Tinh sạch và đánh giá tính chất của LUMBROKINASE tái tổ hợp ở PICHIA PASTORIS

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

----------

-----------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
TINH SẠCH VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT CỦA LUMBROKINASE
TÁI TỔ HỢP Ở PICHIA PASTORIS

Người hướng dẫn

: TS. Đỗ Thị Tuyên

Sinh viên thực hiện

: Nguyễn Ngọc Minh

Lớp

: KS CMSH 11-01

Đề tài được thực hiện tại phòng Công nghệ sinh học enzyme

Hà Nội - 2015


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới TS. Đỗ Thị

Tuyên, Phó trưởng phòng Công nghệ sinh học Enzyme, Viện Công nghệ sinh học,
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã định hướng nghiên cứu, hướng
dẫn, sửa luận văn và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn cố PGS. TS Quyền Đình Thi, Trưởng phòng Công
nghệ sinh học Enzyme, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công
nghệ Việt Nam, đã tạo mọi điều kiện về hóa chất, thiết bị, thời gian giúp đỡ tôi hoàn
thiện đề tài này.
Tôi xin cảm ơn Ths. Vũ Thị Bích Ngọc đã trực tiếp hướng dẫn tôi trong quá
trình hoàn thành luận văn. Tập thể cán bộ, nghiên cứu sinh, sinh viên phòng Công
nghệ sinh học Enzyme, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công
nghệ Việt Nam đã giúp đỡ tôi tận tình trong suốt quá trình làm khóa luận, tôi xin
gửi lời cảm ơn sâu sắc.
Tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo Khoa Công nghệ sinh học – Viện Đại học Mở
Hà Nội đã luôn quan tâm, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học
tập và hoàn thiện luận văn tốt nghiệp.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè đã luôn động
viên giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập.

Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2015

Nguyễn Ngọc Minh

i


BẢNG KÍ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Kí hiệu

Tên đầy đủ

APS

Ammonium persulfate

BSA

Bovine serum albumin (albumin huyết thanh bò)

Bp

Base pairs

cs

Cộng sự

cDNA

Complement DNA

DNA

Deoxyribonucleic acid

dNTP

2’ Deoxynucleoside 5’ triphosphate

ĐC
EDTA

kb
kDa

Đối chứng
Ethylene diamine tetraacetic acid
Kilo base
Kilo dalton

M

Marker (thang chuẩn)

OD

Optical density

PCR

Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)

RNA

Ribonucleic acid

RNase

Ribonuclease

rLK

Recombinant lumbrokinase (lumbrokinase tái tổ hợp)

Rpm

Revolutions per minute (vòng quay/ phút)

SDS

Sodium dodecyl sulfate

SDSPAGE

Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis

Taq

Thermus aquaticus

TE

Tris EDTA

TEMED
v/v
WHO

N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine
Volume/ volume
World Health Organization

Nguyễn Ngọc Minh

ii


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2. 1. Hóa chất và enzyme .............................................................................. 15
Bảng 2. 2. Dung dịch và đệm ................................................................................. 16
Bảng 2. 3. Môi trường ........................................................................................... 17
Bảng 2. 4. Máy móc và thiết bị .............................................................................. 17
Bảng 2. 5. Thành phần gel co và gel tách ............................................................... 20
Bảng 3. 1. Hàm lượng protein và hoạt tính riêng của dịch sau hòa tủa ở các nồng độ
muối bão hòa khác nhau ........................................................................................ 25
Bảng 3. 2. Hiệu suất tinh sạch rLK ........................................................................ 27
Bảng 3. 3. Ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt tính enzyme ......................... 33

Nguyễn Ngọc Minh

iii


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1. 1. Cơ chế hoạt động của LK ........................................................................ 8
Hình 1. 2. Vector pPICZαA ................................................................................... 13
Hình 2. 1. Đường chuẩn BSA (Sigma) ................................................................... 20
Hình 2. 2. Đường chuẩn plasmin (Sigma) .............................................................. 22
Hình 3. 1. Điện di đồ protein ngoại bào thu được từ dịch nuôi cấy chủng nấm men
tái tổ hợp ............................................................................................................... 24
Hình 3. 2. Đĩa thử hoạt tính thủy phân fibrin sau khảo sát nồng độ tủa muối
ammonium sulfate dịch lên men chủng nấm men tái tổ hợp XpPLK11 .................. 26

Hình 3. 3. (A) Điện di đồ sản phẩm tinh sạch rLK, (B) Đĩa thử hoạt tính thủy phân
fibrin ...................................................................................................................... 27
Hình 3. 4. Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme rLK ..................................... 29
Hình 3. 5. Ảnh hưởng nhiệt độ đến độ bền enzyme rLK. ....................................... 30
Hình 3. 6. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme ....................................... 30
Hình 3. 7. Ảnh hưởng của pH đến độ bền enzyme ................................................. 31
Hình 3. 8. Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ đến hoạt tính enzyme ........................ 32
Hình 3. 9.Ảnh hưởng của chất tẩy rửa đến hoạt tính enzyme ................................. 33

Nguyễn Ngọc Minh

iv


MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN .........................................................................................................i
BẢNG KÍ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT .......................................................ii
DANH MỤC CÁC BẢNG ................................................................................... iii
DANH MỤC CÁC HÌNH ..................................................................................... iv
MỤC LỤC.............................................................................................................. v
MỤC LỤC.............................................................................................................. v
MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3
1.1. Bệnh tắc nghẽn mạch máu ............................................................................. 3
1.1.1. Sơ lược về bệnh tắc nghẽn mạch máu ..................................................... 3
1.1.2. Khái niệm về bệnh tắc nghẽn mạch máu ................................................. 3
1.1.3. Nguyên nhân gây tắc nghẽn mạch máu ................................................... 4
1.1.4. Các phương pháp điều trị bệnh tắc nghẽn mạch máu .............................. 4
1.2. Khái quát về lumbrokinase ............................................................................ 6

