm hơn so với các phương
pháp phân loại cổ điển. Trong DNA vi khuẩn thì locus di truyền rRNA bao
gồm các vùng 16S, 23S và 5S rRNA, giữa các vùng này là vùng đệm
(internally transcribed spacer - ITS). DNA trong vùng 16S-23S có sự thay đổi
lớn về độ dài và trình tự, sự thay đổi này rất có ích cho việc phân biệt loài ở
prokaryotes. Gần đây phương pháp PCR-RFLP được sử dụng rất có hiệu quả
trong việc phân biệt các chủng ở prokaryotes [21, 36]. Gen 23S rDNA là một
trình tự có kích thước lớn, tính đa hình cao và thường xuyên hơn so với các
vùng 16S rDNA và 5S rDNA. Trong nghiên cứu gần đây chỉ có đoạn trong
vùng 5V của 23S rDNA được giải trình tự để phân tích so sánh. Trình tự 23S
rDNA ở M. tuberculosis khác với các loài đã phát hiện ở 7 vị trí, đây là các vị
trí thích hợp cho việc thiết kế các primer và probe. Vùng 5V của 23S rDNA
có thể dùng làm gen đích cho phát hiện nhanh và xác định mycobacteria ít
nhất ở mức độ loài. Sự khác nhau đáng kể giữa các loài không phải
mycobacteria và mycobacteria có ý nghĩa trong lâm sàng cho thấy giá trị tiềm
năng của vùng này trong chẩn đoán.
Theo tác giả Mekonnen Kurabachew và cộng sự (2004) gen đích 23S

rDNA có mặt ở tất cả các chủng lao gây bệnh do đó sử dụng cặp mồi đặc hiệu
khuếch đại vùng gen đích 23S rDNA là một thuận lợi cho việc phát hiện M.
tuberculosis complex trong những trường hợp không có trình tự IS6110 ở một
số chủng M. tuberculosis complex. 23S rDNA cũng có thể sử dụng để phân

19


biệt M. tuberculosis và M. bovis và cũng được sử dụng để phân biệt các chủng
lao gây bệnh trong các mycobacteria [41].
1.3. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN LAO
1.3.1. Phương pháp soi trực tiếp
Phương pháp phát hiện nhanh vi khuẩn lao trước đây thường dựa vào
thao tác nhuộm Ziehl-Neelsen sau đó soi trực tiếp trên kính hiển vi. Đây là
một phương pháp phát hiện nhanh chỉ trong 30 phút đến 1 giờ, khá đơn giản
và có chi phí thấp nhưng nồng độ vi khuẩn phải đạt 104 khuẩn/1ml nên độ
nhạy thấp hơn so với phương pháp nuôi cấy vi khuẩn lao. Người ta đã cải tiến
phương pháp này bằng kĩ thuật li tâm và cô đặc để làm tăng độ nhạy của chẩn
đoán. Ở các nước phát triển họ sử dụng kính hiển vi huỳnh quang nhằm nâng
cao độ nhạy và rút ngắn thời gian chẩn đoán so với các phương pháp truyền
thống dựa trên cơ sở của phương pháp nhuộm Ziehl-Neelsen. Phương pháp
này có ưu điểm là cho kết quả nhanh và không đòi hỏi quá khắt khe về kỹ
thuật do đó làm giảm những lỗi nhỏ trong quá trình làm thí nghiệm. Nhược
điểm của phương pháp là giá thành của các hóa chất, thiết bị dùng cho thí
nghiệm rất đắt đó là vấn đề lớn đối với các nước nghèo và có thu nhập thấp.
Những năm gần đây phương pháp nhuộm diacetate đánh dấu huỳnh
quang được sử dụng nhằm đánh giá sự có mặt cũng như khả năng tồn tại của
vi khuẩn trong các mẫu đờm. Phương pháp này được đề xuất để phát hiện
sớm và chính xác vi khuẩn lao đã qua điều trị nhưng chưa thành công do giá
thành cao [27, 34].

1.3.2. Phương pháp nuôi cấy
Nuôi cấy vi khuẩn lao trước đây được coi là phương pháp tiêu chuẩn trong
chẩn đoán phát hiện trong phòng thí nghiệm. Đây là phương pháp được thực

