Bước đầu nghiên cứu thành phần hoá học của đông trùng hạ thảo( cordyceps SP1 ) ở Nghệ An

1

Bộ giáo dục và đào tạo
Trờng Đại học vinh

Đoàn Thị Tuyến

Bớc Đầu nghiên cứu thành phần hoá Học
CủA ông trùng hạ thảo (Cordyceps sp1)
ở Nghệ An

Luận văn thạc sĩ hoá học

Vinh

M U
1. Lý do chn ti
Vit Nam nm vựng trung tõm ụng Nam hng nm cú lng
ma v nhit trung bỡnh tng i cao. Vi khớ hu nhit i giú mựa
núng, m ó cho rng Vit Nam mt h thc vt a dng v phong phỳ.


2
Nấm ký sinh côn trùng không chỉ là một nhóm có tính đa dạng sinh
học cao mà còn có vai trò quan trọng trong phòng trừ sinh học sâu hại cây
trồng và trong y - dược tạo các hợp chất có hoạt tính sinh học cao. Trên thế
giới có khoảng 1,5 triệu loài nấm, trong đó có hơn 400 nghìn loài nấm ký
sinh côn trùng đã được biết ở trên thế giới.
Nghệ An là tỉnh có Vườn Quốc gia Pù Mát, khu Bảo tồn thiên nhiên Pù
Huống và khu Bảo tồn thiên nhiên Pù Hoạt. Đây là những vùng
được đánh giá là có tính đa dạng sinh học rất cao. Tại đây chứa

đựng nguồn lợi rất lớn về đa dạng sinh học, trong đó có nguồn
lợi nấm ký sinh côn trùng và có thể sử dụng chúng làm nguyên
liệu tốt cho công nghệ sinh học nấm - côn trùng tạo chế phẩm
sinh học trong phòng trừ sâu hại cây trồng và tạo sản phẩm có
hoạt tính sinh học cao trong y - dược.
Cho đến nay, nấm ký sinh côn trùng là nhóm duy nhất chưa nhận
được sự quan tâm đúng mức của các nhà khoa học công nghệ nghiên cứu về
nấm và côn trùng ở Việt Nam cũng như trên thế giới.
Từ lâu, Đông trùng hạ thảo vẫn được xem là bài thuốc quý cho y học
phương Đông. Cho tới bây giờ, người Việt Nam và cả thế giới cũng còn chưa
biết nhiều về loài dược liệu này nhưng ở Trung Quốc, các danh y đã sử dụng
Đông trùng hạ thảo trong các bài thuốc của mình từ hơn 2.000 năm trước.
Do việc nghiên cứu về thành phần hoá học của Đông trùng hạ thảo
(Cordyceps sp1) chưa được tiến hành ở Việt Nam. Chính vì vậy chúng tôi
chọn đề tài: “Bước đầu nghiên cứu thành phần hoá học của Đông trùng
hạ thảo(Cordyceps sp1) ở Việt Nam” từ đó góp phần xác định thành phần
hoá học của các hợp chất và tìm ra hướng mới cho thực phẩm chức năng ở
nước ta.
2. Nhiệm vụ nghiên cứu


3
Trong luận văn này, chúng tôi có các nhiệm vụ:
- Chiết chọn lọc với các dung môi thích hợp để thu được hỗn hợp các
hợp chất từ Đông trùng hạ thảo (Cordyceps sp1).
- Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất Đông trùng hạ
thảo(Cordyceps sp1).
3. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là dịch chiết Đông trùng hạ thảo (Cordyceps
sp1). ở Việt Nam.

Chương 1
TỔNG QUAN
1.1. Chi Cordyceps
1.1.1. Phân loại
Đông trùng hạ thảo còn gọi là trùng thảo, hạ thảo đông trùng hay
đông trùng thảo là một giống nấm túi có tên khoa học là Cordyceps


4
sinensis thuộc nhóm Ascomycetes mọc ký sinh trên sâu non ( ấu trùng) c ủa
một loại sâu thuộc họ sâu Cánh bướm thuộc chi Hepialus. Thường gặp
nhất là sâu non của loài Hepialus armoricanus. Ngoài ra còn 40 loài khác
thuộc chi Hepialus cũng có thể bị Cordyceps sinensis ký sinh. Chi nấm
Cordyceps có tới 350 loài khác nhau, chỉ riêng ở Trung Quốc đã tìm th ấy
60 loài. Tuy nhiên cho đến nay người ta m ới chỉ nghiên cứu nhi ều nh ất
được về 2 loài Cordyceps sinensis và Cordyceps militaris Link. Lo ài th ứ
hai được gọi là Nhộng trùng thảo [5].


