Nghiên cứu và chế phẩm nitrat hóa để xử lý nước thải nuôi trồng hải sản

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
..............

..............

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đề tài:
NGHIÊN CỨU VÀ CHẾ PHẨM NITRAT HOÁ ĐỂ XỬ LÝ
NƯỚC THẢI NUÔI TRỒNG HẢI SẢN

Giáo viên hướng dẫn

: TS. Hoàng Phương Hà

Sinh viên thực hiện

: Trần Thị Dương

Lớp

: 11-02

Hà Nội – 2015


Lời cảm ơn
Đầu tiên cho tôi gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến TS. Hoàng Phương Hà,
người đã trực tiếp chỉ dạy và hướng dẫn tôi một cách tận tình trong suốt thời gian
tôi thực hiện khóa luận này.

Cho tôi gửi lời cảm ơn đến TS. Đỗ Thị Tố Uyên - phó trưởng phòng, phụ
trách Phòng Công nghệ Sinh học Môi trường (Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn
lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) đã tạo mọi điều kiện tốt nhất trong suốt thời
gian tôi thực tập tại phòng thí nghiệm.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến sự giúp đỡ và chỉ bảo tận tình của tập
thể các cán bộ nghiên cứu khoa học tại phòng Công nghệ Sinh học Môi trường Viện công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã
giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này.
Đồng thời cho tôi gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô Khoa Công
nghệ Sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội đã truyền đạt những kiến thức bổ ích và
tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến những người thân trong gia
đình, bạn bè đã luôn bên cạnh ủng hộ và giúp đỡ tôi rất nhiều về cả vật chất và tinh
thần để tôi có thể hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này.
Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn.
Hà Nội, ngày 22 tháng 5 năm 2015
Sinh viên

Trần Thị Dương


Mục lục
Lời mở đầu .............................................................................................................. 1
PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................ 4
1.1. Tổng quát chung về nghề nuôi trồng thủy sản của Việt Nam ......................... 4
1.2. Tình trạng ô nhiễm môi trường trong NTTS .................................................. 5
1.3. Ảnh hưởng của nguồn nước bị nhiễm các hợp chất chứa nitơ tới môi trường
NTTS ................................................................................................................... 7
1.4. Chế phẩm vi sinh vật. .................................................................................... 8
1.4.1. Khái niệm chế phẩm sinh học.................................................................. 8
1.4.2. Lợi thế khi sử dụng chế phẩm sinh học trong xử lí nước ......................... 9

1.5. Chế phẩm nitrate hóa..................................................................................... 9
1.5.1 Quá trình nitrate hóa................................................................................. 9
1.5.2. Hệ vi khuẩn nitrate hóa ......................................................................... 11
1.8. Chất mang sử dụng trong chế phẩm ............................................................. 12
1.9. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước .................................................. 14
Phần 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................. 16
2.1. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị sử dụng .................................................... 16
2.1.1. Nguyên liệu ........................................................................................... 16
2.1.2. Hóa chất, môi trường............................................................................. 16
2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 17
2.2.1. Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật ......................................................... 17
2.2.2. Phương pháp cố định tế bào trên bề mặt chất mang rắn ......................... 18
2.2.3. Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn trong chế phẩm [5]. ................. 20
2.2.4. Phương pháp đánh giá hoạt tính nitrate hóa của chế phẩm ..................... 21
2.2.5. Phương pháp xác định độ ẩm của chế phẩm .......................................... 27

i


2.2.6. Phương pháp đánh giá khả năng sinh trưởng và hoạt tính của vi khuẩn
nitrate hóa trên môi trường nước lợ ................................................................. 28
2.2.7. Phương pháp xác định khả năng xử lý amoni trên hệ lọc ở qui mô 10 lit28
Phần 3. KẾT QUẢ ................................................................................................ 29
3.1. Hoạt hóa và lựa chọn một số chủng vi khuẩn nitrate hóa có hoạt tính cao .... 29
3.2. Nhân nuôi vi khuẩn thu sinh khối ................................................................ 30
3.3.1. Ảnh hưởng của độ ẩm đến sinh trưởng của vi khuẩn trong quá trình lên
men xốp .......................................................................................................... 31
3.3.2. Ảnh hưởng của độ ẩm đến hoạt tính nitrate hóa của vi khuẩn trong quá
trình lên men xốp ............................................................................................ 33
3.3.3. Đánh giá khả năng sinh trưởng và hoạt tính nitrate hóa của vi khuẩn trong

môi trường nước lợ ......................................................................................... 37
3.4. Thử nghiệm chế phẩm trong hệ lọc dung tích 10 lit ở quy mô phòng thí
nghiệm ............................................................................................................... 39
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................... 43
KẾT LUẬN ........................................................................................................... 43
KIẾN NGHỊ .......................................................................................................... 43
TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT ............................................................... 44
TÀI LIỆU THAM KHẢO NƯỚC NGOÀI............................................................ 45

ii


Danh mục bảng viết tắt
NTTS

Nuôi trồng thủy sản

ĐBSCL

Đồng Bằng Sông Cửu Long

TS

Thủy sản

iii


Mục lục hình ảnh
Hình 1.1: Tình hình ô nhiễm môi trường nuôi tại các khu vực nuôi trồng ................ 5

Hình 2.1: Sơ đồ tổng quan quy trình nhân giống vi sinh vật .................................. 18
Hình 2.2: Sơ đồ tổng quát quy trình tạo chế phẩm nitrate hóa ............................... 20
Hình 3.1: Biểu đồ hoạt tính của chế phẩm sau khi tạo thành ................................. 33
Hình 3.2: Hoạt tính của 4 loại chế phẩm trong 40 ngày ........................................ 35
Hình 3.3. Hoạt tính của chế phẩm sau 3 tháng ...................................................... 36
Hình 3.4: Hoạt tính của chế phẩm tháng 4 ............................................................ 37
Hình 3.5. Hoạt tính của chế phẩm trong môi trường chứa muối NaCl ................... 38

