Phân lập và xác định các đặc tính sinh học của chủng vi khuẩn PHOTOBACTERIUM DAMSELAE gây bệnh tụ huyết trùng ở cá biển nuôi lồng tại hải phòng

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
----------

-----------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài:
PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CÁC ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA CHỦNG
VI KHUẨN PHOTOBACTERIUM DAMSELAE GÂY BỆNH TỤ HUYẾT
TRÙNG Ở CÁ BIỂN NUÔI LỒNG TẠI HẢI PHÒNG

Giáo viên hướng dẫn: TS. Phạm Thị Tâm
Sinh viên thực hiện: Trương Thu Hương
Lớp: 1102

Hà Nội – 2015


LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến TS. Phạm Thị
Tâm, người đã tận tình hướng dẫn, dìu dắt em trong suốt quá trình em thực tập và
hoàn thành khóa luận này.
Em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ thuộc Khoa
Công nghệ sinh học – Viện Đại học Mở Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi nhất cho
em có thể thực tập và hoàn thành khóa luận này..
Cuối cùng, em xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân đã luôn ở
bên em cổ vũ, động viên, cảm ơn các anh-chị, bạn bè trong phòng thí nghiệm Vi
Sinh, khoa Công Nghệ Sinh Học, Viện Đại Học Mở Hà Nội đã luôn tận tình giúp đỡ
trong suốt thời gian em thực tập và hoàn thiện đề tài này.

Trong quá trình thực tập không tránh khỏi được những sai sót, kính mong các
thầy cô giáo, các anh-chị và các bạn đóng góp ý kiến để cá nhân em tiếp thu và
hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 26 tháng 5 năm 2015
Sinh viên

Trương Thu Hương


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1
1. Đặt vấn đề .............................................................................................. 1
2. Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................... 2
2.1. Mục tiêu chung ................................................................................ 2
2.2. Mục tiêu cụ thể ................................................................................ 2
3. Ý nghĩa của đề tài ................................................................................... 3
3.1. Ý nghĩa khoa học ............................................................................. 3
3.2. Ý nghĩa thực tiễn ............................................................................. 3
4. Thời qian và địa điểm nghiên cứu........................................................... 3
PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 4
1.1. Lịch sử phát triển nuôi trồng thủy sản .................................................. 4
1.1.1. Lịch sử phát triển nuôi trồng thủy sản trên thế giới ....................... 4
1.1.2. Lịch sử phát triển nuôi trồng thủy sản trong nước ......................... 5
1.2. Lịch sử phát hiện bệnh do vi khuẩn Photobacterium damselae............ 7
1.2.1. Lịch sử phát hiện bệnh trên thế giới .............................................. 7
1.2.2. Lịch sử phát hiện bệnh ở Việt Nam............................................... 7
1.3. Tổng quan về vi khuẩn Photobacterium damselae............................... 8
1.3.1. Phân loại khoa học ........................................................................ 8
1.3.2. Đặc điểm hình thái ....................................................................... 9

1.3.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa ............................................................ 9
1.3.4. Đặc điểm gây bệnh của Photobacterium damselae ..................... 10
1.3.5. Độc tố vi khuẩn và cơ chế gây bệnh............................................ 13
1.3.6. Khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn Photobacterium
damselae .............................................................................................. 14
1.3.7. Các phương pháp kiểm tra sự có mặt của Photobacterium
damselae .............................................................................................. 15
PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 16
2.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu ....................................................... 16
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................. 16


2.1.2. Động vật thí nghiệm ................................................................... 16
2.1.3. Môi trường và hóa chất ............................................................... 16
2.1.4. Thiết bị và dụng cụ ..................................................................... 20
2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................... 21
2.2.1. Phương pháp thu và xử lý mẫu ................................................... 22
2.2.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn P.damselae ............................... 22
2.2.3. Phương pháp hóa sinh ................................................................. 24
2.2.4. Phương pháp nghiên cứu tính kháng kháng sinh của một số chủng
vi khuẩn P.damselae phân lập ............................................................. 25
2.2.5. Phương pháp gây nhiễm động vật thí nghiệm ............................. 26
2.2.6. Phương pháp đánh giá sự ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy đến sự
phát triển và khả năng gây dung huyết của vi khuẩn P.damselae................. 26
PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..................................................... 27
3.1. Kết quả phân lập vi khuẩn Photobacterium damselae gây bệnh trên cá
biển nuôi lồng........................................................................................... 27
3.2. Xác định sự ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy đến sự phát triển và
khả năng gây dung huyết của vi khuẩn P.damselae .................................. 31
3.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian nuôi cấy ............................ 32