5

Hình 1: Ảnh của một số loài nấm ký sinh Cordyceps
Nấm và sâu hợp sinh với nhau. Vào mùa đông, con sâu non nằm ở


6
dưới đất, nấm phát triển trên toàn thân con sâu để hút ch ất dinh d ưỡng l àm
cho con sâu chết. Đến mùa hạ, nấm sinh cơ chất (stroma) m ọc ch ồi khỏi
mặt đất nhưng gốc vẫn dính liền vào đầu sâu. Người ta thường đào l ấy t ất

cả xác sâu và nấm mà dùng làm thuốc. Vì mùa đông là con sâu, mùa hạ
lại thành cây cỏ nên vị thuốc này có tên là đông trùng - hạ thảo. Chỉ phát
hiện được Đông trùng hạ thảovào mùa hè ở một số cao nguyên cao hơn mặt
biển từ 3500 đến 5000m.
Hàng nghìn năm nay, Đông trùng hạ thảođược coi là thần dược trong
y học cổ truyền Việt Nam và Trung Quốc. Theo y học, Đông trùng h ạ th ảo
có 2 loài: Sacc Link (dài từ 4 đến 11 cm) và Cordiceps ophiglossoides HerFr (dài từ 2 đến 6cm).
Các nhà y học cổ truyền mô tả sự hình thành của Đông trùng hạ thảo
như sau: Bộ nấm nang Ascomyces sống ký sinh trên vật chủ l à sâu non của
một loài bướm (Caterpillar) họ cánh vẩy, đặc biệt ở loài bướm đêm
Hepialus armoricanus. Ban đêm bướm đẻ trứng, trứng nở thành ấu trùng rồi
thành sâu non. Mùa đông sâu non chui xuống đất sinh sống.
Trong môi trường ẩm, bào tử nấm Ascomyces phát triển trên thân sâu
nở thành các sợi nấm, lan dần vào thịt sâu, phá hủy thân sâu non. Các s ợi
nấm phát triển thành một khối dày, chắc, thân sâu chỉ còn là một cái vỏ bao
bọc các sợi nấm.
Sang mùa hạ, từ miệng sâu, cuống nấm mọc ra, đội đất nhô lên, gi ữa
cuống phình ra, trên bề mặt cuống có những mầm nhọn. Các mầm nh ọn
này nẩy ra một số hạt tròn, trong chứa các bào t ử n ấm. Thân n ấm cao g ần
10cm. Khi đào nấm lên làm thuốc, người ta thấy gốc nấm còn dính li ền
với đầu của xác sâu.
Sau đây là vài chi tiết mô tả của sâu và cây nấm th ực s ự: Ấu trùng của
bướm dài khoảng từ 3-6 cm, dày độ 0,4 - 0,7, sắc nâu vàng, mình nhám với
nhiều vạch chạy ngang. Sâu có 8 cặp chân cụt ở khúc bụng và 4 cặp chân
hơi dài ở khúc trên. Cắt ngang mình sâu thì thịt sâu ở ruột m àu trắng hơi
ngả vàng vàng, còn chung quanh có màu vàng sẫm.
Cây nấm mọc từ đầu con sâu trông nhưng một cái cọng cắm vào, đầu
cọng phình ra như cái chùy rồi thuôn nhỏ lại. Cây mầu nâu hay sẫm đen
lại, dài 4 - 8 cm, kính đo 0.3 cm, chót đầu há ra cho thấy ruột trắng ở trong
và một hốc rỗng, đây là phần mang bào tử thường bị gẫy khi phơi khô.

7
1.1.2. Thành phần hoá học của chi Cordyceps
Về thành phần hóa học, đông trùng hạ thảo chứa 25-32% protit (gần
đây có thông báo cho rằng tỷ lệ này đạt tới 44,26%), khi thủy phân cho t ới
14 - 19 axit amin khác nhau. Ngoài ra, còn có ch ứa nhi ều lo ại vitamin nh ư
A, B1, B2, B12, C, E, K (trong 100g đông trùng hạ thảo có 0,12 g vitamin
B12; 29,19 mg vitamin A; 116,03 mg vitamin C, ...) và các nguyên tố vi
lượng như Na, K, Ca, Mg, Al, Mn, Cu, Zn, Bo, Fe... trong đó cao nh ất l à
phosphor, một lượng đáng kể nước, chất béo, protein, chất sợi thô,
carbohydrat tro khoáng chống oxy hóa, chống virus, chống ung bướu, axit
glutamic [5], [45].
Mười một bioxanthracen (1-11) và 2 đồng phân (12 và 13), được phân
lập từ nấm ký sinh trên côn trùng Cordyceps pseudomilitaris BCC1620 [25].

