Nghiên cứu quy trình tinh sạch hoạt chất ACARBOSE từ chủng ACTINOPLANES SP, KCTC 9161 và đánh giá độc tính cấp của ACARBOSE trên chuột thực nghiệm

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TINH SẠCH HOẠT CHẤT ACARBOSE
TỪ CHỦNG ACTINOPLANES SP. KCTC 9161 VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỘC
TÍNH CẤP CỦA ACARBOSE TRÊN CHUỘT THỰC NGHIỆM

Giáo viên hướng dẫn:TS. Đỗ Thị Tuyên
Sinh viên thực hiện: Trần Ngọc Bích

Hà Nội - 2015


VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TINH SẠCH HOẠT CHẤT ACARBOSE
TỪ CHỦNG ACTINOPLANES SP. KCTC 9161 VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỘC
TÍNH CẤP CỦA ACARBOSE TRÊN CHUỘT THỰC NGHIỆM

Giáo viên hướng dẫn

: TS. Đỗ Thị Tuyên

Sinh viên thực hiện

: Trần Ngọc Bích

Lớp

:11-01 YTMT

Luận văn được thực hiện tại Phòng CNSH Enzyme, Viện CNSH

Hà Nội - 2015


LỜI CÁM ƠN
Em xin chân thành cảm ơn TS. Đỗ Thị Tuyên, Phòng Công nghệ sinh học
enzyme, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
đã tạo mọi điều kiện tốt nhất về hóa chất, trang thiết bị thí nghiệm cũng như tận
tình chỉ bảo hướng dẫn động viên em sửa bài luận để có thể làm tốt khóa luận này.
Và em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Th.S Lê Thanh Hoàng và tập thể cán
bộ phòng CNSH Enzyme đã hướng dẫn giúp đỡ bảo ban em rất nhiều trong suốt
quá trình làm luận văn.
Trong thời gian theo học tại Khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại Học Mở Hà
Nội, các thầy cô đã tận tình dạy dỗ, truyền đạt cho em và những bạn sinh viên
những kiến thức quý báu. Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến các thầy cô.
Cuối cùng, em xin được cám ơn gia đình, những người bạn bè thân thiết nhất
luôn bên em động viên em trong suốt thời gian học tập đặc biệt là bố mẹ luôn luôn
bên cạnh hỗ trợ em những lúc khó khăn nhất.
Dù đã có nhiều cố gắng, song luận văn có thể có những thiếu sót. Kính mong
nhận được sự chia sẻ và những đóng góp quý báu của các thầy cô giáo.
Em xin trân trọng cảm ơn và gửi lời chúc sức khỏe và công tác tốt đến các quý
thầy cô!
Hà Nội, tháng 6 năm 2015
Sinh viên

Trần Ngọc Bích

i


MỤC LỤC
LỜI CÁM ƠN ..........................................................................................................i
MỤC LỤC ..............................................................................................................ii
BẢNG KÍ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT ......................................................................... iv
DANH MỤC CÁC BẢNG ...................................................................................... v
DANH MỤC HÌNH VẼ ......................................................................................... vi
MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1
CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................... 3
1.1

Bệnh đái tháo đường .................................................................................. 3

1.2

Giới thiệu chung về acarbose...................................................................... 5

1.2.1

Khái niệm ............................................................................................ 5

1.2.2

Cấu trúc ............................................................................................... 5

1.2.3

Nguồn gốc ........................................................................................... 7

1.2.4

Cơ chế hoạt động ................................................................................. 7

1.3

Tác dụng của acarbose................................................................................ 8

1.4

Vai trò của Actinoplanes trong sinh tổng hợp Acarbose.............................. 9

1.4.1

Đại cương về chi Actinoplanes ............................................................ 9

1.4.2

Đặc điểm xạ khuẩnActinoplanes sp.................................................... 10

1.5

Ứng dụng của acarbose trong việc điều trị bệnh ĐTĐ type 2 .................... 12

1.6

Tình hình nghiên cứu acarbose trên Thế Giới ........................................... 13

1.7

Tình hình nghiên cứu acarbose ở Việt Nam .............................................. 16

CHƯƠNG 2:PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................................... 18
2.1

Chủng giống ............................................................................................. 18

2.2

Thiết bị dụng cụ thí nghiệm ...................................................................... 18

ii


2.2.1

Dụng cụ, thiết bị ................................................................................ 18

2.3

Hóa chất ................................................................................................... 18

2.4

Môi trường nuôi cấy ................................................................................. 19

2.5

Đệm và dung dịch .................................................................................... 19

2.6

Phương pháp ............................................................................................ 20

2.6.1

Nuôi cấy vi sinh vật ........................................................................... 20

2.6.2

Tách chiết và tinh sạch sơ bộ ............................................................. 20

2.6.3

Sắc ký bản mỏng TLC ....................................................................... 21

2.6.4

Xác định hoạt tính ức chế α-glucosidase ............................................ 21

2.6.5

Tinh sạch acarbose từ than hoạt tính .................................................. 22

2.6.6

Kết tinh sản phẩm .............................................................................. 22

2.6.7

Đánh giá độ bền của sản phẩm sau các điều kiện bảo quản. ............... 23

2.6.8

Đánh giá độc tính cấp của hoạt chất acarbose trên chuột thực nghiệm....
.......................................................................................................... 23

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 24
3.1

Lên men sinh tổng hợp acarbose............................................................... 24

3.2

Tinh sạch qua cột than hoạt tính ............................................................... 25

3.2.1

Tinh sạch qua cột than lần 1 ............................................................... 25

3.2.2

Tinh sạch qua cột than lần 2 ............................................................... 26

3.3

Cô đặc, kết tinh sản phẩm đường acarbose ............................................... 27

3.4

Đánh giá độ bền sản phẩm acarbose ......................................................... 29

3.5

Đánh giá độc tính cấp của hoạt chất acarbose trên chuột nhắt trắng .......... 30

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................... 32
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 33

iii


BẢNG KÍ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT
A.

Actinoplanes

ĐTĐ

Đái tháo đường

NTP

N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine

pNPG

p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside

Rf

Độ di động

TLC

Thin layer chromatography
(Sắc ký lớp mỏng)

et al.

