Nghiên cứu biểu hiện GEN BGC mã hóa BETA GLUCOSIDASE trong e COLI sử dụng VECTOR biểu hiện PET 22b(+)
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.29 MB, 58 trang )
VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài:
NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN BGC MÃ HÓA
BETA-GLUCOSIDASE TRONG E.COLI SỬ DỤNG
VECTOR BIỂU HIỆN PET-22B(+)
Người hướng dẫn
: TS. Đỗ Thị Huyền
Sinh viên thực hiện
: Nguyễn Thị Thơm
Lớp
: 11-02
Hà Nội - 2015
Khóa luận tốt nghiệp
Khoa Công nghệ sinh học
LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại phòng Kỹ thuật Di truyền,Viện
Công nghệ Sinh học tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm giúp đỡ, động viên của
thầy cô, gia đình và bạn bè.
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Trương Nam HảiViện trưởng viện Công nghệ Sinh học, TS. Đỗ Thị Huyền trưởng phòng Kỹ thuật Di
truyền đã tận tình hướng dẫn và dìu dắt tôi trong suốt thời gian qua.
Trong quá trình thực hiện đề tài, tôi đã nhận được sự chỉ bảo chuyên môn
nhiệt tình từ NCS. Nguyễn Thị Thảo- người luôn theo sát thí nghiệm của tôi để có
những lời khuyên bổ ích và kịp thời.
Gần hai năm học tập và nghiên cứu tại phòng Kỹ thuật Di truyền, tôi đã nhận
được rất nhiều sự quan tâm giúp đỡ, động viên chân thành của tập thể cán bộ
phòng. Các thực tập sinh luôn thân thiện, nhiệt tình tạo nên một môi trường nghiên
cứu chủ động, và hăng say. Tôi xin chân thành cảm ơn sư giúp đỡ quý báu này.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô giáo trong khoa Công nghệ
Sinh học, Viện Đại Học Mở Hà Nội đã động viên chỉ dẫn, đóng góp ý kiến và tạo
điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn này.
Bằng tình cảm chân thành, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè đã
luôn ở bên, động viên giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn này.
Hà Nội, tháng 5 năm 2015
Sinh viên
Nguyễn Thị Thơm
SV: Nguyễn Thị Thơm
K18.CNSH.11-02
Khóa luận tốt nghiệp
Khoa Công nghệ sinh học
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
CHƯƠNG I ................................................................................................................. 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................................... 2
1.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ BETA-GLUCOSIDASE ..................................................... 2
1.1.1. Đặc điểm cấu trúc và phân loại .................................................................. 2
1.1.1.1. Sơ lược về beta-glucosidase ...........................................................................2
1.1.1.2. Tính đặc hiệu cơ chất và chất ức chế beta-glucosidase ................................3
1.1.1.3. Phân loại beta-glucosidase..............................................................................4
1.1.1.4. Cấu trúc và chức năng.....................................................................................5
1.1.1.5. Các dạng hoạt tính của beta-glucosidase .......................................................7
1.2. ỨNG DỤNG CỦA ENZYME BETA-GLUCOSIDASE ................................. 7
1.2.1. Ứng dụng trong sản xuất cồn sinh học ....................................................... 8
1.2.2. Ứng dụng trong công nghiệp giấy .............................................................. 9
1.2.3. Ứng dụng trong xử lý môi trường .............................................................. 9
1.3. ĐẠI CƯƠNG VỀ TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN .............................. 10
1.3.1. Vector tách dòng pBluescript SK(+) ........................................................ 10
1.3.2. Chủng tách dòng E. coli DH10B ............................................................. 11
1.3.3. Biểu hiện gen trong E. coli ....................................................................... 11
1.3.3.1. Chủng biểu hiện E. coli BL21(DE3) ...........................................................12
1.3.3.2. Vector biểu hiện pET-22b(+) .......................................................................13
CHƯƠNG 2 .............................................................................................................. 15
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ............................................................................ 15
2.1 VẬT LIỆU ....................................................................................................... 15
2.1.1. Các chủng vi sinh vật và plasmid ............................................................. 15
2.1.2. Các loại môi trường nuôi cấy ................................................................... 15
2.1.3. Hóa chất và dung dịch sử dụng ................................................................ 16
2.1.3.1. Hóa chất .........................................................................................................16
2.1.3.2. Enzyme ..........................................................................................................16
2.1.3.3. Các dung dịch sử dụng trong tách chiết DNA plasmid từ tế bào E.coli ....16
2.1.3.4. Các dung dịch dùng trong điện di DNA trên gel agarose 0,8%.................17
2.1.3.5. Các dung dịch dùng trong điện di trên gel polyacrylamide- SDS .............17
2.1.4. Máy móc và thiết bị .................................................................................. 19
SV: Nguyễn Thị Thơm
K18.CNSH.11-02
Khóa luận tốt nghiệp
Khoa Công nghệ sinh học
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................. 19
2.2.1. Khuếch đại gen bằng phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) . 19
2.2.2. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E. coli bằng phương pháp sốc nhiệt . 20
2.2.3. Tách chiết DNA plasmid từ tế bào E. coli ............................................... 22
2.2.4. Điện di DNA trên gel agarose .................................................................. 23
2.2.5. Phương pháp xử lý DNA bằng enzyme hạn chế ...................................... 24
2.2.6. Phản ứng ghép nối gen ngoại lai vào ADN plasmid ................................ 24
2.2.7. Biểu hiện gen ............................................................................................ 25
2.2.8. Điện di protein trên gel polyacrylamide – SDS ....................................... 26
2.2.9. Xác định lượng đường khử bằng DNS ..................................................... 27
CHƯƠNG 3 .............................................................................................................. 29
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................................. 29
3.1. THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN MANG GEN BGC MÃ HÓA BETAGLUCOSIDASE.................................................................................................... 29
3.1.1. Nhân dòng gen bgc mã hóa enzyme beta-glucosidase bằng PCR .......... 30
3.1.2. Cắt sản phẩm PCR và pET-22b(+) bằng XhoI+ NcoI.............................. 31
3.1.3 Nối ghép gen bgc vào vector biểu hiện pET-22b(+) ................................. 32