1.2.1. Giới thiệu chung ..................................................................................... 6
1.2.2. Nguồn gốc .............................................................................................. 7
1.2.3. Cơ chế hoạt động .................................................................................... 7
1.2.4. Ứng dụng................................................................................................ 8
1.3. Tình hình nghiên cứu .................................................................................... 9
1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới .......................................................... 9
1.3.2. Tình hình nghiên cứu lumbrokinase trong nước .................................... 10
1.4. Gỉớỉ thiệu về hệ biểu hiện P. pastoris .......................................................... 11
1.4.1. Hệ biểu hiện P. pastoris ........................................................................ 11
1.4.2. Vector biểu hiện pPICZαA ................................................................... 13
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP................................................. 15
2.1. Vật liệu và hóa chất ..................................................................................... 15
2.1.1. Chủng vi sinh vật .................................................................................. 15
2.1.3. Dung dịch và đệm ................................................................................. 15
2.1.4. Môi trường ........................................................................................... 16
2.1.5. Máy móc và thiết bị .............................................................................. 17
2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 18
2.2.1. Biểu hiện lumbrokinase tái tổ hợp ở chủng P. pastoris .......................... 18
2.2.2. Tủa muối ammonium sulfate ................................................................ 18
2.2.3. Tinh sạch protein tái tổ hợp .................................................................. 18
2.2.4. Xác định hàm lượng protein ................................................................. 19
2.2.5. Điện di biến tính protein (SDS-PAGE) ................................................. 20
2.2.5. Xác định hoạt tính thủy phân fibrin....................................................... 21
2.2.6. Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme ........................... 22
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................................... 24
3.1. Biểu hiện lumbrokinase trong P. pastoris .................................................... 24
3.2. Tinh sạch lumbrokinase tái tổ hợp ............................................................... 25
3.2.1. Tủa protein bằng muối ammonium sulfate ............................................ 25
Nguyễn Ngọc Minh

v


3.2.2. Tinh sạch lumbrokinase ........................................................................ 26
3.3. Đánh giá tính chất của rLK ......................................................................... 27
3.3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính và độ bền enzyme rLK .............. 27
3.3.2. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính và độ bền của enzyme rLK ................ 30
3.3.3. Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ đến hoạt tính của enzyme rLK .......... 31
3.3.4. Ảnh hưởng của chất tẩy rửa đến hoạt tính của enzyme rLK .................. 32
3.3.5. Ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt tính enzyme rLK ........................ 33
KẾT QUẢ VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................ 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 36
PHỤ LỤC ............................................................................................................. 39

Nguyễn Ngọc Minh

vi


MỞ ĐẦU
Bệnh tim mạch là một trong những nguyên nhân gây tử vong cao nhất trên
toàn thế giới. Theo tổ chức Y tế thế giới (WHO), hàng năm có khoảng trên 17 triệu
người chết vì bệnh tim mạch, dự tính lên tới 23,3 triệu người vào năm 2030. Trên
80% các ca tử vong xảy ra ở các nước có thu nhập thấp và trung bình, điển hình là
các nước đang phát triển tại vùng Nam Á và Đông Nam Á, nơi bệnh tim mạch đang
gia tăng cùng với tốc độ công nghiệp hóa, đô thị hóa và những thay đổi trong lối
sống [18] . Tại Việt Nam, theo thống kê của Viện tim mạch, tỷ lệ người dân mắc
các bệnh tim mạch và đột quỵ khoảng 16% dân số.
Có nhiều nguyên nhân dẫn tới rối loạn tim mạch và mạch máu não như: chứng
tràn máu não, tăng huyết áp, sơ cứng động mạch... [21]. Trong tổng số các bệnh

nhân bị tai biến mạch máu não thì có đến 24% tử vong, 50% sống nhưng bị các di
chứng nặng hoặc nhẹ, chỉ có 26% số bệnh nhân sống và làm việc bình thường.
Nguyên nhân chủ yếu là do xuất hiện cục máu đông gây tắc mạch và cản trở lưu
thông máu. Do đó, việc làm tan cục máu đông đóng vai trò quan trọng trong việc
điều trị bệnh này.
Vào khoảng những năm 90, các nhà nghiên cứu tại Nhật Bản đã phát hiện
được 1 enzyme có hoạt tính thủy phân fibrin cao từ giun đất Lumbricus rubellus,
bao gồm 6 izozyme được đặt tên chung là lumbrokinase [30]. Về phương diện lâm
sàng, lumbrokinase được xem là thuốc tan huyết khối đặc hiệu, sử dụng làm thuốc
uống vì có thể được hấp thu từ ruột vào máu và hoạt hóa hệ thống fibrin nội sinh
[35]. Một ưu điểm lớn của lumbrokinase so với các thuốc điều trị bệnh tắc nghẽn
mạch thông dụng khác - thường được sử dụng làm thuốc tiêm như tPA (tissue type
plasminogen activator), urokinase và streptokinase [24] là không có tác dụng phụ,
không gây chảy máu hệ thống, giá thành rẻ.
Hiện nay, hầu hết các thuốc đặc trị tắc nghẽn mạch máu có mặt tại Việt nam
phải nhập khẩu từ nước ngoài và có giá thành cao. Vì vậy, những năm gần đây,
nghiên cứu sản xuất các yếu tố chống tắc nghẽn mạch máu dạng tự nhiên và tái tổ

Nguyễn Ngọc Minh

1


hợp bắt đầu được quan tâm ở trong nước. Trong đó việc ứng dụng công nghệ sinh
học để sản xuất lumbrokinase tái tổ hợp được các nhà nghiên cứu trên thế giới quan
tâm. Các chủng tái tổ hợp có những ưu điểm: chủ động về giống, hoạt tính cao, ổn
định, thuận lợi cho quá trình sản xuất tạo sản phẩm.
Nhằm góp phần vào việc tạo sản phẩm và chủ động nguồn nguyên liệu để sản
xuất lumbrokinase tái tổ hợp, đề tài KC04.01/11-15 (2012-2014) “Nghiên cứu quy
trình công nghệ sản xuất lumbrokinase tái tổ hợp làm thuốc phòng chống tắc nghẽn

mạch máu’’ cấp Bộ Khoa học và Công nghệ do PGS.TS. Quyền Đình Thi làm chủ
nhiệm đã đề xuất xây dựng quy trình công nghệ sản xuất lumbrokinase tái tổ hợp.
Chúng tôi tiến hành nghiên cứu “Tinh sạch và đánh giá tính chất của
lumbrokinase tái tổ hợp ở Pichia pastoris”. Với đề tài trên, luận văn tập trung giải
quyết các mục tiêu sau: (1) Tinh sạch lượng lớn protein lumbrokinase tái tổ hợp có
hoạt tính thủy phân fibrin; (2) Đánh gía tính chất của lumbrokinase tái tổ hợp tinh
sạch.