iv


Danh mục bảng
Bảng 1: Thành phần hóa học của tro trấu [8] ....................................................... 13
Bảng 2.1: Môi trường nuôi cấy vi khuẩn nitrate hóa ............................................. 16
Bảng 3.1. Hoạt tính oxy hóa amoni của nhóm vi khuẩn oxy hóa amoni.................. 29
Bảng 3.2. Hoạt tính oxy hóa nitrite của nhóm vi khuẩn oxy hóa nitrite .................. 30
Bảng 3.3. Mật độ tê bào vi khuẩn nitrate hóa trong chế phẩm ............................... 31
Bảng 3.4. Khảo sát mật độ tế bào vi khuẩn trong chế phẩm theo thời gian ............ 32
Bảng 3.2. Mật độ tế bào vi khuẩn của chế phẩm trong môi trường chứa muối NaCl
.............................................................................................................................. 38
Bảng 3.5. Hiệu quả xử lí amoni của chế phẩm nitrate hóa ở mẻ thứ nhất .............. 39
Bảng 3.6. Hiệu suất xử lí amoni của chế phẩm nitrate hóa ở mẻ thứ hai................ 40
Bảng 3.7. Hiệu suất xử lí amoni của chế phẩm nitrate hóa ở mẻ thứ ba ................. 40

v


Lời mở đầu
Việt Nam đang bước vào thời kì công nghiệp hóa, hiện đại hóa nền kinh tế,
nhằm đạt mục tiêu chiến lược là trở thành một đất nước công nghiệp tiên tiến vào

năm 2020. Trong những năm gần đây, nhận thấy tầm quan trọng của nghề nuôi
trồng thủy sản (NTTS), Chính phủ và Bộ thủy sản đã dành sự ủng hộ mạnh mẽ cho
sự phát triển bền vững của ngành NTTS. Một trong số các hỗ trợ đó là tăng cường
nguồn kinh phí cho phát triển và nâng cấp cơ sở hạ tầng của toàn Ngành. Chính vì
thế ngành khai thác NTTS ở nước ta đã có những bước tiến vượt bậc. Thủy sản (TS)
là một trong những ngành kinh tế mũi nhọn của Việt Nam, NTTS và sản phẩm xuất
khẩu thủy sản đóng vai trò quan trọng trong việc tăng trưởng GDP của cả nước.
Tổng sản lượng thủy sản đạt 6,3 triệu tấn (năm 2014), tăng 4,4% so với năm 2013.
Sản xuất tôm nước lợ tăng trưởng mạnh về cả diện tích lẫn sản lượng, đóng góp
quan trong đưa kim ngạch xuất khẩu thủy sản năm 2014 tiếp cận mức 8 tỷ USD,
tăng 16,5% so với năm 2013, mức tăng cao nhất trong vòng 3 năm trở lại đây [2].
Bên canh đó, sự phát triển của ngành NTTS còn góp phần giải quyết công căn việc
làm cho hàng triệu lao động trong nước. Tuy nhiên ngành NTTS và xuất khẩu TS
mang lại nhiều lợi nhuận nhưng cũng gặp không ít khó khăn như ô nhiễm môi
trường nuôi dẫn đến dịch bệnh cho động vật nuôi, thiệt hại đáng kể đến nền kinh tế,
ảnh hưởng lớn đến tình hình phát triển chung của ngành. Nguyên nhân chính của
tình trạng này là do lượng thức ăn dư thừa và các chất thải của động vật nuôi, ngoài
ra trong môi trường nuôi con giống còn chứa dư lượng kháng sinh, dược phẩm,
thuốc trị liệu và kích thích tố… Các thành phần gây ô nhiễm chính là các hợp chất
hữu cơ, các hợp chất nitơ, photpho, các thực vật phù du, các chật lắng đọng do
nguồn nước đầu vào mang vào, trong đó ô nhiễm bởi các hợp chất nitơ vô cơ chiếm
tới 30-40%. Sự ô nhiễm nitơ, photpho và hữu cơ còn gây nên hiện tượng phú
dưỡng, làm giảm lượng ôxy hòa tan trong nước ảnh hưởng trầm trọng đến sản lượng
và chất lượng con giống [4].
Hiện nay, ngoài thị trường các sản phẩm phục vụ cho ngành NTTS rất đa
dạng như thuốc, hóa chất và chế phẩm sinh học. Hóa chất được dùng trong NTTS
thường ở các dạng: thuốc diệt nấm (antifoulants), thuốc khử trùng (disinfectants),
1

thuốc diệt tảo (algicides), thuốc trừ cỏ (herbicides), thuốc diệt kí sinh trùng
(parasiticcides) và thuốc diệt khuẩn (antibacterials); chất kháng sinh được sử dụng
trong nuôi trồng thủy sản chủ yếu để chữa các bệnh lây nhiễm hoặc phòng bệnh cho
thủy sản. Những hoá chất trên có vai trò quan trọng trong việc bảo vệ sức khoẻ
động vật thuỷ sản nếu được sử dụng đúng, nhưng sử dụng sai mục đích và lạm dụng
dẫn đến những hậu quả khôn lường, gây rủi do cho người lao động, tồn dư các chất
độc trong sản phẩm thuỷ sản gây hại cho người tiêu dùng, làm giảm giá trị thương
phẩm và còn tạo các chủng vi khuẩn kháng thuốc trong điều trị bệnh. Chính vì vậy,
chế phẩm sinh học được sử dụng như một công cụ hữu hiệu để giải quyết vấn đề ô
nhiễm môi trường trong ao nuôi, tạo nền tảng vững chắc cho phần lớn hoạt động
nuôi trồng thủy sản. Chế phẩm sinh học đã được chấp nhận rộng rãi để khống chế
dịch bệnh, tăng sức đề kháng. Khác với biện pháp hóa học và kháng sinh, chế phẩm
sinh học cung cấp một phương thức an toàn bền vững đối với người nuôi và tiêu
dùng.
Trong số các danh mục chế phẩm sinh học phải kể đến chế phẩm nitrate hóa,
chúng được sử dụng rộng rãi trong xử lý nước (nước thải công nghiệp, nước thải
sinh hoạt, nước thải chế biến lương thực thực phẩm, nước nuôi trồng thủy sản…).
Trong nuôi trồng thủy sản, nhóm vi khuẩn nitrate hóa tham gia vào quá trình làm
sạch môi trường, giảm thiểu khả năng gây bệnh trong lĩnh vực sản xuất giống thủy
sản và nuôi thủy sản thâm canh.
Nitrate hóa là một quá trình quan trọng nằm trong vòng chuyển hóa nitơ. Ở giai
đoạn này NH4+ được oxy hóa thành NO3- thông qua NO2- với sự tham gia, của nhóm
các vi khuẩn tự dưỡng, chủ yếu thuộc chi Nitrosomonas (vi khuẩn oxy hóa amoni)
và Nitrobacter (vi khuẩn oxy hóa nitrite) [17], [22]. Việc ứng dụng quá trình
chuyển hóa nitơ vô cơ này cùng với hệ vi khuẩn tham gia vào quá trình luôn mở ra
nhiều hướng đi mới trong xử lí nước bị ô nhiễm amoni đạt hiệu quả và thân thiện
với môi trường.
Đề tài: “Nghiên cứu sản xuất chế phẩm nitrate hóa để xử lí môi trường hải
sản” góp phần tạo thêm một chế phẩm sinh học để xử lý môi trường nuôi cho
ngành NTTS.