3.1.4. Tách chiết DNA plasmid pET22-bgc từ tế bào E. coli DH10B ............... 34
3.1.5. Kiểm tra gen bgc trong vector biểu hiện pET-22b(+) bằng enzyme hạn
chế....................................................................................................................... 35
3.2. BIỂU HIỆN GEN BGC TRONG CHỦNG E. COLI BL21(DE3) ................. 37
3.2.1. Biến nạp vector biểu hiện pET22-bgc vào tế bào khả biến E. coli BL21 37
3.2.2. Biểu hiện gen bgc trong chủng E. coli BL21 ........................................... 37
3.3. LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN PROTEIN BGC TRONG CHỦNG
VI KHUẨN E. COLI BL21 ................................................................................... 39
3.3.1. Môi trường nuôi cấy ................................................................................. 39
3.3.2. Khảo sát đối với nồng độ NaCl ................................................................ 41
3.3.3. Lựa chọn nhiệt độ biểu hiện ..................................................................... 42
3.3.4. Lựa chọn nồng độ IPTG ........................................................................... 44
3.4. KIỂM TRA SƠ BỘ HOẠT TÍNH CỦA BETA -GLUCOSIDASE............... 46
KẾT LUẬN ............................................................................................................... 48
KIẾN NGHỊ .............................................................................................................. 49
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 50
SV: Nguyễn Thị Thơm
K18.CNSH.11-02
Khóa luận tốt nghiệp
Khoa Công nghệ sinh học
NHỮNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
BGC
Betaglucosidase
DNA
Deoxyribonucleic acid
LB
Luria- Bertani medium
Amp
Ampicillin
IPTG
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside
RNA
Ribonucleic acid
DNTP
Deoxyribonucleotide triphosphate
EDTA
Ethylene diamine tetra acetic acid
APS
Amonium persulfate
Bp
Base pairs
Kb
Kilobase
kDa
KiloDalton
OD
Optical density
SDS
Sodium dodecyl sulfate
PAGE
Polyacrylamide gel electrophoresis
TAE
Tris-acetate-EDTA
TEMED
Tetramethylethelenediamine
SV: Nguyễn Thị Thơm
K18.CNSH.11-02
Khóa luận tốt nghiệp
Khoa Công nghệ sinh học
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1. Thành phần gel polyacrylamide ................................................................. 18
Bảng 2. Thành phần phản ứng PCR ........................................................................ 19
Bảng 3. Thành phần của phản ứng cắt ................................................................... 24
Bảng 4. Thành phần phản ứng nối ghép gen ........................................................... 25
Bảng 5. Thành phần phản ứng với DNS ................................................................. 28
SV: Nguyễn Thị Thơm
K18.CNSH.11-02
Khóa luận tốt nghiệp
Khoa Công nghệ sinh học
DANH MỤC HÌNH
Hình 1. Cơ chế tác dụng của cellulase .......................................................................2
Hình 2. Cấu trúc không gian của beta-glucosidase có nguồn gốc từ nấm .................6
Hình 3. Sơ đồ cấu tạo vector pET-22b(+) ................................................................14
Hình 4. Sơ đồ thí nghiệm..........................................................................................30
Hình 5. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR ..................................................................31
Hình 6. Điện di kiểm tra sản phẩm tinh chế gen bgc và vector pET-22b(+) sau khi
xử lý với cặp enzyme hạn chế NcoI/ XhoI ................................................................32
Hình 7. Đĩa biến nạp sản phẩm lai gen bgc với vector pET-22b(+) trong tế bào E.
coli DH10B trên môi trường thạch đĩa LBA ............................................................33
Hình 8. Phân tích sản phẩm tách chiết DNA plasmid pET22-bgc ...........................34
Hình 9. A) Sơ đồ thể hiện quá trình cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET22-bgc bằng
cặp enzyme NcoI và XhoI. B) Phân tích sản phẩm cắt kiểm tra pET22-bgc bằng
enzyme hạn chế NcoI và XhoI ...................................................................................35
Hình 10. Phân tích sản phẩm cắt kiểm tra pET22-bgc bằng enzyme hạn chế XhoI và
NdeI ...........................................................................................................................36
Hình 11. Đĩa biến nạp pET22-bgc vào tế bào E. coli BL21 ....................................37
Hình 12. Phân tích protein được biểu hiện trong chủng E. coli BL21 .....................38
Hình 13. Phân tích protein được tổng hợp trong E. coli BL21 mang gen bgc .........40
Hình 14. Phân tích protein biểu hiện trong E. coli BL21 mang gen bgc ................42
Hình 15. Phân tích protein được biểu hiện trong tế bào ...........................................43
Hình 16. Đồ thị thể hiện giá trị OD600 khi thu mẫu ..................................................45
Hình 17. Phân tích protein biểu hiện trong E. coli BL21 mang gen bgc .................45
Hình 18. Kết quả sơ bộ kiểm tra hoạt tính enzyme ..................................................46
Hình 19. Đồ thị thể hiện hàm lượng đường khử được giải phóng ...........................47
SV: Nguyễn Thị Thơm
K18.CNSH.11-02
Khóa luận tốt nghiệp
Khoa Công nghệ sinh học
MỞ ĐẦU
Hàng năm ngành nông lâm nghiệpViệt Nam đã tạo ra nguồn phế phẩm rất
lớn chủ yếu là rơm rạ với khối lượng ước tính đạt khoảng 46 triệu tấn/ năm. Nguồn
sinh khối được coi là dư thừa này có thể tận dụng làm nguyên liệu sinh học để tạo ra
các sản phẩm có giá trị như nhiên liệu sinh học.
Trong quá trình chuyển hóa các phế phẩm nông nghiệp cần hệ thống enzyme
cellulase để có thể thủy phân hiệu quả cellulose giải phóng ra sản phẩm cuối cùng là
glucose. Beta-glucosidase là một trong những cellulase đóng vai trò quan trọng
trong quá trình thủy phân sinh khối thực vật do chúng có khả năng phân cắt
cellobiose và cello-oligosaccharide thành đường glucose và giải ức chế cho endoglucanase. Tuy nhiên, việc tìm ra các enzyme có hoạt tính mạnh, phân cắt nhanh
đang là thách thức lớn với các nhà khoa học để các sản phẩm chuyển hóa từ nguồn
sinh khối cạnh tranh được trên thị trường.
Mối được xem là sinh vật có ích do có khả năng phân giải cellulose thực vật,
tăng độ mùn cho đất, là mắt xích thức ăn quan trọng trong chu trình luân chuyển vật
chất trong hệ sinh thái...Hệ vi sinh vật trong ruột mối rất phong phú, đa dạng và
đóng vai trò quan trọng đối với sự tồn tại của loài mối. Chúng tiết ra các enzyme
cellulase và hemicellulase tham gia thủy phân hoàn toàn lignocellulose thành
đường, qua đó mối có thể tiêu hóa gỗ một cách dễ dàng. Vì vậy, đây là nguồn gen
quan trọng cho nghiên cứu khai thác các gen mới mã hóa các enzyme có hoạt tính
tốt. Trong năm 2012-2015 phòng Kỹ thuật Di truyền đã giải mã metagenome của vi
sinh vật trong ruột mối Coptotermes gestroi. Với dữ liệu thu được, hơn 200 gen mã
hóa cho beta-glucosidase đã được xác định, trong đó có 29 gen hoàn thiện. Qua các
phần mềm tin sinh học Phòng đã lựa chọn và phân lập được gen bgc mã hóa betaglucosidase mã GL0128938 có kích thước 1437bp.
