Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon và nito trong quá trình lên men sinh tổng hợp mannitol bằng vi khuẩn lactic

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Viện Đại Học Mở Hà Nội

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
-----***-----

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài:
Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn Cacbon và Nitơ trong quá trình lên
men sinh tổng hợp Mannitol bằng vi khuẩn lactic
Người hướng dẫn : Ths. Đỗ Trọng Hưng
Sinh viên thực hiện: Phạm Thanh Thủy
Lớp

: 11 – 01

-----***----Hà Nội – 2015
SVTH: Phạm Thanh Thủy,11-01

1


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Viện Đại Học Mở Hà Nội

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành khóa luận này, em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ThS. Đỗ Trọng
Hưng, phó chủ nhiệm bộ môn công nghệ đường bột - Viện Công nghiệp thực phẩm,

đã tận tình hướng dẫn truyền đạt cho em những kinh nghiệm về chuyên môn và luôn giúp
đỡ động viên tinh thần cho em trong suốt quá trình viết khóa luận tốt nghiệp.
Đồng thời em xin cảm ơn các anh, chị cán bộ phòng Công nghệ đường bột – Viện
Công nghiệp thực phẩm đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho em trong quá trình thực
hiện khóa luận.
Em chân thành cảm ơn quý Thầy, Cô trong khoa Công nghệ sinh học- Viên Đại
Học Mở Hà Nội đã tận tình truyền đạt kiến thức trong những năm em học tập. Với vốn
kiến thức được tiếp thu trong suốt quá trình học không chỉ là nền tảng cho quá trình
nghiên cứu khóa luận mà còn là hành trang quý báu để em bước vào đời một cách vững
chắc và tự tin.
Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè đã luôn bên em, cổ vũ
động viên em trong suốt quá trình học tập và thực hiện khóa luận này.
Do thời gian và trình độ hạn chế, không tránh khỏi được những sai sót. Em rất
mong nhận được sự giúp đỡ và chỉ bảo của các thầy cô.
Em xin trân trọng cảm ơn

Hà Nội, tháng 5 năm 2015
Sinh viên
Phạm Thanh Thủy

SVTH: Phạm Thanh Thủy,11-01

2


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Viện Đại Học Mở Hà Nội

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 2.1: Tên hóa chất dùng trong nghiên cứu.................................................................20
Bảng 2.2: Thiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên cứu.......................................................21
Bảng 2.3: Môi trường MRS................................................................................................21
Bảng 2.4: Môi trường SCP1...............................................................................................22
Bảng 2.5: Môi trường SCP2...............................................................................................22
Bảng 2.6: Môi trường OSCP. ............................................................................................23
Bảng 2.7: Môi trường lên men SP. ....................................................................................23
Bảng 3.1. Khả năng phát triển của các chủng VK lactic trên môi trường MRS................29
Bảng 3.2. Kết quả tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp mannitol
cao......................................................................................................................................31
Bảng 3.3. Đặc điểm hình thái của chủng Lactobacillus sp. HF08.....................................33
Bảng 3.4. Đánh giá khả năng phát triển trong các điều kiện pH và nhiệt độ khác nhau của
các chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. HF08......................................................................34
Bảng 3.5. Khả năng sử dụng các nguồn cacbon khác nhau của chủng Lactobacillus sp.
HF08..................................................................................................................................35
Bảng 3.6. Lựa chọn môi trường nhân giống thích hợp .....................................................36
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của của tỷ lệ kết hợp đường trong môi trường nhân giống đến sự
sinh trưởng và phát triển của Lb. fermentum HF08..........................................................37
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi nhân giống tới khả năng sinh trưởng và phát triển
tạo sinh khối tế bào của chủng Lb. fermentum HF08........................................................38
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của thời gian nhân giống tới khả năng sinh trưởng và phát triển tạo
sinh khối của chủng Lb. fermentum HF08.........................................................................39
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của pH môi trường nhân giống tới khả năng sinh trưởng và phát
triển tạo sinh khối tế bào của chủng Lb. fermentum HF08................................................40
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của sự phối hợp cơ chất đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng
hợp mannitol.......................................................................................................................41

SVTH: Phạm Thanh Thủy,11-01

3

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Viện Đại Học Mở Hà Nội

Bảng 3.12. Ảnh hưởng của tỉ lệ phối hợp cơ chất đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng
hợp mannitol.......................................................................................................................42
Bảng 3.13. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp
mannitol .............................................................................................................................43
Bảng 3.14. Ảnh hưởng của các nguồn đường đến sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp
mannitol..............................................................................................................................44
Bảng 3.15. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sự sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp
mannitol..............................................................................................................................45
Bảng 3.16. Ảnh hưởng của tỉ lệ nguồn nitơ đến sự sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp
mannitol..............................................................................................................................48

DANH MỤC HÌNH
Hình 3.1. Đồ thị sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn lactic........................30
Hình 3.2. Sắc ký đồ mẫu chuẩn hỗn hợp fructose, glucose, mannitol (a) và mẫu lên men
chủng Lactobacillus sp. HF08 (b)......................................................................................31
Hình 3.3. Sắc ký đồ mẫu chuẩn hỗn hợp fructose, glucose, mannitol (a) và mẫu lên men
trên môi trường có nồng độ fructose/glucose = 100/50 g/l (b)..........................................43
Hình 3.4. Sắc ký đồ mẫu chuẩn hỗn hợp fructose, glucose, mannitol (a) và mẫu lên men
trên môi trường chứa cao nấm men FIRI (b).....................................................................46

SVTH: Phạm Thanh Thủy,11-01

4

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Viện Đại Học Mở Hà Nội

KÝ HIỆU VÀ VIẾT TẮT

CNSH: Công nghệ Sinh học
CNTP: Công Nghiệp Thực phẩm
MDH: Mannitol dehydrogenase
VSV: Vi sinh vật
VK: Vi khuẩn
LAB: Vi khuẩn Lactic
FDA: Cục Quản lý thực phẩm và thuốc Hoa Kỳ
LDH: Lactate dehydrogenase
HPLC: Sắc ký lỏng cao áp
CSL: Cao ngô
HFCS: High fructose corn syrup
rpm: vòng/phút
CFU/ml: Số lượng khuẩn lạc/ ml
FIRI: Viện Công nghệ Thực phẩm