20


hiện trong môi trường Lowenstein . Nhược điểm của nó là chậm và mất nhiều
thời gian (4-8 tuần), nhưng ngược lại nó khá đơn giản và giá thành thấp. Đã
có những phương pháp cải tiến trên môi trường nuôi cấy lỏng chẳng hạn như
phương pháp BACTEC đánh dấu phóng xạ hay hệ thống phát hiện tự động
mycobacteria MGIT (Mycobacteria Growth Indicator Tube) sử dụng huỳnh
quang và đã làm tăng được tốc độ chẩn đoán [17].
Ngoài ra còn một số phương pháp chẩn đoán khác cũng được đề cập tới
như phương pháp γ-interferon (IFN-γ) [17, 18] và phương pháp BacT/Alert
3D. Những phương pháp này đều có những ưu nhược điểm nhất định và điều
cơ bản nhất là giá thành, thời gian cũng như độ chính xác của từng phương
pháp là những vấn đề cần phải xem xét. Chính vì vậy các phương pháp này
không thường xuyên được sử dụng trong chẩn đoán phát hiện vi khuẩn lao.
1.3.3. Sinh học phân tử trong chẩn đoán lao
1.3.3.1. Kĩ thuật PCR
Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) được phát minh vào năm
1985 bởi nhà hóa sinh người Mỹ Kary Mullis và được hoàn thiện hơn bởi
Saiki và cộng sự. Nguyên lý của kĩ thuật này đã được Khorana và đồng
nghiệp mô tả từ trước đó. Kỹ thuật PCR cho phép khuếch đại các trình tự
DNA đặc hiệu nhờ vào các gen đích tương ứng với các DNA này và các
thành phần cần thiết của phản ứng PCR. Kỹ thuật này đã được áp dụng rộng
rãi trong rất nhiều lĩnh vực như khoa học hình sự, mô bệnh học, các chẩn
đoán trước sinh và chẩn đoán các mầm bệnh [4, 12, 13, 14, 15, 20, 28].
Những nghiên cứu ở cấp độ phân tử về vi khuẩn lao cho thấy các yếu tố

DNA lặp lại trong M. tuberculosis có liên quan với sự đa dạng DNA trong
nhiễm sắc thể của vi khuẩn lao. Sự đa dạng này cho phép các nhà nghiên cứu
phân biệt được các chủng lao khác nhau. Vì vậy các yếu tố này rất quan trọng

21


và cần thiết trong các nghiên cứu dịch tễ học bệnh lao, như nghiên cứu sự lây
truyền trong cộng đồng, sự bùng nổ dịch và đặc biệt là đường lây của các
chủng kháng thuốc. Có hai dạng yếu tố DNA lặp lại đó là: yếu tố IS 6110, yếu
tố này có khả năng di chuyển, đoạn gen đích này có chiều dài 1300 cặp base.
Ngoài ra còn có yếu tố khác là yếu tố lặp lại trực tiếp DR (Direct Repeat).
Yếu tố IS6110 là yếu tố được sử dụng nhiều nhất trong các nghiên cứu dịch tễ
học vì có trong nhiều chủng vi khuẩn lao khác nhau. Tuy nhiên một số nghiên
cứu gần đây chỉ ra rằng một số chủng M. tuberculosis không chứa trình tự
IS6110, như các chủng phân lập được từ Đông Nam Châu Á và Ấn Độ. Theo
Ernesto Liebana và cs (1996) thì có tới 4 chủng trong 304 chủng M.
tuberculosis phân lập ở Việt Nam không có trình tự IS6110 do đó có thể gây
ra hiện tượng âm tính giả [30]. Các nghiên cứu cũng đã phát hiện trình tự IS
1081 có ở tất cả các chủng M. tuberculosis nghiên cứu và không tìm thấy ở
các loài thuộc họ Mycobacteria khác, do đó có thể dùng cả IS 1081 cho phản
ứng PCR và Multiplex PCR để phát hiện M. tuberculosis đặc biệt là các
chủng ở Đông Nam Á [23]. Ngoài ra gen 23S rDNA là đoạn gen mã hoá cho
tiểu phần 23S của ribosome cũng được các tác giả gợi ý sử dụng trong việc
phát hiện và xác định sự có mặt của vi khuẩn lao [39].
1.3.4.2. Kĩ thuật multiplex PCR
Kỹ thuật multiplex PCR đã ra đời như một bước hoàn thiện hơn về khả
năng chẩn đoán của PCR. Chamberlain và cộng sự là những người đầu tiên
mô tả, phát triển kỹ thuật multiplex PCR vào năm 1988. Trong kỹ thuật
multiplex PCR, nhiều gen đích được khuếch đại cùng một lúc bằng nhiều cặp

mồi trong cùng một phản ứng. Kỹ thuật multiplex PCR tiết kiệm thời gian,
công sức và đóng vai trò rất quan trọng trong chẩn đoán phân tử bao gồm
phân tích đột biến gen, tính đa hình DNA, phân tích định lượng, phân tích đột
biến và phát hiện RNA. Trong lĩnh vực bệnh truyền nhiễm, kỹ thuật này rất
22