Cộng sự (cs)

WHO

World Health Organization (tổ chức y tế thế giới)

RT

Room temperature

iv


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Danh sách thiết bị sử dụng trong thí nghiệm .................................................... 18
Bảng 2.2. Danh sách các hóa chất được sử dụng trong thí nghiệm ................................... 19
Bảng 2.3. Các loại môi trường trong thí nghiệm .............................................................. 19

Bảng 2.4. Danh sách các dung dịch và đệm chính sử dụng trong thí nghiệm.................... 19
Bảng 3.1. Độ bền hoạt tính và cảm quan sản phẩm acarbose sau 6 tháng ......................... 29
Bảng 3.2.Kết quả nghiên cứu độc tính cấp theo liều của bột nguyên liệu acarbose........... 31

v


DANH MỤC HÌNH VẼ
Hình 1.1.Công thức cấu tạo của acarbose .......................................................................... 6
Hình 1.2. Cấu trúc phân tử acarbose ................................................................................. 6
Hình 1.3. Xạ khuẩn chi Actinoplanessp. ............................................................................ 7
Hình 1.4. Acarbose ức chế cạnh tranh quá trình thủy phân tetrasaccharide bởi .................. 8
α-glucosidase trong ruột non ............................................................................................. 8
Hình 1.5. Khuẩn lạc chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 trên môi trường thạch ............. 11
Hình 1.6. Hình thái khuẩn lạc chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 trong môi trường lỏng.
........................................................................................................................................ 11
Hình 3.1. Hình thái chủng xạ khuẩn Actinoplanes sp. KCTC 9161.................................. 24
Hình 3.2. Sắc ký đồ TLC mẫu acarbose sinh tổng hợp từ chủng Actinoplanes KCTC 9161
........................................................................................................................................ 25
Hình 3.3. Sắc ký đồ TLC các phân đoạn tinh sạch acarbose từ dịch lên men chủng
Actinoplanes sp. KCTC-9161 khi qua cột than hoạt tính 1. ............................................. 26
Hình 3.4. Sắc ký đồ TLC các phân đoạn tinh sạch acarbose khi qua cột than hoạt tính 2 . 27
Hình 3.5. Quá trình cô đặc và kết tính sản phẩm đường acarbose. ................................... 27
Hình 3.6. TLC kiểm tra sản phẩm acarbose tinh sạch ...................................................... 28
Hình 3.7. Quy trình lên men và tinh sạch acarbose từ chủng Actinoplanes sp. KCTC-9161
........................................................................................................................................ 28
Hình 3.8. Sản phẩm acarbose sau các tháng bảo quản ..................................................... 30

vi

Trần Ngọc Bích

Khoa Công nghệ Sinh học

MỞ ĐẦU
Đái tháo đường (ĐTĐ) là một bệnh phổ biến. Nó ảnh hưởng đến hàng triệu
người cả nam và nữ, ở mọi lứa tuổi, mọi tầng lớp xã hội. Gánh nặng bệnh tật do
ĐTĐ đang tăng lên trên toàn cầu, đặc biệt ở các nước đang phát triển, trong đó có
Việt Nam – nơi quá trình đô thị hóa đang làm thay đổi tập quán ăn uống, giảm hoạt
động thể lực và tăng cân.
Theo thống kê của Tổ chức y tế Thế giới (WHO), cứ mỗi ngày có 3600 bệnh
nhân ĐTĐ mới được chẩn đoán. Theo thông tin mới nhận (báo sức khỏe đời sống
sau ngày 29/5/2015) hiện nay trên thế giới có khoảng 382 triệu người bệnh ĐTĐ, số
người mắc ĐTĐ type 2 chiếm khoảng 90%. Ước tính đến năm 2035, con số này sẽ
tăng lên tới 592 triệu. Tỷ lệ người mắc bệnh tăng nhanh ở các nước phát triển là
42% và ở các nước đang phát triển là 170%. Việt Nam là nước có tốc độ tăng nhanh
nhất thế giới. Trong 10 năm qua, số người mắc bệnh ĐTĐ tăng 211% và lên đến 5,1
triệu người tử vong trong 2013. Và trong số đó 80 % người bị bệnh ĐTĐ sống ở
những nơi thu nhập thấp và trung bình, 11% tổng chi tiêu về y tế trên thế giới được
cho là do chi phí liên quan đến bệnh đái tháo đường. ĐTĐ là một căn bệnh hết sức
nguy hiểm bởi những biến chứng của nó. Tại Việt Namcó khoảng50%bệnh nhân
mắc bệnh này phát hiện bệnh khi bệnh đã nặng với nhiều biến chứng như tim mạch,
thận, mắt, thần kinh ngoại…Triệu chứng ĐTĐ diễn ra âm thầm khiến người bệnh
khó phát hiện đến khi xảy ra biến chứng mới đi chữa trị gây khó khăn tốn kém cho
người bệnh,gia đình và xã hội.
Hiện nay,thuốc điều trị ĐTĐ rất đa dạng.Có các hướng điều trị như tăng khả
năng sử dụng insulin củatế bào, giảm khả năng phân giải đường thành glucose ở
ruột non. Tuy nhiên, trong các hướng điều trị trên,hướng điều trị giảm khả năng
phân giải đường thành glucose đang là giải pháp tốt hiện nay.Chất đang được ưu

tiên nhất vẫn là acarbose - một hợp chất hữu cơ giả đường có nguồn gốc từvi sinh
vật. Đặc biệt là xạ khuẩn Actinoplanes sp. Xạ khuẩn sinh trưởng nhanh hiệu quả
cao ngoài ra còn sử dụng các nguyên liệu dễ kiếm nên giá thành sẽ thấp hơn.Xuất
phát từlí do trên,chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu quy trình tinh sạch hoạt
chất acarbose từ chủng Actinoplanes sp. và đánh giá độc tính cấp của acarbose trên
Khóa luận tốt nghiệp – 20151


Trần Ngọc Bích

Khoa Công nghệ Sinh học

chuột thực nghiệm” trong khuôn khổ đề tài “Nghiên cứu quy trình công nghệđiều
chế acarbose làm nguyên liệu thuốc chữa bệnh đái tháo đường” do TS.Đỗ Thị
Tuyên làm chủ nhiệm vớimục tiêu: (1) xây dựng được quy trình tinh sạch hoạt chất
acarbose (2) nghiên cứu độ bền sản phẩm và (3) đánh giá được độc tính cấp của sản
phẩm acarbose.