Để đánh giá được tính chất của enzyme, chúng tôi đã tiến hành đề tài “
Nghiên cứu biểu hiện gen bgc mã hóa beta-glucosidase trong E.coli sử dụng
vector biểu hiện pET-22b(+)”.
SV: Nguyễn Thị Thơm
1
K18.CNSH.11-02
Khóa luận tốt nghiệp
Khoa Công nghệ sinh học
CHƯƠNG I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ BETA-GLUCOSIDASE
1.1.1. Đặc điểm cấu trúc và phân loại
1.1.1.1. Sơ lược về beta-glucosidase
Enzyme cellulase là một phức hệ enzyme có tác dụng thủy phân cellulose
thông qua việc phân cắt liên kết beta-1,4-glucozit trong cellulose tạo ra sản phẩm là
đường glucose. Phức hợp cellulase bao gồm ba loại enzyme chính đó là: endo-1,4beta-glucanase (EC.3.2.1.4), cellobiohydrolase ( hoặc exo-1,4-beta-glucanase )
(EC.3.2.1.91), và beta-glucosidase (EC.3.2.1.21) [3]. Các enzyme này có tính đặc
hiệu khác nhau và hoạt động hỗ trợ cho nhau. Quá trình thủy phân cellulose thông
qua sự hoạt động tuần tự và hiệp đồng của các enzyme để chuyển hóa thành đường
glucose. Trong đó, ở giai đoạn đầu, endo-glucanase sẽ tác động vào vùng vô định
hình trên bề mặt cellulose, thủy phân ngẫu nhiên liên kết β-1,4 glucozit trong mạch
cellulose nhanh chóng làm giảm mức độ trùng hợp tạo ra các đầu mạch tự do.
Cellobiohydrolase tấn công cellulose từ đầu không khử tạo ra sản phẩm là các
cellobiose và cuối cùng beta-glucosidase sẽ thủy phân cellobiose giải phóng ra hai
phân tử đường beta-D-glucose [3, 4].
Hình 1. Cơ chế tác dụng của cellulase
SV: Nguyễn Thị Thơm
2
K18.CNSH.11-02
Khóa luận tốt nghiệp
Khoa Công nghệ sinh học
Beta-glucosidase còn có tên gọi khác là beta-D-glucoside glucohydrolase,
EC.3.2.1.21, xúc tác cho quá trình thủy phân các liên kết β-glucoside ở các gốc
alkyl, aryl và β-glucoside như disaccharide và oligosaccharide chuỗi ngắn tạo ra
đường glucose [2] [3]. Beta-glucosidase rất phổ biến trong thiên nhiên và có thể
được tìm thấy trong vi khuẩn, nấm, thực vật, và động vật. Enyme này làm tăng hiệu
quả thủy phân hiệu quả cellulose trong điều kiện hoạt động nhất định.
1.1.1.2. Tính đặc hiệu cơ chất và chất ức chế beta-glucosidase
Beta-glucosidase có tính đặc hiệu cơ chất tương đối. Vì vậy, khi nghiên cứu cơ
chế hoạt động và động học của beta-glucosidase, điều quan trọng là phải xem xét
các cơ chất đang được sử dụng. Nếu cơ chất đặc hiệu của enzyme bị thay đổi sẽ ảnh
hưởng đến các dữ liệu động học thu được [1]. Các aryl-glucoside p- nitrophenylbeta-D-glucopyranoside là cơ chất chuẩn trong việc xác định hoạt tính của enzyme
beta-glucosidase. Tất cả các enzyme đã biết có khả năng thủy phân đặc hiệu trên
nền cơ chất này với giá trị Km từ 0,31mM đến 1,87mM [3]. Dữ liệu thu được bằng
cách sử dụng các sinh khối tổng hợp hoặc các thành phần tinh khiết ít có giá trị và
khả năng áp dụng hạn chế vào việc dự đoán và mô hình hóa quá trình thủy phân
sinh khối [1].
Hiệu quả chuyển hóa thành đường mạnh là đặc tính cần thiết với enzyme.
Trong hầu hết các trường hợp glucose - sản phẩm chính của quá trình thủy phân có
tác dụng ức chế mạnh mẽ lên beta-gluosidase làm giảm đáng kể tỷ lệ cellulose được
thủy phân thông qua cơ chế cạnh tranh [1] [3]. Vì vậy, ngoài hoạt tính mạnh ra, các
nhà khoa học còn tìm kiếm các enzyme beta-glucosidase có khả năng chịu được
nồng độ glucose cao. Chỉ một vài beta-glucosidase đã được báo cáo là chịu được
glucose ví dụ từ Aspergillus oryzae với Ki là 1,36 M [3]. Sự giảm tốc độ hình thành
glucose cũng có thể được gây ra bởi hiện tượng glycosyl hóa như các phản ứng
enzyme là một quá trình thuận nghịch. Đây là điểm khác biệt giữa beta-glucosidase
với các enzyme khác thuộc nhóm cellulase. Do hiện tượng glycosyl hóa này mà tốc
độ chuyển hóa sinh khối thành đường giảm đáng kể. Đây là phản ứng không mong
muốn trong quá trình thủy phân sinh khối, nhưng nó thường xuất hiện ở một số
enzyme beta-glucosidase khi nồng độ glucose cao. Để hạn chế quá trình này, một số
SV: Nguyễn Thị Thơm
3
K18.CNSH.11-02
Khóa luận tốt nghiệp
Khoa Công nghệ sinh học
gốc axit amin thiết yếu tham gia vào quá trình glysosyl hóa đã đươc nghiên cứu
thay thế bởi các gốc axit amin. Ngoài ra, một số sản phẩm sinh ra trong quá trình
thủy phân sinh khối như các đường đơn, các dẫn xuất đường, amin, và phenol cũng
có thể ức chế hoạt tính enzyme [1].