H3CO

H3CO

OH

OH
O

O
H 3CO

CH3

OH
OH

H 3CO

OAc
OH

CH3

CH3
O

H3CO
OH

H3CO

(1)

CH3

O

H3CO
H3CO

(2)

OH

8
H3CO

H3CO

OH

OH

O
H 3CO

OAc
OAc

O
CH3

H 3CO

CH3

OH
H

CH3
O

H3CO

CH3

OH

H3CO

O

H3CO
H3CO

(3)
H3CO

OH

(4)
H3CO

OH

OH

O
H CO

OAc
H

O
CH3

H 3CO

CH3

H
H

CH3

CH3

O

H CO

O

H3CO
H3CO

OH

(5)

H3CO

OH

(6)


9
H3CO

OH

H3CO

OH

O
H CO

O
CH3

OAc
H

H 3CO

CH3

H
H

CH3

CH3

O

H CO

O

H3CO
H3CO

OH

OH

H3CO

(7)

(8)
H3CO

OH

(9)
OCH3 OH

OCH3 OH

CH3
OH
H 3CO OH

H 3CO
O
H 3CO
OH

CH3
OMe

CH3
CH3

OH
H 3CO

O

CH3
H3CO

OH

OH

O
H 3CO

CH3
O

O
OCH3 OH

(10)

OCH3 OH

(11)


10
OCH3 OH

OCH3 OH

O

O
H3CO

CH3

H3CO

CH3

H

OH

(12)

(13)
O

(14)
HO
O

O

O O

O

O

Cordyanhydride A
O
HO
O

O

O O

O

O O

O

O

(15) Cordyanhydride B
Kou Y.C và cộng sự [31] dã phân lập từ dịch chiết metanol của loài
Cordyceps cicadae là beauvericin (16), beauvericin A (17), beauvericin B
(18) bassiatin (19), bassiatin A (20).


11
CH2CH3

CH3
N

O
O

O
O

N

O

N

O
O

O

O
O

O

N

CH3
N

O

O

O

O

CH3
N

O

(16) Beauvericin

O

O

(17) Beauvericin A
CH2CH3

(18) Beauvericin B

N

O
O
N

N
O

O

O
O

O
O

O

O

O
O

CH2CH3
N

O

N
O

(19)
Bassiatin
(20) Bassiatin A
CH2OH

(21)
Adenosine

HNCH2
CH2OH

(22) N HNCH2
Cordycepin N N
HO

(23)

N

N
N

N O N

HO
O
OH OH
OH OH

NH2
N NH
2

N

N
N
N N
HO
N O N
HO
O

O


12
Hydroethyladenosine
(24) Dideoxyadenosine

Các chất béo chủ yếu là axit béo chưa bão hòa nh ư oleic, linoleic. Từ
loài Cordiceps sinensis, các nhà nghiên cứu đã chiết xuất được uracil,
uridin, adenin và adenosin; từ loài Cordiceps ophioglossoides đã chi ết xu ất
được ophiocordin có tính kháng sinh [9], [28].
Jia J. M. và cộng sự [26] đã phân lập từ loài Cordyceps sinensis
cyclodipeptide mới có tên là cordycedipeptide A, hai hợp chất 3-isopropyl-6isobutyl-2,5-dioxopiperazine
và
3,6-di(4-hydroxy)
benzyl-2,5dioxopiperazine. Thử độc tính tế bào cho thấy cordycedipeptide A có khả
năng kháng các dòng tế bào L-929, A375 và Hela.
H

H

H

O

O
N
H

N
H

N
H

N
H

NH2
O

(25) Cordycedipeptide A

(27) 3,6di(4-hydroxy)
benzyl-2,5- HO

H
O

O

(26)3-isopropyl-6-isobutyl
2,5-dioxopiperazine

O

H
N

OH
O

N
H

dioxopiperazine

HO

HO

O
O


13
(28) Sitosterol

HO

(29) 5a,8a-epidioxy-22E-ergosta-6,22-dien-3b -ol

O
O

HO

O

(30)5a,8a-epidioxy-22E-

(31), 5a,6a-epoxy-5a-ergosta-

ergosta-6,9(11),22-trien-3β -ol

7,22-dien-3β -ol

Gần đây, Jia J. M. và cộng sự [27] đã phân lập từ loài Cordyceps
sinensis hai hợp chất mới cordyceamide