3.2.2. Ảnh hưởng của pH ...................................................................... 34
3.2.3. Ảnh hưởng của độ mặn (NaCl) ................................................... 36
3.3. Kết quả thử nghiệm khả năng kháng kháng sinh của các chủng
Photobacterium damselae phân lập được ................................................. 37
3.3. Khả năng gây bệnh cho cá mú của chủng vi khuẩn phân lập.............. 39
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 43
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 44


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Kí hiệu

Từ viết tắt

BHI Broth

Brain Heart Infusion Broth

TCBS

Thiosulfate Citrate Bile Salt Sucrose

KIA

Kligler Iron Agar

DNA

Deoxyribonucleotide Acid

PCR

Polymerase Chain Reaction

D

Đường kính

R

Resistant

I

Intermediate

S

Susceptible

OD (đo mật độ quang
học)

Optical Density


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Biểu đồ nuôi trồng thủy sản toàn cầu theo vùng năm 2012 ............. 4
Hình 1.2. Biểu đồ sản lượng thủy sản Việt Nam qua các năm 1995-2012 ...... 6

Hình 1.3. Hình thái vi khuẩn P.damselae dưới kính hiển vi điện tử ................ 9
Hình 2.1. Sơ đồ tiếp cận nội dung nghiên cứu của đề tài .............................. 21
Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc trên môi trường Marine agar.......................... 28
Hình 3.2. Hình thái vi khuẩn P.damselae soi dưới kính hiển vi điện tử ........ 28
Hình 3.3. Hình thái khuẩn lạc khi ria trên môi trường TCBS ........................ 29
Hình 3.4. Kết quả thử nghiệm các phản ứng sinh hóa ................................... 31
Hình 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian nuôi cấy đến sự phát triển của
vi khuẩn P.damselae .................................................................................... 33
Hình 3.6. Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của vi khuẩn P.damselae ..... 35
Hình 3.7. Ảnh hưởng của độ mặn đến sự phát triển của vi khuẩn P.damselae
..................................................................................................................... 36
Hình 3.8. Đánh giá khả năng kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn
P.damselae phân lập..................................................................................... 38
Hình 3.9. Dấu hiệu bệnh lý của cá sau gây nhiễm ........................................ 41
Hình 3.10. Hình ảnh kết quả phân lập lại của các chủng P.damselae............ 42


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Các đặc tính sinh lý, sinh hóa của chủng vi khuẩn P.damselae .... 10
Bảng 2.1. Thiết bị chính dùng trong nghiên cứu ........................................... 20
Bảng 3.1. Các mẫu bệnh phẩm và đặc điểm hình thái của các chủng phân lập
từ các mẫu bệnh phẩm mang các biểu hiện nhiễm Photobacterium .............. 27
Bảng 3.2: Các đặc tính sinh hóa điển hình của vi khuẩn Photobacterium
damselae phân lập trên cá biển nuôi lồng ..................................................... 30
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian nuôi cấy đến khả năng gây
dung huyết của vi khuẩn P. damselae T1.7 và T1.8 ...................................... 34
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của pH đến khả năng gây dung huyết của vi khuẩn ... 35
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của độ mặn đến khả năng gây dung huyết của ........... 37
Bảng 3.6: Khả năng kháng kháng sinh của các chủng P.damselae phân lập . 37
Bảng 3.7: Kết quả cảm nhiễm trên cá mú bởi vi khuẩn P.damselae.............. 40

MỞ ĐẦU
1.