Khóa luận tốt nghiệp – 20152


Trần Ngọc Bích

Khoa Công nghệ Sinh học

CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Bệnh đái tháo đường
Đái tháo đường là căn bệnh đầy thách thức ảnh hưởng đến hàng triệu người
trên thế giới. Nếu không kiểm soát được, nó sẽ dẫn đến suy giảm sức khỏe và các
vấn đề nghiêm trọng khác. Đái tháo đường là một bệnh mãn tính trong đó cơ thể

không sản xuất đủ insulin, hay không thể sử dụng insulin. Thông thường, các loại
tinh bột,chất đường và các chất dinh dưỡng khác được phân tách thành glucose, và
được máu chuyển đến các tế bào. Các tế bào sử dụng insulin, một chất nội tiết tố
(hormone) do tuyến tụy tiết ra, giúp chuyển hóa glucose thành năng lượng. Nếu
không có đủ insulin, hay insulin không được sử dụng đúng, glucose sẽ tăng lên
trong máu và nước tiểu, điều này sẽ gây nên rất nhiều vấn đề về sức khỏe. Nguyên
nhân của bệnh Đái tháo đường hiện vẫn chưa được xác định rõ ràng. Có thể là do
mối quan hệ gia đình, chẳng hạn nếu cha mẹ bị đái tháo đường thì con của họ sẽ dễ
bị đái tháo đường hơn. Một nguyên nhân khác đó là lối sống, bao gồm chế độ ăn và
tập luyện, cũng giữ một vai trò quan trọng. Đái tháo đường type 2 có khuynh hướng
dễ xảy ra hơn ở người thừa cân.
Đái tháo đường đang phát triển mạnh và gây ảnh hưởng đến 285 triệu người
trưởng thành trên thế giới – chiếm 6,4% dân số trưởng thành trên toàn cầu. Đến
2030, con số này được dự báo tăng lên đến 438 triệu người hay 7,8% dân số trưởng
thành trên toàn cầu. Căn bệnh này làm hao tổn chi phí của những người mắc bệnh.
Bên cạnh hàng trăm trường hợp tử vong, bệnh đái tháo đường còn có thể làm suy
yếu chức năng của tim, thận, mắt, và thần kinh. Đái tháo đường thường đi kèm với
bệnh tim, đột quỵ, tăng huyết áp, bệnh thận, mù mắt, tổn thương thần kinh, và đoạn
chi. Đái tháo đường tạo ra những gánh nặng kinh tế do gia tăng tỷ lệ mắc bệnh mới
và số lượng các thương tật liên quan cùng xuất hiện. Hiện nay, người ta ước tính chi
phí chăm sóc y tế hàng năm trên toàn thế giới cho bệnh nhân đái tháo đường vào
khoảng 223 tỷ đô-la, con số này đang tiếp tục tăng lên theo tỷ lệ mắc bệnh đái tháo
đường mới. Hội Đái tháo đường quốc tế (IDF) ước tính chi tiêu cho bệnh đái tháo
đường trên toàn thế giới tối thiểu sẽ là 561 tỷ đô-la vào năm 2030.

Khóa luận tốt nghiệp – 20153


Trần Ngọc Bích

Khoa Công nghệ Sinh học

Những người bị đái tháo đường type 1 bị thiếu insulin, có nghĩa là cơ thể sản
xuất không đủ insulin. Như vậy các loại chất bột, đường (carbohydrates) ăn vào
không được chuyển thành năng lượng. Có ít hơn 10% những người bị đái tháo
đường là type 1, và phần lớn các trường hợp được chẩn đoán là trẻ em và người trẻ
trưởng thành.
Những người bị đái tháo đường type 2 bị đề kháng với insulin. Cơ thể có thể
sản xuất một ít insulin nhưng nó không thể chuyển hóa được glucose. Khoảng 85%
đến 95% người bị đái tháo đường trên thế giới là type 2. Mặc dù đái tháo đường
type 2 trước đây thường xảy ra ở người lớn tuổi, trong những năm gần đây bệnh
thường xảy ra ở những người trẻ hơn và cả trẻ em.
Đái tháo đường trong thai kỳ là một ví dụ của đái tháo đường "có điều kiện".
Đái tháo đường "có điều kiện" xảy ra liên quan đến những tình trạng bệnh lý nào
đó, như là bệnh tuyến tụy, một số rối loạn di truyền, và mang thai. Tuy nhiên, dù chỉ
trong ngắn hạn, những phụ nữ bị đái tháo đường trong thai kỳ sẽ gia tăng nguy cơ
mắc bệnh đái tháo đường type 2 trong giai đoạn sau của cuộc đời.
Đái tháo đường type 1 có thể tiến triển nhanh, với các triệu chứng rõ ràng. Đái
tháo đường type 2 có xu hướng tiến triển chậm hơn, và các triệu chứng thường đi
kèm với các tình trạng bệnh lý khác.
Phát hiện sớm bệnh đái tháo đường giúp gia tăng cơ hội phòng ngừa hay làm
chậm xuất hiện các triệu chứng. Một số trong các triệu chứng kể trên có vẻ như bình
thường, nhưng nếu bạn thấy sự xuất hiện của chỉ một triệu chứng thôi thì cũng nên
nhờ đến sự đánh giá của nhân viên y tế.
Đặc điểm của ĐTĐ type 2 với những biểu hiện như đi tiểu nhiều, khát nước. Ở
một số trường hợp xảy ra hiện tượng sút cân mặc dù bệnh nhân ăn nhiều hơn. Do
không có đủ insulin để chuyển đường vào tế bào, các cơ quan không đủ năng lượng
dẫn tới hiện tượng đói và cơ thể cảm thấy mệt mỏi. Những biến chứng thường gặp
của bệnh đái tháo đường type 2 như nhồi máu cơ tim, tăng huyết áp, đục thủy tinh
thể, tăng nhãn áp, loãng xương, suy giảm thính giác, suy thận và tổn hại thần kinh.

Điều trị bệnh đái tháo đường type 2 đòi hỏi một quá trình điều trị suốt đời bao
gồm sự kết hợp của nhiều yếu tố.Mục tiêu điều trị là kiểm soát đường huyết ở mức
độ ổn định và ngăn ngừa biến chứng.
Khóa luận tốt nghiệp – 20154


Trần Ngọc Bích

Khoa Công nghệ Sinh học

Có các biện pháp trị ĐTĐ là:
Biện pháp không sử dụng thuốc:
Theo dõi thường xuyên lượng đường trong máu kết hợp với ăn uống hợp lý,
tập thể dục thường xuyên. Ăn uống thực phẩm lành mạnh, ít chất béo và calo có thể
giúp ngăn ngừa các biến chứng nghiêm trọng. Bên cạnh đó, hoạt động thể chất
khoảng 30 phút mỗi ngày, giúp giảm cân dư thừa, giữ trọng lượng cơ thể ở phạm vi
vừa phải có thể làm giảm nguy cơ bệnh đái tháo đường.
Thuốc điều trị ĐTĐ thường type 2 gồm các nhóm sau:
-

Kích thích tụy tạng tiết thêm insulin(Sulfonylureas, repaglinide)

-

Cản trở gan đưa thêm đường vào máu(Metformin, Sulfonylureas)

-

Giúp cho đường đi vào tế bào dễ dàng hơn (Rosiglitazone)

-

Giảm hấp thu đường qua đường ruột(Acarbose)