Nguyễn Ngọc Minh

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Bệnh tắc nghẽn mạch máu
1.1.1. Sơ lược về bệnh tắc nghẽn mạch máu
Bệnh tắc nghẽn mạch máu gây ra rối loạn tim mạch và tai biến mạch máu não là
một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế giới. Liên đoàn tim
mạch thế giới đưa ra thống kê cứ ba người thì có một người tử vong trong đó có
một người tử vong vì bệnh tim mạch. Ở Mỹ cứ 29 giây có một người bị bệnh mạch
vành, và cứ 1 phút thì có một người tử vong. Tử vong do bệnh tim mạch chiếm
42% toàn bộ các ca tử vong, phí tổn do bệnh này chiếm 128 tỉ usd mỗi năm . Hiện
nay trên thế giới số người chết hoặc chịu di chứng nặng nề từ các bệnh tim mạch
và tai biết mạch máu não ngày càng gia tăng, nhất là các nước đang phát triển.
Ngoài ra còn có rất nhiều bệnh liên quan đến tắc nghẽn mạch máu não như: tràn
máu não, nhồi máu cơ tim, tắc động mạch phổi. Nguyên nhân chủ yếu của các bệnh
trên là do các cục máu đông làm tắc nghẽn mạch máu. Do đó để hạn chế thấp nhất
tỉ lệ tử vong và các biến chứng do bệnh tim mạch gây ra, các nhà khoa học đã đi
theo hướng xử lý các huyết khối hình thành trong thành mạch. Và việc làm tan cục
máu đông đóng vai trò quan trọng trong việc điều trị bệnh tim mạch.

1.1.2. Khái niệm về bệnh tắc nghẽn mạch máu
Bệnh tắc nghẽn mạch máu là một chứng bệnh do fibrin bị đóng cục tạo thành
cục máu đông lưu giữ trong mạch gây tắc mạch và cản trở lưu thông máu. Bệnh
này tác động nên cả hệ thống động mạch (gọi là huyết khối động mạch do xơ vữa)
và hệ thống tĩnh mạch (gọi là thuyên tắc- huyết khối tĩnh mạch) [33]
Huyết khối động mạch do xơ vữa là hiện tượng chất béo tích tụ trong thành
động mạch và tạo thành mảng xơ vữa động mạch. Khi mảng xơ vữa bị vỡ ra, tại
những chỗ này, máu sẽ bị hoạt hóa và đông cục gây tắc động mạch. Những cục
máu đông đó được gọi là huyết khối. Bệnh có thể gây ra hiện tượng nhồi máu cơ
tim, hoại tử [33].
Thuyên tắc huyết khối tĩnh mạch là một chứng bệnh có liên quan đến tình

Nguyễn Ngọc Minh

3


trạng máu đóng cục trong các tĩnh mạch nằm sâu bên trong cơ thể, thường gặp
nhất là các tĩnh mạch ở chân. Đây là tình trạng tắc nghẽn một tĩnh mạch do cục
máu đông được vận chuyển trong dòng máu từ một nơi khác đến. Huyết khối tĩnh
mạch sâu xảy ra khi cục máu đông được hình thành và làm tắc tĩnh mạch chi dưới
hay tĩnh mạch chậu. Khi cục máu đông bị bóc tách ra khỏi thành mạch, nó có thể
dẫn đến thuyên tác phổi, gây tử vong. Chứng bệnh này phổ biến ở người già,
nhưng phụ nữ trẻ cũng không miễn nhiễm, đặc biệt là trong thời kỳ sinh đẻ [32].
1.1.3. Nguyên nhân gây tắc nghẽn mạch máu
Các nghiên cứu đã chỉ ra rất nhiều nguyên nhân gây tắc nghẽn mạch máu:
Tắc nghẽn mạch máu do yêu tố V Leiden là một biến thể của yếu tố V trong
quá trình đông máu. Yếu tố này bị bất hoạt chậm nên tồn tại lâu hơn trong máu gây
ra tình trạng đông máu. Tỷ lệ đột biến gene của yếu tố V Leiden chiếm 20-40%
các bệnh nghẽn mạch máu và tần suất bệnh là 5% trong quần thể dân cư [29].

Tắc nghẽn mạch do thiếu antithrombin: Antithrombin ức chế hoạt động của
một số yếu tố đông máu như thrombin, IXa, Xa. Do đó, thiếu antithrombin là một
nguyên nhân gây tác nghẽn mạch máu đây là bệnh mang di truyền thể trội trên
nhiễm sắc thể thường. Bệnh thường gặp là tắc nghẽn mạch phổi ( co động mạch ) và
tĩnh mạch, ít thấy tác nghẽn động mạch. Chứng tắc nghẽn mạch máu này có thể xảy
ra một cách tự phát hoặc do chấn thương, thai nghén và phẫu thuật [29].
Tắc nghẽn động mạch: Do mỡ và Ca2+ lắng đọng gây biến dạng bề mặt thành
mạch làm kích hoạt con đường đông máu nội sinh là nguyên nhân của tắc nghẽn
mạch máu do tăng mỡ máu và tiến triển thành xơ vữa động mạch. Nghẽn động
mạch có thể gây ra nhồi máu cơ tim hoặc đột quỵ.
Tắc nghẽn mạch máu là nguyên nhân dẫn đến các bệnh tim mạch, nguyên nhân
gây tử vong hàng đầu tại các nước phát triển.
1.1.4. Các phương pháp điều trị bệnh tắc nghẽn mạch máu
1.1.4.1. Các thuốc hóa học
Các thuốc kháng đông máu có bản chất hóa học thường được sử dụng là
heparin và coumarin. Đầu những năm 1950, aspirin được sừ dụng trong việc ngăn
Nguyễn Ngọc Minh