SVTH: Phạm Thanh Thủy,11-01

2


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Viện Đại Học Mở Hà Nội

MỞ ĐẦU
Hiện nay, trên thế giới cũng như ở Việt Nam các bệnh liên quan đến dư thừa năng
lượng như béo phì, huyết áp, tim mạch và đặc biệt là bệnh tiểu đường, do tiêu thụ dinh
dưỡng quá mức đặc biệt là các sản phẩm có chứa đường (carbohydrate), các sản phẩm
này còn gây bệnh răng miệng rất hay gặp ở trẻ em do ăn nhiều thực phẩm có chứa đường
thông thường. Với sự phát triển của khoa học công nghệ, các nhà nghiên cứu đã nghiên
cứu tạo ra các chất có vị ngọt nhưng không phải là đường, đó là các polyol sử dụng như là
chất đường thay thế nên gọi là “Sugar free”, trong đó có mannitol.
Mannitol là đường rượu sáu cacbon, có độ ngọt bằng khoảng một nửa đường
saccarose. Nó được tìm thấy nhiều trong rau củ và hoa quả như: bí ngô, nấm, hành, trong
tảo biển, đặc biệt là tảo biển nâu. Mannitol được sử dụng rất phổ biến trên toàn thế giới do
nó mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe con người như tăng sức đề kháng, có lượng calo
thấp, rất có lợi cho người tiểu đường, tim mạch hay người ăn kiêng sử dụng,… Vì vậy
mannitol được ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, y tế...
Trong số các phương pháp sản xuất mannitol: hóa học, enzym và lên men sinh
tổng hợp thì cho thấy công nghệ lên men có ưu việt hơn, tạo ra sản phẩm có độ tinh khiết
cao, dễ triển khai sản xuất ở qui mô công nghiệp và có khả năng cạnh tranh được giá
thành do được sản xuất từ nguyên liệu có sẵn và rẻ tiền. Trong quá trình lên men, các
chủng vi khuẩn axit lactic được sử dụng là đối tượng nghiên cứu sản xuất mannitol, các
chủng này đã được ứng dụng rộng rãi và an toàn trong chế biến và bảo quản thực phẩm,
đồ uống, y dược,...
Quá trình lên men sinh tổng hợp mannitol bởi vi khuẩn lactic ngoài ảnh hưởng của
các điều kiện lên men như nhiệt độ, pH, tỷ lệ giống,... thì cơ chất cacbon và nitơ đóng vai
trò quan trọng, định hướng đến sản phẩm cuối cùng theo mong muốn và nâng cao hiệu
quả của quá trình lên men. Cơ chất chính để chuyển hoá thành mannitol là fructose dưới
tác dụng của enzyme mannitol dehydrogenase phụ thuộc NADH, bên cạnh đó sự phối hợp
cơ chất trong quá trình lên men cũng đã được nghiên cứu cho thấy chúng có vai trò quan
SVTH: Phạm Thanh Thủy,11-01

1


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Viện Đại Học Mở Hà Nội

trọng và ảnh hưởng lớn đến hiệu suất chuyển hoá sinh tổng hợp mannitol, như vậy nguồn
cacbon là rất quan trọng. Bên cạnh cơ chất chính là nguồn cacbon thì vi khuẩn lactic
cũng cần những nguồn dinh dưỡng khác để sinh trưởng, phát triển một cách tốt nhất. Một
trong số những cơ chất quan trọng trong đó chính là nitơ - một trong những thành phần
không thể thiếu trong môi trường sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật nói chung và vi
khuẩn lactic nói riêng, nhằm tổng hợp nên các thành phần quan trọng xây dựng tế bào vi
sinh vật. Do vậy hai yếu tố này liên quan chặt chẽ đến quá trình sinh tổng hợp mannitol
bằng phương pháp lên men vi khuẩn lactic, với mục đích nhằm xác định được nguồn
cacbon và nitơ thích hợp để nâng cao hiệu suất lên men sinh tổng hợp mannitol, giúp cho
quá trình thu hồi sau này đạt hiệu suất và chất lượng cao. Với thời gian có hạn, chúng tôi
đề xuất nghiên cứu đề tài:“Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn Cacbon và Nitơ trong
quá trình lên men sinh tổng hợp Mannitol bằng vi khuẩn lactic”.
Mục tiêu đề tài: Đánh giá được sự ảnh hưởng và xác định được tỷ lệ thích hợp của
nguồn cơ chất cacbon và nitơ trong quá trình lên men sinh tổng hợp mannitol bằng chủng
vi khuẩn lactic
Nội dung nghiên cứu chính:
Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp
mannitol cao.
Đánh giá một số đặc điểm hình thái, tính chất sinh hoá của chủng vi khuẩn
lactic đã lựa chọn.
Nghiên cứu xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình nuôi cấy nhân
giống chủng vi khuẩn lactic đã lựa chọn.
Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon trong quá trình lên men sinh tổng

hợp mannitol bằng chủng vi khuẩn lactic đã lựa chọn.
• Nghiên cứu ảnh hưởng của sự phối hợp nguồn cơ chất trong quá trình lên men
sinh tổng hợp mannitol.
• Nghiên cứu xác định tỷ lệ phối hợp nguồn Cacbon thích hợp cho quá trình lên
men sinh tổng hợp mannitol.

SVTH: Phạm Thanh Thủy,11-01

2


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Viện Đại Học Mở Hà Nội

• Nghiên cứu lựa chọn nồng độ nguồn Cacbon thích hợp cho quá trình lên men
sinh tổng hợp mannitol.
• Nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn đường thích hợp cho quá trình lên men
sinh tổng hợp mannitol.
Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn nitơ trong quá trình lên men sinh tổng
mannitol bằng chủng vi khuẩn lactic đã lựa chọn
• Nghiên cứu lựa chọn nguồn Nitơ hữu cơ thích hợp cho quá trình lên men sinh
tổng hợp mannitol.
• Nghiên cứu xác định tỷ lệ Nitơ hữu cơ thích hợp cho quá trình lên men sinh tổng
hợp mannitol

SVTH: Phạm Thanh Thủy,11-01

3

KHÓA LUẬN TỐT
T NGHIỆP

Viện
ện Đại
Đạ Học Mở Hà Nội

PHẦN 1: TỔNG QUAN
1.1. MANNITOL – TÍNH CH
CHẤT VÀ ỨNG DỤNG CỦA
A MANNITOL.
1.1.1. Mannitol [14,21,23,43
[14,21,23,43]:
Mannitol có công th
thức hóa học là C6H14O6,(tên gọi
ọi khác mannite, Dmannohexane-1,2,3,4,5,6-hexaol,
hexaol, mannitolum, mannitolo hay đường
ờng manna),
manna) là đồng
phân lập thể sorbitol. Mannitol llà một nguyên liệu sinh hóa quan trọng
ọng thường
th
được sử
dụng trong nhiều lĩnh vực
ực nh
như y học và thực phẩm, công nghệ sinh học.
ọc.
Mannitol thuộcc nhóm polyol - tên gọi thu gọn của nhóm rượu
u đa phân tử,

t nên còn
gọi là “sugar
gar alcohol” vì trong công th
thức có chứaa nhóm alcohol (CH-OH)
(CH
ở vị trí
cacbonyl (C=O) trong các aldose và ketose. Polyols là carbonhydrates nhưng
nh
không phải
là đường, cũng không phải
ải rrượu, chúng được sử dụng như một chất
ất làm
l
ngọt, các nhà
khoa học gọi chúng là "đườ
ờng rượu" bởi vì một phần của cấu
u trúc hóa học
h tương tự như
đường và một phần là tương
ương ttự như rượu.

