Nghiên cứu khả năng phân hủy dầu DIESEL của màng sinh học do chủng vi khuẩn tạo thành được phân lập từ mẫu đấu và mẫu nước ô nhiễm dầu tại tỉnh quảng ngãi

Viện đại học mở hà nội
KHOA công nghệ sinh học
===***===

Khóa luận tốt nghiệp
ti:
NGHIấN CU KH NNG PHN HY DU DIESEL
CA MNG SINH HC DO CHNG VI KHUN TO
THNH C PHN LP T MU U V MU
NC ễ NHIM DU TI TNH QUNG NGI

Người hướng dẫn

: ths. Cung thị ngọc mai

sinh viên thực hiện : đinh trần thu phương
lớp

: 1102

Hà nội - 2015


Viện đại học mở hà nội
KHOA công nghệ sinh học
===***===

Khóa luận tốt nghiệp
ti:
NGHIấN CU KH NNG PHN HY DU DIESEL
CA MNG SINH HC DO CHNG VI KHUN TO

THNH C PHN LP T MU U V MU
NC ễ NHIM DU TI TNH QUNG NGI

Người hướng dẫn

: ths. Cung thị ngọc mai

sinh viên thực hiện : đinh trần thu phương
lớp

: 1102

Hà nội - 2015


Lời cảm ơn!
Trước hết, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới ThS. Cung Thị
Ngọc Mai, TS. Lê Thị Nhi Công cán bộ phòng Công nghệ sinh học Môi trường, Viện
Hàn Lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình hướng dẫn và chỉ dạy trong
suốt thời gian tôi thực hiện khóa luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn tới Phụ trách Phòng CNSH môi trường là TS. Đỗ Thị
Tố Uyên cùng toàn thể cán bộ nhân viên Phòng Công nghệ sinh học Môi trường, đặc
biệt là ThS. Vũ Thị Thanh đã giúp đỡ, chỉ bảo tận tình trong suốt quá trình tôi học tập
nghiên cứu hoàn thành khóa luận của mình.
Bên cạnh đó, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô Khoa công nghệ Sinh học,
Viện Đại Học Mở Hà Nội cùng với Lãnh đạo viện Công nghệ sinh học, Viên Hàn lâm
khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học
tập, nghiên cứu tại trường cũng như tại viện.
Cuối cùng, tôi xin gửi gửi lời cảm ơn sâu sắc đến những người thân trong gia
đình, ban bè đã luôn bên cạnh ủng hộ và giúp đỡ tôi rất nhiều cả về vật chất và tinh

thần để tôi có thể hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này.
Một lần nữa xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 22 tháng 05 năm 2015
Sinh viên

Đinh Trần Thu Phương


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU …………………………………………………………………………...1
PHẦN 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................................... 3
1.1. Tình trạng ô nhiễm dầu và hậu quả tác động của nó............................................. 3
1.1.1. Tình trạng ô nhiễm dầu trên thế giới và ở Việt Nam ..................................... 3
1.1.2. Hậu quả của ô nhiễm dầu ............................................................................... 4
1.2. Các phương pháp xử lý ô nhiễm dầu .................................................................... 5
1.2.1. Phương pháp cơ học ....................................................................................... 5
1.2.2. Phương pháp hóa học ..................................................................................... 5
1.2.3. Phương pháp sinh học .................................................................................... 6
1.3. Vai trò của vi sinh vật trong xử lý nước ô nhiễm dầu........................................... 7
1.3.1. Vi sinh vật có khả năng phân hủy dầu ........................................................... 7
1.3.2. Cơ chế phân hủy dầu diesel của vi sinh vật ................................................... 7
1.4. Giới thiệu chung về màng sinh học (biofilm) ..................................................... 12
1.4.1. Khái niệm màng sinh học (biofilm) ............................................................. 12
1.4.2. Sự hình thành, thành phần và cấu trúc của biofilm...................................... 12
1.4.3. Ứng dụng của màng sinh học....................................................................... 15
1.5. Ảnh hưởng của một số điều kiện hóa lý đến sự hình thành và phát triển của
biofilm ........................................................................................................................ 17
1.5.1. Ảnh hưởng của pH ....................................................................................... 17
1.5.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ ............................................................................... 17

1.5.3. Ảnh hưởng của nguồn carbon ...................................................................... 18
1.5.4. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen.................................................................... 19
1.6. Các phương pháp phân loại vi sinh vật ............................................................... 20
1.6.1. Phân loại theo phương pháp truyền thống ................................................... 21
1.6.2. Phân loại theo phương pháp sinh học phân tử ............................................. 21
PHẦN 2 . VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................. 23
2.1. Vật liệu ................................................................................................................ 23
2.1.1. Nguyên liệu .................................................................................................. 23
2.1.2. Hóa chất và môi trường nuôi cấy ................................................................. 23


2.1.3. Máy móc và thiết bị nghiên cứu................................................................... 24
2.2. Phương pháp nghiên cứu..................................................................................... 25
2.2.1. Làm giàu vi khuẩn và phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng sử dụng
dầu diesel .. …………...………………….………………………………………25
2.2.2. Khảo sát khả năng sử dụng dầu diesel của các chủng vi khuẩn .................. 26
2.2.3. Đánh giá khả năng tạo màng sinh học (biofilm) của các chủng vi khuẩn
phân lập được .......................................................................................................... 27
2.2.4. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn.................................... 28
2.2.5. Phân loại, định tên vi khuẩn dựa vào xác định trình tự đoạn gen mã hóa
16S rRNA và xây dựng cây phát sinh chủng loại................................................... 30
2.2.6. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện hóa lý đến sự hình thành màng
sinh học của vi khuẩn ............................................................................................. 32
2.2.7. Đánh giá khả năng phân hủy dầu diesel của màng sinh học do chủng vi
khuẩn tạo thành ....................................................................................................... 33
PHẦN 3 . KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 34
3.1. Làm giàu và phân lập tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng sử dụng dầu
diesel........................................................................................................................... 34
3.2. Khảo sát khả năng sử dụng dầu diesel của các chủng vi khuẩn phân lập được .. 36
3.3. Đánh giá khả năng tạo màng sinh học (biofilm) của các chủng vi khuẩn đã phân