Trong thực tế, hiệu suất của enzyme beta-glucosidase ảnh hưởng bởi một số
yếu tố như nhiệt độ, pH, và các chất rắn. Về nhiệt độ, vận tốc của phản ứng do
enzyme xúc tác chỉ tăng lên khi tăng nhiệt độ đến một giới hạn nhất định, chưa ảnh
hưởng đến cấu trúc của enzyme. Theo quy tắc Van’t Hoff khi nhiệt độ tăng thêm
10oC thì tốc độ phản ứng sẽ tăng lên gấp đôi, áp dụng cho tất cả các phản ứng hóa
học trong đó có phản ứng xác tác của enzyme. Tuy nhiên, khi đạt đến nhiệt độ cao,
tính ổn định của protein sẽ bị ảnh hưởng, dẫn đến sự biến tính và bất hoạt còn ở
nhiệt độ thấp dưới 0oC, hoạt tính của enzyme bị giảm nhiều nhưng lại có thể phục
hồi khi đưa về nhiệt độ thích hơp. Do đo phải nghiên cứu tìm nhiệt độ tối ưu nhất
cho enzyme hoạt động. Beta-glucosidase có thể hoạt động tối ưu nhất ở 60-75oC
[1] [3]. Beta-glucosidase thường sở hữu một chuỗi carbohydrate có thể đóng một
vai trò trong khả năng chịu nhiệt; sau khi phân cắt của chuỗi carbohydrate này, tính
chịu nhiệt của enzyme giảm [3]. Khả năng hoạt động của enzyme còn phụ thuộc
vào pH môi trường phản ứng. Tùy thuộc vào bản chất của enzyme mà pH thích hợp
để enzyme hoạt động có thể trung tính, kiềm hoặc axit. Hầu hết các betaglucosidase có độ pH axit vào khoảng pH 4-5 [1] [3]. Ngoài ra, một số ion kim loại
cũng ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme. Các ion kim loại có thể kìm hãm hoặc
ức chế hoạt động của enzyme. Các ion kim loại nặng ở nồng độ nhất định có thể
gây biến tính và kìm hãm không thuận nghịch enzyme. Các chất ức chế khác của
các enzyme bao gồm nojirimycin và deoxy nojirimycin; các kim loại nặng như Hg2+
, Cu2+, Pb2+, Co2+, và p-chloromercuribenzoate [2].
1.1.1.3. Phân loại beta-glucosidase
Beta-glucosidase là nhóm enzyme thủy phân có thể được phân loại theo hai
cách: phân loại dựa trên cơ chất đặc hiệu của chúng hoặc phân loại theo sự đồng
nhất về mặt trình tự nucleotide.
SV: Nguyễn Thị Thơm
4
K18.CNSH.11-02
Khóa luận tốt nghiệp
Khoa Công nghệ sinh học
Phân loại dựa trên cơ chất đặc hiệu
Dựa trên cơ chất đặc hiệu có thể phân beta-glucosidase thành 3 lớp: aryl betaglucosiase (lớp 1), cellobiase thật (lớp 2) và enzyme có cơ chất đặc hiệu rộng (lớp
3). Hầu hết beta-glucosidase thuộc lớp 3 với khả năng phân cắt các liên kết
glycosidic khác nhau như β 1,4; β 1,6; β 1,2; và α 1,3; α 1,4; α 1,6 [2].
Phân loại trên cơ sở trình tự nucleotide
Theo phân loại của Henrissat và Bairoch, beta-glucosidase chủ yếu trong họ 1
và 3 từ 88 họ glycosyl hydrolase. Trong họ 1, beta-glucosidase có thể được tìm thấy
từ cổ khuẩn, thực vật và động vật có vú. Chúng cũng thường thể hiện hoạt tính betagalactosidase. Họ 3 bao gồm beta-glucosidase từ vi khuẩn, nấm và thực vật với một
đặc trưng hai miền cấu trúc hình cầu [4] [5].
1.1.1.4. Cấu trúc và chức năng
Cấu trúc
Beta-glucosidase đã được nghiên cứu cấu trúc để từ đó gây đột biến định
hướng làm tăng hoạt tính enzyme để dùng trong công nghiệp. Cấu trúc betaglucosidase 2 từ Trichoderma reesei (TrBgl2) đã được làm sáng tỏ bởi Lee và cộng
sự năm 2012 với một cấu trúc mang mã 3AHY [4]. Cấu trúc của TrBgl2 gồm
Glu165 xúc tác cho phản ứng axit/bazơ và Glu 367 là xúc tác trao đổi điện tử
nucleophin và tận dụng cấu trúc beta giữ lại hoạt tính cho của enzyme. Enzyme này
mang cấu trúc gồm 8 chuỗi xoắn α (α 2, α3, α5, α7, α8, và α11-13) và 8 chuỗi gấp
nếp β (β1- β5, β7, β9, và β12) tạo nên trung tâm hoạt động điển hình của enzyme
GH1. Ngoài ra, vùng trung tâm được đóng gói bằng bốn xoắn α bổ sung (α1, α6, α9,
và α10) và sáu sợi β- (β6, β 8, β10, β11, β13, và β14).với vị trí hoạt động bao gồm
một vùng lõm trên bề mặt của enzyme để cho cơ chất bám vào. Hai vùng bảo thủ
cụ thể là TFNEP và VTENG chứa E165 xúc tác axit bazơ và E367 xúc tác
nucleophin nằm đối diện nhau ở đáy trung tâm hoạt động. Các axit amin tham gia
vào việc bám dính lên cơ chất bao gồm: gắn kết chặt với dư lượng glycone: Q16,
H119, W120, N164, N296, W417, N422, E424, W425, T431, và F433; gắn kết chặt
với dư lượng aglycone: C168, N225, F228, Y298, T299, W339. Các nghiên cứu về
SV: Nguyễn Thị Thơm
5
K18.CNSH.11-02
Khóa luận tốt nghiệp
Khoa Công nghệ sinh học
đột biến đã được tiến hành nhằm xác định vai trò và chức năng của các axit amin
trong trung tâm hoạt động của enzyme. Hai đột biến (F250A và P172L/F250A) làm
tăng hiệu quả xúc tác enzyme và hai đột biến (và L167W và P172L) làm nâng cao
khả năng chịu nhiệt của enzyme được tạo ra [2].
Hình 2. Cấu trúc không gian của beta-glucosidase có nguồn gốc từ nấm
Trichoderma reesei [4]
Chức năng
Beta-glucosidases đóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh học.
Chẳng hạn như chuyển đổi sinh khối vi sinh vật và côn trùng, tham gia vào các
phản ứng sinh học khác nhau ( ví dụ như terpenol flavonoid) từ các tiền chất
glycoside [5] [6]. Trong thực vật, beta-glucosidase liên quan đến cơ chế phòng vệ
cyanide, quá trình chín của quả và chuyển hóa sắc tố [2]. Beta-glucosidase còn được
nghiên cứu để ứng dụng trong quá trình chuyển hóa cellulose. Beta-glucosidase
phân cắt cellooligosaccharide đặc biệt là sự thủy phân cellobiose để tạo thành
đường glucose. Ngoài ra, beta-glucosidase cũng làm giảm sự ức chế của sản phẩm
trên cellobiohydrolase và endoglucanase, đó là hai enzyme chính chịu trách nhiệm
cho sự phân cắt, chuyển hóa cellulose.
SV: Nguyễn Thị Thơm
6
K18.CNSH.11-02
Khóa luận tốt nghiệp
Khoa Công nghệ sinh học
Beta-glucosidase được ứng dụng rộng rãi đế phân cắt cellulose. Mặc dù có
hoạt tính xúc tác quá trình glycosyl hóa nhưng hoạt tính này thấp và ít được ứng
dụng trong công nghiệp [5] [6].