ên được phân lập từ dịch triết củaa hoa cây tro, Fraxinus ornus
Mannitol lần đầu tiên
vào năm 1920.Trên thếế giớ
giới, mannitol đã được sản xuất trên
ên quy mô công nghiệp
nghi bằng
phương pháp hydro hóa ở nhi
nhiệt độ và áp suất cao. Nhưng vài năm trở
ở lại

lạ đây thì các nhà
khoa học đã ứng dụng
ng công ngh
nghệ sinh học để sản xuất mannitol ở quy mô công nghiệp
nghi
với nhiều ưu điểm vượt trội
ội thay th
thế cho những phương pháp truyền
n thống.
thố
1.1.2. Tính chất mannitol[14,47]
[14,47].
- Là tinh thể màu trắng.
ắng.
- Có độ hòa tan thấp:
ấp: 20% ở 20°C.
- Nhiệt độ nóng chảy
ảy cao: 165 - 168°C.
- Có độ ngọt thấp (bằng
ằng 50% so với đường mía) giúp ích cho người
ời bị bệnh tiểu đường sử
dụng.
SVTH: Phạm Thanh Thủy,11
11-01

4


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Viện Đại Học Mở Hà Nội

- Có năng lượng thấp: 1g mannitol sản sinh ra 1.6 kilocalo điều này cho thấy mannitol rất
thích hợp với người thừa cân béo phì hay người ăn kiêng.

- Mannitol cũng được xếp vào loại prebiotic, kích thích sự phát triển vi sinh vật
đường ruột Bifidobacteria và Lactobacilli làm tăng quẩn thể Bifidobaterium. Các vi
khuẩn đường ruột này có khả năng chuyển hóa mannitol thành các axit hữu cơ và các axit
béo chuỗi ngắn (axit axetic, propionic, n-butyric) mà không sinh ra năng lượng, tạo môi
trường axit thấp ở đại tràng ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh. Ngoài ra các
axit hữu cơ còn cải thiện hệ tiêu hóa, axit axetic và propionic chống tăng cholesterol,
butyric hạn chế sự phát triển của biểu mô của thành tế bào đại tràng giúp đại tràng tăng
khả năng hấp thu khoáng chất, tổng hợp các vitamin nhóm B, axit folic và tăng cường hệ
thống miễn dịch.
- Mannitol là chất ngọt không bị thủy phân bởi enzyme tiêu hóa nên có khả năng phòng
bệnh răng miệng đặc biệt là tình trạng sâu răng ở trẻ em hiện nay.

1.1.3. Ứng dụng của mannitol[7,14,36]
1.1.3.1. Trong thực phẩm:
Với các đặc tính của mannitol như: giảm chỉ số đường huyết, kiểm soát insulin do
khả năng thấp thụ từ từ và cơ thể, giá trị năng lượng thấp, độ ngọt và tính chất hút ẩm
thấp nên nó được thay thếđường cho các sản phẩm cần giảm calo, thực phẩm cho người bị
tiểu đường. Mannitol thường được sử dụng trong các sản phẩm như: kẹo cao su, kẹo mền,
kem, kẹo bạc hà, bánh cookie , thạch trái cây...
Trong chế biến thực phẩm, mannitol được ứng dụng rộng rãi chiếm 50,6%(trong
đó 42% sản xuất kẹo, còn lại trong các thực phẩm khác). Do tính chất không hút ẩm và
năng lượng thấp nên mannitol được lựa chọn trong ứng dụng sản xuất kẹo là chủ yếu,
mannitol được sử dụng trong sản xuất kẹo socola không đường như là một thành phần bao
bọc kẹo giúp kẹo không dính vào giấy gói. Trong sản xuất kẹo dùng cho người tiểu
đường, trong số các polyol thì mannitol được lựa chọn là chất tạo độ ngọt thích hợp nhất,

do không kích thích tăng glucose trong máu
Mannitol được Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) xếp vào
nhóm thực phẩm an toàn, đặc biệt có thể sử dụng như một chất phụ gia an toàn cho con
người.
SVTH: Phạm Thanh Thủy,11-01

5


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Viện Đại Học Mở Hà Nội

1.1.3.2. Trong dược phẩm.
Mannitol trong y học là một thuốc lợi tiểu tốt, làm giảm áp lực nội sọ, nhãn áp, và
thuốc điều trị thận, chất khử nước, đườngthay thế. Tiêm mannitol như một sự thâm nhập
nhanh của thuốc hạ huyết áp, đặc biệt là trong não rối loạn lâm sàng có thể thay thếđược
các loại thuốc thường được sử dụng, vì có đặc điểm nhanh chóng, hiệu quả và chính xác.
Sử dụng như một viên tá dược, mannitol không hấp thụ độ ẩm, khô nhanh, ổn định hóa
học tốt, và đặc biệt tốt cho các loại thuốc chống ung thư, kháng sinh, thuốc kháng
histamin, và các vitamin. Ngoài ra, thuốc cũng được sử dụng như một chất giúp để tỉnh
táo. Manitol đóng vai trò như một thuốc nhuận tràng ở liều uống lớn hơn 20 g và đôi khi
được bán như thuốc nhuận tràng cho trẻ em.
1.1.3.3. Trong công nghiệp.
Trong ngành công nghiệp, mannitol có thể được sử dụng trong ngành công sản
xuất nghiệp nhựa, và este glycerol nhân tạo các loại nhựa nhựa thông, chất nổ, kíp nổ
(nitrat hóa mannitol).
1.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT MANNITOl
1.2.1. Phương pháp tổng hợp hóa học[13,15,20,26]
Phương pháp hóa học cơ bản dựa trên sự hydro hóa fructose tạo mannitol. Nguyên

liệu được sử dụng ở đây là tinh bột hoặc sacarose (đường ăn). Tinh bột được thủy phân
tạo ra hỗn hợp xi rô chứa 42% fructose, 52% dextrose và 6% maltose. Còn sacarose thì
đơn giản hơn chỉ là được thủy phân thành đường đơn, trong đó có khoảng 50% là
fructose. Mặc dù tinh bột là nguồn rẻ hơn so với sucrose, nhưng sự chuyển đổi của tinh
bột là phức tạp hơn nhiều. Hiện nay mannitol được sản xuất bởi sự hydro hóa hóa học
fructose dưới sự xúc tác của niken (Ni 2mg/kg) ở nhiệt độ(120ºC -160ºC) và áp suất
cao(70 – 140 atm), sau khi tinh bột và đường sacarose đã được xử lí.Trong quá trình
hydro hóa, glucose và α-fructose chuyển hóa thành sorbitol, β-fructose chuyển hóa thành
mannitol. Như vậy hydro hóa một hỗn hợp fructose/glucose = 50/50 thì sẽ cho sản phẩm
hỗn hợp tương ứng mannitol/sorbitol = 30/70, hiệu suất phản ứng tạo mannitol không cao,
chỉ đạt 48-50%, sản phẩm không tinh khiết và khó để tách mannitol khỏi sorbitol.