4


ngừa nhồi máu cơ tim [9], tuy nhiên vai trò của nó trong việc điều trị cấp tính
không được chứng minh. Các thuốc heparin, aspirin, atropine, papaverine và
nitroglycerin cũng thường xuyên được dùng để ngăn ngừa hoặc làm giảm co thắt
mạch vành. Như vậy, cho đến những năm 1950 các phương pháp điều trị chỉ là
giảm nhẹ chứ không phải điều trị. Do đó bệnh tắc nghẽn mạch vẫn là nguyên nhân
gây tử vong lớn ở người cao tuổi.
1.1.4.2 Các thuốc có bản chất enzyme
Sau khi nhận ra sự phân giải fibrin có thể được thực hiện trong cơ thể sống
bằng quá trình chuyển hóa plasminogen không hoạt động thành plasmin hoạt động,

người ta hướng đến phương pháp điều trị mới là sử dụng các chất hoạt hóa
plasminogen hoặc trực tiếp thủy phân fibrin. Các nghiên cứu lâm sàng chỉ ra ràng
cách tốt nhất để hòa tan huyết khối là tiêm trực tiếp vào tĩnh mạch một enzyme có
khả năng hoạt hóa plasminogen thành plasmin hoặc enzyme có khả năng thủy phân
trực tiếp fibrin như các loại thuốc sau: streptokinase, alteplase, urokinase,
lumbrokinase.
Streptokinase (SK): là một protein có khối lượng phân tử 47 kDa, do liên cầu
khuẩn tan huyết I nhóm A sinh ra. Nó tác động theo một cơ chế phức tạp với cả
plasminogen liên kết và không liên kết với fibrin trong tuần hoàn để tạo thành một
phức họp hoạt hóa. Phức hợp này biến đổi plasminogen còn dư thành plasnìin là
enzyme thủy phân protein, có tác dụng tiêu fibrin và có thể làm tan các cục máu
đồng trong lòng mạch. SK được sử dụng để điều trị thuyên tắc mạch phổi và tĩnh
mạch sâu. Bên cạnh những ưu điểm trên thì SK cũng có những tác dụng phụ khi sử
dụng lâu dài như đau cơ, buồn nôn, sốt, hạ huyết áp, loạn nhịp tim [24].
Alteplase: một chất hoạt hóa plasminogen mô của người (t-PA) sản xuất bằng
công nghệ DNA tái tổ hợp. Alteplase làm tan huyết khối bằng cách gắn vào fibrin
và khởi đầu sự chuyển plasminogen thành plasmin. Tác dụng phụ của alteplase là
gây chảy máu như ở nơi tiêm, đường tiêu hóa, trong não, hạ huyết áp [33].
Urokinase: tác động trực tiếp trên hệ tiêu fibrin nội sinh để chuyen
plasminogen thành plasmin enzym thủy phân protein sẵn có trong cơ thể. Plasmin
Nguyễn Ngọc Minh

5


phân giải fibrin, fibrinogen, và những protein trợ đồng khác trong huyết tương.
Plasminogen có trong cục huyết khối và cục nghẽn mạch, do đó hoạt hóa do
urokinase diễn ra bên trong và cả trên bề mặt cục huyết khối và cục nghẽn
mạch.Tác dụng phụ của urokinase là giảm huyết áp, loạn nhịp, sưng quanh hố mát,
chảy máu ở nơi chấn thương xuyên da [12].

Nhìn chung các loại thuốc có bản chất hóa học hay có bản chất enzym đều có
tác dụng hoạt hóa plasminogen thành plasmin để thủy phân những cục máu đông
bên canh những lợi ích này còn tồn tại những khuyết điểm là chúng đều đắt và có
những tác dụng phụ khi sử dụng trong thời gian lâu dài, chính vì vậy đã có những
nghiên cứu để tìm ra một loại thuốc có giá thành rẻ có khả năng tương tự như
plasmin là thủy phân trực tiếp các cục máu đông, đó là những chế phẩm
lumbrokinase chiết xuất từ giun đất đó là enzyme lumbrokinase.
Lumbrokinase vừa có tác dụng thủy phân trực tiếp fibrin (tiêu cục máu đông),
vừa có tác dụng gián tiếp như tPA (là chất hoạt hóa thường dùng, có tác dụng thủy
phân gián tiếp fibrin bằng cách hoạt hóa plasminogen thành plasmin-enzyme thủy
phân fibrin của cơ thể). Với tác dụng kép như vậy dùng lumbrokinase cho hiệu quả
cao, giá thành thấp, mang lại lợi ích rất lớn cho người bệnh. Trên thế giới,
lumbrokinase đã được sử dụng từ năm 1980 cho đến nay, cũng như tại Việt Nam
chưa ghi nhận tác dụng phụ nào của lumbrokinse, do đó người bệnh có thể sử dụng
lâu dài.
1.2. Khái quát về lumbrokinase
1.2.1. Giới thiệu chung
Lumbrokinase (LK) là tên gọi chung chỉ một nhóm gồm 6 iso-zyme có tác
dụng thủy phân fibrin, làm tan cục máu đông. Khối lượng trung bình của LK từ 2532 kDa [28]. Lumbrokinase là những chuỗi polypeptide đơn giàu asparagine hoặc
aspartic acid, rất ít poline và lysine, không chứa thành phần đường. Chúng được xếp
vào serine protease kiềm giống trypsin tuy nhiên chúng giàu asparagine và aspartic
acid hơn so với các serine protease khác đã biết.

Nguyễn Ngọc Minh

6


Lumbrokinase được tìm thấy trong ruột, dịch mô và dịch ruột của rất nhiều
loài giun đất. Chúng có tác dụng tiêu sợi huyết mạnh, người ta giải thích sự có mặt