1.1.1.5. Các dạng hoạt tính của beta-glucosidase
Beta-glucosidase là enzyme có khả năng chuyển hóa các cơ chất của nó thành
sản phẩm mà vẫn giữ lại cấu hình anomer. Các phản ứng của chúng diễn ra theo cơ
chế hoán vị kép [7].
Phản ứng thủy phân: beta- glucosidase thường xúc tác thủy phân liên kết β 1,4
glucoside ở các gốc aryl- và alkyl β-D-glucoside từ đầu không khử. Đầu tiên, các
điện tử của enzyme trong trung tâm hoạt động tấn công vào cơ chất tạo ra enzyme
trung gian α-glycosyl. Tiếp theo, sản phẩm trung gian bị thủy phân bởi nước tạo ra
sản phẩm cuối cùng là β-glucose [8]. Các điện tử trong nhiều trường hợp có thể từ
Asp hoặc Glu. Trong nghiên cứu phân tích của các nhà khoa học về betaglucosidase từ Rhizomucor miehei, tương tự như β-glucosidase từ nấm đã biết, axit
amin Asp254 như là gốc xúc tác điện tử, nằm trong vùng bảo thủ SDW. Để giải
phóng aglycon, một axit amin khác trong vùng hoạt động sẽ đóng vai trò trao ion H+
cho quá trình oxi hóa liên kết glycosid, kết quả là aglycon được giải phóng dưới
dạng R-OH. Trong trường hợp beta-glucosidase từ R. miehei- , axit amin His177
được coi như là nguồn cho H+ nằm trong vùng KHY [8].
Phản ứng thủy phân ngược hoặc transglycosylation: trong các phản ứng tổng
hợp, các phân tử phản ứng ở bước thứ 2 là một R'-OH thay vì là nước, sẽ tạo ra một
oligosaccharide hoặc một glucoside khác. Trong phản ứng thủy phân ngược, cơ chất
là đường, mà chủ yếu là glucose, sản phẩm tạo ra là một disaccharide. Trong quá
trình transglycosylation, các sản phẩm được hình thành là kết quả giữa nước và các
nguyên tử nhận [7]. Trong nhiều trường hợp, giảm sự hoạt động của nước có thể sẽ
giảm sự thủy phân làm tăng quá trình transglycosylation [3].
1.2. ỨNG DỤNG CỦA ENZYME BETA-GLUCOSIDASE
Nhóm enzyme cellulase là nhóm enzyme rất phổ biến trong công nghiệp, chỉ
đứng sau amylase và protease nên các ứng dụng của chúng trong công nghiệp là rất
SV: Nguyễn Thị Thơm
7
K18.CNSH.11-02
Khóa luận tốt nghiệp
Khoa Công nghệ sinh học
lớn. Chúng được ứng dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp như công nghiệp
dệt, bột giặt, công nghiệp giấy, công nghiệp sản xuất cồn. Hơn nữa phức hệ
cellulases nói chung và beta-glucosidase nói riêng còn được sử dụng trong xử lý
môi trường cũng như công nghiệp dược phẩm.
1.2.1. Ứng dụng trong sản xuất cồn sinh học
Trong những năm gần đây, các nước trên thế giới đều phải đối mặt với tình
trạng cạn kiệt các nguồn năng lượng hóa thạch như than đá, dầu mỏ, khí đốt...và
tình trạng biến đổi khí hậu toàn cầu. Vì vậy các nước phát triển đã ưu tiên cho
hướng nghiên cứu để sản xuất ra nguồn năng lượng tái tạo, thân thiện hơn với môi
trường, và chủ động được khâu sản xuất để thay thế dần các nguồn năng lượng hóa
thạch trên. Nguồn năng lượng này phần lớn được sản xuất từ nguồn sinh khối khác
nhau như rỉ mía đường, tinh bột ngô và từ các nguồn sinh khối lignocellulose.
Ở nước ta, ước tính hàng năm, nguồn nguyên liệu lignocellulose từ phế phẩm
nông nghiệp như rơm, rạ, lá mía và bã cây mía bỏ phí lên đến 50 triệu tấn. Các biện
pháp xử lý nguồn phế phẩm này chủ yếu là đốt đã gây ra những ảnh hưởng tiêu cực
đến môi trường sống và sức khoẻ con người. Việc tận dụng được nguồn nguyên vật
liệu lignocellulose phế phẩm này vào sản xuất cồn sinh học sẽ đem đến nhiều lợi ích
to lớn cho môi trường cũng như cho nền kinh tế [10]. Beta-glucosidase là một trong
nhưng enzyme cellulases quan trọng đang được quan tâm nghiên trong việc sản xuất
nhiên liệu sinh học như cồn sinh học từ nguồn phế phẩm lignocellulose dồi dào thay
thế cho nguồn nguyên liệu hóa thạch [11].
Các hợp chất hữu cơ có chứa cellulose, các phế phẩm lignocellulose được
nghiền nhỏ và trộn với dịch enzyme thủy phân. Hỗn hợp được khuấy trộn đều để
cellulose có thể dễ dàng phân hủy. Dịch đường tạo ra chứa chủ yếu là đường
glucose- nguyên liệu chính để lên men sản xuất cồn sinh học. Việc sản xuất ethanol
từ nguồn nguyên liệu này đem lại nhiều nguồn lợi nhưng sự phát triển của nó đang
bị hạn chế bởi những khó khăn về mặt lợi nhuận kinh tế, và kỹ thuật chưa tối ưu.
Một lĩnh vực mới được sử dụng trong sản xuất cồn sinh học là công nghệ DNA tái
tổ hợp. Công nghệ này đã mở ra một hướng mới để tạo ra được lượng lớn cellulase
có hoạt tính cao, ổn định và có thể được ứng dụng để tạo các phức hợp cellulose cải
SV: Nguyễn Thị Thơm
8
K18.CNSH.11-02
Khóa luận tốt nghiệp
Khoa Công nghệ sinh học
thiện những khó khăn hiện nay trong sản xuất cồn sinh học từ nguyên liệu
lignocellulose [13].
1.2.2. Ứng dụng trong công nghiệp giấy
Nguyên liệu ban đầu để chế biến giấy gồm có hai loại là cellulose từ gỗ và các
giấy phế liệu. Để tạo ra giấy nguyên liệu phải trải qua rất nhiều công đoạn khác
nhau trong đó có công đoạn nghiền bột giấy cơ học và tẩy trắng. Trong công đoạn
nghiền bột giấy, bổ sung enzyme cellulase làm thay đổi cấu hình sợi cellulose, tăng
khả năng nghiền và tiết kiệm năng lượng trong quá trình nghiền cơ học. Trước khi
nghiền hóa học gỗ được xử lý với enzyme làm tăng khả năng khuếch tán hóa chất
vào phía trong gỗ.