2


Mục tiêu cần đạt được của đề tài:
Tạo chế phẩm nitrate hóa bằng quá trình lên men xốp để ứng dụng trong xử lí
nước bị ô nhiễm các hợp chất nitơ vô cơ tại các ao nuôi hải sản.
Nội dung nghiên cứu:
- Hoạt hóa một số chủng vi khuẩn nitrate hóa sẵn có cho mục tiêu nhân nuôi tạo
sinh khối.
- Nghiên cứu quá trình lên men xốp đối với vi khuẩn nitrate hóa.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của độ ẩm trong quá trình lên men tạo chế phẩm sinh học
có mật độ vi khuẩn và hoạt tính nitrate hóa tốt nhất.
- Đánh giá ảnh hưởng của muối NaCl đến khả năng sinh trưởng và hoạt tính của vi
khuẩn nitrate hóa trong chế phẩm.
- Xác định mật độ vi khuẩn và hoạt tính nitrate hóa của chế phẩm theo thời gian.
- Ứng dụng thử nghiệm chế phẩm sinh học nitrate hóa trên hệ lọc ở qui mô phòng
thí nghiệm.

3


PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quát chung về nghề nuôi trồng thủy sản của Việt Nam
Việt Nam là một nước có vị trí địa lí và điều kiện tự nhiên thuận lợi cho việc
phát triển ngành thủy sản, với bờ biển dài trên 3200 km, khoảng 3000 hòn đảo lớn
nhỏ, có vùng mặt nước nội địa rộng lớn hơn 1.4 triệu ha nhờ hệ thống sông ngòi,
đầm phá dầy đặc. Điều kiện đất đai, khí hậu nhìn chung rất thuận lợi, khiến Việt
Nam từ lâu đã trở thành một trong những quốc gia sản xuất và xuất khẩu thủy sản
hàng đầu khu vực. Chính vì vậy ngành nuôi trồng thủy sản của nước ta đã và đang
phát triển. Xuất khẩu thủy sản đóng vai trò quan trọng trong việc tăng thu nhập

ngoại tệ mạnh cho đất nước. Năm 2014 xuất khẩu thủy sản lần đầu vượt mốc 7 tỷ
USD, dự báo đạt mức kỷ lục với giá trị xuất khẩu đạt 7,84 tỷ USD, tăng 16,5% so
với năm 2013. Mặt hàng xuất khẩu thủy sản của Việt Nam gồm nhiều loại như tôm,
cá tra, cá ngừ, mực, bạch tuộc,…tuy nhiên tôm và cá tra là hai mặt hàng chủ lực.
Theo Hiệp hội thủy sản Việt Nam, trong 8 tháng đầu năm 2014, mặt hàng tôm đã
đóng góp 50,1% và cá tra đóng góp 21,6% vào tổng giá trị xuất khẩu. Đây là ngành
hàng xuất khẩu chủ lực trong lĩnh vực xuất khẩu thủy sản Việt Nam [2].
Thuỷ sản đóng vai trò quan trọng trong việc cung cấp thực phẩm cho nhân loại.
Thực phẩm thuỷ sản có giá trị dinh dưỡng cao rất cần thiết cho sự phát triển của con
người. Không những thế nó còn là một ngành kinh tế tạo công ăn việc làm cho
nhiều người đặc biệt ở những vùng nông thôn và ven biển. Trong những năm tới, do
nhu cầu mặt hàng thủy sản trên thế giới tăng cao, thị trường được mở rộng nên
ngành khai thác, nuôi trồng thủy sản ở Việt Nam càng có tiềm năng phát triển. Mặc
dù vậy, nghề nuôi trồng thủy sản ở nước ta cũng gặp không ít khó khăn trong quá
trình nuôi con giống như quản lí chất lượng ao nuôi, kiểm soát dịch bệnh, kĩ thuật
ao nuôi, nguồn giống... do vậy việc cung cấp con giống khỏe mạnh, đạt tiêu chuẩn
chất lượng là nhu cầu thiết yếu đối với các trang trại nuôi. Trong quá trình nuôi con
giống (tôm, cá) do lượng thức ăn dư thừa và chất thải của con giống đã gây ô nhiễm
môi trường dẫn đến dịch bệnh ảnh hưởng lớn đến chất lượng giống. Trong quá trình
nuôi thâm canh tôm, chỉ có 15 – 20% thức ăn được dùng vào việc phát triển mô
động vật, 15% tổng lượng thức ăn bị hao hụt do không ăn hết và thất thoát, chỉ có
4


40 – 45% là được sử dụng cho quá trình chuyển hóa bình thường, duy trì và lột vỏ
[4].
1.2. Tình trạng ô nhiễm môi trường trong NTTS
Tình trạng ô nhiễm môi trường đang xảy ra nghiêm trọng trong nuôi NTTS
do phần lớn các chất hữu cơ dư thừa từ thức ăn, phân và các rác thải khác đọng lại
dưới đáy ao nuôi. Ngoài ra, còn các hóa chất, dư lượng kháng sinh được sử dụng

trong quá trình nuôi còn lại mà không được xử lý. Việc hình thành lớp bùn đáy do
tích tụ lâu ngày của các chất hữu cơ, cặn bã và là nơi sinh sống của các vi sinh vật
gây thối, các vi sinh vật sinh khí độc như NH3, NO2, H2, H2S, CH4,.... Các vi sinh
vật gây bệnh phần lớn thuộc các chi: Vibrio, Aeromonas, Ecoli, Pseudomonas,
Proteus, Staphylococcus... nhiều loại nấm và nguyên sinh động vật [13].