lập được ...................................................................................................................... 37
3.4. Nghiên cứu được một số đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn sử dụng dầu
diesel và tạo màng tốt nhất từ các chủng vi khuẩn đã phân lập được ........................ 38
3.5. Định tên và xây dựng cây phát sinh chủng loại .................................................. 39
3.5.1. Tách chiết DNA tổng số của chủng vi khuẩn QND10................................. 39
3.5.2. Nhân đoạn gen mã hóa 16S rRNA bằng kỹ thuật PCR ............................... 40
3.6. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện hóa lý đến sự hình thành màng
sinh học của chủng Acinetobacter sp. QND10 .......................................................... 42
3.6.1. Ảnh hưởng của pH ....................................................................................... 42
3.6.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ ............................................................................... 43
3.6.3. Ảnh hưởng của nguồn carbon ...................................................................... 45
3.6.4. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen.................................................................... 46


3.7. Đánh giá khả năng sử dụng dầu diesel của màng sinh học do chủng
Acinetobacter sp. QND10 tạo thành .......................................................................... 47
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.................................................................................. 51
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 52
PHỤ LỤC ................................................................................................................. 58 


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Nguồn C được vi sinh vật sử dụng .......................................................... 18
Bảng 1.2. Nguồn N được vi sinh vật sử dụng .......................................................... 19
Bảng 2.1: Máy móc và thiết bị dung trong đề tài ..................................................... 24
Bảng 3.1: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn trên môi trường
HKTS với mẫu làm giàu không và có bổ sung glucose ................................................ 36


DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1. Sự hoạt động của chất phân tán .......................................................................... 6
Hình 1.2. Quá trình chuyển hóa alkane ........................................................................... 9
Hình 1.3. Quá trình phân hủy Hydrocarbon và sinh trưởng của vi sinh vật hiều khí ... 10
Hình 1.4. Con đường phân hủy hiếu khí của n-alkane .................................................. 11
Hình 1.5. Quá trình hình thành màng sinh học của vi sinh vật ..................................... 13
Hình 1.3: Ảnh hiển vi điện tử phóng đại 21.850 lần, hiển thị cấu trúc không gian của
một màng sinh học với mạng lưới ngoại bào xung quanh ............................................ 15
Hình 3.1. Mẫu làm giàu trên môi trường khoáng Gost dịch có bổ sung 1% dầu DO .. 35
Hình 3.2: Khả năng sinh trưởng của chủng vi khuẩn trên môi trường khoáng Gost dịch
có bổ sung 1% dầu diesel .............................................................................................. 37
Hình 3.3: Khả năng bắt giữ tinh thể tím của màng sinh học của các chủng vi khuẩn .. 38
sau 48 giờ nuôi cấy ........................................................................................................ 38
Hình 3.4: khả năng tạo màng của các chủng vi khuẩn .................................................. 38
Hình 3.5: Hình thái khuẩn lạc (A) và hình thái tế bào (B) của chủng QND10 ............. 39
Hình 3.6: Điện di đồ DNA tổng số của chủng vi khuẩn QND10 .................................. 39
Hình 3.7. Điện di đồ sản phẩm PCR nhân đoạn gen 16S rRNA của chủng QND10 .... 40
Hình 3.8: Cây phát sinh chủng loại của chủng vi khuẩn QND10 ................................. 41
Hình 3.9: Khả năng bắt giữ tím tinh thể của màng sinh học do chủng Acinetobacter sp.
QND10 tạo thành ở các pH khác nhau sau 48 giờ ........................................................ 42
Hình 3.10: Ảnh hưởng của pH đến khả năng tạo màng sinh học của chủng vi khuẩn
Acinetobacter sp. QND10 ............................................................................................. 43
Hình 3.11: Khả năng bắt giữ tím tinh thể của màng sinh học do chủng Acinetobacter
sp. QND10 tạo thành ở các nhiệt độ khác nhau sau 48 giờ ........................................... 44
Hình 3.12: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng tạo màng sinh học của chủng vi
khuẩn Acinetobacter sp. QND10 ................................................................................... 44
Hình 3.13: Khả năng bắt giữ tím tinh thể của màng sinh học do chủng Acinetobacter
sp. QND10 tạo thành ở các nguồn carbon khác nhau ................................................... 45
Hình 3.14: Ảnh hưởng của nguồn carbon đến khả năng tạo màng sinh học của chủng
vi khuẩn Acinetobacter sp. QND10............................................................................... 45

Hình 3.15: Khả năng bắt giữ tím tinh thể của màng sinh học do chủng Acinetobacter
sp. QND10 tạo thành ở các nguồn nitor khác nhau ....................................................... 46
Hình 3.16: Ảnh hưởng của nguồn carbon đến khả năng tạo màng sinh học của chủng
vi khuẩn Acinetobacter sp. QND10............................................................................... 47
Hình 3.17: Khả năng sinh trưởng tại các nồng độ dầu DO khác nhau của chủng vi
khuẩn Acinetobacter sp. QND10 ................................................................................... 48
Hình 3.18: Khả năng sinh trưởng của chủng vi khuẩn Acinetobacter sp. QND10 tại các
nồng độ dầu DO khác nhau ........................................................................................... 48
Hình 3.19. Biểu đồ thể hiện hiệu suất phân hủy dầu diesel của màng sinh học chủng vi
khuẩn Acinetobacter sp.QND10 .................................................................................... 49 


BẢNG CHỮ VIẾT TẮT
Kí hiệu

Ý nghĩa

Bp

: Base pair (cặp bazơ)

DNA

: Deoxyribonucleic acid

DO

: Diesel oil (dầu diesel)

HKTS

: Hiếu khí tổng số

LB

: Luria – Bertani

Nm

: Nanomet

PCR

: Polymease Chain Reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp)