A, cordyceamide

B và

aurantiamide.
OH
O

O

HO

HN

N
H
O

O
O

(32) Cordyceamide A

HO

HN

N
H
O

O
O

(33) Cordyceamide B


14

(34) Aurantiamide

O

(35)

O

N
H
O

HN

HO
OH

O

OH

HO

O

H
N

O

O

OH
O

O
N
H

Quan trọng hơn là trong sinh khối Đông trùng hạ thảo có nhiều chất
hoạt động sinh học mà các nhà khoa học đang phát hiện dần dần ra nhờ
các tiến bộ của ngành hoá học các hợp chất t ự nhiên. Nhi ều ho ạt ch ất n ày
có giá trị dược liệu thần kỳ như axit cordiceptic, cordycepin, adenosine,
hydroxyethyl - adenosine và đặc biệt là nhóm hoạt chất HEAA (Hydroxy Ethyl - Adenosine - Analogs) [17], [18].
Kredich

N.M.

và

cộng

sự

[30]

đã

phân

lập

homocitrullylaminoadenosine từ Cordyceps militaris.
(36)

NH2
N

N
N

O

N
HO

OH
O

HN

O
NH2

N
H

H2N

Homocitrullylaminoadenasine
OHC
(37) Cordyformamide

OH
NH

HO

OH
HN

HO

CHO

hợp

chất

15
Bunyapaiboonsri T. và cộng sự [10] đã phân lập từ nấm ký sinh trên
côn trùng Cordyceps sp BBC 1861 các diphenyl ete.
HOH2C
OMe
HO
HO

(38) Cordyol A

HOH2C
OMe
HO
(39) Cordyol B
HO

OH

O

O

CH3 OH

CH3 O

O

CO2CH3

OH
CH3

OH

O

HO

HO

CH3

(40) Cordyol C

(41) Diorcinol

OH

OH

CH3

OH

O
H 3C

CH3

OH

OH

OH

O

HO

CH3

CH3

CH3

CH3

OH

O

OH
CH3

(42) Violaceol – I

(43) Violaceol – II

Seephonkai P., và cộng sự [43] đã phân lập 1 propolone từ nấm ký
sinh trên công trùng Cordyceps sp. BBC 1681,
O
OH
HO
O


16
(44) Cordytropolone
1.1.3. Sử dụng và hoạt tính sinh học [1], [5],
Từ lâu, Đông trùng hạ thảo vẫn được xem là bài thuốc quý cho y học
phương Đông. Cho tới bây giờ, người Việt Nam và cả thế giới cũng còn chưa
biết nhiều về loài dược liệu này nhưng ở Trung Quốc, các danh y đã sử dụng
Đông trùng hạ thảo trong các bài thuốc của mình từ hơn 2.000 năm trước.
Đông trùng hạ thảo có nguồn gốc từ cao nguyên Thanh Tạng - Trung
Quốc. Trước thời Hán, dân tộc Tạng phát hiện ra m ột loại dược ph ẩm có tên
gọi địa phương là “Ya Zha Geng Bu” điều trị bệnh phổi, khi nhà vua
Songzain Gambo đến kinh thành Trường An thành hôn với công chúa V ăn
Thành, Ya Zha Geng Bu đã đến Trung Nguyên, góp phần điều trị bệnh tật
cho các dân tộc, loại dược phẩm này đã được ghi vào sách “Nguyệt Vương
Dược Chẩn” vào thế kỷ thứ VIII trước Công nguyên.
Do loại thực vật này sinh sống trên vùng đất giá rét cao nguyên, có
hình dạng như con trùng nên dân tộc Hán còn gọi nó l à Trùng Tuy ết. Trong
“Bản thảo cương mục” của nhà y dược học nổi tiếng đời Minh - ông Lý Th ời
Trân ghi nhận: Trùng Tuyết “Cam hạn vô độc ”, có tác dụng đi ều trị bệnh
“giải nội nhiệt khát”. Đến đời Thanh, căn cứ vào đặc tính về hình d ạng
“mùa đông là trùng, mùa hạ là thảo” của Trùng Tuyết ng ười ta g ọi nó l à
“Đông Trùng Hạ Thảo”. Danh y đời Thanh - ông Ngô Ngh ĩa L ạc trong sách