SVTH: Phạm Thanh Thủy,11-01

6


KHÓA LUẬN TỐT
T NGHIỆP

Viện
ện Đại
Đạ Học Mở Hà Nội

Phương trình phản ứng:
Ni,p,tºcao

D-frutose
frutose

D
D-mannitol
mannitol

D-sorbitol
sorbitol
Mặt khác phản ứng
ng hydro hóa còn gâ
gây ô nhiễm môi trường
ng và tồn
t dư chất xúc tác
trong sản phẩm, điều kiệnn ph
phản ứng phức tạp, tiềm tàng nguy cơ cháy nổ…,
n
do vậy việc
ứng dụng phương
ng pháp sinh hhọc trong sản xuất mannitol để thay thế phương pháp hóa
học cổ điển là tất yếu.
1.2.2. Phương pháp sử dụng
ụng enzym
enzyme :
Fructose biến đổi tạo mannitol, enzyme ch
chịu trách nhiệm
m cho sự biến đổi fructose
thành mannitol là enzyme mannitol dehydrogenase(mdh)
dehydrogenase(mdh)kết hợp vớii NAD(P)H có vai trò
chủ yếu là đồng xúc tác.
Vi khuẩn lactic sản
ản xu
xuất ra enzyme mannitol dehydrogenas (mdh) , đây là enzyme

nội bào, rất khó để tách triết tinh khi
khiết chúng, vì vậy phương pháp sử
ử dụng
dụ enzyme không
được sử dụng nhiều.
1.2.3. Phương pháp sử dụng
ụng vi sinh vvật[37, 45, 46, 47]
Với mục đích
ích nâng cao hi
hiệu suất tổng hợp mannitol và dễ dàng thu hồi sản phẩm,
các nhà khoa học đã đề xuấất quá trình sản xuất bằng phương sinh họcc cho sản
s phẩm chính
là mannitol, không tạo sảnn ph
phẩm phụ sorbitol. Chính vì vậy
y quy trình sản
s xuất mannitol
bằng phương pháp sinh tổng
ng hhợp từ vi sinh vật được quan tâm nghiên cứurất
c
nhiều và đã
bắt đầu từ lâu. Nhiều vi sinh vvật như nấm men, nấm mốc và đặc biệtt là nhóm vi khuẩn
khu
lactic dị hình đã đượcc nghiên ccứu và xác định là chỉ sinh tổng hợp tạo
o mannitol, mà không
hình thành sorbitol. Hơn thếế nữa, vi sinh vật còn có khả năng sản xuấtt và tái tạo
t tác nhân
SVTH: Phạm Thanh Thủy,11
11-01

7

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Viện Đại Học Mở Hà Nội

thúc đẩy enzym mannitol dehydrogenase (MDH) là NAD(P)H, do đó không cần bổ sung
NAD(P)H vào môi trường lên men.
Simley và cộng sự(1969) đã nghiên cứu sinh tổng hợp mannitol trên đối tượng nấm
Aspergillus candidus trên môi trường có cơ chất là glucose cho năng suất tổng hợp
mannitol 0,15 g/L/giờ, hiệu suất chuyển hóa đạt 31 mol%. Hendriksen và cộng sự (1988)
cũng nghiên cứu sinh tổng hợp mannitol bằng nấm Penicillium scabrosum trên cơ chất
sucrose cho năng suất tổng hợp mannitol đạt 0,14 g/L/giờ, hiệu suất chuyển hóa đạt 56,7
mol%. Còn với nấm men là một đối tượng phổ biến sinh tổng hợp các loại đường alcohol,
Onishi và Suzuki (1970) đã nghiên cứu sinh tổng hợp mannitol bằng nấm men Torulopsis
mannitofaciens trên cơ chất glycerol cho hiệu suất chuyển hóa đạt khoảng 31,0 mol%.
Đây là một phương pháp đầy hứa hẹn, cần thiết để mở rộng ra quy mô sản xuất
công nghiệp. Vì vậy, các phương pháp công nghệ sinh học ngày càng được nghiên cứu
chuyên sâu hơn để có thể tìm ra con đường đơn giản nhất sử dụng nguồn cơ chất kinh tế
mà vẫn đạt được năng suất mannitol tinh khiết tối ưu thay thế cho con đường sản xuất
tổng hợp hóa học có nhiều hạn chế.
1.3.

TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP MANNITOL BẰNG VI

KHUẨN LACTIC[6,7,8,12,17,15]
1.3.1. Sinh tổng hợp mannitol ở vi khuẩn lactic đồng hình.
Vi khuẩn lactic có hai kiểu lên men là lên men đồng hình và dị hình. Trong đó lên
men đồng hình là kiển lên men mà sản phẩm là một sản phẩm duy nhất hoặc chủ yếu, các
chất khác chỉ có ở dạng vết không đáng kể.

Vài chủng lactic lên men đồng hình như các chủng Leuconostoc và Lactobacilli
group III lên men đồng hình từ cả fructose và glucose(Kandler and Weiss 1986); chủng
Steptococcus mutant và Lactobacillus leichmanii sản xuất lượng nhỏ mannitol từ
glucose(Chalfan và cộng sự 1975; Lesche và Kornman 1976). Trong quá trình đồng hóa
glucose, một số vi khuẩn lactic đồng hình thiếu hụt cả hai loại enzym L- và D-lactate
dehydrogenase (LDH), do đó tổng hợp mannitol như là một sản phẩm cuối cùng của quá
trình đồng hóa glucose.

SVTH: Phạm Thanh Thủy,11-01

8


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Glucose

Viện Đại Học Mở Hà Nội

Fructose
NADH+H+

Glucose-6-P

NAD+

Frucose-6-P

Ethanol

Pyruvate

Mannitol-1-P

Acetate

-P

Mannitol
Lactate
Sơ đồ sinh tổng hợp mannitol từ vi khuẩn lactic đồng hình.
1.3.2. Sinh tổng hợp mannitol ở vi khuẩn lactic dị hình.
Lên men dị hình là kiểu lên men mà sản phẩm tạo thành có nhiều loại, như trong
lên men sinh tổng hợp mannitol thì sản phẩm chính - mannitol và sản phẩm phụ-axit
lactic, axit axetic,.... Một số vi khuẩn lactic lên men dị hình thuộc giống Lactobacillus;
Leuconostoc; và Oenococus có thể sản xuất trực tiếp mannitol từ fructose (Saha 2003).
Ngoài mannitol những vi khuẩn này có thể sản xuất axit lactic,axit acetic;cacbon dioxit và
ethanol.
Fructose

MDH

Mannitol + axit lactatic + axit acetic + CO2 + ethanol.