Hình 1.1: Tình hình ô nhiễm môi trường nuôi tại các khu vực nuôi trồng
Trong những năm gần đây, tình hình dịch bệnh đối với ngành NTTS đang
diễn ra khá phức tạp. Chỉ tính riêng tỉnh Quảng Ninh, trong năm 2014 dịch bệnh đã
xẩy ra và gây thiệt hại nghiêm trọng đối với tôm sú và tôm thẻ chân trắng tại các địa
phương Quảng Yên, Tiên Yên, Móng Cái với diện tích mắc bệnh là 634 ha/tổng
diện tích nuôi thủy sản là 20100 ha. Tại Vân Đồn, Hải Hà tu hài và cá song chết rải
rác thiệt hại trên 200 tỷ đồng, nguyên nhân gây chết là do chúng bị các bệnh như
đốm trắng, bệnh còi tôm, hoại tử gan tụy đầu vàng, taura, với tu hài thì bị bệnh sưng
vòi, rìa vỏ thâm đen, bệnh do vi khuẩn Vibrio. spp và nội ký sinh Perkinsus. spp
gây nên [12].
Tại khu vực châu Á ở các nước Trung Quốc, Thái Lan, Malayxia, Việt Nam,
dịch hội chứng tôm chết sớm (EMS) hay hội chứng hoại tử gan tụy cấp tính
(AHPNS) ở tôm đang lan rộng và gây thiệt hại lớn cho ngành NTTS. Theo ước tính
của Liên minh NTTS toàn cầu (GAA), thiệt hại do dịch EMS của châu Á lên tới 1
5


tỷ USA/năm. Theo nguồn tin từ FAO, các nhà khoa học của đại học Arizona mới
chỉ xác định được nguyên nhân gây bệnh này là do vi khuẩn Vibrio
parahaemolyticus [16].
Tất cả các nguyên nhân dẫn đến dịch bệnh của ngành nuôi thủy sản đều do môi
trường nuôi con giống bị ô nhiễm.
Vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) là vùng đất ngập nước điển hình
có chế độ ngập lũ theo mùa mưa, ngập mặn ven biển theo thủy triều với trên 90%

diện tích đất tự nhiên, tạo ra các lợi thế tự nhiên rất cơ bản trong phát triển nuôi
trồng và chế biến thủy sản. Ngành NTTS ở khu vực ĐBSCL đã có một bước phát
triển với diện tích và sản lượng nuôi trồng với quy mô lớn: Năm 2005 toàn khu vực
ĐBSCL có diện tích nuôi trồng thủy sản là 680.200 ha, năm 2012 là 2.221.182 tấn,
trong đó cá nuôi là 1.770.509 tấn và tôm nuôi là 357.772 tấn (Niên giám thống kê
2012). Sản lượng thủy sản nuôi trồng của ĐBSCL chiếm 70,94% tổng sản lượng
nuôi trồng thủy sản trong toàn quốc với mức tăng trưởng hàng năm khoảng
17,8 %/năm. Cùng với đó là sự phát triển của các cơ sở chế biến thủy sản với tổng
số các cơ sở chế biến xuất khẩu trong toàn vùng là 206 cơ sở, trong đó 188 cơ sở
đông lạnh và 18 cơ sở là các loại hình hàng khô và đồ hộp… với tổng công suất chế
biến khoảng 780.000 - 950.000 tấn/năm. Các tỉnh: Cà Mau, Cần Thơ, Tiền Giang,
Kiên Giang, An Giang là những địa phương có số nhà máy chiếm trên 53% tổng số
nhà máy chế biến thủy sản toàn vùng ĐBSCL. Thị trường tiêu thụ bao gồm 29 quốc
gia thuộc Bắc Mỹ, EU, châu Á, châu Đại Dương và Trung Đông với các mặt hàng
chế biến cá tra và tôm…với tổng kim ngạch xuất khẩu đạt khoảng 4 tỷ USD/năm.
Với lợi thế như vậy nhưng trong quá trình chế biến thủy sản nguồn nước thải từ
nước rửa nguyên liệu, sơ chế nguyên liệu, chế biến sản phẩm, các nguồn nước vệ
sinh nhà xưởng sản xuất, nước rửa máy móc thiết bị, dụng cụ sản xuất trong các
phân xưởng nhà máy chế biến thủy sản chứa nhiều thành phần gây ô nhiễm như:
BOD5 khoảng 800 - 2.000 mg/l, có lúc đạt đến 4.500 mg/l. COD khoảng 1.000 2.500 mg/l, có lúc đạt đến 5.000 mg/l, chất rắn lơ lửng (SS) khoảng 300 - 600 mg/l,
nitơ tổng số (Nt) khoảng 100 - 150 mg/l, photpho tổng số (Pt) khoảng 20-50 mg/l,
đặc biệt vi sinh Coliforms thường lớn hơn 1.105 MPN/100ml, với lưu lượng khoảng

6


20 - 35 m3/tấn sản phẩm, đây là nguồn gây ô nhiễm môi trường rất nghiêm trọng
cần phải được xử lý đáp ứng quy chuẩn môi trường quy định 14].
1.3. Ảnh hưởng của nguồn nước bị nhiễm các hợp chất chứa nitơ tới môi
trường NTTS

Trong môi trường NTTS, thành phần gây ô nhiễm chính trong các bể nuôi
thường là các hợp chất nitơ và một số hợp chất hữu cơ, tuy mức độ ô nhiễm nitơ
không cao như các loại nước thải khác nhưng dễ dẫn đến ấu trùng con giống bị ngộ
độc, làm giảm khả năng sinh trưởng và phát triển của con giống dẫn đến năng suất
thu hoạch kém. Khí NH3 là yếu tố gây độc đến tỉ lệ sống và sinh trưởng đối với thủy
sinh, NH3 được hình thành từ quá trình phân hủy protein, xác bã động vật phù du,
sản phẩm bài tiết của các động vật hay từ phân bón vô cơ, hữu cơ. Đối với loái giáp
xác, ở nồng độ 0,09 mg/L NH3 làm giảm sự sinh trưởng của tôm càng xanh
(Macrobrachium rosenbergii), ở hàm lượng 0,425 mg/l làm giảm 50% sự sinh
trưởng của các loài tôm hẹ. Đối với tôm sú hậu ấu trùng (Penaeus monodon) có tỉ lệ
LC50/24 giờ là 5,71 mg/l [9]. NH3, NH4+ trong nước rất cần thiết cho sự phát triển
của vi sinh vật, là nguồn thức ăn tự nhiên, nhưng nếu hàm lượng NH4+ quá cao sẽ
làm cho động vật phù du phát triển quá mức không có lợi cho tôm, cá (thiếu oxy,
pH dao động..), ngoài ra ở hàm lượng amoni cao vượt mức cho phép sẽ gây độc
trực tiếp đến hệ hô hấp của cá hoặc tôm, gây mất cân bằng về mặt sinh lí, làm giảm
sức đề kháng và dẫn đến chết. Khi trong môi trường xuất hiện amoni, vi khuẩn oxy
hóa amoni sẽ chuyển hợp chất này thành nitrie, nitrite còn được hình thành từ quá
trình khử nitrate. Đây là hợp chất vô cơ cực kì độc cho động vật thủy sinh đặc biệt
là các ấu trùng nuôi, chỉ với hàm lượng nitrite vượt quá 0,3 mg/l sẽ ức chế vận
chuyển oxy trong máu gây ngộ độc cao cho động vật nuôi.
Chính vì vậy tại các cơ sở nuôi giống hải sản, để cải thiện môi trường nuôi
thì việc sử dụng các công nghệ xử lí nước bằng biện pháp sinh học luôn được đặt
lên hàng đầu để ngăn cản và kiểm soát được các dịch bệnh. Hiện nay các nhà
nghiên cứu đã chứng minh được việc sử dụng probiotic trong nuôi trồng thủy sản đã
cải thiện được chất lượng nước, làm cân bằng quần thể vi sinh vật trong nước và
giảm thiểu lượng vi sinh vật gây bệnh. Sử dụng sản phẩm probiotic là bổ sung vi
khuẩn có ích vào môi trường thay thế cho các loại vi khuẩn có hại. Từ những tiêu
7