RNA

: Ribonucleic acid

rRNA

: Ribosomal Ribonucleic acid

µl

: Microlit

µm

: Micromet


MỞ ĐẦU
Dầu mỏ là một trong những nhiên liệu quan trọng nhất của xã hội dùng để sản
xuất điện và cũng là nhiên liệu của tất cả các phương tiện giao thông cũng như nhiên
liệu trong đời sống hàng ngày của con người. Dầu mỏ đóng vai trò quan trọng hàng
đầu trong nền kinh tế toàn cầu. Nó tác động tới sự phát triển nền kinh tế của mọi quốc
gia trên Thế giới và hầu như mọi ngành công nghiệp đều phụ thuộc rất lớn vào nguồn
tài nguyên quý giá này.
Từ nguồn tính toán, trữ lượng dầu mỏ thế giới nằm trong khoảng từ 1.148 tỉ
thùng đến 1.260 tỉ thùng. Dự kiến nguồn năng lượng trên thế giới từ dầu mỏ có thể lên
tới 80% vào giai đoạn 2016-2017. Nhưng sự “cung không đủ cầu” do các quốc gia có
nguồn dầu mỏ là quá ít so với nhu cầu sử dụng của hàng trăm quốc gia trên thế giới.
Do đó việc khai thác và vận chuyển dầu ngày càng được đẩy mạnh. Cùng với sự phát
triển của việc khai thác, chế biến và vận chuyển dầu, một trong những vấn đề đang
được quan tâm hiện nay là tình trạng ô nhiễm môi trường của các chất thải (các
hydrocarbon) có trong dầu. Các hiện tượng tràn dầu, rò rỉ dầu gây tình trạng ô nhiễm
nghiêm trọng cho môi trường như: hủy hoại hệ sinh thái động thực vật, gây ảnh hưởng
trục tiếp đến cuộc sống con người, v.v…
Phương pháp phân hủy sinh học sử dụng các tác nhân sinh học như vi sinh vật và
các chất có hoạt tính sinh học do vi sinh vật sản sinh ra đã được sử dụng kết hợp cùng
với các phương pháp vật lý, hóa học để xử lý nước nhiễm dầu và đã cho kết quả khả
quan. Gần đây, các nhà khoa học đã đưa ra phương pháp sử dụng màng sinh học
(Biofilm) để xử lý các hợp chất hữu cơ khó phân hủy trong nước bị ô nhiễm dầu.
Màng sinh học là tập hợp các nhóm vi sinh vật trong đó các tế bào vi sinh vật được
gắn chung vào trong chất nền polymer có thành phần chủ yếu là polysaccharide và
protein do chúng tạo ra. Chính đặc điểm này giúp các tế bào vi sinh vật chống chịu
được với các điều kiện khắc nghiệt của môi trường như: sự suy giảm nguồn dinh
dưỡng và các yếu tố vật lý môi trường thay đổi (sự thay đổi về pH, nhiệt độ, sự thẩm

thấu hay sự mất nước của tế bào, v.v…) từ đó làm tăng hiệu suất phân hủy các hợp
chất ô nhiễm khi xử lý ngoài hiện trường. 
1 
 


Xuất phát từ thực tiễn đó, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu
khả năng phân hủy dầu diesel của màng sinh học do chủng vi khuẩn tạo thành
được phân lập từ mẫu đất và mẫu nước ô nhiễm dầu tại tỉnh Quãng Ngãi”.
Mục tiêu đề tài: Phân lập và tuyển chọn được chủng vi khuẩn có khả năng phân
hủy dầu diesel và có khả năng tạo màng tốt nhất từ các chủng vi khuẩn phân lập được
tại các mẫu đất và mẫu nước ô nhiễm dầu thu thập được tại tỉnh Quảng Ngãi.
Nội dung nghiên cứu:
- Làm giàu và phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng sử dụng dầu diesel.
- Khảo sát khả năng sử dụng dầu diesel của các chủng vi khuẩn phân lập được.
- Đánh giá khả năng tạo màng sinh học (biofilm) của các chủng vi khuẩn phân lập
được.
- Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn sử dụng dầu diesel và
tạo màng tốt nhất từ các chủng vi khuẩn đã phân lập được.
- Định tên chủng vi khuẩn sử dụng dầu diesel và tạo màng tốt nhất từ các chủng vi
khuẩn đã phân lập được dựa vào xác định trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA và xây
dựng cây phát sinh chủng loại.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện hóa lý (pH, nhiệt độ, nguồn carbon,
nguồn nitrogen) đến sự hình thành màng sinh học của chủng vi khuẩn sử dụng dầu
diesel và tạo màng tốt nhất.
- Đánh giá khả năng phân hủy dầu diesel của màng sinh học do chủng vi khuẩn sử
dụng dầu diesel và tạo màng tốt nhất tạo thành tại điều kiện tối ưu.

2 
 

PHẦN 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình trạng ô nhiễm dầu và hậu quả tác động của nó
1.1.1. Tình trạng ô nhiễm dầu trên thế giới và ở Việt Nam
™ Trên thế giới
Theo báo cáo của Cơ quan Năng lượng Quốc tế (IEA), nhu cầu dầu mỏ toàn cầu
sẽ tăng nhanh trong năm 2015 [58]. Do đó việc tìm kiếm, thăm dò và khai thác dầu mỏ
tại các vùng biển trên thế giới hiện nay đang được tiến hành mạnh mẽ để cung cấp đủ
nhu cầu sử dụng của chúng ta. Việc sử dụng dầu mỏ làm nhiên liệu cho quá trình vận
hành máy móc trong sản suất, việc xuất khẩu dầu mỏ đem lại năng suất hiệu quả kinh
tế và lợi nhuận rất lớn. Tuy nhiên, việc khai thác, bảo quản, vận chuyển chúng vẫn còn
chưa tốt dẫn tới các sự cố tràn dầu gây thiệt hại lớn không chỉ về mặt kinh tế mà còn
tác động xấu đến môi trường. Trên thế giới đã và đang xảy ra những vụ tràn dầu, rò rỉ
dầu gây hậu quả nghiêm trọng như: Tai nạn dầu lớn nhất thế giới xảy ra vào năm
1979. Trong chiến tranh Iran – Irac (1981-1987) có 314 cuộc tấn công vào tàu chở
dầu. Đây là sự kiện tràn dầu lớn bắt đầu vào tháng 3/1983, khi Irac tấn công vào 5 tàu
trở dầu tại bờ biển Nowrnz, làm thiệt hại 3 quy trình sản xuất dầu tại bờ biển Nowrnz,
đó là điều kiện tạo nên tràn dầu ở vùng Persian Gruff, ước tính khoảng 260.000 tấn
dầu. Ngày 20/4/2010, giàn khoan Deepwater Horizon nằm cách bờ biển Louisiana của
Mỹ 50 dặm đã đột ngột phát nổ và chìm xuống biển, giết chết 11 công nhân và khiến
cho hàng trăm triệu lít dầu thô tràn ra biển, trở thành sự cố tràn dầu lớn nhất từ trước
tới nay. Khoảng nửa triệu tấn khí, 80% trong đó là khí methane, đã rò rỉ ra biển sau vụ
nổ gây ra một thảm họa sinh thái nghiêm trọng cho khu vực rộng hơn 1.500 km2, ảnh
hưởng tới việc kinh doanh của hàng loạt ngành kinh tế biển. Vụ tràn dầu ở vịnh Bột
Hải bắt đầu từ ngày 4/6/2011 tuy nhiên tới đầu tháng 7, sự việc này mới được thông
báo rộng rãi. Trung Quốc đã phải sống trong thảm họa tràn dầu lớn nhất lịch sử. Hàng
trăm nghìn tấn dầu tràn trên biển Hoàng Hải. Một diện tích khoảng 840 đến hơn 4.000
km2 đã bị ô nhiễm nặng do dầu tràn.