Quá trình này dựa vào khả năng của vi khuẩn lactic để sử dụng fructose giống như
một chất nhận điện tử và khử nó thành mannitol sử dụng enzym mannitol 2dehydrogenase (MDA). Saha và Nakamura (2003) trình bày rằng những chủng tốt của
axitlactic lên men dị hình sản xuất mannitol từ fructose như: chủng L. intermedius NRRL
B- 3693 sản xuất 198 g mannitol từ 300g fructose/lít trong điều kiện pH=5.0), nhiệt độ
37˚C.
Vi khuẩn đồng sử dụng fructose và glucose (2:1) và đồng thời sản xuất

mannitol,axit lactic, và axit acetic với số lượng tương tự nhau khi đem so sánh với chỉ
một nguồn fructose. Glucose biến đổi thành axit lactic và axit acetic còn fructose biến đổi
thành mannitol.
SVTH: Phạm Thanh Thủy,11-01

9


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Viện Đại Học Mở Hà Nội

Glucose

2 Frutose
ATP

ADP
Glucose-6-P
NAD+

NADH

H+

+

6-P-Gluconate
NAD+

CO2

NADH

H+

+

Ribulose-5-P

2 Mannitol
Xylolose-5-P

Pyruvate
NAD+
NADH + H+
Lactate

Acetyl-P
ADP

ATP
Acetate

Sơ đồ quá trình sinh tổng hợp mannitol bởi vi khuẩn lactic dị hình
Cùng lên men của hai cơ chất được báo cáo là kích thích cho một số enzym, như
vậy phải có một kết quả tốt hơn, về chất nhận electron có thể là NADH, thường bị hạn chế
trong quá trình sản xuất mannitol. Vì vậy, trong lên men đồng thời của cả glucose và
fructose, thì glucose được sử dụng như một nguồn năng lượng trong khi fructose được sử
dụng như một chất nhận electron.

SVTH: Phạm Thanh Thủy,11-01

10


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Viện Đại Học Mở Hà Nội

1.4. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH LÊN MEN SINH TỔNG HỢP
MANNITOL[6,8,10,38,39].
1.4.1. Nguồn Cacbon:
Đường là nguồn cacbon chủ yếu cho tế bào vi khuẩn lactic phát triển và sinh tổng
hợp mannitol. Nồng độ đường có ảnh hưởng rất lớn tới quá trình lên men sinh tổng hợp
mannitol, nồng độ đường fructose cao thì lượng mannitol tạo ra nhiều, tuy nhiên nồng độ
đường quá cao sẽ ức chế sự phát triển của vi khuẩn lactic do đó ảnh hưởng tới quá trình
trao đổi chất của vi khuẩn lactic. Ngược lại nếu nồng độ đường thấp thì hàm lượng
mannitol tạo thành thấp gây khó khăn cho quá trình thu hồi và không hiệu quả kinh tế.
Vi khuẩn Lactic sử dụng cơ chất là frutose để chuyển hóa thành mannitol trong quá
trình lên men sản xuất mannitol nhờ ezyme mà chúng sản xuất ra-enzyme mannitol
dehydrogenase(mdh). Kèm theo đó có thể kết hợp với một vài loại đường khác như
glucose, maltose, saccarose,….. để tăng hiệu xuất chuyển hóa lên mức tối đa. Việc kết
hợp các loại đường khác nhau có ý nghĩa đặc biệtgiúp cho quá trình sinh trưởng của vi
khuẩn lactic được thuận lợi, còn tái tạo ra NAD(P)H có tác dụng tăng cường hoạt động
enzyme này thúc đẩy chuyển hoá fructose thành mannitol cao hơn so với sử dụng riêng cơ
chất fructose.
D-Fructose

Fomate

Glucose
+

+

NAD

NAD
mdh

mdh

NADH

NADH

CO2

Gluconate

D-Mannitol

Sơ đồ chuyển hóa fructose thành mannitol trong vi khuẩn lactic.

SVTH: Phạm Thanh Thủy,11-01

11


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Viện Đại Học Mở Hà Nội

Theo nhiều nghiên cứu trên thế giới, việc sử dụng kết hợp giữa fructose và glucose
theo tỷ lệ thích hợp(2:1) có thể tăng năng suất chuyển hóa từ fructose thành mannitol lên
đến 100%.
Để giảm chi phí đầu tư trong quá trình sản xuất mannitol, một vài cơ chất có giá trị
thấp được tận dụng từ các ngành chế biến thực phẩm như rỉ đường, siro carob, siro hạt
điều, siro HFCS đã được sử dụng trong nghiên cứu sản xuất mannitol.Carvalheiro và cộng
sự (2011) đã sử dụng siro carob (chứa sucrose, fructose, glucose và pinitol) với hàm
lượng đường tổng 92 g/l làm có chất sinh tổng hợp mannitol đạt 240 mM đối với chủng
Leuconostoc fructosum tại 370C trong 24 giờ. Saha (2006) đánh giá sử dụng rỉ đường
riêng rẽ và kết hợp với fructose (3:1) trong quá trình sản xuất mannitol trên chủng L.
intermedius NRRL-3693, khi sử dụng rỉ đường riêng rẽ cho kết quả đạt 221,7 mM tại 40
giờ lên men, còn khi kết hợp với fructose thì cho hàm lượng mannitol cao hơn 2,6 lần tại
16 giờ lên men.
1.4.2. Nguồn Nitơ.
Vi khuẩn Lactic cũng như các sinh vật sống khác đều cần Nitơ trong các quá trình
sống để xây dựng các cấu trúc của tế bào. Bên cạnh việc sử dụng một nguồn nitơ duy nhất
thì ta có thể kết hợp một số nguồn nitơ với nhau để vi khuẩn Lactic phát triển một cách tốt
nhất góp phần tăng năng xuất chuyển hóa mannitol.
Một số nguồn nitơ thường được sử dụng trong công nghiệp lên men:
Peptone là dịch thủy phân không hoàn toàn của nhiều nguồn protein khác nhau.
Peptone có nhiều nguồn gốc khác nhau: thịt, casein, gelatin, bột đậu tương,… nên thành
phần khá khác nhau. Peptone là nguyên liệu khá đắt tiền.
Cao nấm men là nguồn đạm mà nhiều loại vi sinh vật ưa thích. Cao nấm men chứa
nhiều các axit amin , các peptide, các vitamin tan trong nước và các loại hydratcacbon.
Cao ngô là chất dịch đặc sánh có màu nâu sẫm hay cao đặc đồng nhất. thành phần
cao ngô phụ thuộc vào loại ngô, phương pháp ngâm ngô,… do đó mà thay đổi trong
khỏang rộng. Hàm lượng chất khô không được ít hơn 48%. Trong cao ngô có nhiều acid