có giá trị trong chẩn đoán xác định virus, vi khuẩn, nấm và ký sinh trùng,
ngoài ra kỹ thuật này còn để phân tích các sinh vật chuyển gen, phân tích
microsatelite và xác định kiểu gen. Đặc biệt, phản ứng multiplex PCR rất hữu
ích cho việc phát hiện trực tiếp M. tuberculosis từ các mẫu lâm sàng . Với các
kết quả nghiên cứu về tính khuyết gen ở một số chủng lao trên thế giới đã
được công bố thì việc tiến hành multiplex PCR càng trở nên cần thiết.
1.3.4. Một số nghiên cứu về tỷ lệ khuyết gen của M.tuberculosis trên thế giới
Trên thế giới đã có một số tác giả nghiên cứu về hiện tượng khuyết gen
và số lượng bản copy của gen IS6110 ở M. tuberculosis. Một số nghiên cứu
tiến hành trên các chủng lao có nguồn gốc từ Châu Phi và Châu Âu cho thấy
sự hiện diện của 5 đến 15 bản copy của IS6110. Tác giả Van Soolingen và
cộng sự (1991) công bố rằng nhiều chủng ở Đông Nam Á và khoảng 30% các
chủng ở Ấn Độ chỉ chứa một bản sao của IS6110 [53]. Năm 1993 Lilly K. W.
Yeun và cộng sự khi nghiên cứu 41 chủng lao từ các bệnh nhân có gốc Việt
Nam đã thấy 5 chủng chỉ có duy nhất một bản sao của IS6110 và 4 chủng
trong số đó không chứa các trình tự IS6110 [40]. Một số chủng từ Malaysia,
Tanzania và Oman cũng có duy nhất một bản sao của IS6110 [32]. Das và
cộng sự (1993) đã công bố trong một nghiên cứu khoảng 40% các chủng từ
Madras không có hoặc chỉ có duy nhất một bản sao của IS6110 [24], Ở các
chủng lao chỉ có duy nhất một bản sao hoặc không có bản sao nào cho gen
IS6110 thì việc sử dụng trình tự gen đích này trong việc phát hiện vi khuẩn
lao sẽ không mang lại kết quả chính xác. Đến nay, ở Việt Nam chưa có một
nghiên cứu chính thức nào về hiện tượng khuyết gen với số lượng mẫu lớn

trên cả 3 miền Bắc Trung Nam để có được đánh giá tổng quát về hiện tượng
khuyết gen trong M. tuberculosis ở Việt Nam.

23


Chương 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên các mẫu chủng vi khuẩn lao M.
Tuberculosis được thu thập từ 3 bệnh viện ở cả ba miền Bắc – Trung – Nam
Việt Nam.
Miền Bắc: Bệnh viện Lao và Bệnh phổi TƯ – Kí hiệu chủng TB02
Miền Trung: Bệnh viện Đa Khoa TW Huế - Kí hiệu chủng TB05
Miền Nam: Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch – Kí hiệu chủng TB06
Tất cả các mẫu chủng trên được phân lập sau đó tăng sinh trên môi trường
Lowenstein rồi tách chiết thu DNA sử dụng trong quá trình nghiên cứu.
2.1.2. Cỡ mẫu nghiên cứu
Cỡ mẫu được tính theo công thức tính cỡ mẫu theo khuyến cáo của
WHO cho các nghiên cứu dịch tễ học [54]
n = Z21-αα/2 P (1-P)/ d2
Trong đó :
Z1- α/2 = 1,96 (với độ tin cậy β= 95%)
P : Tỉ lệ ước đoán trong quần thể (tỷ lệ ước đoán khuyết gen đích
IS6110 ở Việt Nam là 5 % theo các nghiên cứu trong nước công bố).
d : Độ dao động của tỉ lệ phát hiện không quá 5% so với tỷ lệ thực
n : Cỡ mẫu tối thiểu cần đạt được
Căn cứ công thức trên, chọn d = 2% thì cỡ mẫu tối thiểu cần đạt là n =
456, thực tế đã thu thập 750 chủng vi khuẩn lao ở cả 3 miền.

24


Cách lấy mẫu: Thu thập ngẫu nhiên chủng vi khuẩn phân lập được trong
khoản thời gian thuộc giai đoạn 2007-2010 tại các điểm nghiên cứu.
2.2. VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU
Các hóa chất, sinh phẩm, trang thiết bị được sử dụng tại phòng thí nghiệm
Vi sinh vật và các mầm bệnh sinh học – Trung tâm nghiên cứu ứng dụng Sinh
Y Dược – Học viện Quân Y.
2.2.1. Các hóa chất và thiết bị
Các hóa chất và thiết bị chính phục vụ cho nghiên cứu được trình bày
trong bảng 2.1 và 2.2

25