3 
 


Những tác động của ô nhiễm dầu tới môi trường, kinh tế xã hội, sức khỏe con
người, hệ sinh thái, v.v... cho thấy việc cần phải nỗ lực hơn để tìm cách giải quyết là
vấn đề của toàn cầu.
™ Ở Việt Nam
Việt Nam đang phải đối mặt với tình trạng ô nhiễm môi trường biển và ngày càng
trở nên nghiêm trọng do hậu quả của sức ép dân số, sức ép tăng trưởng kinh tế, khả
năng quản lý và sử dụng kém hiệu quả các nguồn tài nguyên biển. Hội đồng nghiên
cứu Quốc gia Hoa Kỳ (NRC) năm 2009 đưa ra con số uớc đoán rằng Việt Nam, hàng
năm có khoảng 3,2 triệu tấn dầu làm ô nhiễm biển từ các nguồn khác nhau. Các nguồn
ô nhiễm chính được ghi nhận là từ dầu, phụ gia và sự cố tràn dầu gây tổn thất không
nhỏ về mặt kinh tế và hệ sinh thái Việt Nam. Theo đánh giá của Viện Khoa học và Tài
nguyên Môi trường biển-Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam: Từ năm 1989 đến
nay, vùng biển Việt Nam có khoảng 100 vụ tràn dầu do tai nạn tàu, các vụ tai nạn này
đều đổ ra biển từ vài chục đến hàng trăm tấn dầu [56]. Trong 2 năm 2006 và 2007 tại
ven biển các tỉnh miền Trung và miền Nam đã xảy ra một số sự cố tràn dầu không rõ
nguồn gốc, nhất là từ tháng 1 năm 2007 đến tháng 6 năm 2007, có rất nhiều vệt dầu
trôi dạt dọc bờ biển của 20 tỉnh từ đảo Bạch Long Vĩ xuống tới mũi Cà Mau. Trong sự
cố này, các cơ quan chức năng đã thu gom được 1720,9 tấn dầu. Tháng 6/2009, tàu
Nhật Thuần đã chìm sâu xuống biển Vũng Tàu sau khi bùng cháy trong khoảng 2 giờ
liền. Theo Sở Tài nguyên Môi trường tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu, tại thời điểm xảy ra tai
nạn, trong tàu Nhật Thuần có chứa khoảng 1.795m3 dầu cặn và chất thải lẫn dầu [4].
1.1.2. Hậu quả của ô nhiễm dầu
Sự cố tràn dầu gây ô nhiễm môi trường biển, ảnh hưởng nghiêm trọng đến các hệ
sinh thái. Đặc biệt là hệ sinh thái rừng ngập mặn, cỏ biển, vùng triều bãi cát, đầm phá
và các rạn san hô. Ô nhiễm dầu làm giảm khả năng chống đỡ, tính linh hoạt và khả
năng khôi phục của các hệ sinh thái. Hàm lượng dầu trong nước tăng cao, các màng

dầu làm giảm khả năng trao đổi oxy giữa không khí và nước, làm giảm oxy trong
nước, làm cán cân điều hòa oxy trong hệ sinh thái bị đảo lộn.
Ngoài ra, dầu chứa nhiều thành phần khác nhau, làm biến đổi, phá hủy cấu trúc tế
bào sinh vật, có khi gây chết cả quần thể. Dầu thấm vào cát, bùn ở ven biển có thể ảnh
4 
 


hưởng trong một thời gian rất dài. Đã có nhiều trường hợp các loài sinh vật chết hàng
loạt do tác động của sự cố tràn dầu.
Điều đáng báo động nữa là dầu lan trên biển và dạt vào bờ trong thời gian dài
không được thu gom sẽ làm suy giảm lượng cá thể sinh vật, gây thiệt hại cho ngành
khai thác và nuôi trồng thủy, hải sản. Dầu gây ô nhiễm môi trường nước làm cá chết
hàng loạt do thiếu oxy hòa tan. Dầu bám vào đất, kè đá, các bờ đảo làm mất mỹ quan,
gây mùi khó chịu đẫn đến doanh thu của ngành du lịch cũng bị thiệt hại nặng nề. Nạn
tràn dầu còn làm ảnh hưởng đến hoạt động của các cảng cá, cơ sở đóng mới và sửa
chữa tàu biển. Do dầu trôi nổi làm hỏng máy móc, thiết bị khai thác tài nguyên và vận
chuyển đường thủy [57].
1.2. Các phương pháp xử lý ô nhiễm dầu
1.2.1. Phương pháp cơ học
Khi sự cố tràn dầu xảy ra, phương pháp cơ học được xem là biện pháp xử lý đầu
tiên giúp ngăn chặn, khống chế và thu gom nhanh chóng lượng dầu tràn. Một số biện
pháp được sử dụng phổ biến như: dùng phao ngăn dầu chuyên dụng, dùng tre nứa kết
thành phao ngăn nhằm quây gom, dồn dầu vào vị trí nhất định; thu gom bằng cách
bơm, hút, vớt thủ công, chứa vào các phương tiện đơn giản, v.v...
1.2.2. Phương pháp hóa học
Trong việc xử lý ô nhiễm dầu, phân hủy dầu là biện pháp bắt buộc khi không thể
tổ chức thu hồi bằng biện pháp cơ học. Phương pháp được áp dụng là sử dụng các chất
phân tán, các chất phá nhũ tương dầu-nước, chất keo tụ và hấp thụ dầu, v.v... Ưu điểm
ở đây là xử lý nhanh tuy nhiên lại không xử lý được triệt để và gây ô nhiễm thứ cấp.