của nó trong các loài giun là do chúng để cần tiêu hóa thức ăn là những mảnh vụn
thực vật và các chất hữu cơ trong đất nên chúng sản xuất LK như một serine
protease [28].
Lumbrokinase là một enzyme có hoạt tính thủy phân fibrin cao, làm đứt các
sợi fibrin một loại protein trong máu vốn có tác dụng làm đông máu, giúp liền vết
thương, nhưng đồng thời nó cũng là nguyên nhân gây nên xơ vữa thành mạch của
bệnh nhân tim mạch hoặc mỡ máu, gây tắc mạch máu.
Ngoài khả năng thủy phân fibrin, lumbrokinase còn có khả năng hoạt hóa
giống như tPA, nó hoạt hóa plasminogen thành plasmin, từ đó plasmin mới thủy
phân được fibrin.
1.2.2. Nguồn gốc
Đã có nhiều công trình nghiên cứu về LK nhưng chủ yếu là tách chiết enzyme
này từ những loài giun đất. Loài giun đất Lumbricus rubellus đã được phát hiện tại
Nhật, có khả năng thủy phân mạnh fibrin và sau đó được tinh sạch từ 6 iso-enzym
đều có khả năng đó và được đặt tên là LK [31]. Tiếp theo là các nghiên cứu trên
loài giun này ở Hàn Quốc, cũng đã tinh sạch và khảo sát các đặc điểm, giải trình tự
nucleotide và nhân dòng gene mã hóa LK có hoạt tính thủy phân fibrin cao [31].
Năm 1997, Yang và Ru đă tách chiết enzyme thủy phân fibrin được hoạt hỏa bởi
SDS có nguồn gốc từ giun đất Eisenia fetida. Bằng các kỹ thuật sắc ký trên gel
DEAE sepharose, sephadex G-75 và phenyl sepharose đã tinh sạch được ioại
enzyme có khối lượng phân tử là 45 kDa gồm hai tiểu đơn vị, tiểu đơn vị lớn 26
kDa và tiểu đơn vị nhỏ 18 kDa gắn kết với nhau bằng liên kết tương tác kỵ nước
[36].
1.2.3. Cơ chế hoạt động
Cơ chế hoạt động của LK bao gồm việc kích hoạt plasminogen giống như các
yếu tố hoạt hóa mô t-PA khác và phân hủy trực tiếp fibrin nhưng không phân hủy
Nguyễn Ngọc Minh

7

các protein huyết tương bao gồm plasminogen và albumin (Hình 1.1). Các enzyme
LK có hoạt động tiêu sợi huyết rất mạnh mẽ, ổn định trong pH rộng và sự ổn định
cao chống lại sự thay đổi nhiệt độ. Chúng là serine protease kiềm giống trypsin
nhưng được đánh giá có sự ổn định và khả năng chịu đựng dung môi cao hơn.
Vilhardt (1986) bằng phản ứng miễn dịch đã chứng minh 10-15% LK được hấp thụ
hoàn toàn qua các mô và đường ruột. Do vậy LK được đánh giá cao hơn các chất
khác trong hoạt động phân hủy các cục máu đông [15].
Khả nảng hấp thụ LK qua thành ruột non trên thỏ đã được kháng huyết thanh
cũng đã được chứng minh. LK tinh khiết được pha trong dung dịch đệm KrebsHenseleit ở các nồng độ khác nhau lần lượt là 0,5; 1,0 và 2,0 mg/ml đã được đưa
vào bên trong niêm mạc ruột của thỏ trong các khoảng thời gian khác nhau (30, 60,
120 phút). Xác định khả năng tiêu sợi huyết bàng cách lấy dịch bên ngoài niêm
mạc ruột thỏ sau các khoảng thời gian và nhỏ iên đĩa fibrin theo dõi vòng hoạt tính.
Kết quá cho thấy, sau 2 giờ theo dõi, vòng hoạt tính trên đĩa fibrin đạt 21,79 ±11,0;
22,118 ± 0,4; 11,8 ± 39,77 mm2. Khi nhỏ trực tiếp LK ở các nồng độ khác nhau lên
đĩa fibrin, diện tích vòng hoạt tính lần lượt là 148,3; 253,5; 276,2 mm2 tương ứng
vứi 14,7; 8,7 và 11,5 % LK được chuyển từ bên trong ra bên ngoài niêm mạc ruột
non. Điều đó chứng tỏ rằng, LK được hấp thụ hiệu quả qua thành ruột non vào máu
và thích hợp làm nguyên liệu sản xuất thuốc trị tắc nghẽn mạch máu qua đường
uống [35].

Tan huyết khối

Hình 1. 1. Cơ chế hoạt động của LK
1.2.4. Ứng dụng
Trên thị trường có rất nhiều loại thuốc để điều trị các bệnh liên quan đến tác
Nguyễn Ngọc Minh

8

nghẽn mạch máu và LK là một trong những loại chế phẩm được sử dụng phổ biến
trên thế giới vì giá thành rẻ, không gây tác dụng phụ và có thể điều trị và hỗ trợ
điều trị cho nhiều bênh liên quan đến tim mạch như:
Hỗ trợ điều trị và phục hồi cho bệnh nhân bị tai biến mạch máu não (đột quỵ),
nhồi máu cơ tim và các bệnh lý liên quan đến cục máu đông, cải thiện các di chứng
như liệt, teo cơ, nói ngọng, tê bì chân tay...
Dự phòng tai biến mạch máu não (đột quỵ), nhồi máu cơ tim ở bệnh nhân có
nguy cơ cao như tăng huyết áp và các bệnh lý liên quan đến mạch vành...
Hỗ trợ điều trị cho bệnh nhân tiểu đường, đặc biệt là bệnh nhân có hoại tử đầu
chi do tai biến của bệnh tiểu đường và các bệnh lý liên quan đến mạch máu như
viêm tắc mạch.
1.3. Tình hình nghiên cứu
1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Trên thế giới đã cổ rất nhiều công trình nghiên cứu sản xuất LK nhưng chù
yếu đi theo hướng nghiên cứu sản xuất LK tự nhiên được chiết xuất từ giun đất có
hoạt tính thủy phân huyết khối. Bên cạnh đó cũng có một số nghiên cứu phương
pháp sản xuất lk tái tổ hợp để nhằm tạo ra một lượng lớn LK để phục vụ cho điều
trị,
Năm 2004, Cho và cộng sự đă nhân dòng thành công gen LK từ Lumbricus
rubellus vào hệ thống vi khuẩn. Trình tự hoàn chỉnh C-DNA của gen LK từ
Lumbricus rubellus đã được khuếch đại bằng mẫu mRNA và được biểu hiện trong
các tế bào E.coli [11].
Cũng trong năm 2004, Hu và cộng sự đã tối ưu hóa dòng tế bào, biểu hiện và
đánh giá tính chất lý hóa của LK tái tổ hợp trong sữa dê. Hai gen LK đã được nhân
dòng và tối ưu hóa đưa vào vector biểu hiện tế bào tuyến vú pIbCP. Vector pIbPCLK đã được trực tiếp đưa vào tế bào tuyến vú ở dê. Kết quả đã chỉ ra rằng cả 2 gen
LK-w và LK-m đã được thể hiện trong sữa dê. Hoạt tính thủy phân fibrin của LK-w
trong sữa là 225 ± 13,2 tPA U/L, trong khi đó LK-m là 550 ± 21,6 tPA U/L. Điều
Nguyễn Ngọc Minh