Đặt vấn đề
Những năm gần đây, nghề nuôi trồng thủy sản (NTTS) đã không ngừng phát

triển và ngày càng chiếm vị trí quan trọng trong ngành Thủy sản nói riêng và kinh tế
đất nước nói chung. Với kim ngạch xuất khẩu năm 2010 đạt 4,94 tỷ USD, thủy sản
là một trong ba ngành có đóng góp lớn nhất cho tổng kim ngạnh xuất khẩu của Việt
Nam. Trong sự phát triển chung của ngành NTTS thì nuôi biển được coi là chiến
lược hàng đầu và mở ra nhiều hứa hẹn với mục tiêu xuất khẩu trong tương lai. Các
đối tượng nuôi biển chủ yếu là cá, tôm hùm, động vật thân mềm và rong biển trong
đó cá có nhiều tiềm năng để phát triển nuôi với quy mô công nghiệp. Thống kê của
Bộ Thuỷ sản năm 2006, số lồng nuôi cá biển ở nước ta có 16.319 lồng, tổng sản
lượng cá nuôi đạt 3.508 tấn. Trong đó, vùng nuôi tập trung chủ yếu ở Hải Phòng
(Vịnh Lan Hạ, Bến Bèo - Cát Bà) có 6.000 lồng, với sản lượng nuôi 1.200 tấn;
Quảng Ninh (Vịnh Hạ Long) có 5.700 lồng, với sản lượng đạt 1.300 tấn; Kiên Giang
(huyện đảo Phú Quốc) có 131 lồng, sản lượng nuôi đạt 90 tấn.
Tuy nhiên, khi nghề nuôi cá biển phát triển thì người nuôi cũng gặp không ít
khó khăn, trong đó, vấn đề lo ngại lớn nhất là dịch bệnh gây ra trên cá. Qua một số
nghiên cứu đã chỉ ra rằng những tác nhân gây bệnh chủ yếu trên cá biển nuôi lồng
thường là virus, nấm và vi khuẩn trong đó nguy hiểm nhất là bệnh tụ huyết trùng
(xuất huyết nhiễm trùng) do vi khuẩn Photobacterium damselae gây ra. Vi khuẩn
tấn công và gây bệnh trên cá biển nuôi ở tất cả các giai đoạn phát triển của cá từ giai
đoạn ấu trùng, cá giống đến cá nuôi thương phẩm. Khi bị bệnh cá có thể biểu hiện ở
dạng mãn tính và cấp tính, biểu hiện bệnh tụ huyết trùng như: gây loét trên da, xuất
hiện các nốt kem trắng hoặc u hạt tubercules màu trắng ở một số cơ quan nội tạng,
gây hoại tử trong nội tạng, hoại tử tập trung ở thận và lá lách, gây nhiễm trùng và

hoại tử rộng rãi [30]. Dấu hiệu lâm sàng của cá bệnh như: cá ăn kém, da tối mầu,
mang hoại tử. Cá bệnh có thể chết sau 5-10 ngày với tỷ lệ chết cao từ 80-100% gây
thiệt hại kinh tế ở các nước như: Nhât, Mỹ, Pháp, Tây Ban Nha, Hy Lạp, Thổ Nhĩ
Kỳ, ... Ở Việt Nam, bệnh phân bố ở hầu hết các vùng nuôi trên cả nước. Bệnh xảy ra
hầu hết các giai đoạn của cá, vì vậy, việc tìm ra phương pháp phòng và trị bệnh có
thể hạn chế những tổn thất do dịch bệnh gây ra là hết sức cần thiết.

1


Thực tế hiện nay, trong NTTS, người dân thường sử dụng nhiều hóa chất và
kháng sinh để khống chế vi khuẩn này, song việc sử dụng kháng sinh có thể gây
hiện tượng nhờn thuốc và không mang lại hiệu quả cao. Vi khuẩn này có khả năng
tạo ra màng bảo vệ (biofilm) trước thuốc diệt khuẩn và kháng sinh. Chính vì thế,
dịch bệnh thường bùng phát trở lại rất nhanh sau khi thuốc hết tác dụng. Mặt khác,
dư lượng kháng sinh trong sản phẩm từ cá biển có thể gây ảnh hưởng xấu đến chất
lượng thịt cá và sức khỏe của con người. Để giảm thiểu việc sử dụng kháng sinh
điều trị bệnh và đảm bảo chất lượng sản phẩm từ cá biển, việc nghiên cứu các giải
pháp phòng bệnh trong đó hướng đến sản xuất vắc-xin phòng bệnh tụ huyết trùng ở
cá biển mang tính bền vững và hết sức cần thiết.
Xuất phát từ lý luận và thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành đề tài:
“Phân lập và xác định đặc tính sinh học của chủng vi khuẩn Photobacterium
damselae gây bệnh tụ huyết trùng trên cá biển nuôi lồng tại Hải Phòng” làm cơ
sở ban đầu hướng đến việc sản xuất vắc-xin phòng bệnh tụ huyết trùng ở cá biển
trên quy mô công nghiệp.
2.