Trong đó,nhóm thuốc tăng tiết insulin giảm tác dụng theo thời gian,dễ gây
tăng cân và hạ đường huyết,còn nhóm nhóm thứ 2nguy cơ nhiễm acid lactic theo
mức độ suy giảm chức năng thận,có nhóm thuốc acarbose là không làm tăng lượng
đường trong máu,ượng đường huyết ở người tiểu đường giảm đáng kể sau khi
ăn,bảo tồn tế bào β,không gây dụng nạp lactose... Nhóm này đang là hướng nghiên
cứu chủ yếu hiện nay.
1.2 Giới thiệu chung về acarbose
1.2.1 Khái niệm
Acarbose là một hợp chất hữu cơ giả đường pseudo-oligosaccharide.
Acarboseức chế các enzyme trong ruột có khả năng phân giải các hợp chất đường
phức tạp thành đường đơn là dạng có thể hấp thụ được. Vì vậy, acarbose được sử
dụng rộng rãi trong việc điều trị bệnh ĐTĐ type 2.
1.2.2 Cấu trúc
Acarbosecó công thức cấu tạo: C25H43NO18, khối lượng phân tử: 645,605
g/mol,tên

hóa

học:

O{4,6-dideoxy-4[1S-(1,4,6/5)-4,5,6-trihydroxy-3-

hydroxymethyl-2-cyclohexen-1-yl]-amino-α-D-gluco-pyranosyl}-(1→4)-O-α-Dglucopyranosyl-(1→4)-D-gluco-pyranose.
Khóa luận tốt nghiệp – 20155

Trần Ngọc Bích

Khoa Công nghệ
ngh Sinh học

Hình 1.1.Công
1.
thức cấu tạo của acarbose

Acarbose thuộcc nhóm C7 N-aminocyclitol.
N
Acarbose gồm
m 2 thành ph
phần, một
phân tử acarviosin gắnn vvới một phân tử maltose. Acarviosin là thành ph
phần quan
trọng nhất trong cấu
u trúc của
c acarbose, nó gồm mộtt nhóm valienamine, m
một vòng
cyclohexitol liên kết vớ
ới nhóm 4-amino-4,6-dideoxyglucose.
dideoxyglucose. Chính nh
nhờ phân tử
acarviosin này mà acarbose có kh
khả năng ức chế cạnh tranh vớii các enzyme trong
ruột (Lee et al. 1997).
Acarbose là mộtt ch
chất ức chế cạnh
nh tranh oligosaccharide, bbởi vì bản thân

acarbose cũng tồn tạii liên kết
k α-1,4. Một ví dụ so sánh giữ
ữa acarbose và
maltotetraose, một chấtt tươ
tương tự acarbose.

Hình 1.2. Cấu trúc phân tử acarbose

Mũi tên đánh dấấu sự khác biệt giữaa maltotetraose và acarbose: nhóm
hydroxyl C6 ở đường
ng B bị
b vắng mặt. Liên kết O-glycoside giữa đơn vvị đường A và
B được thay thế bởii liên kết
k N-glycoside. Vị trí O5 của đường A đư
được thay thế bởi
một nguyên tử carbon (C7) và liên kết
k đôi hình thành giữaa C5 và C7.

Khóa luận tốt nghiệp – 20156


Trần Ngọc Bích

Khoa Công nghệ
ngh Sinh học

1.2.3 Nguồn gốc
Acarboseđượcc tìm thấy
th lần đầu tiên vào cuối những năm
m 1960, ttừ các chủng

Actinoplanes sp. đượcc phân llập trong mẫu đất trồng cà phê ở Ruiru, Kenya. Cho
đến nay, acarbose chỉ được
đư tìm thấy ở vi sinh vật, chúng được mộột số loài tiết ra
nhằm ức chế sự phát triểển của các sinh vật xung quanh bằng
ng cách tác động vào quá
trình hấp thụ đường củaa nh
những loài này.
Trong

tự

nhiên,

acarbose

được

tổng

hợp

bởi

Actinoplanesvà

Streptomyces(Hemker
(Hemker et al. 2001)là
2001) hai chi của xạ khuẩn. Xạ khuẩnn là m
một nhóm vi
khuẩn phânbố rộng

ng rãi trong tự
t nhiên, có thể tìm thấy ở ðất, nýớcc và các loài thực
th
vật.
t. Chúng là các vi khuẩn
khu Gram dương, có tỉ lệ (%G+C) trong DNA cao. M
Mặc dù
là sinh vật nhân sơ nhưng
ưng chúng thường
th
sinh trưởng dưới dạng sợii và có nhi
nhiều bào
tử. Đa số các xạ khuẩn đềều có khả năng sinh kháng sinh.
Xạ khuẩn thuộcc chi Actinoplanes phát triển dưới dạng sợii phân nhánh, hiếu
hi
khí, hóa dị dưỡng, ưa ẩm.
m. Những
Nh
nghiên cứu hiện nay thường tậpp trung vào chi
Actinoplanes, đặc biệtt là ch
chủng Actinoplanes sp. SE50 (Goeke et al. 1996)vì
1996) đây là
chủng có khả năng
ng sinh acarbose cao và không
khôn gây hại.

Hình 1.3. Xạ khuẩn chi Actinoplanessp.

1.2.4 Cơ chế hoạt động
ng

Chất ức chế cạnh
nh tranh là những
nh
phân tử có tác dụng ức chế enzyme, th
thường
có cấu trúc giống vớii các cơ
c chất, do đó có khả năng liên kết vớii trung tâm hoạt
ho
động của enzyme, chiếm
m chỗ
ch của cơ chất. Vì vậy, chúng có khả năng
ăng làm gi
giảm tốc
độ phản ứng của cơ chấtt bằng
b
cách làm giảm số lượng
ng enzyme có kh
khả năng kết hợp
với cơ chất. (Lê Ngọcc Tú 2000,
2000 Phạm Thị Trân Châu và Trần Thị Áng 2009)
2009).
Acarbose cũng làà m
một chất như vậy. Acarbose có cấu tạo tương
ương đối giống với
một tetrasaccharide:đềuu gồm
g
bốn đơn phân, các đơn phân liên kếtt vvới nhau bằng
liên kết α-1,4. Trong cơ
ơ thể,
th tinh bột và một số loại đường bị α-amylase

amylase tuy
tuyến tụy
Khóa luận tốt nghiệp – 20157


Trần Ngọc Bích

Khoa Công nghệ
ngh Sinh học

thủy
y phân thành oligosaccharide, ở màng ruột non, α-glucosidase tiếpp ttục thủy phân
oligosaccharide, disaccharide thành glucose và các đường đơnn khác, làm ttăng lượng
đường trong máu. Bảnn chất
ch của các enzyme này lả có khả năng cắtt đđứt liên kết α1,4 giữa các đơnn phân trong các phân tử
t đường.
Do sự tương đồng
ng về
v cấu trúc và kích thướcc nêu trên, acarbose có th
thể dễ dàng
liên kết với α-glucosidase
glucosidase hay α-amylase. Các liên kế này tồn tạii trong trong 44-6
giờ, làm giảm tốc độ thủy
th phân các phân tử đường phức tạp.
p. Vì vvậy, bệnh nhân
ĐTĐ có thể tránh đượcc hiện
hi tượng tăng đường huyết đột ngộtt sau khi ăn. Cơ chế
hoạt động củaa acarbose được
đư minh họa ở hình 1.4 (Wehmeier and Piepersberg
2004; Mori et al. 2011).