9


này đã chỉ ra việc tối ưu hóa các dòng tế bào có vai trò quan trọng nhằm nâng cao
biểu hiện LK. Khối lượng phân tử của LK tái tổ hợp là 31.8 kDa [19]
Năm 2005, Ge và cộng sự đã nhân dòng thành công gen mã hóa lumbrokinase
từ giun đất L.bimastus (GenBank: AF 433650). Gen này (852 bp) gồm một khung
đọc mở mã hóa cho 2 phần của protein: một peptide tín hiệu (44 aa) và một peptide
thành thục (239 aa). Gen lk đã được nhân dòng và đưa vào vector pPICZαA, một
vector dùng biểu hiện trong nấm men. Bằng phương pháp SDS-PAGE và Western
blot, kết quả đã chỉ ra rằng PI239 tái tổ hợp đã tiết vào dịch nuôi cấy và có hoạt tính
thủy phân fibrin [16]
Năm 2007, Ge và cộng sự đã dùng vector biêu hiện pPICZαA và tế bào vật
chủ là P. pastoris KM71 để biẻu hiện LK tái tổ hợp (rPI239), kết quả là thu được
protein táí tổ hợp có trọng lượng phân tử cao hơn trong lượng của phân tử PI239
hoàn chỉnh (29 kda) [17] .
Tới năm 2010, Xu và cộng sự đã xây dựng và biểu hiện peptide của lk PI239
trong E.coli, họ khuếch đại và tối ưu hóa các gene của LK mà sau khi đã được
nhân dòng vào vector biểu hiện pET-22b+ . Cấu trúc LK đã được thiết kế (rLK) và
biểu hiện như thể vùi và họ tiếp tục quá trình tinh sạch rLK đã thu nhận ở thể vùi .
họ sử dụng ure cho quá trình làm tan protein . Các tinh sạch rLK được phân tích
thành công trong mô hình động vật và thể hiện đầy đủ sự tan cục máu đông , và
một lần nữa khẳng định LK như chất điều trị cho các bệnh liên quan đến huyết khối
[34].
Năm 2012, Wang và các cộng sự đã nhân dòng, biểu hiện và đánh giá tính
chất của một gen lumbrokinase từ giun đất E.festida mã hóa protein hòa tan cục
máu đông trong E.coli[26]
1.3.2. Tình hình nghiên cứu lumbrokinase trong nước
Năm 2004, PGS-PTS-Nguyễn Thị Ngọc Dao và cộng sự, đã nghiên cứu và
sản xuất một chế phẩm từ giun quế ở Ba Vì của Việt Nam là lumbrotin. Từ nguồn

nguyên liệu trên nhóm nghiên cứu bắt tay vào sản xuất chế phẩm dưới dạng bột
uống , không độc hại. Họ toại bỏ tạp chất và sấy khô giun ở nhiệt dộ thấp . Tiếp đến
Nguyễn Ngọc Minh

10


giun được nghiên thành bột rồi phối chế với một số phụ gia . Mặc dù là enzyme
nhưng lumbrotin không bị phân hủy trong đường tiêu hóa, vẫn giữ được hoạt tính
khi ngấm vào máu. Sau khi thử nghiệm trên động vật , chế phẩm đã được thử
nghiệm trên 30 người tình nguyện ở Hà Nội và cho kết quả tốt. Đó là những bệnh
nhân bị tai biến mạch máu do viêm tắc động mạch. Sức khỏe của những bệnh nhân
uống thuốc, kết hợp với châm cứu, tiến triến tốt hơn so với những bệnh nhân chỉ
dùng phương pháp châm cứu [1].
Năm 2006, Lý Thị Bích Thủy và cộng sự đã nghiên cứu tinh sạch và khảo sát
mộỉ số tính chất của enzyme thủy phân fibrin của dịch chiết từ loài giun quế P.
excavates [5]. Năm 2007, Phan Thị Bích Trâm cũng đã và tách chiết được 8 phân
đoạn có hoạt tính thủy phân fibrin cao [6] .
Đề tài : “ Nghiên cứu quy trình công nghệ sản xuất Lumbrokinase tái tổ hợp
làm thuốc phòng chống tắc nghẽn mạch máu ” mã số KC04.01/11-15 do PGS.TS
Quyền Đình Thi làm chủ nhiệm và viện công nghệ sinh học , viện Hàn lâm khoa
học và công nghệ Việt Nam là cơ quan chủ trì thực hiện từ năm 2012-2014 đã đạt
được các kết quả ban đầu là biểu hiện LK ở 3 hệ biểu hiện E. coli, Bacillus và P.
pastoris. Đã tiến hành tinh sạch và nhận dạng enzyme lumbrokinase tái tổ hợp bằng
khối phổ Maldi- Tof, chọn lựa được 1 chủng nấm men tái tổ hợp (ký hiệu XpPLK
11) có khả năng sinh tổng hợp LK cao trong 3 hệ biểu hiện đã tạo được, tối ưu các
điều kiện nuôi cấy sinh tổng hợp LK từ chủng tái tổ hợp trên thiết bị 5 lít, 10 lít và
80 lít để thu sản phẩm LK tái tổ hợp, bước đầu xây dựng quy trình công nghệ sản
xuất chế phẩm LK trên quy mô phòng thí nghiệm[4]
Năm 2013 Vũ Thị Bích Ngọc và cộng sự đã tạo dòng và biểu hiện thành công

gen mã hóa lumbrokinase ở Pichia pastoris [2]. Năm 2014 Vũ Thị Bích Ngọc và
cộng sự đã hoàn thành đề tài “Biểu hiện, tinh sạch và đánh giá tính chất của của
lumbrokinase ở P. pastoris” [3].
1.4. Gỉớỉ thiệu về hệ biểu hiện P. pastoris
1.4.1. Hệ biểu hiện P. pastoris
Hơn 3 thập niên trước, E. coli được sử dụng rộng rãi như tế bào vật chủ cho
Nguyễn Ngọc Minh