Trong công nghệ tái chế giấy, các loại giấy thải cần được tẩy mực trước khi
đưa đi sản xuất các loại giấy in giấy viết. Đây là giai đoạn rất quan trọng trong quá
trình sản xuất giấy. Trước đây, người ta thường dùng axit HCl để tấy trắng giấy, tuy
nhiên HCl thải ra trong quá trình sản xuất làm ô nhiễm môi trường và gây hại đối
với sức khỏe người lao động. Ngày nay, người ta thường sử dụng enzyme cellulase
nói chung và beta-glucosidase nói riêng để tẩy trắng giấy với ưu điểm là giữ cho sợi
giấy không bị ăn mòn nhiều và không ảnh hưởng đến môi trường [11].
1.2.3. Ứng dụng trong xử lý môi trường
Các chất hữu cơ chiếm một khối lượng rất lớn trong tổng số các chất thải hữu
cơ hiện nay ở các đô thị và khu công nghiệp. Trong số rác thải hữu cơ có nguồn gốc
từ thục vật, cellulose chiếm khoảng 50%. Các chất thải chứa cellulose thường là
những chất khó phân hủy trong điều kiện tự nhiên. Nếu để các chất hữu cơ phân
hủy trong điều kiện tự nhiên thì thời gian phân hủy rất lâu (khoảng hơn tám tháng ở
điều kiện khí hậu nhiệt đới). Tuy nhiên nếu bổ sung thêm các vi sinh vật giàu
cellulases thì thời gian phân hủy sẽ rút ngắn chỉ còn lại một tháng. Điều này rất có ý
nghĩa trong việc bảo vệ môi trường, hạn chế sự ô nhiễm đất, nước và không khí.
Đồng thời thúc đẩy quá trình chuyển hóa vật chất trong tự nhiên.
SV: Nguyễn Thị Thơm
9
K18.CNSH.11-02
Khóa luận tốt nghiệp
Khoa Công nghệ sinh học
Ngoài việc bổ sung trực tiếp các vi sinh vật vào đống ủ để xử lý rác thải thì
việc tạo ra các chế phẩm vi sinh có chứa các vi sinh vật sinh ra cellulase đang được
quan tâm nghiên cứu sản xuất.
Phức hệ cellulase được sử dụng để xử lý nguồn nước thải do các nhà máy giấy
thải ra. Nguyên liệu làm giấy là gỗ- sinh khối của thực vật bậc cao có chứa rất nhiều loại
polysaccharide, trong đó các polysaccharide quan trọng quyết định số lượng và chất
lượng giấy là cellulose. Vì vậy, nước thải của nhà máy sản xuất giấy, các cơ sở chế biến
gỗ khi bổ sung các chế phẩm chứa phức hệ enzyme cellulase đem lại hiệu quả cao.
1.3. ĐẠI CƯƠNG VỀ TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN
1.3.1. Vector tách dòng pBluescript SK(+)
Tách dòng gen là một kỹ thuật quan trọng trong sinh học phân tử. Kỹ thuật
này cho chúng ta những hiểu biết về cấu trúc, chức năng và sự điều hòa hoạt động
của gen. Mục đích của việc tạo dòng gen là thu được một lượng lớn bản sao của
một trình tự DNA xác định.
Để tách dòng được một đoạn gen bất kỳ, trước hết cần phải có vector tách
dòng. Vector là phân tử DNA dạng vòng, mang nhiều đặc tính trong đó có khả năng
câm nhập vào tế bào vật chủ, sử dụng bộ máy tế bào của vật chủ để tạo ra nhiều bản
sao khác giống hệt nó. Ngoài ra vector còn có khả năng sao chép độc lập với DNA
của vật chủ.
Có nhiều loại vector tách dòng khác nhau như: Plasmid, phage, cosmid, nhiễm
sắc thể nhân tạo. Tùy thuộc vào kích thước đoạn DNA muốn tạo dòng và mục đích
tạo dòng mà sử dụng loại vector thích hợp. Thông thường với các đoạn DNA không
quá lớn (<10kb) thì plasmid là vector được sử dụng nhiều nhất do nó có các ưu
điểm sau:
- DNA có kích thước nhỏ (2-5 kb), dạng vòng, nằm ngoài nhân nên có khả năng
tự sao chép độc lập với vật chất di truyền của vật chủ.
- Có chứa các gen chỉ thị hoặc gen đánh dấu để nhận biết và có vị trí đa nối đề
chèn các đoạn gen ngoại lai.
SV: Nguyễn Thị Thơm
10
K18.CNSH.11-02
Khóa luận tốt nghiệp
Khoa Công nghệ sinh học
- Mỗi vi khuẩn có chứa hàng trăm plasnid nên có thể tạo ra số lượng bản sao lớn
trong thời gian ngắn.
Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng vector pBluescipt SK(+) làm vector tách
dòng. Vector pBluescript SK(+) là một trong những vector được sử dụng rộng rãi
do nó có khả năng kết hợp được các ưu điểm của vector phage và vector plasmid.
Về cấu tạo, pBluescript SK(+) có cấu tạo dạng vòng khép kín, có kích thước
khoảng 3000 bp. Phụ thuộc vào sự cài đặt của đoạn DNA này so với định hướng
sao chép của gen lacZ mà người ta phân loại vector pBluescript SK(+) hay
pBluescript SK(-). Vector pBluescript SK(+) có gen lacZ chứa đoạn polylinker gồm
21 vị trí nhận biết của enzyme hạn chế. Trong đó có điểm nhận biết của enzyme hạn
chế tương đối hiếm là NotI. Ngoài ra, còn có hai promoter T3 và T7 là các promoter
mạnh và có gen kháng ampicillin cho phép lựa chọn các vi khuẩn mang vector tái tổ
hợp mong muốn và có điểm khởi đầu sao chép ColE cho phép nhân bản vector
trong E. coli như plasmid.
1.3.2. Chủng tách dòng E. coli DH10B
Escherichia coli DH10B được thiết kế cho việc tách dòng gen và tạo thư viện
DNA genome. Chúng được sử dụng rộng rãi trong sinh học phân tử do tận dụng
được lợi thế về đặc tính như hiệu quả dịch mã DNA cao, và khả năng bảo toàn
plasmid lớn [13].
Đặc biệt genotype của E. coli DH10B có chứa các vùng trình tự đặc hiệu như:
mcrA mcrBC mrr galE trong đó: Mcr và MRR cho phép nhân dòng tốt hơn đoạn
DNA được methy hóa- cần thiết cho việc tạo thư viện gen; galE ngăn chặn việc tạo
ra UDP-galactose, cắt cụt màng LPS và cho phép đoạn DNA dễ xâm nhập hơn.