Hình 1.4. Acarbose ức chế cạnh tranh quá trình thủyy phân tetrasaccharide bởi
α-glucosidase trong ruột non

1.3 Tác dụng củaa acarbose
Acarbose có rấtt nhi
nhiều ưu điểm trong việc điều trị bệnh ĐTĐ.
Đ. Do ccơ chế tác
động không ảnh hưởng
ng đến
đ insulin, acarbose không làm làm tăng
ăng insulin huy
huyết,
không gây đề kháng insulin, bảo
b tồn tế bào beta tuyến tụy, giảm nồồng độ HbA1c,
triglyceride.
Acarbose không
ông có khả
kh năng ức chế β-glucosidase (lactase), do đó sẽ không
gây ra hiện tượng không dung nạp lactose (Hanefeld et al. 2008). Bởi cơ chế tác
động làm giảm nồng độ đường huyết là khác nhau, acarbose có thể được dùng đơn
hoặc kết hợp vớii các thuốc
thu trị liệu khác như sulfonylurea, metformin ho
hoặc insulin
để điều trị bệnh ĐTĐ type 2(Piñol
2
et al. 2007).
Khóa luận tốt nghiệp – 20158

Trần Ngọc Bích

Khoa Công nghệ Sinh học

Bên cạnh ứng dụng trong điều trị ĐTĐ type 2 acarbose còn được thử nghiệm
để sản xuất nhiều loại thuốc phòng và chữa bệnh khác như: béo phì, mỡ máu,dạ
dày,bệnh mục xương ở người hoặc dùng trong chăn nuôi để tăng tỉ lệ thịt và mỡ
trong vật nuôi(Frommer et al. 1975).
Acarbose còn có tác dụng giảm nguy cơ tim mạch .Một số nghiên cứu dịch tễ
học đã chỉ ra rằng tăng đường huyết sau ăn có liên quan đến nguy cơ mắc bệnh tim
mạch. Các nghiên cứu so sánh hiệu quả điều trị bằng acarbose và glimepiride đối
với hàm lượng licoprotein trong huyết thanh ở bệnh nhân ĐTĐ type 2 mới được
chuẩn đoán. Các bệnh nhân được chỉ định ngẫu nhiên để điều trị trong 12 tuần chia
thành 3 nhóm: Với acarbose, glimepiride, đối chứng ăn uống bình thường và kết
quả cho thấy acarbose đã làm giảm nguy cơ tim mạch (Hayashim et al. 2008).
1.4 Vai trò của Actinoplanes trong sinh tổng hợp Acarbose
1.4.1 Đại cương về chi Actinoplanes
Chi Actinoplanes pháttriển dưới dạng sợi phân nhánh, không đứt đoạn, Gram
dương, một phần sợi dinhdưỡng có thể là Gram âm, không nhuộm kháng acid, rất ít
sợi khí sinh hoặc không có, tạo nhiềuloại sắc tố có khả năng khuếch tán. Bào tử
chứa trong túi bào tử, sinh trên cuống sinh bào tử hoặckhông cuống, ít khi trong
thạch. Dưới điều kiện nhất định, nhiều chủng có hệ sợi sắp xếp dạng que(palisade).
Khi đó, túi bào tử chủ yếu được sinh ở đầu các sợi. Bào tử hình cầu hoặc que ngắn,
sắpxếp theo nhiều cách khác nhau bên trong túi bào tử, được hình thành bằng cách
đứt đoạn sợi bêntrong túi bào tử trực tiếp hoặc sau vài lần phân nhánh. Sau khi
ngâm trong nước, bào tử di độngđược giải phóng ra từ túi bào tử, trong một số
trường hợp, khả năng di động xuất hiện sau khi bàotử được giải phóng. Bào tử di
động chứa tiên mao cực. Thành tế bào chứa meso-2,6-diaminopimelic acid,
diaminopimelic

acid,

hydroxydiaminopimelic

và

LL -2,6-

glycine(Lechevalier

and

Lechevalier 1970).
ThànhphầnđườngchứaD-xylosevàLarabinose.Thànhphầnphospholipidchínhlàphosphatidylethanolamin. Hiếu khí, hóa dị
dưỡng hữu cơ, ưa ấm hoặc ưa nhiệt vừa phải. Hầu hếtcác chủng đều không cần các
nhân tố sinh trưởng hữu cơ. Tỷ lệ mol GC trong ADN là 72-73%.
Khóa luận tốt nghiệp – 20159


Trần Ngọc Bích

Khoa Công nghệ Sinh học

Loài chuẩn: Actinoplanes philippinensis(Couch 1950).
1.4.2 Đặc điểm xạ khuẩnActinoplanes sp.
Được phân lập năm 1969 trên vùng đất trồng cà phê ở Kenya,Châu Phi
(Schwientek 2012).
Xạ khuẩn Actinoplanes sp. KCTC 9161 thuộc:
Giới

: Bacteria

Ngành

: Actinobacteria

Lớp

: Actinobacteria

Bộ

: Actinomycetales

Họ

: Mycromonosporaceae

Chi

: Actinoplanes

Loài

: Actinoplanes sp.

(Vị trí phân loại theo khóa phân loại Bergey)
Đặc điểm hình thái:
Actinoplanes sp. KCTC 9161 gram dương, cấu tạo dạng sợi, các sợi liên kết
chặt chẽ với nhau tạo khuẩn lạc riêng rẽ, màu vàng cam, ở giữa khuẩn lạc phồng lên

phát triển các túi bào tử trong chứa nhiều bào tử. Bào tử có thể di động. Toàn bộ hệ
sợi xạ khuẩn là một tế bào có nhiều nhân,không có vách ngăn ngang, nhân đơn
giản,không có màng nhân (Nguyễn Lân Dũng 2006). Thành tế bào có chứa meso2,6-diaminopimelic acid,

LL-2,6-diaminopimelic

acid, hydroxydiaminopimelic acid

và glycine,tỷ lệ GC trong AND là 71,32%.
Xạ khuẩn sinh dưỡng bằng bào tử,phát triển mạnh trong điều kiện 25-28°C,
phát triển dạng sợi,phân nhánh,ưa ẩm.
Đặc điểm nuôi cấy gồm:
- Sinh trưởng trong môi trường hiếu khí
- Nhiệt độ nuôi cấy tối ưu là 25°C
- pH 6-8 là pH thích hợp để nuôi cấy

Khóa luận tốt nghiệp – 201510


Trần Ngọc Bích

Khoa Công nghệ Sinh học

Trên môi trường đĩa thạch, khuẩn lạc có dạng tròn,bề mặt nhẵn,có tâm phồng
lên,phát triển chậm.(Vì khuẩn lạc dạng sợi khó mọc trong đĩa thạch).Khuẩn lạc có
màu cam đường kính 1-2 mm. Sau 7-10 ngày bề mặt nhăn lan rộng.