Việc sử dụng chất phân tán có thể gây tổn thất trên các hệ thực vật và động vật trên
biển và ven bờ. Do vậy chỉ nên sử dụng chất phân tán sau khi các phương phác xử lý
khác không đạt hiệu quả cao.
Trong sự cố tràn dầu, vì tỉ trọng của dầu nhỏ hơn nước, nền dầu sẽ nổi trên mặt
nước. Sự khuấy trộn tự nhiên của nước sẽ làm cho lượng dầu tràn phân tán xuống
dưới. Nhưng quy trình tự nhiên này mất một khoảng thời gian khá lâu để dầu hoàn
toàn biến mất khỏi bề mặt nước. Để cho phản ứng tự nhiên này được nhanh hơn người
ta thường sử dụng chất phân tán dầu. Những chất tăng độ phân tán với thành phần
5 
 


chính là những chất hoạt động bề mặt. Nhưng chất hoạt động bề mặt là những hóa chất
đặc biệt bao gồm hydrophilic (phần ưa nước) và olephilic (phần ưa dầu).

Hình 1.1. Sự hoạt động của chất phân tán [55]
Tác nhân phân tán hoạt động như một chất tẩy rửa. những hóa chất này làm giảm
bớt lực căng mặt phân cách giữa dầu và nước tạo ra những giọt dầu nhỏ tạo điều kiện
để diễn ra việc phân hủy sinh học và phân tán. Một số chất phân tán đã được thương
mại hóa trên thị trường như: Superdispersant-25 (công ty cổ phần Việt Nam APTES);
Oil Slick Dispersant – 25 (Công ty cổ phần Công nghệ EMS Việt Nam), v.v…
1.2.3. Phương pháp sinh học
Phương pháp sinh học hiện nay là phương pháp xử lý dầu tràn có hiệu quả và an
toàn cho môi trường nhất được sử dụng kế tiếp ngay sau các biện pháp ứng cứu nhanh.
Ứng dụng công nghệ sinh học là công nghệ sử dụng hệ thống sinh học mà chủ yếu là
các vi sinh vật tự nhiên để khôi phục lại đất hoặc nước đã bị ô nhiễm bởi các chất độc
hại đối với sức khỏe con người và môi trường sống. Việc xử lý dầu tràn bằng ứng
dụng công nghệ phân hủy sinh học đảm bảo an toàn cho môi trường hơn các công
nghệ khác, đặc biệt trong điều kiện sinh thái đa hệ, việc áp dụng công nghệ phân hủy
sinh học làm sạch dầu cũng như làm sạch các chất độc hại khác đạt hiệu quả cao cả về

mặt công nghệ và về kinh tê.
Các thành phần hóa học có trong dầu mỏ thường rất khó phân hủy. Do đó, việc
ứng dụng các quá trình sinh học để xử lý ô nhiễm dầu mỏ có đặc điểm rất đặc biệt.
Công nghệ sinh học được ứng dụng trong vấn đề dầu tràn là việc sử dụng các vi sinh
vật (nấm men hay vi khuẩn) để thúc đẩy sự suy thoái của hydrocarbon dầu mỏ. Đó là
một quá trình tự nhiên do vi khuẩn phân hủy dầu thành các chất khác. Các sản phẩm
6 
 


có thể được tạo ra là CO2, nước và các hợp chất đơn giản mà không ảnh hưởng đến
môi trường.
1.3. Vai trò của vi sinh vật trong xử lý nước ô nhiễm dầu
1.3.1. Vi sinh vật có khả năng phân hủy dầu
Trong dầu mỏ chủ yếu là các hợp chất hydrocarbon nên dễ bị vi sinh vật phân
hủy trong điều kiện hiếu khí và kị khí. Có nhiều loại vi sinh vật có khả năng sử dụng
hydrocarbon như nguồn carbon và năng lượng duy nhất [5, 8, 9]. Trong tự nhiên các vi
sinh vật phân hủy dầu và các sản phẩm từ dầu mỏ luôn tồn tại và phân bố rộng rãi
trong hệ sinh thái khác nhau chiếm khoảng dưới 1% tổng số vi sinh vật dị dưỡng. Tuy
nhiên khi môi trường bị ô nhiễm dầu số lượng các nhóm vi sinh vật này đều tăng
nhanh chóng và có thể lên tới 10% trong tổng số vi sinh vật dị dưỡng, thậm chí trong
một số trường hợp đặc biệt có thể lên tới 90% [18]. Các nhà khoa học đã tìm ra những
vi sinh vật có khả năng phân hủy dầu mỏ bao gồm:
- Vi khuẩn: Achromobbacter, Aeromonas, Arthrobacter, Bacillus, Brevebacterium,
Flavobacterium, Lactobacillus, Leucothrix, Moraxella, Pseudomonas,…
- Xạ khuẩn: Streptomyces sp., Actinomyces sp.,...
- Nấm: Allescheria, Botrytis, Candida, Debaromyces, Fusarium, Hansenula,
Oidiodendrum, Penicillium, Rhodosporidium, Saccharomyces, Torulopsis,... [6, 8, 51]
Mỗi loài vi sinh vật chỉ có thể phân hủy mạnh một hoặc một vài hydrocarbon khác
nhau có trong thành phần của dầu mỏ. Vì vậy, việc sử dụng tập hợp các vi sinh vật sẽ