chí đó mà hiện nay người ta đã sử dụng các chế phẩm vi sinh vật trong đó phải kể
đến chế phẩm chứa nhóm vi khuẩn nitrate hóa để xử lí các hợp chất nitơ vô cơ, loại
ngay những nguy cơ ban đầu dẫn đến dịch bệnh.
Việc sử dụng chế phẩm vi sinh vật trong xử lí nước bị ô nhiễm ngày càng
phổ biến do lợi thế của chúng làm tăng cường khả năng phục hồi và thúc đẩy quá
trình tự làm sạch trong các hệ tái sử dụng nước và ao đầm nuôi hải sản, bên cạnh đó
còn có tính ổn định cao và thân thiện với môi trường.
1.4. Chế phẩm vi sinh vật.
1.4.1. Khái niệm chế phẩm sinh học
Chế phẩm sinh học lần đầu được giáo sư Fuller R (1989) định nghĩa: thành
phần thức ăn có cấu tạo từ những vi khuẩn sống và có tác động hữu ích lên vật chủ
qua việc làm cải thiện sự cân bằng vi khuẩn đường ruột của nó. Định nghĩa này có
thể mở rộng như sau: sự nuôi dưỡng các vi sinh vật hoàn toàn tự nhiên và tác động
tích cực khi đưa vào điều kiện môi trường sống [20].
Ngày nay có thể hiểu, chế phẩm vi sinh vật là hỗn hợp hoặc riêng biệt từng
chủng vi sinh vật có hoạt tính sinh học cao đã được tuyển chọn, chúng được tồn tại
và phát triển trong môi trường chứa chất mang được lựa chọn làm cơ chất. Các chế
phẩm của vi sinh vật có trong chế phẩm nhằm mục đích cải thiện sức khỏe con
người và vật nuôi, cây trồng và chất lượng môi trường.
Chế phẩm sinh học được hình thành phải đạt được các tiêu chuẩn sau đây:
- Thứ nhất: Làm cân bằng hệ vi sinh vật trong nước, ức chế sự phát triển quả mức
của các nhóm vi sinh vật gây hại, đưa về ngưỡng an toàn cho các động vật thủy sinh.
- Thứ hai: Các vi sinh vật có lợi trong chế phẩm sinh học phải đủ lớn để khi đưa vào
môi trường ao nuôi có hiệu quả nhanh và mạnh giảm thiểu ô nhiễm môi trường, hạn
chế dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản.
- Thứ ba: các vi sinh vật trong chế phẩm phải có khả năng phân giải các chất vô cơ,
hữu cơ trong ao nuôi làm giảm thiểu các nguồn gây ô nhiễm từ nitơ như NO2, NH3,
NO3-…từ đó cải thiện chất lượng nước đáng kể.

8

- Thứ tư: Cung cấp nguồn dưỡng chất cần thiết cho cá, tôm, hệ vi sinh vật trong
nước phát triển như cung cấp dinh dưỡng khoáng thiết yếu, các acid amin,
vitamin…
1.4.2. Lợi thế khi sử dụng chế phẩm sinh học trong xử lí nước
Ở nước ta trong những năm gần đây, việc sử dụng chế phẩm sinh học để xử lí
nước ngày càng phổ biến và đang được ứng dụng một cách có hiệu quả, do đó nó có
nhiều bước tiến. Chế phẩm sinh học được coi là một công cụ hữu hiệu để giải quyết
vấn đề ô nhiễm môi trường trong ao nuôi, tạo nền tảng vững chắc cho phần lớn hoạt
động nuôi trồng thủy sản trên thế giới. Chế phẩm sinh học đã được chấp nhận rộng
rãi để khống chế dịch bệnh, tăng sức đề kháng, khác với biện pháp hóa học và
kháng sinh, chế phẩm sinh học cung cấp một phương thức an toàn bền vững đối với
người nuôi và người tiêu dùng. Các chế phẩm sinh học trong nuôi tôm có một vai
trò cực kì quan trọng để phân hủy các chất hữu cơ và tác động làm giảm đáng kể
lớp bùn nhớt trong ao. Kết quả là cải thiện chất lượng nước trong ao nuôi, giảm tỉ lệ
mắc bệnh, tăng số lượng vi sinh vật phù du, giảm mùi hôi và sau cùng là tăng sản
lượng nuôi [11].
Việc sử dụng các vi sinh vật hữu ích nhằm cạnh tranh với các vi khuẩn gây
bệnh đã được ứng dụng rộng rãi trong chăn nuôi, thay thế cho việc sử dụng hóa chất,
kháng sinh là một giải pháp quan trọng kiểm soát bệnh trong nuôi trồng thủy sản.
1.5. Chế phẩm nitrate hóa
Chế phẩm nitrate hóa được hình thành dựa trên nguyên lí hoạt động của nhóm
vi khuẩn nitrate hóa tham gia vào quá trình nitrate hóa.
1.5.1 Quá trình nitrate hóa
Quá trình nitrate hóa là quá trình chuyển hóa amoni (NH4+) thành nitrate
(NO3-) bởi tác động của các vi khuẩn hiếu khí. Trước hết NH4+ được chuyển hóa
thành NO2- bởi các vi khuẩn oxy hóa amoni (chủ yếu vi khuẩn thuộc chi
Nitrosomonas), sau đó vi khuẩn oxy hóa nitrite (chủ yếu thuộc chi Nitrobacter) tiếp
tục chuyển hóa NO2- thành NO3- với sự xúc tác của enzyme nitrite oxidase. NO3- có