y học nổi tiếng “Bản thảo Trùng Tân” đã nêu rằng: Đông trùng hạ thảo“Cam
bình, bổ phế ích thận, chỉ huyết hóa đờm, trị ho lao”. Trong sách y h ọc n ổi
tiếng “Dược tính khảo” ở đời Thanh cũng chứng minh rằng: “Đông trùng h ạ
thảobế tinh ích khí, chuyên bổ mệnh môn”.
Loài thuốc quý này chỉ mọc trên những đỉnh núi cao chót vót hơn
4000m của vùng Tứ Xuyên - Tây Tạng và việc tìm kiếm, thu hoạch là cả
một chặng đường cam go vất vả. Theo nhiều sách cổ ghi lại, khi các m ục
đồng sống lang bạt trên dãy Hymalaya nhận ra một vài con trâu Yark (lo ài
trâu đặc biệt, chỉ có ở Tây Tạng) ăn một loại nấm lạ luôn kh ỏe m ạnh v à có
khả năng tình dục cao hơn hẳn so với bầy đàn, họ đã quyết định hái loại nấm
lạ đó về dùng thử. Và kết quả vượt quá sự mong đợi.
Thời gian trôi qua, thứ nấm lạ này cũng theo chân các đo àn quân vi ễn
chinh, những người hành hương từ cao nguyên Tây Tạng về tới Trung Thổ và


17
các danh y ngay lập tức nhận ra những giá tr ị quý báu c ủa nó. L ập t ức, th ứ
nấm lạ này được tiến cung và trở thành một trong những loại d ược li ệu quý
hiếm nhất, chỉ dùng cho Hoàng tộc và các đại thần. Ban đầu, ng ười ta dùng
nước sôi đun nó lên, pha với trà hoặc ăn nguyên cả cây cả r ễ. Sau đó, nó
được nhồi vào vịt để làm thức ăn bổ dưỡng, hỗ trợ khả năng tình dục cho c ả
nam và nữ, nấu với gà để ăn vào đầu mùa đông, đầu mùa xuân, giúp c ơ th ể
nhanh chóng thích nghi với những sự thay đổi khí hậu. Rồi nó được bào chế
và dùng để trị các chứng bệnh như ho lao, thiếu máu, đau lưng, làm chậm
quá trình lão hóa, giúp tăng sức khỏe trong thời gian dưỡng bệnh…Và người
Trung Quốc cổ đại coi nó như là một loại nhân sâm mới. Sau này, việc s ử
dụng loài “nấm” này trở nên rộng rãi, phổ biến hơn trong dân gian nh ờ m ột
số người có sáng kiến nuôi trồng và phát triển nó trên nền gạo, sau đó bào
chế ra thành nhiều dạng sản phẩm như bột khô, thuốc nước, tuy nhiên, tác
dụng cũng đã bị giảm đi đáng kể so với hàng “chính phẩm”. Cái tên Đông

trùng hạ thảobắt đầu xuất hiện vào khoảng sau thế k ỷ thứ 10, khi nh ững
người Hán đầu tiên đặt chân lên cao nguyên Tây Tạng, tận mắt nhìn thấy
loài thuốc này sinh trưởng, tồn tại và phát triển trong thiên nhiên hoang dã.
Đông trùng hạ thảo(các tên khác là Trùng thảo, Đông trùng th ảo, mùa Đông
có dạng con sâu, mùa hạ mọc thành cây cỏ) là một loài thực vật thuộc h ọ
nấm. Đông trùng hạ thảodo chất đệm nấm mọc dính liền vào đầu sâu non
mà thành. Đầu sâu non giống như con tằm, dài chừng 3-5cm, đường kính
khoảng 0.3-0.8cm. Bên ngoài có mầu vàng sẫm hoặc nâu vàng với khoảng
20-30 vằn khía, vằn khía ở phần đầu nhỏ hơn. Phần đầu có m ầu nâu đỏ,
đuôi giống như đuôi con tằm, có tất cả 8 cặp chân. Chất đệm n ấm hình que
cong mọc ra từ mình sâu non, dài hơn sâu non m ột chút. Sâu non d ễ b ẻ gãy,
ruột bên trong căng đầy, màu trắng hơi vàng; ch ất đệm nấm khá dai v à bên
trong ruột hơi rỗng, có màu trắng ngà. Vào mùa đông, sâu n ằm d ưới đất,
nấm phát triển và hút chất bổ toàn thân làm sâu chết. Đến mùa hạ, nấm mọc
chồi khỏi mặt đất, hình dạng giống ngón tay, dài khoảng 4-11cm, nhưng gốc
vẫn dính liền vào đầu sâu. Khi thu hoạch Đông trùng hạ thảo, người ta
thường đào lấy cả xác sâu lẫn nấm.
Theo Toan Ánh trong cuốn Phong tục Việt nam t ừ bản thân đến gia
đình, ngoài Bắc ta có ăn: “Đông trùng hạ thảo ăn béo ngầy ngậy. Ta cho đây
là một món ăn bổ. Đông trùng hạ thảocòn được dùng để ngâm rượu như