giúp cho quá trình phân hủy hydrocarbon xảy ra nhanh và triệt để hơn.
1.3.2. Cơ chế phân hủy dầu diesel của vi sinh vật
Alkane là thành phần chủ yếu trong dầu thô (khoảng 50%). Chúng có thể được
phân loại gồm: alkane mạch thẳng (n-alkane), mạch vòng (cyclo-alkane) và phân
nhánh (iso-alkane) và được tìm thấy ở ba trạng thái: khí (C1-C4), lỏng (C5-C16) và
rắn (C17) [36].
Để kích thích quá trình phân hủy của vi sinh vật người ta thường bổ sung vào môi
trường một số loại vi sinh vật phù hợp hoặc cung cấp dinh dưỡng (nitrogen,
phosphore…) cho vi sinh vật bản địa phát triển. Vi khuẩn là nhóm vi sinh vật chính
7 
 


tham gia phân hủy dầu mỏ. Nhiều vi khuẩn đã được ghi nhận về khả năng sử dụng
hydrocarbon như nguồn carbon và nitrogen, chẳng hạn như các chủng vi sinh vật thuộc
các chi: Arthrobacter, Acinetobacter, Candida., Pseudomonas, Rhodococcus,
Streptomyces, Bacillus, Acinetobacter, v.v…. Ngoài ra, một số loài vi khuẩn có khả
năng phân hủy cao các hydrocarbon, vì thế gọi là vi khuẩn hydrocarbonoclastic.
Chúng đóng vai trò quan trọng trong việc loại bỏ hydrocarbon từ môi trường ô nhiễm
[31,50]. Vi khuẩn tham gia vào phân hủy hydrocarbon có trong dầu mỏ theo những
con đường rất khác nhau. Người ta phân chúng vào ba nhóm dựa trên cơ chế chuyển
hóa dầu của chúng như sau:
™ Nhóm 1: Bao gồm những vi sinh vật phân giải các chất mạch hở như rượu, mạch
thẳng, như aldehyde ceton, acid hữu cơ.
™ Nhóm 2: Bao gồm những vi sinh vật phân hủy các chất hữu cơ có vòng thơm như
benzen, phenol, toluen, xilen.
™ Nhóm 3: bao gồm những vi sinh vật phân hủy hydratcarbon dãy polymetyl,
Schneiker và cộng sự (2006) đã tìm thấy một loại vi khuẩn biển Alcanivora
borkumensis có khả năng đồng hóa cả alkane thẳng và alkane phân nhánh, nhưng
không thể chuyển hóa các hydrocarbon thơm. Alcanivorax dieselolei, gproteobacterium cũng là một vi khuẩn hydrocarbonoclastic, nó không thể đồng hóa

đường hoặc acid amin như các nguồn năng lượng và carbon nhưng nó có thể sử dụng
một số acid hữu cơ và alkane. Acinetobacter đã được tìm thấy là chi có khả năng sử
dụng n-alkane chiều dài chuỗi C10-C40 như một nguồn carbon duy nhất [45, 48].
Hexadecan có trong thành phần béo của dầu thô và là một trong những thành
phần chính của dầu diesel [24]. Sự phân hủy hexadecan đã được quan sát bởi các loài
vi khuẩn, chẳng hạn như Pseudomonas putida, Rhodococcus erythropolis và Bacillus
thermoleovorans [15] và hai chủng vi khuẩn Flavobacterium sp. ATCC 39723 và
Arthrobacter sp. [46] alkane không tan trong nước. Khả năng hòa tan của alkane phụ
thuộc phần lớn vào trọng lượng phân tử. Phân tử lượng càng lớn, độ hòa tan càng giảm
[29]. Các n- alkane có độ dài trung bình (C10-C24) dễ bị phân giải nhất. Các ankan có
mạch càng dài thì khả năng phân giải càng giảm.      

8 
 


Hình 1.2. Quá trình chuyển hóa alkane
(a)- Methane chuyển hóa thành methanol nhờ MMO; (b) – Butan chuyển hóa thành 1butanol nhờ BMO; (c)- octan chuyển hóa thành 1-octanol; (d)- Octane chuyển hóa
thành 2-octanol; (e) Farnesol chuyển hóa thành 1-hydroxyfarnel
Các vi sinh vật phân giải được alkane là nhờ chúng tiết ra các enzyme xúc tác
cho quá trình phân hủy alkane. Ayala và Torres (2004) đã chỉ ra sự tham gia của 3
enzyme quan trọng trong sự phân giải alkane: Methane monooxygenase (MMO),
hydroxylase alkan (Alk) và Cytochrome P450 monooxygenase [19].
Sự phân hủy hiếu khí alkane cần O2 như một chất bắt buộc trong quá trình hô
hấp. Quá trình oxy hóa của metan dẫn đến sự hình thành của methanol sau đó được
chuyển thành formaldehyde và acid formic. Hợp chất này có thể được chuyển đổi sang
CO2 hay đồng hóa cho sinh tổng hợp các hợp chất hữu cơ khác hoặc bằng các con
đường monophosphate ribulose hoặc bằng con đường serine [38]. Sự phân hủy hoàn
toàn hydrocarbon chủ yếu xảy ra trong điều kiện hiếu khí (Hình 1.3) [44].