Hình 1.5. Khuẩn lạc chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 trên môi trường đĩa thạch

Trên môi trường lỏng,chủng phát triển tốt,tạo thành các hạt pellet tròn,không

tan khi lắc lên,màu vàng cam,một số sắc tố cam tiết ra môi trường tạo môi trường
có màu cam.

Hình 1.6. Hình thái khuẩn lạc chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 trong môi trường lỏng.

Nhiều nghiên cứu cho thấy các chủng Actinoplanes có vai trò quan trọng trong việc
sản xuất hoạt chất acarbose với hoạt tính ức chế α-glucosidase. Dịch nuôi cấy chủng
Actinoplanessp. SE50 đã được công ty Bayer AG thử nghiệm với hoạt tính ức chế
amylase,maltase và saccharase trong ruột chuột (Frommer et al. 1975).
Vào năm 1977, Schmidet và cộng sự đã tìm thấy hỗn hợp oligosaccharide
trong dịch lên men trong đó có acarbose hiệu lực ức chế α-glucosidase (Schmidet et
al. 1997).
Khóa luận tốt nghiệp – 201511


Trần Ngọc Bích

Khoa Công nghệ Sinh học

Sau này chủng tự nhiên Actinoplanessp. khác được phân lập gọi là
Actinoplanessp. SE50/110 đã sản xuất acarbose lên tới 1g/L và từ đó chủng này
được sử dụng rộng rãi trong nhiều nghiên cứu về gene sinh tổng hợp acarbose,chức
năng mã hóa enzyme của nó (Schwientek 2012; Klein et al. 2013).
1.5 Ứng dụng của acarbose trong việc điều trị bệnh ĐTĐ type 2
Có hai hướng chính để điều trị bệnh ĐTĐ type 2 là:
- Tăng lượng insulinhay tăng độ nhạy cảm của insulin. (ví dụ như sulfonylurea
có tác dụng hạ đường huyết do ngăn cản tế bào tuyến tụy tạo ra glucagon, kích thích
tế bào beta ở tụy tiết ra insulin), các loại insulin tái tổ hợp hay insulin từ thực vật
chuyển gene.
- Giảm nồng độ đường huyết nhờ ngăn cản quá trình tiêu hóa và hấp thụ

carbohydate. Việc này có thể thực hiện bằng cách ức chế α-glucosidase trong ruột
non. Có rất nhiều hợp chất trong tự nhiên có tác dụng này như chất charantin trong
quả mướp đắng, chất 6-o-caffeoyl-sophorse trong các cây thuộc họ khoai lang.
Tuy nhiên hầu hết các chất này có nguồn gốc thực vật (một số từ nấm) khi
đem thử nghiệm trên động vật và người thì không mang lại hiệu quả cao. Một số
hợp chất được sử dụng làm thuốc điều trị bệnh hiện nay như: acarbose, miglitol,
voglibose, deoxynojirimycin có nguồn gốc từ vi khuẩnnhư Bacillusspp.(Quyền
Đình Thi and Vũ Văn Hạnh 2011).
Kể từ khi đượcphát hiện, acarbose đã được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi
trong việc điều trị bệnh ĐTĐ type 2. Ưu điểm của acarbose là không làm tăng
insulin huyết, không gây đề kháng insulin, bảo tồn tế bào beta, giảm nồng độ
HbA1c (hemoglobin glycosyl hóa), triglyceride và giảm các biến chứng do tiểu
đường. Acarbose không có hoạt tính ức chế chống lại lactase và do đó sẽ không gây
ra hiện tượng bất dung nạp lactose trong cơ thể (Hanefeld et al. 2008).
Ngoài ra, acarbose có thời gian bán hủy tương đối lâu, khoảng từ 6-8 giờ và
được chuyển hóa hoàn toàn trong ruột người.Các sản phẩm chuyển hóa chủ yếu là
dẫn xuất của 4-methylpyrogallol không độc.Một phần nhỏ được hấp thụ vào máu sẽ
được bài tiết qua đường nước tiểu.
Acarbose đã được sử dụng là thuốc điều trị ĐTĐ type 2, ở châu Âu và Trung
Quốc là Glucobay (Bayer AG), ở Bắc Mỹ là Precose(Bayer Pharmaceutical), và
Khóa luận tốt nghiệp – 201512


Trần Ngọc Bích

Khoa Công nghệ Sinh học

Prandase (Bayer AG) ở Canada. Ở nước ta Công ty Cổ phần Dược Hậu Giang sản
xuất viên nén có tên thương mại Glumeca.
Bởi cơ chế tác động làm giảm nồng độ đường huyết là khác nhau, acarbose

được dùng đơn hoặc có thể kết hợp với các thuốc trị liệu khác như sulfonylurea,
metformin hoặc insulin để điều trị bệnh ĐTĐ type 2.Ảnh hưởng của nó đến HbA1c
được kiểm tra và đánh giá.Trong nhóm đối chứng, nhóm điều trị bằng sulfonylurea
và nhóm metformin, hàm lượng HbA1c giảm một cách có ý nghĩa thống kê khi bổ
sung acarbose trong điều trị. Việc giảm có ý nghĩa thống kê trong
6 tháng và hiệu quả ổn định này kéo dài một năm(Piñol et al. 2007).
1.6 Tình hình nghiên cứu acarbose trên Thế Giới
Vào những năm 1970, các chất ức chế enzyme α-glucosidase có nguồn gốc
thực vật được lần đầu nghiên cứu và thử nghiệm. Tuy nhiên kết quả không khả quan
do các chất này không thể hiện hoạt tính trên cơ thể động vật. Cũng trong thời gian
này, những nghiên cứu đầu tiên về acarbose xuất hiện (Hanefeld et al. 2008).
Năm 2003, Choi và cộng sự đã phân lập được chủng vi sinh vật có khả năng
sinh tổng hợp acarbose cao. Chủng Actinoplanes sp. CKD485-16 được lên men sinh
tổng hợp acarbose với năng suất 2,3 g/L(Choi and Shin 2003).
Thực tế có rất ít công trình nghiên cứu về tối ưu môi trường lên men sinh tổng
hợp acarbose trên thế giới.Đáng kể nhất là công trình của Wei và cộng sự năm
2010, khi tối ưu môi trường lên men chủng Actinoplanes sp. A56 sinh tổng hợp.
Hàm lượng acarbose đạt được từ 837 đến 1043 mg/L (Wei et al. 2010).
Wang và cộng sự đã công bố mô hình nuôi cấy và lên men theo kiểu fed-batch
trên đối tượng A.utahensis ZJB-08196 vào năm 2012.Ông đã tối ưu áp suất thẩm
thấu và bổ sung cơ chất liên tục trong quá trình lên men kết quả làm tăng sản lượng
acarbose lên 4878 mg/L, tăng 15,9% so với phương pháp nuôi cấy chìm kiểu
cũ(Wang et al. 2012b).
Kế thừa thành tựu trên,vào chính năm 2012,Sun và đồng nghiệp của ông tiếp
tục nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes utahensis
ZJB- 08196 khi thêm SAM (S-adenosylmethionine) vào môi trường nuôi cấy. Kết
quả sau 192 giờ nuôi cấy lượng acarbose đạt tới 6113 mg/L
Khóa luận tốt nghiệp – 201513