18
ngâm rượu thuốc”. Một số bác sĩ Việt Nam cho biết hiện nay cũng có vài
người bị ung thư dùng Đông trùng hạ thảophụ trợ với hóa h ọc và x ạ tuy ến tr ị
liệu hiện đại, tuy không chữa lành nhưng có thấy hiệu quả trong s ự nâng đỡ
và bồi bổ thể trạng giúp cho bịnh nhân chịu đựng cầm cự với t ử th ần lâu d ài
hơn.
Trong Đông y, Đông trùng hạ thảo được liệt vào danh sách những loài
thuốc quý hiếm nhất, khó tìm nhất. Theo Bản thảo cương m ục viết năm

1575 của danh y Lý Thời Trân (nhà Minh), Đông trùng hạ thảo được x ếp
ngang với nhân sâm về công năng chữa bênh - thuộc vào loại toàn di ện
nhất.
Giới khoa học phương Tây bắt đầu nghiên cứu Đông trùng hạ thảo vào
năm 1993, khi Trung Hoa lục địa tổ chức một Đại hội Thể thao với s ự tham
dự của nhiều quốc gia. Một toán chín nữ lực sĩ Trung Hoa đã to àn th ắng v ề
môn chạy đua. Thành tích của họ đã làm giới thể thao quốc tế kinh ng ạc vì
cả thẩy chin nữ lực sĩ đã phá kỷ lục 42 giây trên kỷ lục quốc tế! Người ta
nghi có sự gian lận bằng cách “đốp ping” (doping) tức là chích kích tố
steroid để tăng cường một cách giả tạo nhất thời cho các l ực s ĩ h ăng s ức
trước khi thi đua, nên đã điều tra thử nghiệm kỹ. Kết quả chứng minh rằng
không phải gian lận! Tuy nhiên họ nhận thấy trong thực đơn ăn kiêng c ủa
các vận động viên điền kinh Trung Quốc phá k ỷ lục thế gi ới ở môn ch ạy có
hai thành phần rất lạ. Thứ nhất là máu rùa, thứ hai chính là Đông trùng hạ
Thảo. Khi hỏi nhóm dìu dắt, huấn luyện viên Trung hoa thì h ọ nói l à nh ờ
dùng Đông trùng hạ thảo nên các lực sĩ mới thi thố tài năng tuyệt diệu như
vậy. Tháng 10 năm 2004, trong một phóng sự đường trường về dãy
Hymalaya do đài BBC (Anh Quốc) thực hiện, phóng viên Michael Palin đã
tuyên bố với cả thế giới rằng “Đông trùng hạ thảo” có thể tr ị được t ất cả các
bệnh”
1.2. Đông trùng hạ thảo (Cordyceps sp1)
1.2.1. Mô tả
Nấm: Fungi
Họ- Clavicipataceae
Chi- Cordyceps
Loài- Cordyceps sp1
Đông trùng hạ thảo (Cordyceps sp1) là một giống nấm mọc kí sinh


19

trên sâu non của một loài sâu thuộc họ sâu Cánh bướm. Nấm và sâu hợp sinh
với nhau. Vào mùa đông, con sâu non nằm dưới đất, nấm phát triển vào toàn
con sâu để hút chất trong con sâu làm cho con sâu chết. Đến mùa hạ, nấm
sinh cơ chất (stroma) mọc chồi khỏi mặt đất, nhưng gốc vẫn dính liền vào
đầu sâu, đào lấy tất cả xác sâu và nấm mà dùng.
Vị thuốc bao gồm cả nấm và sâu, hái vào tháng 6 – 7. Rửa sạch, phơi
khô, phun rượu vào rồi phơi khô hẳn. Bó thành từng bó 10 – 15 con một.
Ngang chỗ nấm, người ta buộc sợi chỉ đỏ trông rất đẹp [1], [5].