Mục tiêu nghiên cứu

2.1. Mục tiêu chung

Phân lập và xác định được các đặc tính sinh học điển hình của vi khuẩn
Photobacterium damselae.
2.2. Mục tiêu cụ thể
-

Phân lập được 06-08 chủng vi khuẩn P.damselae từ mẫu bệnh phẩm một số

loài cá biển (cá mú, cá hồng, cá bớp) nghi mắc bệnh tụ huyết trùng ở cá biển nuôi
lồng tại Cát Bà.
-

Xác định được các đặc tính sinh học của chủng vi khuẩn P. damselae phân lập

được: khả năng sinh enzym catalase, tryptophanase, khả năng sử dụng các loại
đường, khả năng sinh H2S, khả năng sinh hơi, khả năng gây dung huyết.
-

Xác định khả năng gây bệnh của các chủng P.damselae phân lập.

-

Xác định tính kháng kháng sinh của các chủng P.damselae phân lập.

2


3.

Ý nghĩa của đề tài

3.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả của đề tài là cơ sở dữ liệu khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo về
dịch tễ học và các giải pháp phòng, trị bệnh.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Là cơ sở khoa học cho việc nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn Photobacterium
damselae giảm độc lực được đánh giá kỹ càng về tính an toàn, khả năng tạo kháng
thể bảo hộ là nguyên liệu có chất lượng tốt để sản xuất vắc-xin phòng bệnh tụ huyết
trùng ở cá. Vắc-xin là giải pháp hữu hiệu trong việc hạn chế dịch bệnh làm tăng hiệu
quả kinh tế trong sản xuất cá biển.
4.

Thời qian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian nghiên cứu từ 9/2014 đến 5/2015 tại Phòng Vi Sinh, khoa Công

Nghệ Sịnh Học, Viện Đại Học Mở Hà Nội.

3


PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Lịch sử phát triển nuôi trồng thủy sản
1.1.1. Lịch sử phát triển nuôi trồng thủy sản trên thế giới
Lịch sử của nghề nuôi trồng thủy sản trên thế giới đã được bắt đầu từ khoảng
500 năm trước công nguyên tại Trung Quốc với loài cá được nuôi đầu tiên là cá
chép (Cyprinus carpio). Hình thức sơ khai là thu cá giống từ sông để ương nuôi
trong ao vùng nước ngọt. Nghề nuôi cá chép sau đó được lan rộng ra nhiều nơi ở
Châu Á, Trung Đông và Châu Âu do sự di dân của người Hoa. Trong khi đó, loài cá
nước lợ được nuôi đầu tiên là loài cá Măng (Chanos chanos) vào thế kỷ 15 tại
Indonesia.
Trên thế giới, Châu Á cho sản lượng thủy sản nuôi trồng lớn nhất, chiếm 89%

tổng sản lượng và 77% tổng giá trị sản phẩm thủy sản nuôi trồng thế giới năm 2006.
Năm 2006, tổng sản lượng nuôi trồng thủy sản thế giới là 51 triệu tấn và sản lượng
khai thác là 92 triệu tấn. Trong số này, Trung Quốc chiếm 66,7% tổng sản lượng
nuôi, các nước Châu Á khác chiếm 22,8%, và các nước khác còn lại ở Châu Âu,
Châu Mỹ, Úc,… chiếm 10,5% [1,5].