amin rất cần thiết cho vi khuẩn lactic phát triển.
SVTH: Phạm Thanh Thủy,11-01

12


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Viện Đại Học Mở Hà Nội

Trong tất cả các nguồn nitơ mà vi sinh vật có thể sử dụng thì cao nấm men là sự
lựa chọn tốt nhất. Mỗi một loài thì có tỷ lệ nguồn nitơ khác nhau cho quá trình phát triển.
Để giảm chi phí nguyên liệu trong sản xuất, Saha BC. (2006) đã nghiên cứu ảnh
hưởng của nguồn nitơ tới quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp mannitol bởi chủng L.
intermedius NRRL B-3693 cho thấy sử dụng peptone và cao ngô (SCL) có thể là nguồn
cung cấp nitơ thích hợp thay thế nguồn nitơ đắt tiền như cao nấm men, pepton.
1.4.3. Các yếu tố ảnh hưởng khác[15,33]:
1.4.3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ:
Nhiệt độ là yếu tố ảnh hưởng quan trọng trong lên men nói chung và lên men sinh
tổng hợp mannitol nói riêng, nó ảnh hưởng đến sự tăng trưởng, sinh tổng hợp của vi
khuẩn lactic trong quá trình lên men mà từ đó sản lượng mannitol được sản xuất ra nhiều
hay ít.
Falguni Patra và cộng sự (2011) khi nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá
trình lên men sản xuất mannitol của các chủng Leuconostoc cho thấy khi tăng nhiệt độ từ
25 – 350C thì hàm lượng mannitol sinh ra cũng tăng lên đáng kể, tuy nhiên nếu tăng nhiệt
độ cao hơn nữa thì hàm lượng mannitol giảm xuống. Một số nghiên cứu khác thì nhiệt độ
thường thích hợp nhất cho quá trình lên men chuyển hoá là 370C, điều đó cho thấy hoạt
tính của MDH thích hợp nhất ở 370C.
1.4.3.2. Ảnh hưởng của pH:
pH-một yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sinh tổng hợp mannitol.Trong quá

trình lên men sinh tổng hợp mannitol, pH giảm xuống thấp(do sản phẩm sinh ra không chỉ
có mannitol mà còn có các axit hữu cơ như axit lactic axit axetic) sẽ ngăn cản vi khuẩn
lactic hoạt động dẫn đến làm giảm hiệu suất lên men..
Điều này được giải thích rằng hệ enzyme MDH nội bào của mỗi vi khuẩn chỉ hoạt
động tối ưu trong một khoảng pH nhất định. Sự trao đổi chất của tế bào có thể bị chậm lại
khi hoạt tính enzyme giảm do tác động của pH.
Vì vậy ta thấy rằng pH là một trong những yếu tố quan trọng giữ vai trò quyết
định, cần phải kiểm soát nghiêm ngặt trong suốt quá trình lên men.

SVTH: Phạm Thanh Thủy,11-01

13


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Viện Đại Học Mở Hà Nội

1.4.3.3. Ảnh hưởng của thời gian:
Thời gian trong lên men sinh tổng hợp mannitol là một yếu tố quan trọng, thời gian
lên men phải thích hợp hay chính là thời gian tối thiểu để vi khuẩn lactic có thể chuyển
hóa tối đa hoặc hoàn toàn cơ chất fructose thành manitol.
Tùy vào từng chủng vi khuẩn lactic mà có thời gian lên men thích hợp, khoảng từ
24-72 giờ. Trong nghiên cứu, vi khuẩn lactic chúng tôi sử dụng có thời gian lên men thích
hợp là 48 giờ.
1.4.3.4. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất:
Nồng độ cơ chất ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất của vi khuẩn lactic, nồng
độ quá nhiều ảnh làm ảnh hưởng đến áp suất thẩm thấu của vi khuẩn, còn quá ít thì sản
lượng sảm phẩm tạo thành không đủ tính kinh tế. Việc tìm ra một nồng độ cơ chất thích
hợp là điều vô cùng cần thiết trong lên men.

1.5. VI KHUẨN LACTIC – ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU CỦA SINH TỔNG HỢP
MANNITOL.
1.5.1. Đặc điểm của vi khuẩn lactic:
Vi khuẩn lactic thuộc Lactobacillisaceae.
Vi khuẩn lactic là vi khuẩn Gram dương, không di động,không tạo bào tử (tuy
nhiên ngày nay người ta đã tìm thấy một số giống thuộc họ lactic có khả năng tạo bào tử).
Vi khuẩn lactic là vi khuẩn hô hấp tùy tiện (kị khí và hiếu khí) không chứa
cytochrom và enzym catalase, có khả năng sinh tổng hợp enzyme peroxydase rất mạnh,
chúng phân giải H2O2 để tạo ra H2OvàO2 để dùng.
Vi khuẩn lactic có dạng hình cầu hoặc hình que, đứng riêng lẻ hoặc tạo thành chuỗi
tùy theo từng chủng.
Nhiệt độ sinh trưởng tối ưu là 25-47ºC.
Có 4 cách chính phân loại vi khuẩn lactic thường được sử dụng:
1-Xét theo cách thức lên men, vi khuẩn lactic được chia thành hai nhóm là vi
khuẩn lactic lên men đồng hình và vi khuẩn lactic lên men dị hình.
2-Xét theo hình thái cấu trúc thì vi khuẩn lactic được chia ra hai nhóm:

SVTH: Phạm Thanh Thủy,11-01

14


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Viện Đại Học Mở Hà Nội

- Liên cầu khuẩn lactic (Streptococcus lactic): Tế bào hình tròn, oval, thường xếp
thành đôi hoặc thành chuỗi. Nhiệt độ phát triển tối ưu là 30-35ºC và được ứng dụng nhiều
trong sản xuất sữa chua, bơ, pho mát.
- Trực khuẩn lactic (Lactobacillus): Chúng đứng riêng lẻ hoặc kết thành chuỗi.