Hình
1.2: Ảnh của
Đông trùng hạ
thảo
(Cordyceps sp1)
Vị thuốc
như vậy gồm có
phần sâu non
dài 2.5 – 3 cm, đường kính 3 – 5 mm, màu vàng nâu hay xám nâu. Từ đầu
con sâu mọc ra một thân nấm hình trụ đặc biệt có khi 2 hay 3 con sâu. Thân
nấm thường dài 3 – 6 cm, đặc biệt có thể dài 11cm. Phía dưới thân nấm có
đường kính1.5 – 4mm, phía trên to phình ra, cuối cùng lại thon nhọn, cả
phần này dài 10 – 45mm, đường kính 2.5 – 6mm. Nếu còn non thì đặc, nếu
già thì thân rỗng. Dùng kính hiển vi, ta sẽ thấy phần phình to này có vỏ sần
sùi, có những hạt nhỏ tức là tử nang xác nổi lên. Phần đầu thon nhọn không
mang tử nang xác và dài 0.5 – 3.5mm.
1.2.2. Thành phần hoá học của đông trùng hạ thảo (Cordyceps sp1)
Chưa được nghiên cứu.


20

1.2.3 Tác dụng dược lí của đông trùng hạ thảo [1], [5]

Đông trùng hạ thảo là một vị thuốc được ghi vào tài liệu thuốc đông y
vào giữa thế kỉ 18 trong bộ Bản thảo cương mục thập di (1765).
Trong sách cổ ghi chép, đông trùng hạ thảo là một vị thuốc bổ, chữa
thần kinh suy nhược, chữa ho, ho lao. Bổ tinh khí chữa đau lưng, bổ thận.
Liều dùng : Ngày uống 6 – 12g dùng với hình thức ngâm rượu uống.
Người ta cho rằng đông trùng hạ thảo ngâm rượu uống chữa chứng
đau lưng, mỏi gối, tác dụng ngang nhân sâm.
Theo tài liệu cổ, đông trùng hạ thảo có vị ngọt, tính ôn, vào 2 kinh
phế và thận. Có tác dụng ích phế, thận, bổ tinh tủy, cầm máu, hóa đờm, dùng
chữa hư lao sinh ho, ho ra máu, liệt dương, lưng gối đau mỏi, di tinh.
Đông trùng hạ thảo Việt Nam mặc dù khác đông trùng hạ thảo nhập
khẩu từ Trung Quốc, nhưng nhân dân cũng dùng như đông trùng hạ thảo
nhập. Ngoài ra, người ta còn xào nấu với trứng mà ăn cho bổ, hoặc có người
mua đông trùng hạ thảo Việt Nam về để nuôi chim họa mi.

Chương 2
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Phương pháp lấy mẫu
Mẫu nấm ký sinh côn trùng (Cordyceps sp1) được thu thập từ tháng 7
năm 2008 tại Vườn Quốc gia Pù Mát, được PGS. TS. Trần Ngọc Lân giám
định tên khoa học và lưu giữ tại khoa Nông Lâm Ngư, Trường Đại học


21
Vinh. Mẫu được xem xét và đánh giá dưới kính hiển vi điện tử theo phương
pháp Lacey và Brooks [34]. Phân lập sử dụng theo phương pháp của Goettel
và Inglis [16]. Phân lập các bào tử đơn dựa theo phương pháp của Choi và
cộng sự [13]. Cấy chuyển sang môi trường Potato Dextrose Agar (PDA)

theo phương pháp của Samson [42]. Đặc điểm hình thái của bào tử, sợi nấm,
cấu trúc quả thể và một số đặc điểm sinh học khác được đánh giá, nhận dạng
các loài nấm ký sinh côn trùng theo phương pháp của Luangsa-ard và cộng
sự [38].
2.2. Phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các
hợp chất
Để phân tích và phân tách cũng như phân lập các hợp chất, sử dụng
các phương pháp sắc ký như:
- Sắc ký khí (GC)
- Sắc ký khí- khối phổ (GC-MS)
- Sắc ký cột (CC).
- Sắc ký lớp mỏng (TLC) phân tích.
- Các phương pháp kết tinh phân đoạn.
2.3. Phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất
Cấu trúc của các hợp chất được khảo sát nhờ sự kết hợp các phương
pháp phổ:
- Phổ tử ngoại (UV)
- Phổ hồng ngoại (IR)
- Phổ khối lượng va chạm electron (EI - MS).
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR.
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR.
- Phổ DEPT.