9 
 


Hình 1.3. Quá trình phân hủy hydrocarbon và sinh trưởng của vi sinh vật hiếu khí
Quá trình phân hủy hoàn toàn các hydrocarbon chủ yếu diễn ra trong điều kiện
hiếu khí và bao gồm một số bước như mô tả ở hình 1.3. Đầu tiên các hydrocarbon tiếp
xúc với vi khuẩn có khả năng phân hủy chúng. Quá trình này bắt đầu từ hydrocarbon
không tan trong nước và đòi hỏi có sự tham gia của chất hoạt động bề mặt sinh học
được tạo ra bởi vi khuẩn giúp các vi sinh vật có thể tiếp xúc trực tiếp với chất ô nhiễm.
Tiếp đó, các hydrocarbon sẽ được hoạt hóa và kết hợp của O2 dưới sự xúc tác bởi
oxygenase và peroxidase. Sau đó các con đường chuyển đổi thành các hydrocarbon
thông qua chu trình Krebs và việc sinh tổng hợp sinh khối tế bào từ các chất chuyển
hóa trung tâm là acetyl-CoA, succinate và pyruvate, đường cần thiết cho quá trình sinh
tổng hợp và cho sự tăng trưởng của vi sinh vật đó.
Sự phân hủy của n-alkane bắt đầu từ quá trình oxy hóa của một nhóm methyl tạo
ra một rượu bậc một sau đó bị oxy hóa thành aldehyde tương ứng, cuối cùng chuyển
thành acid béo. Acid béo liên kết với CoA và nhờ oxy hóa tại vị trí β tạo ra acetyl-CoA
[49]. Tuy nhiên, trong một số trường hợp, cả 2 đầu của phân tử alkane bị oxy hóa
thông qua hydroxyl ở vị trí đầu và cuối của các nhóm methyl, làm cho một loại acid
10 
 


béo hydroxy tiiếp tục chuuyển đổi thhành một acid
a
dicarbboxylic nhờ
ờ oxy hóa tại vị trí β
m này tạo ra một rượ
ợu bậc hai được chuyyển đổi thành các xeeton tươngg

[25]. Sản phẩm
ygenase tạoo ra một este. Các esste bị thủyy
ứng,, và sau đóó bị oxy hóóa bởi mộtt monooxy
phânn bởi một esterase,
e
tạạo ra rượu và
v acid béo
o. Cả 2 quáá trình oxyy hóa này có thể cùngg
tồn tại
t trong một
m số vi sinnh vật.

Hình 1.4.
1 Con đườ
ờng phân hủ
ủy hiếu khí của n-alkanne

(1): Tấn công vào vịị trí carbonn tận cùng; (2): Tấn côông vào vị trí carbon thứ 2
111 
 


Acremonium spp. oxy hóa ethanol bởi monooxygenase phụ thuộc NADPH, sau đó
được oxy hóa thành acetaldehyde và acid acetic. Acetate được tạo thành đồng hóa
thành carbon tế bào thông qua chu trình acid tricarboxylic ngược lại và bỏ qua
glyoxalate. Tương tự như vậy, một số propan và butan cũng có khả năng tăng trưởng
về alkane mạch dài, chẳng hạn như n-dodecane và n-hexadecan.
1.4. Giới thiệu chung về màng sinh học (biofilm)
1.4.1. Khái niệm màng sinh học (biofilm)
Biofilm là một tập hợp các vi sinh vật bám trên bề mặt của vật thể rắn hoặc bề mặt

chất lỏng tạo thành lớp màng bao phủ bề mặt đó. Phần lớn các vi sinh vật sinh trưởng
trên môi trường bán lỏng đều có khả năng tạo ra màng sinh học. Trong màng sinh học,
hệ vi sinh vật có khả năng chống chịu các điều kiện khắc nghiệt của môi trường tốt
hơn, hỗ trợ trao đổi chất tốt hơn và hạn chế sự cạnh tranh của các vi sinh vật khác [40].
™ Nhóm vi khuẩn tạo biofilm
Biofilm là cấu trúc thường gặp trong tự nhiên, trên 90% vi khuẩn sống trong màng
sinh học như các váng trên mặt nước, cặn máy lọc, v.v... Để có thể tồn tại trong điều
kiện khó khăn (thiếu dinh dưỡng, thay đổi nhiệt độ, áp suất, v.v...) vi sinh vật bám lên
bề mặt, liên kết với các loài khác để sống cộng sinh và tự bảo vệ mình.
Vi khuẩn bám vào bề mặt theo nhiều cách khác nhau. Một số vi khuẩn tự bản thân
đã có tính kết dính nhờ lipopolysaccharides ngoại bào cộng với những đặc tính cấu
trúc tế bào hỗ trợ cho việc di chuyển đến bề mặt là các phần phụ gốc protein như lông
nhung hoặc lông roi. Các vi khuẩn khác chỉ tổng hợp chất kết dính cần thiết khi có bề
mặt để chúng bám vào, điển hình như vi khuẩn gây viêm đường hô hấp Pseudomonas
aeruginosa gặp một mặt kính, trong vòng 15 phút, nó sẽ kích hoạt ngay một hệ gene
cần để tổng hợp polysaccharide, khi vi khuẩn đã bám vào bề mặt, chúng phân chia và
liên tục sản xuất nhiều polysaccharide để tạo nên màng sinh học hoàn chỉnh [21].
1.4.2. Sự hình thành, thành phần và cấu trúc của biofilm
™ Sự hình thành màng sinh học

12 
 


Hình 1.5. Quá trình hình thành màng sinh học của vi sinh vật
Quá trình hình thành màng sinh học gồm 5 giai đoạn:
- Giai đoạn 1 và 2: Các tế bào vi sinh vật dạng tự do được gắn trên 1 bề mặt bất kỳ và
liên kết với nhau thường được chia thành 2 giai đoạn là đảo ngược và không thể đảo
ngược. Khi chưa có sự hình thành cầu polymer giữa các chất nền và EPS bài tiết bởi
các vi sinh vật. Khi vi sinh vật sinh trưởng, phát triển và có sự hình thành cầu polymer