Trần Ngọc Bích

Khoa Công nghệ Sinh học

Tiếp đến năm 2013,Xue và cs cũng tăng cường sản xuất acarbose và giảm bớt
sự tạo thành hợp chất C từ chủng đột biến A.utahensis ZJB-08196 bằng việc bổ
sung thêm validamine-chất hoạt hóa tạo thành acarbose trong quá trình lên men
giúp đạt nặng suất 6006 mg/L acarbose và 212 mg/L thành phần C sau 168 giờ (Xue
et al. 2013).
Vào năm 2014, Cheng và cộng sự của ông đã thực hiện một chiến lược lên
men thẩm thấu ca mới để cải thiện sản xuất acarbose và đồng thời làm giảm sản
phẩm phụ C từ quá trình lên men chủng xạ khuẩn Actinoplanes sp. A56. Hợp phần
C (Acarviosy-1,4-GLC-1,1-GLC) là một acarbose cấu tử cao,và có thể được phần
lớn được hình thành trong quá trình lên men acarbose làm cho việc thanh lọc
acarbose là rất khó khăn. Bằng cách lựa chọn mức độ thẩm thấu như tham số quá
trình lên men chính của acarbose sản xuất từ chủng Actinoplanes sp. A56 làm thành
phần C đã giảm từ 498,2 ± 27,1 xuống 307,2 ± 9,5 mg /L, và năng suất acarbose tối
đa đã được tăng từ 3,431.9 ± 107,7 đến 4,132.8 ± 111,4 mg /L (Cheng, et al., 2014).
Trong dịch lên men sinh tổng hợp acarbose từ chủng xạ khuẩn chi
Actinoplanes sp. thì ngoài chứa thành phần acarbose ra nó còn chứa các loại đường
khác và tạp chất nên khi ta loại được hết các loại đường và tạp chất trong dịch lên
men sẽ thu được acarbose có độ tinh sạch cao.
Trên thế giới có rất nhiều nghiên cứu về phương pháp tinh sạch acarbose hiện
nay.Vào năm 1949,Whistler và Durso đã dùng than hoạt tính để tách
glucose,maltose,rafinose ra khỏi hỗn hợp.Than hoạt tính sẽ hấp thụ đường và phản
hấp phụ từng loại đường theo gradient ethanol 0-15%.chất nào có ái lực yếu hơn sẽ
bị đẩy ra ở nồng dộ thấp hơn và ái lực cao nhất sẽ được đưa ra sau cùng với thứ thự
đẩy tăng dần như sau:glucose,maltose,rafinose.glucose bị đẩy bằng nước
cất,maltose bị đẩy ra ở nồng dộ ethanol 5% và rafinose được đẩy ra cuối cùng bằng
ethanol 15% (Whistler and Durso 1949).

Phương pháp tinh sạch bằng than hoạt tính đơn giản dễ làm,chi phí thấp,loại
được các chất màu và tách được từng loại đường ra khỏi hỗn hợp tuy vậy phải mất
nhiều thời gian.
Năm 1987, Lange và cộng sự đã nghiên cứu sử dụng các hợp chất polymer để
tinh sạch acarbose dùng chất trao đổi cation dạng acid mạnh như lewatit TSW 40
Khóa luận tốt nghiệp – 201514


Trần Ngọc Bích

Khoa Công nghệ Sinh học

hoặc chất trao đổi cation dower 50 WX4 dùng nước đẩy các chất không hấp phụ
khỏi cột,rồi thu acarbose bằng HCl 0,025N. Các phân đoạn chứa acarbose được đưa
lên cột trao đổi anion lewatit MP62 và rửa bằng nước để trung hòa dịch
acarbose.Kết quả thu được acarbose với độ tinh sạch 89,5% (Lange and
Rauenbusch 1987).
Tiếp đến năm 1990, Rauenbusch tiếp tục tinh sạch từ dịch acarbose có độ tinh
sạch 78-88% được ông và cs nghiên cứu trước đó (Lange, Rauenbusch, 1987) và sử
dụng thêm chất trao đổi cation dạng acid yếu hydrophilic như: CM-sephadex C25,
CM-sephadex C1 6b,Carboxymethylcellulose CM52 trong pH khoảng 4,0-5,5 để
gắn chất màu và các hợp chất giống đường và kết quả thu được acarbose với độ tinh
sạch đạt 985 hoặc nhiều hơn nữa (Rauenbush 1990).
Keri và cs đã tinh sạch được acarbose từ dịch lên men với độ tinh sạch lên tới
99% vào năm 2002. Dịch lên men được acid hóa với pH 2,0-2,2 bằng acid sulfuric
sau đó lọc thu dịch trong rồi hấp thụ trong nhựa trao đổi anion dạng acetat hoặc
tartrate và rửa với nước tiếp tục đem hấp thụ trong nhựa trao đổi cation amberlite
252H dạng acid và rửa bằng HCl 0,02 M.Sau đó dịch rửa được loại bỏ ion Cl- bằng
nhựa trao đổi ion dạng base,cô đặc dịch thu được và kết tủa acarbose bằng ethanol,
lọc và làm khô. Các tinh thể acarbose thu được có độ tinh sạch đạt 99% (Keri and