3-Xét theo tính mẫn cảm với oxy: gồm 3 nhóm chính là kỵ khí nghiêm ngặt, yếm
khí tùy tiện và vi hiếu khí.
4-Xét theo nhiệt độ phát triển tối ưu: gồm 2 nhóm là vi khuẩn lactic ưa ấm (25 –
35ºC) và ưa nhiệt (37 – 45ºC).
Vi khuẩn lactic sinh sản chủ yếu bằng phân chia tế bào, từ một tế bào mẹ ban đầu,
sau quá trình phân chia tạo ra hai tế bào con, các tế bào con có thể tách ra khỏi tế bào mẹ
hoặc dính liền với tế bào mẹ tạo thành chuỗi dài hay thành chùm. Thời gian sinh sản của
chủng này nằm trong khoảng 0,5 -2 giờ.
1.5.2. Nhu cầu dinh dưỡng cho sự phát triển của vi khuẩn lactic[2,3.4]:
Qua nhiều nghiên cứu người ta thấy rằng nhu cầu dinh dưỡng là một trong những
yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến kết quả lên men. Các loại vi khuẩn lactic khác nhau thì
có nhu cầu dinh dưỡng khác nhau. Chúng không chỉ có nhu cầu về các nguồn cơ chất
chứa các nguyên tố cở bản như cacbon, nitơ, photphat và lưu huỳnh mà còn có nhu cầu về
một số chất cần thiết khác như vitamin, muối vô cơ…
1.5.2.1. Nhu cầu về Cacbon:
Cacbon có trong tế bào chất, thành tế bào, trong tất cả các phân tử enzyme, axit
nucleic và các sản phẩm trao đổi chất. Khoảng một nửa chất khô của tế bào là cacbon, vì
vậy những hợp chất chứa cacbon có ý nghĩa hàng đầu trong sự sống của vi sinh vật.
Vi khuẩn lactic có thể sử dụng nhiều loại hydrat cacbon từ các monosaccarit
(glucoza, fructoza, manoza), các disaccarit (saccaroza, lactoza, maltoza) cho đến các
polysaccarit (tinh bột, dextrin).Chúng sử dụng nguồn cacbon này để cung cấp năng lượng,
xây dựng cấutrúc tế bào và làm cơ chất cho quá trình lên men tổng hợp các acid hữu cơ.
Tuy nhiên nhu cầu cacbon còn tùy thuộc vào loài vi khuẩn, chẳng hạn như
lactobacillus delbrueckii có thể sử dụng đường maltose, glucose, saccarose nhưng lại
không sử dụng được lactose, raffinose. Mà Lactobacillus bulgaricus có thể sử dụng

SVTH: Phạm Thanh Thủy,11-01

15

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Viện Đại Học Mở Hà Nội

lactose nhưng không sử dụng được maltose và saccarose, một số loại còn sử dụng
được cả dextrin. Trong quá trình lên men ngoài việc sử dụng các hợp chất chứa cacbon, vi
khuẩn lactic còn có thể sử dụng các axit amin như arginin, tizonin, gluconin làm nguồn
cung cấp năng lượng.
1.5.2.2. Nhu cầu về Nitơ :
Cũng như Cacbon, Nitơ cũng là thành phần hết sức quan trọng đối với sự sống của
vi sinh vật nói chung cũng như vi khuẩn lactic nói riêng. Nitơ có mặt trong mọi thành
phần quan trọng của tế bào như protein, enzyme, axit nuleic,... tất cả các quá trình sinh
trưởng và phát triển của vi sinh vật đều cần nitơ.
Phần lớn vi khuẩn lactic không thể sinh tổng hợp được các hợp chất chứa nitơ. Vì
vậy để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển chúng phải sử dụng các nguồn nitơ có
sẵn trong môi trường.
Các nguồn nitơ vi khuẩn lactic có thể sử dụng như: cao thịt, cao nấm men, trypton,
dịch thủy phân casein từ sữa, pepton,…Hiện nay cao nấm men là nguồn nitơ được sử
dụng nhiều nhất và có hiệu quả nhất. tuy nhiên ở quy mô công nghiệp không thể sử dụng
nguồn nitơ này vì rất tốn kém, mà người ta sẽ sử dụng cao ngô hay khô đậu tương,....
Mỗi loại vi khuẩn thì có một nhu cầu đặc trưng riêng, vì vậy ở nồng độ khác nhau
trong thành phần các nguồn bổ sung nitơ nói trên cho kết quả sinh tổng hợp khác nhau.
1.5.2.3. Nhu cầu về muối khoáng :
Để đảm bảo cho sinh trưởng và phát triển đày đủ, vi khuẩn lactic rất cần các muối
khoáng. Nhằm cung cấp các nguyên tố khoáng như đồng, sắt, natri, kali, photpho, lưu
huỳnh...
Phospho (P) bao giờ cũng chiếm tỷ lệ cao nhất, nó có vai trò quan trọng trong cấu
tạo nhiều thành phần của tế bào như : acid nucleic, phospholipid, các Coezyme như ATP,
ADP, NAD, NADH,… Các mối phospho vô cơ thường được sử dụng là KH2PO4 ,

K2HPO4,…
Lưu huỳnh (S) có mặt trong một số acid amin (metionin, sytein,…) và một số
vitamin (tiamin, bionin,…). Các acid amin này tham gia vào quá trình trao đổi chất ở vi
sinh vật, quá trình oxy hóa khử và hình thành cấu trúc protein. Lưu huỳnh thường được

SVTH: Phạm Thanh Thủy,11-01

16


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Viện Đại Học Mở Hà Nội

bổ sung dưới dạng các muối vô cơ hòa tan mà vi sinh vật có thể đồng hóa một cách dễ
dàng như MgSO4, MnSO4,….
Ngoài ra các nguyên tố khoáng khác có tác dụng tích cực lên sự phát triển và sinh
sản của vi khuẩn lactic như:
Mangan (Mn)có trong một số enzyme hô hấp với vai trò trong việc hoạt hóa một
số enzyme .
Magie (Mg) là nguyên tố vi sinh vật đòi hỏi khá cao, tham gia vào nhiều phản ứng
enzyme có liên quan đến quá trình phosphoryl hóa.
Canxi (Ca) có vai trò đáng kể trong việc xây dựng cấu trúc tế bào, đóng vai trò
trung gian cầu nối giữa các thành phần quan trọng trong tế bào sống.
Kẽm (Zn) tham gia vào nhiều quá trình enzm và có tác dụng đáng kể trong việc
hoạt hóa nhiều enzyme.
1.5.2.4. Nhu cầu về Vitamin
Vitamin đóng vai trò là các coenzyme trong quá trình trao đổi chất của tế bào, nên
rất cần thiết cho hoạt động sống. Tuy nhiên, đa số các loài vi khuẩn lactic không có khả
năng sinh tổng hợp vitamin. Vì vậy cần bổ sung vào môi trường các loại vitamin. Các

chất chứa vitamin thường sử dụng như nước chiết từ khoai tây, ngô, cà rốt hay dịch tự
phân nấm men…
1.5.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất.
1.5.3.1. Ảnh hưởng của oxy :
Vi khuẩn lactic là vi khuẩn hô hấp tùy tiện chúng không có hệ enzym hô hấp , tuy
nhiên chúng vẫn có thể sử dụng oxi phân tử để oxy hóa nhiều cơ chất, điều này được thể
hiện thông qua hệ FAD (Flavin Adenin Dinucleotid).
O2