Hình 1.1. Biểu đồ nuôi trồng thủy sản toàn cầu theo vùng năm 2012
Trong những năm qua, sản lượng nuôi trồng thủy sản thế giới tăng trưởng với
tốc độ vừa phải. Theo báo cáo mới nhất của FAO, năm 2012, sản lượng nuôi trồng
thủy sản đạt mức cao kỷ lục, 90,4 triệu tấn, tương đương 144,4 tỷ đô la Mỹ; trong
đó có 66,6 triệu tấn thủy sản các loại (137,7 tỷ đô la Mỹ) và 23,8 tỷ tấn thực vật

4


thủy sinh nuôi(chủ yếu là tảo biển), tương đương 6,4 triệu đô la Mỹ. Các đối tượng
nuôi bao gồm cá có vẩy, động vật giáp xác, động vật thân mềm, ếch, bò sát (không
tính cá sấu) và các loài thủy sản khác phục vụ cho nhu cầu tiêu dùng của con người.
Năm 2013, sản lượng nuôi trồng thủy sản đạt 70,5 triệu tấn, tăng 5,8%; trong đó,
sản lượng các loài thực vật thủy sinh là 26,1 triệu tấn.
Sản lượng nuôi trồng thủy sản chiếm tỷ trọng ngày càng tăng trong tổng sản
lượng thủy sản toàn cầu (158 triệu tấn), từ 20,9% năm 1995 lên 32,4% năm 2005 và
40,3% năm 2010 và ở mức cao kỷ lục là 42,2% trong năm 2012. Châu Á chiếm tỷ
trọng cao nhất trong tổng sản lượng nuôi toàn cầu 54%, châu Âu chiếm 18% và các
châu lục còn lại <15%.
Trong giai đoạn 2000-2012, sản lượng nuôi toàn cầu có mức tăng trưởng trung
bình hàng năm là 6,2%, giảm so với mức tăng trưởng trong giai đoạn 1980-1990 và
giai đoạn 1990-2000 tương ứng là 10,8% và 9,5%. Giai đoạn 1980-2012, sản lượng
nuôi toàn cầu tăng trưởng ở mức 8,6%/năm. Sản lượng nuôi toàn cầu tăng gấp đôi,
từ 32,4 triệu tấn trong năm 2000 lên mức 66,6 triệu tấn năm 2012.

Dự báo, giai đoạn 2013 - 2022, ngành nuôi trồng thủy sản vẫn duy trì tốc độ
tăng trưởng ổn định, với mức tăng trung bình 2,4%/năm, đạt 181 triệu tấn vào năm
2022 và tăng 18% so với mức trung bình giai đoạn 2010 - 2012. Đến năm 2030, sản
lượng nuôi trồng thủy sản dự kiến tăng thêm 30 triệu tấn và đóng góp khoảng 62%
nguồn cung thủy sản toàn cầu.
Nuôi trồng thủy sản sẽ tiếp tục mở rộng ra khắp các châu lục, với sự đa dạng
của các loài nuôi và hình thức sản phẩm. Các nước châu Á sẽ tiếp tục chiếm phần
lớn sản lượng nuôi trồng thủy sản của thế giới. Năm 2030, các nước Đông Nam Á
sẽ đóng góp 15,9% thị phần và Ấn Độ, 9,2%.Trung Quốc dự kiến sẽ đóng góp
56,9% tổng sản lượng nuôi trồng thủy sản toàn cầu [6].
1.1.2. Lịch sử phát triển nuôi trồng thủy sản trong nước
Ở Việt Nam, nghề nuôi trồng thủy sản (NTTS) cũng phát triển rất năng động.
Nghề nuôi thủy sản truyền thống bắt đầu từ thập niên 1960, tuy nhiên trong vòng 10
năm nay, nghề nuôi thủy sản có tốc độ phát triển rất nhanh chóng. Theo thống kê
của Bộ Thủy sản (2006) thì năm 1999 cả nước có tổng cộng trên 524.619 ha, đạt
sản lượng 480.767 tấn. Năm 2005, cả nước có gần 1.000.000 ha nuôi thủy sản, đạt