thể được các thực vật thủy sinh sử dụng như là một nguồn dinh dưỡng hoặc có thể
bị chuyển hóa tiếp thành khí nitơ (N2) thông qua hoạt động của các vi khuẩn yếm
9


khí như Pseudomonas. Các quá trình chuyển hóa NH4+ xảy ra phụ thuộc vào nồng
độ oxy hòa tan và độ kiềm của nước. Quá trình nitrate hóa gồm 2 giai đoạn được
thực hiện bởi hai nhóm vi khuẩn nối tiếp nhau. Hai nhóm vi khuẩn này có mối quan
hệ mật thiết với nhau, chúng phân bố rộng rãi trong tự nhiên: môi trường đất, nước.
Môi trường thích hợp cho cả 2 loại này phải có pH trong khoảng 6 - 8 (tối ưu ở pH=
7,5).
Giai đoạn nitrite hóa: Chuyển hóa NH4+ thành NO2- bởi nhóm vi khuẩn nitrite

hóa.

NH4+ + 1,5 O2 → NO2 + 2H+ + H2O (1)
Vi khuẩn tham gia vào quá trình này chủ yếu là vi khuẩn tự dưỡng, hiếu khí bắt
buộc, Gram âm. Năng lượng sinh ra từ quá trình chuyển hóa NH4+ thành NO2- sẽ
được các vi khuẩn nitrite hóa sử dụng cho hoạt động sống của mình. Sự có mặt của
các nhóm vi khuẩn nitrite hóa giúp loại bỏ được NH4+, khi hàm lượng NH4+ trong
nước giảm phương trình phản ứng (1) sẽ dịch chuyển theo chiều thuận dẫn đến
giảm hàm lượng NH3 trong nước, giảm khả năng gây độc đối với tôm cá.
Cho đến nay người ta đã phát hiện được các vi khuẩn tham gia vào quá trình
nitrate hóa thuộc các chi: Nitrosococcus, Nitrosomonas, Nitrosopira, Nitrosocystis,
Nitrosolobus [1]. Tất cả các vi sinh vật này đều giống nhau về mặt sinh lí, hóa sinh
nhưng khác nhau về đặc điểm hình thái và cấu trúc tế bào.
-

Giai đoạn nitrate hóa: Chuyển NO2- thành NO3NO2 + 0,5O2 → NO3 + 73kJ (2)
Giai đoạn tiếp theo của quá trình nitrite hóa là sự chuyển hoá NO2- thành

NO3- với sự tham gia của các vi khuẩn oxy hóa nitrite trong điều kiện hiếu khí. Vi
khuẩn tham gia vào quá trình này cũng là vi khuẩn hóa tự dưỡng, chúng chủ yếu
thuộc các chi: Nitrobacter (Nitrobactervinogradskii, Nitrobacter agilis), Nitrospina
(Nitrospina gracili), Nitrococcus (Nitrococcus mobilis); Nitrospira [1].

10


1.5.2. Hệ vi khuẩn nitrate hóa
Hệ vi khuẩn nitrate hóa luôn tồn tại trong đất và nước ngọt, môi trường biển,
nước lợ, chúng là nhóm vi khuẩn tự dưỡng lấy năng lượng và lực từ quá trình oxy
hóa, khi đó chúng sẽ phân giải NH3 (là sản phẩm cuối của quá trình amon hóa)
thành nitrite, nitrate. Nitrate được hình thành thích hợp cho cây trồng sử dụng, hoặc
là cơ chất cho nhóm vi khuẩn khử nitrate, sản phẩm cuối tạo khí nitơ (N2) tự do.
Đồng thời do khả năng linh hoạt trong việc oxy hóa các hợp chất nitơ (N2O, NO,
NO2-, NO3-) nên một thời gian dài người ta xem hệ vi khuẩn này xuất phát chỉ từ
một nhóm thuộc họ Nitrobacteriaceae [25]. Sau đó dựa vào khả năng oxy hóa các
hợp chất vô cơ của vi khuẩn nitrate mà người ta đã chia nhóm vi khuẩn này thành 2
nhóm, nhóm vi khuẩn oxy hóa amoni và nhóm vi khuẩn oxy hóa nitrie.
Đặc trưng của hệ vi khuẩn nitrate hóa là chúng sống được trong môi trường
khoáng vô cơ và oxy hóa chuyên biệt amoni, nitrite hoặc nitrate, không sử dụng
glucose, peptone hay các chất hữu cơ khác để thu năng lượng. Vì vậy, các nhà khoa
học xếp chúng vào nhóm khoáng vô cơ tự dưỡng (lithoautotropic) để phân biệt với
nhóm heterotropic. Bên cạnh đó, hệ vi khuẩn nitrate hóa luôn tồn tại song song với
nhau và có mối quan hệ tương hỗ để hỗ trợ nhau trong quá trình sinh tồn, sản phẩm
của quá trình này (nitrite) là cơ chất chuyển hóa tiếp cho quá trình tiếp theo. Chính
vì vậy hệ vi khuẩn này tồn tại trong môi trường sống rất lâu, ngay cả trong các điều
kiện khắc nghiệt. Vi khuẩn thuộc nhóm heterotropic sống trong môi trường hữu cơ,
chúng bao gồm các loài nấm (Aspergillus), vi khuẩn dị dưỡng (Bacillus,

Paracoccus Pseudomonas, Thermus, Azoarcus) cũng có khả năng oxy hóa amoni
hay nitrite để thu năng lượng, nhưng hoạt tính rất thấp [25].
1.6. Nuôi cấy thu sinh khối vi khuẩn
Do là nhóm vi khuẩn tự dưỡng, nên vi khuẩn nitrate hóa sinh trưởng chậm,
nên có đã nhiều nghiên cứu để tìm được các điều kiện tối ưu cho sinh trưởng và
phát triển của nhóm vi khuẩn này. Trong đó đã có một số nghiên cứu chứng minh
rằng các nhóm vi khuẩn này sinh trưởng tốt hơn trong điều kiện có chất mang [1].
Như vậy, để làm tăng mật độ tế bào của nhóm các vi khuẩn này thì quá trình lên
men xốp có thể phù hợp và đạt hiệu quả hơn.