1.3.3. Biểu hiện gen trong E. coli
Hiện nay có 5 hệ biểu hiện thường được sử dụng để biểu hiện gen như: E. coli,
B. subtilis, nấm men (S. cerevisiae), tế bào động vật và tế bào thực vật. Để thu được
protein ngoại lai với hàm lượng lớn và hoạt tính tốt thì việc chọn lựa hệ biểu hiện và
vector biểu hiện phù hợp là quan trọng và cần thiết. Trong đó E. coli vẫn là một
trong những chủng được sử dụng rộng rãi nhất trong việc tạo ra protein tái tổ hợp.
SV: Nguyễn Thị Thơm
11
K18.CNSH.11-02
Khóa luận tốt nghiệp
Khoa Công nghệ sinh học
Hệ biểu hiện gen trong E. coli
E. coli là một vi khuẩn Gram âm, có dạng hình que với kích thước bộ gen là
4,6 Mb [13]. E. coli được sử dụng phổ biến trong việc biểu hiện các protein tái tổ
hợp do có nhiều ưu điểm như: thao tác đơn giản, có khả năng sinh sản nhanh với
tốc độ cao trên môi trường nuôi cấy đơn giản (thời gian thế hệ của E. Coli chỉ từ 2030 phút) và điều đặc biệt là chúng có khả năng thu nhận rất nhiều các yếu tố di truyền
vận động từ môi trường ngoài như plasmid, phage...Các yếu tố di truyền này có thể
tồn tại và tái bản nhiều lần trong tế bào E. coli. Chính vì vậy, E. coli đã được cải biến
để sử dụng như một vật chủ hữu hiệu trong kỹ thuật tách dòng và biểu hiện gen.
Nhiều nghiên cứu cho thấy hiệu suất tổng hợp protein ngoại lai trong tế bào E.
coli bằng các plasmid được thiết kế phù hợp đã đạt hiệu quả rất cao. Các plasmid
được chọn thường chứa promotor mạnh, được điều khiển chặt chẽ trong quá trình
tổng hợp protein ngoại lai. Ngoài ra, các plasmid này phải có số lượng bản sao lớn
và tồn tại ổn định trong tế bào chủ. Tính bền vững của plasmid không những phụ
thuộc vào đặc tính di truyền của tế bào chủ, và gen nằm trong plasmid mà còn phụ
thuộc vào các điều kiện nuôi cấy.
1.3.3.1. Chủng biểu hiện E. coli BL21(DE3)
Trong quá trình biểu hiện protein ngoại lai, thường xảy ra các hiện tượng các
protein sau khi được biểu hiện bị các protease nội bào phân giải. Để bảo vệ các
protein ngoại lai, người ta đã tạo ra các chủng biểu hiện mang gen đột biến làm mất
khả năng tổng hợp các protease. Chủng biểu hiện E. coli BL21 là một chủng như
vậy. Tế bào E. coli BL21 chứa đột biến lon protease ( một protease nội bào) và
ompT protease (một protease ngoại bào) nên khả năng protein bị phân hủy giảm
đáng kể. Như vậy cả protease nội bào và ngoại bào ở E. coli BL21 đều bị bất hoạt.
Ngoài những đặc điểm trên thì trong DNA hệ gen của E. coli BL21 có chứa
đoạn gen mã hóa cho T7 ARN polymerase. Đây là gen có nguồn gốc từ
bacteriophage T7 được đưa vào hệ gen của E. coli BL21 đặt dưới sự điều khiển của
promoter lac cảm ứng IPTG. Chính nhờ những cải biến này mà E. coli BL21 đã trở
SV: Nguyễn Thị Thơm
12
K18.CNSH.11-02
Khóa luận tốt nghiệp
Khoa Công nghệ sinh học
thành vật chủ hữu hiệu trong việc biểu hiện gen ngoại lai, đặc biệt là những gen
được đưa vào hệ vector pET (plasmid for Expression by T7 ARN polymerase).
1.3.3.2. Vector biểu hiện pET-22b(+)
Vector biểu hiện là vector có thể mang gen ngoại lai mong muốn, cho phép
thực hiện sự phiên mã của các bản sao được tạo dòng và sự dịch mã các mARN của
chúng trong hệ biểu hiện, từ đó tổng hợp protein mong muốn từ gen ngoại lai.
Vector có thể là ADN plasmid, phage hay cosmid. Đây là những phân tử ADN có
khả năng nhân đôi, phiên mã, dịch mã độc lập với vật chủ. Ngoài ra, vector còn phải
chứa gen mã hóa cho protein có chức năng dùng làm dấu hiệu chọn lọc. Gen thường
được sử dụng trong vector biểu hiện là gen kháng kháng sinh. Gen này tạo điều kiện
thuận lợi cho việc nhận biết các dòng tế bào mang ADN plasmid.
Hệ vector pET đã được Studier và các cộng sự thiết kế dựa trên cơ sở hệ điều
khiển promoter mạnh có nguồn gốc từ bacteriophage T7. Gen ngoại lai dưới sự
phiên mã của T7 ARN polymerase.
Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng vector pET-22b(+) làm vector biểu
hiện. Vector pET-22b(+) có chiều dài 5493 bp là vector được sử dụng chủ yếu cho
tách dòng và biểu hiện gen tái tổ hợp trong E. coli. Về cấu tạo, vector này bao gồm:
- Trình tự khởi đầu sao chép (ori) là vị trí gắn của ADN polymeraza, quyết định
số lượng bản sao trong vật chủ.
- Các trình tự mã hóa gen chỉ thị chọn lọc (AmpR) để đảm bảo duy trì sự tồn tại
của vector trong tế bào vi khuẩn đồng thời giúp chọn lọc các dòng tế bào
mang plasmid.
- Vùng đa nối (multiple cloning site) có chứa điểm cắt của một số enzyme hạn
chế để thuận tiện cho việc đưa gen ngoại lai vào vector.
- Promoter T7 kiểm soát phiên mã để nhận biết tín hiệu khởi đầu phiên mã, từ
đó cho phép sản xuất một lượng lớn mARN từ các gen được nhân dòng sau
khi được cảm ứng.
- Các trình tự kiểm soát dịch mã như điểm bám của ribosome được bố trí thích
hợp và codon khởi đầu ATG.
SV: Nguyễn Thị Thơm
13
K18.CNSH.11-02
Khóa luận tốt nghiệp
Khoa Công nghệ sinh học
Ngoài ra trên vector đã được thiết kế thêm một đoạn trình tự mã hóa cho 6 axit
amin Histidine tích điện âm được gọi là đuôi His-tag. Đuôi His này giúp protein tái
tổ hợp được giữ lại khi chúng được đưa qua cột sắc kí ái lực do lực hút tĩnh điện
giữa phần điện tích âm của đuôi His-tag với điện tích dương của các cation có trong
cột tinh sạch.