giữa các chất nền và EPS bài tiết bởi các vi sinh vật sẽ tạo nên giai đoạn bám dính
không thể đảo ngược được. Ở giai đoạn này, chất nền được hình thành với số lượng
lớn từ các đại phân tử trong chất lỏng hoặc các vật liệu phủ nhân tạo. Sau đó, các vi
sinh vật lơ lửng trong chất lỏng được vận chuyển đến bề mặt bằng cách khuếch tán đối
lưu hoặc tự vận động và tạo đọ bám dính yếu với bề mặt rắn. Các tế bào này sẽ có xu
hướng chuyển sang một trạng thái ổn định hơn với bề mặt với các chất ngoại bào được
tiết ra và bám dính trên đó. Quá trình gắn các vi sinh vật đầu tiên bị ảnh hưởng rất
nhiều bởi các thuộc tính bề mặt như độ nhám, chất mang và tỷ lệ vi sinh vật được vận
chuyển đến bề mặt.
- Giai đoạn 3: Các tế bào vi sinh vật bắt đầu phát triển, gắn chặt vào bề mặt chất mang
và liên kết với nhau tạo thành cụm tế bào
- Giai đoạn 4: Ở giai đoạn phát triển, các tế bào bắt đầu gắn chặt với chất mang đồng
thời liên kết với nhau và tăng trưởng. Giai đoạn này bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như
việc vận chuyển, khuếch tấn các chất dinh dưỡng, lực cắt của dòng chảy, tốc độ tăng
trưởng của vi sinh vật. Sau giai đoạn này, sự hình thành màng sinh học cơ bản hoàn
13 
 


tất. sự tăng trưởng của vi sinh vật sống trong màng phụ thuộc rất nhiều vào sự sẵn có
của chất dinh dưỡng. Vì vậy nồng độ chất dinh dưỡng và sự khuếch tán của nó đóng
một vai trò quan trọng trong sự hình thành màng sinh học.
- Giai đoạn 5: Ở giai đoạn này lượng vi sinh vật trong màng rất lớn, màng sinh học sẽ
đạt đến một độ dày nhất định, chất dinh dưỡng dần cạn kiệt, các tết bào vi sinh vật bắt
đầu phát tán ra môi trường bên ngoài, gắn vào một vị trí khác của chất mang và lại tiếp
tục hình thành một màng sinh học mới.
™ Thành phần và cấu trúc của màng sinh học
Một màng sinh học trong tự nhiên gồm hai thành phần chính: thành phần tế bào
(tập hợp các tế bào của một hay nhiều loài vi sinh vật khác nhau bám dính trên bề mặt
nhất định) và mạng lưới các hợp chất ngoại bào (esxtracellular polymeric subtances –

EPS) bao quanh các tế bào tạo nên cấu trúc đặc trưng cho màng sinh học. Trong đó,
khối lượng tế bào vi sinh vật chiếm 2-5% tổng khối lượng màng sinh học, 3-6% là
EPS và ion, còn lại là nước [17]. Một tế bào riêng lẻ có thể tạo ra vài thành phần ngoại
bào khác nhau tùy thuộc vào điều kiện môi trường, đặc tính của từng loài vi khuẩn
cũng như cách thức hình thành màng sinh học của chúng.
™ Thành phần mạng lưới và các hợp chất ngoại bào (EPS)
Thành phần polymer ngoại bào rất đa dạng tùy loài vi sinh vật, dạng màng sinh
học và điều kiện hình thành. Nhưng về cơ bản đều bao gồm các polysacchrides chiếm
khoảng 40-95%, protein là 1-60%, acid nucleic là 1-10%, 1-40% là lipid [27]. Về cơ
bản màng sinh học càng dày, thời gian tồn tại càng lâu thì hàm lượng EPS càng nhiều.
Mật độ tế bào tập trung cao nhất ở lớp đỉnh của màng sinh học và giảm dần theo độ
sâu nhưng thành phần EPS lại phong phú hơn ở phía trong màng sinh học. Thành phần
EPS trong hầu hết các màng sinh học cũng khác biệt so với những vi khuẩn ở dạng
sống tự do. Những thành phần chính được xem xét trong một màng sinh học bao gồm
polysaccharide, protein và DNA.
™ Thành phần tế bào
Màng sinh học có thể được hình thành bởi tập hợp các tế bào của một hoặc nhiều
loài vi sinh vật khác như vi nấm, vi tảo, xạ khuẩn, vi khuẩn. Trong màng sinh học các
tế bào tập hợp thành các đơn vị cấu trúc là các vi khuẩn lạc. Thành phần này đóng vai
14 
 


trò quan trọng trong quá trình hình thành màng sinh học đặc biệt là giai đoạn đầu bởi
nó quy định đặc tính hình thành màng sinh học cho từng loài vi sinh vật, đảm nhiệm
chức năng tiết các hợp chất ngoại bào cũng như có chứa các yếu tố phụ trợ tế bào như
lông roi, lông nhung hỗ trợ cho việc bám dính của các tế bào khác lên bề mặt giá thể.
™ Cấu trúc màng sinh học
Cấu trúc màng sinh học có tổ chức, đặc thù và phản ánh các chức năng nhất định
của màng sinh học. Trong màng sinh học có các kênh vận chuyển, qua đó cung cấp

nước, các chất dinh dưỡng cho vi sinh vật tồn tại trong chúng và đem chất thải đi [47].
Giữa các tế bào vi khuẩn diễn ra sự trao đổi thông tin liên lạc đảm bảo cho màng sinh
học được hình thành một cách chính xác. Màng sinh học có cấu trúc không đồng nhất,
bao gồm nhiều lớp vi khuẩn hiếu khí bên trên và nhiều lớp vi khuẩn kỵ khí bên dưới.
Do các luồng nước chảy qua khuấy động nên các vi khuẩn kỵ khí và hiếu khí song
song tồn tại trong các hốc nhỏ phân bố khắp trong màng sinh học. Chiều dày của màng
sinh học thay đổi từ một vài μm thậm chí đến vài cm tùy thuộc vào loài vi sinh vật,
tuổi màng sinh học, lượng dinh dưỡng và áp lực dòng chảy [23, 35].

Hình 1.3: Ảnh hiển vi điện tử phóng đại 21.850 lần, hiển thị cấu trúc không gian của
một màng sinh học với mạng lưới ngoại bào xung quanh [53]
1.4.3. Ứng dụng của màng sinh học
Thuật ngữ “biofilm” được biết đến từ năm 1978 và được mô tả đầu tiên bởi
Costerton và cộng sự [26]. Và tới nay nó đã được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi
trong nhiều lĩnh vực. Có nhiều bể phản ứng sử dụng biofilm để xử lý lượng lớn thể tích
nước thải ô nhiễm như bể phản ứng tầng sôi (BFD), bể xử lý kỵ khí (USB), bùn hạt kỵ
15