11


Lên men xốp: là thuật ngữ dùng cho các quá trình mà trong đó các vi khuẩn
được sinh trưởng bằng cách sử dụng các vật liệu không tan trong nước. Trong quá
trình lên men xốp, nước là yếu tố thiết yếu nhưng độ ẩm không vượt quá hàm lượng
bão hòa của cơ chất xốp. Ưu điểm của kĩ thuật lên men xốp là môi trường nuôi cấy
đơn giản, lượng chất thải sinh ra ít hơn so với lên men dịch thể, enzyme tạo ra từ
quá trình lên men xốp ít nhạy cảm hơn với các chất kìm hãm hoặc ức chế trao đổi
chất, thu hồi sản phẩm tốt hơn, không phải phá bọt. Quá trình lên men xốp là sử
dụng cơ chất phù hợp cho vi khuẩn nitrate hóa bám dính. Một ưu điểm khác mang
tính lợi thế là các cơ chất sử dụng cho lên men xốp luôn có sẵn và rẻ, được thu nhập
từ các phế phẩm công, nông nghiệp (như trấu, cám gạo, bã mía, bã cà phê, bã nho,
cùi dừa…) hoặc các nguyên liệu tro (các loại nhựa trao đổi ion). Các chất thải nông
nghiệp không những rẻ mà còn là một nguồn cơ chất giàu dinh dưỡng. Sử dụng các
cơ chất có sẵn này còn góp phần làm sạch môi trường sinh thái [10].
1.7. Cố định tế bào vi sinh vật trên bề mặt chất mang
Khái niệm: kĩ thuật cố định tế bào được định nghĩa là: “Kĩ thuật bao bọc
hoặc định vị các tế bào còn nguyên vẹn lên một vùng không gian nhất định nhằm
bảo vệ các hoạt tính xác tác mong muốn” (Karel et al., 1985).

Cố định thường là sự bắt trước các hiện tượng xảy ra trong tự nhiên do các tế
bào có thể phát triển trên bề mặt hoặc bên trong các cấu trúc của nguyên liệu có
trong tự nhiên. Nhiều vi sinh vật tự nó có khả năng gắn trên những bề mặt khác
nhau trong tự nhiên. Nhiều công trình xử lí nước thành công hơn nhờ kĩ thuật cố
định tế bào. Từ đó đã dẫn đến các nghiên cứu của các chất mang khác nhau phù hợp
cho mỗi nhóm vi sinh vật và công nghệ sẽ áp dụng. Những kĩ thuật cố định tế bào
này có thể chia thành 4 nhóm chính như: cố định trên bề mặt chất mang rắn, nhốt
trong khung mạng xốp, kẹo tụ tế bào (tạo hạt), nhốt bằng phương pháp cơ học trên
khung một màng chắn [23].
1.8. Chất mang sử dụng trong chế phẩm
Có nhiều loại chất mang được sử dụng trong kĩ thuật cố định tế bào vi sinh
vật, chúng được phân loại theo các nhóm sau: chất mang có nguồn gốc hữu cơ, chất
mang có nguồn gốc vô cơ, chất mang có nguồn gốc tự nhiên và hệ thống màng [6].

12


Điều kiện lựa chọn chất mang:
-

Có tính chất cơ lí bền vững, không tan trong môi trường phản ứng.

-

Phù hợp với sự sinh trưởng của vi sinh vật

-

Phù hợp hình dạng thiết bị phản ứng sinh học

-

An toàn cho môi trường sống

-

Chất mang có cấu trúc siêu lỗ

-

Giá thành chất mang rẻ
1.8.1. Tro trấu

•

Các nhà nghiên cứu đã phát hiện ra những công dụng đặc hiệu của các phế
phụ phẩm trong đó phải kể đến tro trấu với các ứng dụng trong các lĩnh vực khác
nhau. Trong những năm gần đây việc ứng dụng tro trấu vào sản xuất vật liệu xây
dựng nhằm giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường, góp phần xây dựng một nền sản
xuất nông nghiệp bền vững là một trong những mục tiêu đang được các nhà nghiên
cứu quan tâm. Gần đây các nghiên ứng dụng từ tro trấu cũng đã được tiến hành như
nghiên cứu quy trình thu hồi Silica từ tro trấu, ứng dụng tổng hợp phụ gia cho xi
măng mác cao [3], nghiên cứu tạo bê tông từ tro trấu và các vật liệu siêu dẻo [8].
-

Thành phần hóa học của tro trấu
Tro trấu có dạng hạt dẹt nhiều góc cạnh, cỡ hạt trung bình khoảng 17µm, có

nhiều lỗ xốp, màu đen. Vỏ trấu sau khi đốt cháy thành tro, các thành phần hữu cơ sẽ
chuyển hóa thành các oxit kim loại, silic oxit là chất có tỉ lệ phần trăm cao nhất

chiếm 80 – 90%. Các thành phần oxit có trong tro được thể hiện trong bảng 1 và các
thành phần này có thể thay đổi tùy thuộc vào giống cây lúa, điều kiện khí hậu đất
đai,…
Bảng 1: Thành phần hóa học của tro trấu [8]
Thành phần hóa học của tro trấu %
SiO2

Al2O3

Fe2O3

CaO

MgO

K2O

Na2O

MKN

90.75

0.52

0.48

1.04

0.56

1.34

0.67

3.10

13


1.9. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
Năm 2009, Manju và cộng sự đã nghiên cứu và đưa ra quy trình cố định hệ
vi khuẩn nitrate hóa lên bột gỗ của cây thân thảo Ailantus altissima (300 - 1500µm)
nhằm chuyển hóa lượng amoni trong nước nuôi tôm sang nitrate [24]. Chế phẩm có
tên thương mại là TANOX (Total Amoni Oxidizer), giống vi sinh được phân lập từ
trong các bể nuôi tôm, được Achuthan và cộng sự tuyển chọn trong một công trình
nghiên cứu vào năm 2006 [18]. Quá trình nuôi thu sinh khối các chủng vi khuẩn
nitrate hóa trong cùng một thiết bị, sau đó tiến hành bẫy - hấp thụ với bột gỗ. Thời
gian cố định vi khuẩn theo phương pháp này là 72h thì chế phẩm có hoạt lực nitrate
hóa cao nhất. Kết quả đã cho thấy, với nồng độ ban đầu 105 tế bào/ml thì 1 gram
chế phẩm sau cố định trong 3 ngày sẽ có hoạt lực nitrate hóa cao nhất. Dùng 0,2 g
chế phẩm ứng với 20L nước biển cần xử lí, mức độ chuyển hóa amoni đạt trung
bình 2,4 mg/l.ngày trong 3 ngày đầu tiên. Ngoài việc gắn vi khuẩn lên bột gỗ thì tác
giả Shan và Obbard (2001) nghiên cứu quy trình bẫy vi khuẩn nitrate hóa vào đất
sét nhằm tạo chế phẩm có hoạt lực phân giải amoni cao [25]. Giống vi khuẩn được
phân lập từ hệ vi sinh vật bản địa có sẵn trong bùn ở các bể nuôi tôm và trải qua
một số quy trình hoạt hóa, do vậy hoạt lực phân giải rất cao, lên đến 200 mg/l. Giá
thể để bẫy hấp phụ là các hạt đất sét, có nhiều lỗ xốp, diện tích bề mặt là 1,3 – 3,4
m2/g, được xử lí thành dạng viên có đường kính 1cm, nặng 1g. Theo kết quả đạt
được, chỉ cần 1g hạt có thể xử lí được 10 lít nước thải ( tỉ lệ 1:1000) với hiệu quả