5


sản lượng 1.437.356 tấn, trong đó, sản lượng nuôi thủy sản nước lợ - măn là
546.716 tấn, sản lượng nuôi nước ngọt đạt 890.650 tấn [1,5].
Theo Tổng cục Thủy sản, giai đoạn 2006 - 2010, diện tích NTTS tăng đều qua
từng năm, đến năm 2010, sản lượng tăng gấp 6 lần so với chỉ tiêu đề ra trong kế
hoạch. Tốc độ tăng trưởng bình quân về diện tích tăng 1,7%/năm; sản lượng tăng
trung bình 12,9%/năm, từ 1.694 nghìn tấn năm 2006 lên 2.828 nghìn tấn năm 2010.
Giá trị sản xuất thủy sản tăng từ 25.898 tỷ đồng năm 2006 lên 36.150 tỷ đồng năm
2010, tăng trưởng 8,7%/năm.

Hình 1.2. Biểu đồ sản lượng thủy sản Việt Nam qua các năm 1995-2012

Trong giai đoạn 1995-2012, sản lượng thủy sản Việt Nam đã duy trì tăng
trưởng liên tục với mức tăng bình quân là 9,07%/năm. Đến năm 2014, tổng sản
lượng thủy sản đạt 6,3 triệu tấn, trong đó nuôi trồng thủy sản đạt 3,6 triệu tấn; giá trị
xuất khẩu thủy sản đạt 7,92 tỷ USD, tăng 18% so với năm 2013, góp phần thúc đẩy
phát triển nền kinh tế của cả nước và đem lại nhiều lợi nhuận cho người dân. Tuy
nhiên, tình hình dịch bệnh thủy sản vẫn còn xảy ra ở nhiều nơi [3]. Theo Bộ Nông
nghiệp và Phát triển nông thôn, năm 2014, kim ngạch xuất khẩu thuỷ sản đạt trên
7,9 tỷ USD, tăng 18% so với năm 2013 và vượt 13% so với mục tiêu 7 tỷ USD. Đây
được xem là con số ấn tượng của ngành thuỷ sản trong năm 2014 và vượt qua
những kịch bản lạc quan nhất. Tuy nhiên, theo nhiều chuyên gia, xuất khẩu thuỷ
sản, năm 2015 ngành này vẫn còn nhiều khó khăn do chưa giải quyết triệt để những
tồn tại và còn phụ thuộc nhiều vào yếu tố thị trường bên ngoài [6].

6


1.2. Lịch sử phát hiện bệnh do vi khuẩn Photobacterium damselae
1.2.1. Lịch sử phát hiện bệnh trên thế giới
Bệnh tụ huyết trùng (pseudotuberculosi) hay còn được gọi là xuất huyết
nhiễm trùng, gây ra bởi vi khuẩn ưa mặn Photobacterium damselae (P.damselae).
Nó lần đầu tiên được phân lập từ các quần thể cá rô trắng (Morone americanus)
hoang dã và cá vược (M. saxatilis) vào năm 1963 ở vịnh Chesapeake, Hoa Kỳ, hiện
là tác nhân gây bệnh của nhiều loại cá biển. Căn bệnh này có ảnh hưởng lớn về kinh
tế cả ở Nhật Bản, và ở khu vực Địa Trung Hải, do nó gây ra thiệt hại trong các trang
trại cá tráp và cá chẽm [26]. Từ năm 1969, căn bệnh này đã là một trong những
bệnh nguy hiểm tại Nhật Bản (Kusuda & Yamaoka, 1972). Từ năm 1990 nó đã gây
ra thiệt hại về kinh tế ở các nước châu Âu khác nhau trong đó có Pháp, Ý, Tây Ban
Nha, Hy Lạp, Thổ Nhĩ Kỳ, Bồ Đào Nha và Malta [24].
Bệnh lý bùng phát phụ thuộc vào nhiệt độ và thường xảy ra khi nhiệt độ
nước tăng lên trên 18-20°C. Dưới nhiệt độ này, cá ở tình trạng ủ bệnh (Romalde,