22

Chương 3
THỰC NGHIỆM
3.1.Thiết bị và phương pháp
3.1.1. Hoá chất

Các dung môi dùng để ngâm chiết mẫu thực vật đều dùng loại tinh


23
khiết (pure), khi dùng cho các loại sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột sử dụng
loại tinh khiết phân tích (PA). Dung môi được sử dụng là: metanol (CHOH),

3

n-butanol

(C4H9OH),

etylaxetat

(CH3COOC2H5),

axeton

(CH3COCH3), nước cất.
3.1.2. Các phương pháp sắc ký
3.1.2.1. Sắc ký khí (GC)
Được thực hiện trên máy Agilent Technologies HP 6890N Plus gắn
vào detectơ FID của hãng Agilent Technologies, Mỹ. Cột sắc ký HP-5MS
với chiều dài 30 m, đường kính trong (ID) = 0,25 mm, lớp phim mỏng
0,25µm đã được sử dụng. Khí mang H2. Nhiệt độ buồng bơm mẫu (kĩ thuật
chương trình nhiệt độ-PTV) 250oC. Nhiệt độ detectơ 260oC. Chương trình
nhiệt độ buồng điều nhiệt: 60oC (2min), tăng 4oC/min cho đến 220oC, dừng
ở nhiệt độ này trong 10 min.
3.1.2.2. Sắc ký khí-khối phổ (GC/MS)

Việc phân tích định tính được thực hiện trên hệ thống thiết bị sắc ký
khí và phổ ký liên hợp GC/MS của hãng Agilent Technologies HP 6890N.
Agilent Technologies HP 6890N/ HP 5973 MSD được lắp với cột tách mao
quản và vận hành sắc ký như ở trên với He làm khí mang.
Việc xác nhận các cấu tử được thực hiện bằng cách so sánh các dữ
kiện phổ MS của chúng với phổ chuẩn đã được công bố có trong thư viện
Willey/Chemstation HP.
3.1.2.3. Sắc ký bản mỏng
Sắc ký bản mỏng phân tích được tiến hành trên bản mỏng kính
silicagel Merck 60 F254 tráng sẵn, độ dày 0,2 mm.
Hiện màu: hơi Iot và đèn UV 254 nm.
3.1.2.4. Sắc ký cột
Sắc ký cột thường, sử dụng silicagel cỡ hạt 230-400/mesh.


24
3.2. Dụng cụ và thiết bị
- Nhiệt độ nóng chảy đo trên kính hiển vi Boetius.
- Phổ tử ngoại UV được ghi trên máy Agilent.
- Phổ hồng ngoại IR ghi trên máy Bruker.
- Phổ khối lượng va chạm electron EI-MS được ghi trên máy ghi trên
máy Agilent Technologies 5973.
-Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR được đo trên máy Bruker
500MHz, phổ 13C-NMR và DEPT trên máy Bruker 125 MHz.
3.3. Nghiên cứu các hợp chất từ đông trùng hạ thảo
3.3.1. Nghiên cứu thành phần hoá học dầu béo
Nấm được nuôi cấy trong môi trường Potato Dextrose Agar (PDA)
(5L), ở nhiệt độ 25 - 260C trong 14 ngày, được lọc, rửa với nước bằng phễu
lọc chân không. Sau khi lọc chiết với metanol, quay cất chân không thu
được dịch dầu thô (25g). Dịch dầu này được phân tách trên bằng sắc ký nhồi

silicagel, dung môi giải hấp là cloroform:metanol 19:1-4:1 thu được 6 phân
đoạn chính. Phân đoạn 1 chứa chủ yếu là chất béo được phân tích bằng sắc
ký khí (GC) và sắc ký khí - khối phổ (GC-MS). Phân đoạn 3 (1,2g) tiếp tục
phân tách bằng sắc ký cột trên silicagel, dung môi rửa giải là
cloroform:metanol 15:1-9:1. Kết tinh phân đoạn thu được chất 45 (432mg)
và 46 (32mg).


25

Hình 1.4: Sự sinh trưởng của nấm Cordyceps sp1. trên môi trường PDA
ở các nhiệt độ và thời gian nuôi cấy khác nhau

3.3.2. Phân lập các hợp chất

Cao metanol (46g)
- Phân bố trong nước
- Chiết lần lượt với etylaxetat, butanol

Cao etylaxetat
(17g)

Cao butanol
(5g)

- Sắc kí cột
cloroform : metanol
Chất 45, 46

dịch

nước