phân giải TAN đáng kể (khoảng 3,2 mg N-NH4+/l.ngày).
Tại Việt Nam theo danh mục các sản phẩm xử lí, cải tạo môi trường nuôi
trồng thủy sản được phép lưu hành tại Việt Nam của Bộ Nông nghiệp và Phát triển
Nông thôn, trong số các sản phẩm sản xuất trong nước, có nhiều sản phẩm chứa các
chủng vi sinh vật có lợi trong đó có một số sản phẩm chứa các chủng vi khuẩn
thuộc chi Nitrosomonas và Nitrobacter thường dùng cho các ao nuôi tôm, cá giống.
Một số nghiên cứu của các trường Đại học Bách Khoa Hà Nội như nghiên cứu ứng
dụng công nghệ vi sinh để xử lí nước thải sinh hoạt đô thị. Trường Đại học Quốc
gia Hà Nội, Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học có nghiên cứu điều kiện thích
hợp cho sinh trưởng của vi khuẩn nitrate hóa trong quá trình lên men…, nhưng các
nghiên cứu này cũng chỉ mới bắt đầu và cũng chưa đáp ứng được nhu cầu thực tiễn
14


của các cơ sở ươm giống hải sản. Các nghiên cứu cơ bản trước đây của chúng tôi về
nhóm vi khuẩn nitrate hóa về tính chất sinh học cũng như vai trò của nó trong quá
trình xử lí nước bị ô nhiễm amoni đã thu được những kết quả khả quan về định
hướng ứng dụng ngoài thực tế. Để tiếp tục nghiên cứu về nhóm vi khuẩn nitrate hóa
này, chúng tôi đề xuất các nghiên cứu sản xuất chế phẩm nitrate hóa để ứng dụng
cho các công nghệ xử lí nước nuôi trồng hải sản bị nhiễm amoni.
Việc nghiên cứu chế phẩm ở dạng khô kết hợp với kĩ thuật lên men xốp phù
hợp cho đặc tính của nhóm vi khuẩn này tạo điều kiện thích hợp và sự sinh trưởng
của chúng là một việc cực kì quan trọng và cần thiết. Bên cạnh đó, chế phẩm nitrate
hóa dạng khô có tính ưu việt cao trong việc bảo quản, vận chuyển và dễ dàng sử
dụng. Việc sử dụng nguồn cơ chất tro trấu có thành phần hóa học phù hợp đối với
các nhóm vi khuẩn nitrate hóa.

15

Phần 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị sử dụng
2.1.1. Nguyên liệu
Các chủng vi khuẩn nitrate hóa được cung cấp từ kho giống của phòng thí
nghiệm Công nghệ Sinh học Môi trường, viện Công nghệ sinh học.
Chất mang dùng làm chế phẩm: tro trấu.
2.1.2. Hóa chất, môi trường
- Hóa chất: các hóa chất thông dụng có nguồn gốc từ Trung Quốc, Mỹ, Đức…
- Thiết bị: các thiết bị trong phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học môi trường và thiết
bị của phòng thí nghiệm trọng điểm của Viện Công nghệ sinh học bao gồm tủ nuôi cấy
vi sinh, máy quang phổ, máy ly tâm, máy sấy, nồi hấp khử trùng….
- Môi trường nuôi cấy
Bảng 2.1: Môi trường nuôi cấy vi khuẩn nitrate hóa
Môi trường Winograskyi I cải

Môi trường Winograskyi II cải

tiến (g/l)

tiến (g/l)

(NH4)2SO4

4,7

NaNO2

4,9

K2HPO4

0,31

K2HPO4

0,31

MgSO4.7H2O

0,5

MgSO4.7H2O

0,5

NaHCO3

2

NaHCO3

2

FeSO4

0,4

FeSO4

0,4

pH

7,5±0,2

pH

7,5±0,2

Môi trường đặc là các thành phần hóa chất giống môi trườngWinograski I, II bổ sung
20 g/l Agar.

16


2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật
Hoạt hóa các chủng vi khuẩn nitrate hóa từ tập đoàn chủng giống trên môi
trường Winograski tương ứng, sau đó thử hoạt tính nitrate hóa của các chủng vi khuẩn.
Trong cùng một điền kiện nuôi cấy như nhau, vi khuẩn được lựa chọn dựa vào khả
năng chuyển hóa amoni hoặc nitrite cao hơn.
Các chủng vi khuẩn lựa chọn được lên men thu sinh khối sử dụng cho mục đích
nghiên cứu tạo chế phẩm nitrate hóa.

17


Chủng VK oxy
hóa nitrite

Chủng VK oxy
hóa amoni

1

2

3

Giống được cấy trên đĩa thạch

10 ml MT

1

100 ml
MT

2

Hoạt hóa trên môi trường
lỏng

Nhân giống cấp1

3

1L MT

Nhân giống cấp 2

2000ml sinh khối
Hình 2.1: Sơ đồ tổng quan quy trình nhân giống vi sinh vật
2.2.2. Phương pháp cố định tế bào trên bề mặt chất mang rắn
• Nguyên tắc: phối trộn tế bào vi khuẩn vào chất mang theo phương pháp hấp phụ
trong điều kiện phù hợp pH, lực ion, độ ẩm, nhiệt độ v.v…, hỗn hợp được lên men
trong điều kiện thích hợp
• Chuẩn bị vật liệu làm chất mang: Trấu được thu thập, sơ chế để loại bỏ các tạp
chất sau đó đốt cháy hoàn toàn thành tro.
18