Hình 3. Sơ đồ cấu tạo vector pET-22b(+)
SV: Nguyễn Thị Thơm
14
K18.CNSH.11-02
Khóa luận tốt nghiệp
Khoa Công nghệ sinh học
CHƯƠNG 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1 VẬT LIỆU
2.1.1. Các chủng vi sinh vật và plasmid
- Chủng E. coli DH10B ( Invitrogen) kiểu gen: F– mcrA Δ (mrr-hsdRMSmcrBC)
Φ80lacZΔM15
ΔlacX74 recA1 endA1 araD139
Δ(ara
leu)
7697 galU galK rpsL nupG λ– sử dụng trong thí nghiệm để tách dòng gen
- Chủng E. coli BL21(DE3) ( Invitrogen) kiểu gen: F– ompT gal dcm lon
hsdSB(rB- mB-) λ (DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5]) -sử dụng trong thí
nghiệm để biểu hiện gen
- Plasmid pBlue-bgc là plasmid pBluescript SK(+) mang gen bgc mã hóa betaglucosidase có nguồn gốc từ vi sinh vật trong ruột mối đã được phòng Kỹ thuật di
truyền, viện Công nghệ sinh học thiết kế, được sử dụng làm nguồn gen.
- Plasmid pET-22b(+) được sử dụng làm vector biểu hiện (Novagen).
Các cặp mồi PCR
2.1.2. Các loại môi trường nuôi cấy
- Môi trường LB (Luria- Bertani) lỏng: bacto tryptone 1%; cao nấm men 0,5%
; NaCl 1%.
SV: Nguyễn Thị Thơm
15
K18.CNSH.11-02
Khóa luận tốt nghiệp
Khoa Công nghệ sinh học
- Môi trường chọn lọc LBA lỏng: thành phần gồm môi trường LB lỏng có bổ
sung kháng sinh Amp đến nồng độ cuối cùng là 100 µg/ml.
- Môi trường LB đặc: thành phần gồm môi trường LB lỏng có bổ sung 1,5% agar.
- Môi trường LBA đặc: thành phần gồm môi trường LBA lỏng có bổ sung
1,5% agar.
2.1.3. Hóa chất và dung dịch sử dụng
2.1.3.1. Hóa chất
SDS; Tris-HCl; EDTA (Serva, Đức); isoamylalcohol; chloroform (Roth, Đức);
ethidium bromide; glycerol; ethanol; ampicillin (Merk, Đức); agar; cao nấm men;
bactor tryptone; d-NTPs (Promega, Mỹ); MgSO4 (BioLabs, Anh); CaCl2; NaOH;
kali acetate; glucose; IPTG; polyacrylamide.
2.1.3.2. Enzyme
Các loại enzyme hạn chế bao gồm NcoI; XhoI; NdeI; Taq-DNA polymerase;
T4-DNA ligase (New England BioLabs, Mỹ); nước deion và các loại đệm phù hợp.
2.1.3.3. Các dung dịch sử dụng trong tách chiết DNA plasmid từ tế bào E.coli
Dung dịch I (Sol I):
Dung dịch II (Sol II):
Dung dịch III (Sol III):
Tris-HCl
50 mM, pH 8
EDTA
10 mM, pH 8
Glucose
50 mM.
NaOH
0,2 N
SDS
1%.
Kali acetat
3M
Axit axetic
5 M.
Dung dịch I và III được giữ ở 4oC, dung dịch II được chuẩn bị trước khi sử dụng.
Dung dịch đệm TE
Tris-HCl
10 mM, pH 8
EDTA
1 mM, pH 8
Dung dịch Chloroform/Isoamylalcohol (24:1): 24 lần thể tích chloroform cộng
với 1 lần thể tích isoamylalcohol.
SV: Nguyễn Thị Thơm
16
K18.CNSH.11-02
Khóa luận tốt nghiệp
Khoa Công nghệ sinh học
2.1.3.4. Các dung dịch dùng trong điện di DNA trên gel agarose 0,8%
Dung dịch đệm TAE 50 lần (50X) (100 ml)
Tris base
24,2 %
Axit acetic
5,71 ml
EDTA 0,5M, pH 8
10 ml. Bổ sung nước đến 100 ml.
Bromophenol blue
0,25%
Xylen cyanol FF
0,25%
Glycerol
30%
Đệm tra mẫu 6X
Dung dịch nhuộm gel ethidium bromide (EtBr): 0,5 µg/ml.
2.1.3.5. Các dung dịch dùng trong điện di trên gel polyacrylamide- SDS
Acrylamide 30%: Cân 30 g acrylamide và 0,8 g Bis-acrylamide hòa tan trong
100 ml nước cất khử trùng, bảo quản ở 4oC
Đệm Tris-HCl, pH 8,8
Tris
0,75 M
SDS
0,2% Dùng HCl để chỉnh pH đến 8,8.
Đệm Tris-HCl, pH 6,8
Tris
0,25 M
SDS
0,2% Dùng HCl để chỉnh pH đến 6,8.
Đệm chạy điện di
Tris
0,05 M
Glycine
0,192 M
SDS
0,1 %
SDS 10%: 10 g SDS bổ sung nước cất đến 100 ml
APS 10%: 10 g amonium persulfate bổ sung nước cất đến 100 ml.
TEMED: sử dụng dung dịch đậm đặc mua từ công ty hóa chất.
SV: Nguyễn Thị Thơm
17
K18.CNSH.11-02
Khóa luận tốt nghiệp
Khoa Công nghệ sinh học
Bảng 1. Thành phần gel polyacrylamide
Đệm biến tính mẫu 6X ( Sample Buffer 6X)
Tris-HCl, pH 8
0,36 M
Glycerol
60%
SDS
12%
Bromophenol blue
0,06%
Mecaptoethanol
3/10 v/v
Dung dịch nhuộm gel (Coomassie blue staining) (100 ml)
Coomassie brilliant blue 0,025 g
Methanol
40 ml
Axit axetic
10 ml. Bổ sung nước cất đến 100 ml.
Dung dịch tẩy gel (Destaining)
Methanol
30%
Axit axetic
10%
Sau khi đã chuẩn bị gel điện di protein, bắt đầu tiến hành đổ lần lượt gel tách
trước, khi đổ tránh sao không để tạo bọt khí, sau đó bổ sung nước lên trên bề mặt gel
để tránh hiện tượng gel bị oxi hóa và giúp cho bề mặt gel được phẳng. Sau khoảng 30
phút gel đông, đổ hết nước trên bề mặt gel và gài lược để tiếp tục đổ gel cô.
SV: Nguyễn Thị Thơm
18
K18.CNSH.11-02