11


biểu hiện protein. Chúng được sử dụng để sản xuất các protein tái tổ hợp từ các
cDNA nhân chuẩn đã được nhân dòng. Tuy nhiên trong nhiều trường hợp, các
protein nhân chuẩn được tổng hợp trong vi khuẩn là không bền và không có hoạt
tính sinh học do hệ biểu hiện này không có quá trình sửa đổi sau dịch mã như quá
trình glycosyl hóa, protein thường cuộn xoắn lỗi, protein không bị glycosyl hóa. Để
tránh những vấn đề này, các nhà nghiên cứu đã phát triển các hệ thống biểu hiện
nhân chuẩn như nấm men, côn trùng và các động vật có vú . Sự biểu hiện protein
tái tổ hợp trong nấm men S.cerevisiae đã thành công với nhiều gen được nhân dòng
từ rất nhiều nguồn . Tuy nhiên , quá trình biểu hiện protein ở S.cerevisiae không
phải lúc nào cũng phù hợp cho sản xuất protein ở quy mô lớn do có thể mất
plasmid, quá trình glycosyl hóa vượt mức và năng suất thấp [27]. Do đó
S.cerevisiae không phải lúc nào cũng là tế bào chủ lý tưởng cho sản xuất protein tái
tổ hợp [10].
Ngày nay, nấm men P. pastoris thường được sử dụng nhiều nhất, Hệ thống
này có khả năng sản xuất protein tái tổ hợp với hàm lượng lên đến gam trên lít. Các
protein không thể biểu hiện ở E. coli với mức độ chính xác từ biến đồi sau dịch m3
có thể sản xuất trong P. pastoris. Các protein có nguồn gốc eukaryote thường có
chứa nhiều cầu nối disulfide, cần glycosyl hóa, phosphoryl hóa, đòi hỏi sự hình
thành và lắp ráp các oligomer để hình thành cấu hình protein hoàn chỉnh. Tóm lại,

hệ biểu hiện P. pastoris được chọn vì có những ưu điểm sau [13] :
P. pastoris là một eukaryote nên các protein được biểu hiện ở tế bào này
thường được glycosyl hóa và cuộn xoắn chính xác. P. pastoris dễ nuôi cấy và các
thao tác di truyền đơn giản hơn nhiều so với nuôi cấy trong các tế bào động vật và
chúng có thể sinh trưởng đến mật độ tế bào cao. Vector biểu hiện mang gene ngoại
lai có thể được chèn hiệu quả vào genome nấm men thông qua quá trình tái tổ hợp
giữa các đoạn tương đồng tạo ra dòng tế bào ổn định.
P. pastoris có hai gene AOX1 và AOX2 (mã hóa cho enzyme alcohol oxidase
- AOX) có promoter mạnh cho phép P. pastoris sử dụng methanol như một nguồn
carbon và nguồn năng lượng. Nhờ đó, P. pastoris có thể dễ dàng tăng trưởng trong
điều kiện môi trường methanol khá cao trong khi hầu hết các vi sinh vật khác sẽ bị
Nguyễn Ngọc Minh

12


chết. Các promoter AOX được cảm ứng bởi methanol và bị ức chế bởi glucose.
Thông thường sự biểu hiện của protein ngoại lai được kiểm soát bởi promoter
AOX1 nghĩa là sự biểu hiện protein ngoại lai có thể được cảm ứng bởi sự bổ sung
methanol.
1.4.2. Vector biểu hiện pPICZαA
Có nhiều loại vector được sử dụng trong tách dòng và biểu hiện protein ngoại
lai nhưng mỗi loại vector, tùy theo mục đích sử dụng, được thiết kế phù hợp với
một số chủng nhất định. Nói chung một vector phải mang các đặc điểm cơ bản sau:
có tâm tái bản giúp nhân lên lượng lớn vector, phải có ít nhất một điểm cắt enzyme
giới hạn giúp chèn đoạn DNA vào vector (vị trí đa điểm - multiple cloning site —
MCS) và cần phải mang dấu chuẩn chọn lọc giúp sàng lọc các thể mang vector.
Ngoài ra với vector biểu hiện cần có promoter mạnh để điều khiển biểu hiện protein
ngoại lai.

Hình 1. 2. Vector pPICZαA

pPICZαA là vector 3,6 kb thường được sử dụng để biểu hiện protein tái tổ hợp
trong P. pastoris. Protein tái tổ hợp được biểu hiện gắn với peptide đầu N của trình
tự tín hiệu tiết nhân tố a prepro peptide (MF - α1) bắt nguồn từ S.cerevisiae
(Version., 2010). Vector cho phép biểu hiện mức cao protein ngoại lai được cảm
ứng biểu hiện bởi methanol trong hệ P. pastoris và có thể được sử dụng ở một số
Nguyễn Ngọc Minh

13


chủng P.pastoris như X-33, SMD1168, và KM71H. pPICZαA có chứa các điều
kiện cần thiết như: đầu 5’AOXl chứa promoter điều khiển biểu hiện gene mong
muốn và được cảm ứng bởi methanol, có tín hiệu tiết MF – α1 prepro điều khiển
biểu hiện tiết protein tái tổ hợp, có chứa gen kháng zeocin giúp sàng lọc các thể
mang vector ở cả E. coli và P.pastoris và nhiều đặc điểm khác tạo thuận lợi cho
việc tách dòng vector trong E. coli và biểu hiện protein ngoại lai trong P. pastoris
[16].

Nguyễn Ngọc Minh

14


CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu và hóa chất
2.1.1. Chủng vi sinh vật
•

Chủng nấm men P.pastoris X33 mang gene lk mã hóa cho lumbrokinase
(XpPLK11) được thu nhận từ phòng CNSH Enzyme- Viện CNSH.

2.1.2 Hóa chất và enzyme
Hóa chất sử dụng trong thí nghiệm đều ở dạng tinh khiết, các enzyme cắt
giới hạn đều của các hãng uy tín trên thế giới. Một số hóa chất chính và enzyme
được liệt kê trong bảng 2.1
Bảng 2. 1. Hóa chất và enzyme
Tên hóa chất và enzyme

Hãng sản xuất ( Nước )

Acrylamide, chloroform, isoamyl alcohol,

Merck ( Đức )

EDTA, imidazol, sodium acetate, temed,
triton X100
Cao nấm men, peptone, potassium

Bio Basic Inc. ( Mỹ )

phosphate , trisbase
SDS, Thrombin, Plasmin

Sigma ( Mỹ )

Probond resin

Invitrogen ( Mỹ )

Thang DNA chuẩn, thang protein chuẩn

Fermentas ( Lativa )