Deak 2002).
Năm 2003, Hong và đồng nghiệp của ông đã tinh sạch acarbose từ dịch lên
men qua ba bước tinh sạch: Bước 1 cho qua một trong các cột hấp thụ lewatit EP63,
amberlite XAD 1600T, diaion SP850 rửa với nước cất và thu acarbose bằng acetone
10%. Phân đoạn chính thu được acarbose độ tinh sạch trên 50%. Dịch rửa chứa
acarbose được đưa lên cột và rửa bằng nước cất để loại màu và trung hòa vào cột
anion amberlite IRA67. Bước cuối sử dụng cột trao đổi cation dạng acid mạnh
MFG 210 và rửa cột bằng nước cất ở các pH khác nhau để thu được acarbose ở
phân đoạn có độ tinh sạch 98,1% (Hong et al. 2003).
Lin và cộng sự đã tinh sạch acarbose từ dịch lên men nhờ sử dụng sắc kí trao
đổi cation mạnh và sắc ký ái lực với enzyme gắn kết acarbose α-amyloglucosidase,
đã thu được acarbose với độ tinh sạch đạt 95%. Hai cột chính được sử dụng ở đây là
cột sắc ký trao đổi cation AMBERJET 1200H và cột sắc kí ái lực với hạt sắc kí
Khóa luận tốt nghiệp – 201515


Trần Ngọc Bích

Khoa Công nghệ Sinh học

AMBERJECT 4400 OH có chứa enzyme gắn kết α-amylogucosidase. Dịch thu
được của cột 1 và cột 2 đều tủa với cồn và làm khô và cuối cùng thu được acarbose
có độ tinh sạch đạt 95% (Lin et al. 2005; Lin et al. 2007).
Năm 2008, Rodriguez cùng cộng sự của mình đã nghiên cứu một số chất trao
đổi ion để tinh sạch acarbose từ dịch lên men đạt hiệu quả tốt nhất và trong 4 loại
nhựa trao đổi cation mạnh được nghiên cứu là finex CS9GC, finex CS10GC,
purolite CT151 và purolite SST6 họ đã chọn ra được nhựa finex CS10GC để tinh
sạch thu được acarbose có độ tinh sạch cao (Rodriguez et al. 2008).
Năm 2012, Wang YJ và cs đã nghiên cứu khả năng hấp thụ acarbose từ dịch
lên men của chất trao đổi cation SAC 001x7. Kết quả cho thấy, nhựa trao đổi SAC

001x7 hấp thụ acarbose tốt nhất ở nhiệt độ 400C ĐẠT 951,5 mg/g và hơn 90%
lượng acarbose được hấp thụ trong khoảng thời gian 40 đến 120 phút (Wang et al.
2012a).
Wang Y và cộng sự đã tinh sạch acarbose bằng nhựa trao đổi cation dạng acid
mạnh Amberlite IRA118 vào năm 2013. Kết quả cho ta thấy chất trao đổi cation có
khả năng hấp thụ và trao đổi mạnh acarbose và trước các điều kiện tối ưu đã thu
được 74,3% acarbose từ dịch lên men chủng A. utahensis ZJB-08196 với độ tinh
sạch đạt 80,1% (Wang et al. 2013).
Và còn rất nhiều công trình nghiên cứu hiện nay tiếp tục được nghiên cứu cho
đến tận bây giờ để tạo ra sản phẩm acarbose tốt nhất.
1.7 Tình hình nghiên cứu acarbose ở Việt Nam
Như đã đề cập ở trên,các sản phẩm thảo dược phụ thuộc nhiều vào thời vụ
nên có nhiều đề tài tập trung hướng nghiên cứu hoạt chất từ VSV.Nhưng những
nghiên cứu về acarbose tại Việt Nam cũng khá ít.
Năm 2011,Đỗ Thị Tuyên và cs đã nghiên cứu sàng lọc 1 số chủng Actinoplnes
sp. được cung cấp bởi bảo tàng giống chuẩn Vi sinh Việt Nam VTCC nhằm lựa
chọn chủng có khả năng sinh tổng hợp acarbose cao từ 12 chủng chọn ra được 6
chủng trong đó có 2 chủng Actinoplanes sp. VTCC-A1094 và Actinoplanes sp.
VTCC-A1779 có hoạt tính ức chế α-glucosidase cao nhất là 92% và 81% (Đỗ Thị
Tuyên et al. 2011).
Khóa luận tốt nghiệp – 201516


Trần Ngọc Bích

Khoa Công nghệ Sinh học

Quyền Đình Thi và cs (2012)đã tiến hành nâng caosinh tổng hợp acarbose từ
các dòng đột biến Actinoplanes sp. VTCC-A1779 từ 60 dòng đột biến đã tìm được 6
dòng có khả năng sinh tổng hợp cao hơn chủng gốc và có hoạt tính ức chế 60-80%

(Quyền Đình Thi et al. 2012). Vào năm 2013, Hà Thị Tâm Tiến và cs của mình đã
nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ lên chủng Actinoplanes sp. VTCC-A1779 và các
biến hể chothấy khả năng sinhtổng hợp acarbose và bảo quản ổn định nhất ở - 80OC
và các sản phẩm đều ổn định ở các nhiệt độ 4OC,-20OC và -80OC so với chủng
gốc(Hà Thị Tâm Tiến et al. 2013). Cũng trong năm 2013,Nguyễn Thị Nương và cs
đã tối ưu thành phầnmôi trường lên men sinh tổng hợp acarbose từ chủng
Actinoplanessp.KCTC 9161,kết quả cho thấy môi trường thíchhợp cho lên men sinh
tổng hợp acarbose cho hoạt tính ức chế α-glucosidasecao nhất là 52,24% trong môi
trường lên men MT1 (Nguyễn Thị Nương et al. 2013). Quá trình tinh sạch acarbose
cũng diễn ra song song cùng với quá trình tối ưu môi trường sinh tổng hợp acarbose
từ chủng xạ khuẩn chủ yếu Actinoplanes sp.
Hà Thị Tâm Tiến và cs (2013) đã khảo sát các phương pháp tinh sạch acarbose
từ chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 và kết quả cho thấy acarbose tinh sạch qua
cột than hoạt tính rồi cho qua cột trao đổi ion và cuối cùng là HPLC thu được hoạt
chất acarbose có độ tinh sạch đạt 98% (Hà Thị Tâm Tiến et al. 2013).
Năm 2014, Phạm Quang Trung và cs đã tiến hành quá trình tinh sạch hoạt chất
acarbose và đánh giá khả năng α-glucosidase từ chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161
(Cung cấp bởi Bộ sưu tập chủng giống của Hàn Quốc) trong môi trường Wang và
Basal. Sau 168 giờ lên men hoạt chất acarbose được sinh tổng hợp từ dịch lên mencủa
chủng Actinoplanessp. KCTC 9161 và được tinh sạch sơ bộ bằng cột thanhoạt tính và
cột sắc kí trao đổi ion amberlite IRA 400. Kết quả cho thấy tinh sạch qua cột than
hoạt tính rất đơn giản chỉ cần đẩy qua cácnồng độ cồn 5%-15% độ tinh sạch của nó lên
đến 25%. Đó là một phươngpháp tiết kiệm chi phí và dễ dàng áp dụng.

Khóa luận tốt nghiệp – 201517