+

2e

→

O2 2 –

Ion peroxit (O2 2 – ) sẽ phản ứng với H+ tạo thành H2O2 :
O2 2 – +

2H+

→

H2 O2

Nhưng H2O2 sinh ra lại gây độc với tế bào vì thế một số vi khuẩn lactic sử fungj
các chất oxy hóa như NAD, NADH để khử H2O2 trong hệ enzyme flavo enzyme:
NADH

+

H+ +

H2 O2 →

SVTH: Phạm Thanh Thủy,11-01

H2 O +

NAD+
17


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Viện Đại Học Mở Hà Nội

Như vậy sự có mặt nhiều O2 là hoàn toàn không có lợi cho vi khuẩn lactic, một số
vi khuẩn chỉ sử dụng một lượng rất ít oxy để oxy hóa một số cơ chất(vi khuẩn vi hiếu khí)
còn hầu hết là hợt động trong điều kiện yếm khí(kỵ khí bắt buộc). Do đó trong toàn bộ
quá trình lên men từ khâu phân lập, sàng lọc đến giữ giống, nhân giống và lên men đều
tiến hành nuôi cấy trong môi trường thế tĩnh hay khi giữ giống phải để ống thạch đứng
nhằm tạo bề mặt tiếp xúc oxy nhỏ nhất.
1.5.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ :
Nhiệt độ có ảnh hưởng trực tiếp đến các phản ứng sinh hóa xảy ra trong tế bào vi
sinh vật. Xét đặc tính lí hóa sinh của vi khuẩn người ta chía chúng thành hai nhóm: loại
ưa nhiệt phát triển tối ưu trong khoảng 40 – 50ºC : loại ưa ấm khoảng phát triển tối ưu là
20 - 40ºC.
Xác định nhiệt độ phát triển tối ưu của từng loài là rất quan trọng, điều này quyết

định cả quá trình lên men. Nhiệt độ cao vượt quá ngưỡng cho phép sẽ làm biến tính
protein, làm mất hoạt tính của ezyme; nhiệt độ thấp sẽ làm bất hoạt các quá trình vận
chuyển chất hòa tan qua màng tế bào chất do thay đổi cấu trúc của một số permaza chứa
trong màng và ảnh hưởng đến sự hình thành và tiêu thụ ATP cho quá trình vận chuyển
chủ động các chất dinh dưỡng. Do đó trong quá trình lên men phải giữ nhiệt độ ổn định.
Trong lên men ở phạm vi phòng thí nghiệm người ta sử dụng tủ nuôi ấm, còn trong phạm
vi công nghiệp thì sử dụng dòng nước tuần hoàn để kiểm soát nhiệt độ, và còn sử dụng
cánh khuấy để phân tán đều nhiệt.
1.5.3.3. Ảnh hưởng của pH:
pH là số đo hoạt tính của ion hydrogen trong môi trường. Thang pH thay đổi từ 014, pH có ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. Mỗi vi sinh vật
đều có một phạm vi pH nhất định và pH sinh trưởng tốt nhất. Vi sinh vật ưa acid có pH
phát triển tốt nhất.
Sự phát triển của vi sinh vật chỉ có thể rất nghiêm ngặt ở axit hay kiềm. Đối với vi
khuẩn thuận lợi nhất là chúng phát triển trong môi trường trung tính hoặc kiềm yếu. Đối
với nấm men và nấm mốc thì phát triển ở môi trường axit yếu.

SVTH: Phạm Thanh Thủy,11-01

18


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Viện Đại Học Mở Hà Nội

1.5.3.4. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất:
Các thành phần dinh dưỡng được bổ sung một cách đầy đủ vào môi trường để vi
khuẩn lactic phát triển và sinh tổng hợp mannitol là rất quan trọng. Tuy nhiên việc bổ
sung với hàm lượng bao nhiêu ở nồng độ nào là thích hợp có liên quan mật thiết đến áp
suất thẩm thấu của màng tế bào chất của vi khuẩn.

1.5.3.5. Một số ảnh hưởng khác :
Ảnh hưởng của hàm lượng giống: số lượng tế bào ban đầu có ảnh hưởng rất lớn
đến quá trình lên men sinh tổng hợp, vì vậy hàm lượng giống ban đầu là rất cần thiết để
đảm bảo cho quá trình lên men đạt hiệu suất cao đồng thời gây ức chế cho các vi sinh vật
tạp nhiễm có hại khác.
Ảnh hưởng của chất kích thích tăng trưởng và các chất ức chế có trong nguồn
nguyên liệu: cần loại bỏ các tạp chất có hại.

SVTH: Phạm Thanh Thủy,11-01

19


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Viện Đại Học Mở Hà Nội

PHẦN 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN LIỆU.
2.1.1. Chủng vi sinh vật.
Chủng vi khuẩn được dùng trong nghiên cứu là chủng vi khuẩn lactic thuộc bộ sưu
tập chủng giống của Viện Công nghệ Thực phẩm.
2.1.2. Nguyên liệu dùng trong nghiên cứu.
2.1.1.1. Nguồn Cacbon:
Hydratcacbon là nguyên liệu truyền thống của ngành công nghiệp lên men nói
chung và lên men sản xuất mannitol nói riêng.
Đường fructose, đây là nguyên chính để sản xuất mannitol.
Đường glucose, là nguyên liệu cần cho sự phát triển của vi khuẩn lactic.
Ngoài ra còn có đường saccarose, maltose, rỉ đường, xiro HF (Thái Lan),…..
2.1.2.2. Nguồn nitơ:

Peptone, cao nấm men, cao ngô,…..
2.1.3. Hóa chất dùng trong nghiên cứu.
Bảng 2.1: Tên hóa chất dùng trong nghiên cứu.
STT

Tên hóa chất

Xuất xứ

1

Ferixyanua kali – K3Fe(CN)6

Trung Quốc

2

Kali hydroxit – KOH

Trung Quốc

3

Methylen xanh 0.5%

Trung Quốc

4

Tween 80

Trung Quốc

5

Amonium Citrat

Trung Quốc

6

MgSO4

Trung Quốc

7

KH2PO4

Trung Quốc

8

MnSO4

Trung Quốc

9

Natri acetat – CH3COONa

Trung Quốc

10

NaOH

Trung Quốc

SVTH: Phạm Thanh Thủy,11-01

20