Enzyme : EcoRI, Rnase, T4 ligase

2.1.3. Dung dịch và đệm
Các loại dung dịch và đệm dùng trong thí nghiệm được pha theo hướng dẫn
của các bài thí nghiệm chuẩn có thành phần, nồng độ được tóm tắt trong bảng 2.2

Nguyễn Ngọc Minh

15


Bảng 2. 2. Dung dịch và đệm
Dung dịch

Thành phần , nồng độ

Dung dịch APS

10% amomonium persulfate

Dung dịch bradford gốc

100 ml 95% ethanol, 350 mg Serva blue G, 200 ml
88% acid phosphoric

Dung dịch bradford working

425 ml H20, 15 ml 95% ethanol, 30 ml 88% acid
phosphoric, 30 ml dung dịch bradford gốc

Dung dịch A

Đệm 1,5 M tris HCl, pH 8.8

Dung dịch B

Đệm 0,5 M tris HCl, pH 6.8

Dung dịch C

30% acrylamide, bis – acrylamide

Dung dịch D

10% SDS, 10 mM EDTA

Dung dịch imidazole

3M imidazole, 500 mM NaCl, 20 mM phosphate
buffer, pH 6.0

Dung dịch I

50 mM tris HCl, 10 mM EDTA, pH 8.0

Dung dịch II

0,2 M NaOH, 1% SDS

Dung dịch III

3 M potassium acetate, pH 5.5

Dung dịch IV

2% triton X100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM tris
HCl, 1 mM EDTA

Đệm điện di Protein

20 mM tris HCl, 192 mM Glycine,

0,1 % SDS, pH

8,8
Đệm gắn Native Binding Buffer

50 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, 10 mM imidazole,

(NBB)

pH 8.0

Đệm rửa Native Wash Buffer

50 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, 20 mM imidazole,

(NWB)

pH 8.0

Đệm đẩy Native Elution Buffer

50 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, 250 mM imidazole,

(NEB)

pH 8,0

2.1.4. Môi trường
Các môi trường sử dụng trong thí nghiệm đều được pha theo các quy trình và
công thức chuẩn, có thành phân và nồng độ như trong bảng 2.3

Nguyễn Ngọc Minh

16


Bảng 2. 3. Môi trường

Môi trường

Thành phần

YP

2% peptone, 1% cao nấm men

YPG

YP + 1% glycerol

2.1.5. Máy móc và thiết bị
Các máy móc và thiết bị được sử dụng làm thí nghiệm hiện đại và có độ chính
xác cao thuộc phòng Công nghệ sinh học Enzyme , Viện công nghệ sinh học, Viện
Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam . Được thể hiện ở bảng 2.4
Bảng 2. 4. Máy móc và thiết bị
Tên thiết bị

Xuất xứ ( hãng, nước sản xuất)

Bể ổn nhiệt VS 120 CW

Vision (Hàn Quốc)

Box cấy vi sinh vật Clean Bench TCV.021

Trung tâm chuyển giao công
nghệ (Việt Nam)

Cân phân tích BL10S

Sartorius (Đức)

Hệ thống điện di đứng

Biometra (Đức)

Máy đo pH

Metrohm (Thụy Sỹ)

Máy Votex OSI

Esco (Mỹ)

Máy lắc rung Provocell

Hettich (Đức)

Máy li tâm lạnh Hettich Mikro 22R

Hitachi (Nhật Bản)

Máy li tâm lạnh CF1 RXII

Vision (Hàn quốc)

Máy li tâm thường

Sartorius (Đức)

Máy nuôi lắc Certomat HK

Labomed (Mỹ)

Máy quang phổ UV 200

Tomy ( Nhật)

Nồi khử trùng ES 31

Sanyo (Nhật)

Tủ ổn nhiệt MIR 12

Toshiba (Nhật)

Tủ lạnh 40C GR N4 VTV

Deawoo (Hàn quốc)

Tủ lạnh sâu -200C VCF 280

Sanyo (Nhật Bản)

Tủ lạnh sâu -840C MDF 192

Nguyễn Ngọc Minh

17


2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Biểu hiện lumbrokinase tái tổ hợp ở chủng P. pastoris

Chủng nấm men P. pastoris tái tổ hợp được nuôi cấy qua đem ở 20oC trong 5
ml môi trường YPG. Sau đó tiếp giống 2% dịch giống sang bình 500 ml chứa 100
ml YP lỏng bổ sung 1 % methanol nuôi lắc ở 28 oC, cứ 24h lại bổ sung chất cảm
ứng methanol và nuôi lắc 200 vòng ở 28 oC để cảm ứng tế bào biểu hiện protein tái
tổ hợp. Sau 96 giờ nuôi cấy cảm ứng, tế bào được thu bằng ly tâm 4000 vòng/phút
trong 30 phút.
2.2.2. Tủa muối ammonium sulfate
Nhiều loại muối đã được sử dụng để thực hiện tách protein và tinh lọc qua
salting-out [22]. Trong số các muối, amonium sulfate đã được các hóa chất được sử
dụng rộng rãi nhất vì nó có khả năng hòa tan cao và tương đối rẻ. rLK được tủa
bằng (NH4)2SO4 40-65% ở nhiệt độ 4oC, sau đó thu tủa bằng ly tâm 8000 vòng/phút
trong 10 phút và hòa tan tủa trở lại trong đệm 20 mM potasium phosphate pH 7,5
[14]. Dịch này được loại muối bằng phương pháp thẩm tích trong nước cất qua đêm
ở 4oC để sử dụng cho quá trình tinh sạch tiếp theo.
2.2.3. Tinh sạch protein tái tổ hợp
Nguyên lý
Protein tái tổ hợp được tinh sạch bằng cột resin gắn nikel chuyên dùng cho
các protein tái tổ hợp có đuôi polyhistidine. Trong đó, resin là chất mang dạng
agarose liên kết chéo, chứa thụ thể iminodiacetic acid và chất này làm cầu nối với
niken2+. Cột resin-nikel có ái lực cao với đuôi polyhistidine. Việc gắn kết hình
thành thông qua liên giữa ion niken2+ và đuôi 6xHis trong phân tử protein. Tinh
sạch protein được thực hiện dưới điều kiện không biến tính như chỉ dẫn của
invitrogen. Protein liên kết với protein được rửa giải bằng đẹm pH thấp hoặc bằng
đệm chứa muối imidazole.

Nguyễn Ngọc Minh

18