2002) [32].
Vi khuẩn P.damselae có khả năng tuân thủ và xâm nhập vào tế bào biểu mô
cá. Khả năng xâm nhập này đã được chứng minh trước đây bởi Magariños et al.
(1996) và Yoshida et al. (1997). Tuy nhiên, đây là nghiên cứu đầu tiên của động
học và độ đặc hiệu của quá trình này. Hình ảnh bằng chứng của giai đoạn trong
tế bào của P.damselae bên trong tế bào biểu mô cá được cung cấp bởi các quan
sát bằng kính hiển vi điện tử và kỹ thuật huỳnh quang hiển vi ánh sáng. Với đặc
tính chọn lọc diệt vi khuẩn ngoại bào, kháng sinh Gentamycin được sử dụng
trong các xét nghiệm Gentamycin để xác nhận sự xâm nhập vào biểu mô cá của
P.damselae [19].
1.2.2. Lịch sử phát hiện bệnh ở Việt Nam
Ở Việt Nam, một số loài cá thuộc họ các mú, cá giò, cá vược cũng đã phát
hiện sự hiện diện của P.damselae. Trong đó có các loài E.coioides, E.fuscogutatus,
E.tauvina, E.lanceolatus, E.malabaricus ở Khánh Hoà; loài E.coioides ở Cát Bà
(Hải Phòng) và Cửa Hội (Nghệ An). Bệnh tụ huyết trùng trên cá biển tại Việt Nam

7


được báo cáo lần đầu tiên vào năm 2002 trên cá mú (Epinephelus spp) nuôi lồng
trên vịnh Hạ Long. Kết quả điều tra ở huyện Vân Đồn, Quảng Ninh (2002) có số
lồng bị bệnh. Bệnh xuất hiện từ tháng 5 đến tháng 10, nhiệt độ thích hợp bệnh
phát triển 25-300C.
Kết quả điều tra sơ bộ của Khoa Nông Lâm Ngư – Trường đại học Vinh cho
thấy cá nuôi tại vùng biển Nghệ An, Thanh Hóa thường gặp bệnh có dấu hiệu tương
tự như bệnh tụ huyết trùng. Tuy nhiên, cho tới nay ở Việt Nam vẫn chưa có một báo
cáo khoa học cụ thể nào về tình hình dịch bệnh.
Biểu hiện bệnh lý bên ngoài cho thấy khi mắc bệnh, cá thường bỏ ăn, màu sậm
đi, mang và nội tạng xuất huyết. Bệnh cấp tính cá chết sau 3-5 ngày với tỉ lệ cao, có
thể từ 80-100%.

1.3. Tổng quan về vi khuẩn Photobacterium damselae
1.3.1. Phân loại khoa học
Giới: Vi khuẩn
Ngành: Proteobacteria
Lớp: Gamma Proteobacteria
Bộ: Vibrionales
Họ: Vibrionaceae
Chi: Photobacterium
Loài: Photobacterium damselae
Theo Love và các cộng sự, ban đầu Photobacterium damselae được mô tả như
một loài Vibrio gây bệnh mới, gây lở loét ở Chromis punctipinnis. Kể từ đó, các báo
cáo về khả năng gây bệnh đối với nhiều loài cá khác nhau (cá bơn, cá hồi vân, cá
tráp, cá vược, cá mập) và động vật có vú (cá heo, con người) đã tăng lên rất nhiều.
Ban đầu, P.damselae được mô tả như Vibrio damselae, sau đó chúng được phân
loại lại là một thành viên trong chi Listonella. Đến năm 1991, được chuyển giao cho
các chi Photobacterium. Trong một nghiên cứu sau đó của Gauthier và các cộng sự
(1995) về các tác nhân gây bệnh tụ huyết trùng ở một số loài cá đã xác định chủng

8


vi khuẩn này là một thành viên của Photobacterium damselae bằng phương pháp
phân tích loài theo các trình tự 16S rDNA và DNA [18].
1.3.2. Đặc điểm hình thái

Hình 1..3. Hình thái vi khuẩn P.damselae dưới kính hiển vi điện tử
Photobacterium damselae là trực khuẩn Gram âm, kích thước khoảng 0.5 - 0.8
µm x 0.7 - 2.6 µm, lưỡng cực [10].
1.3.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
Về điều kiện nuôi cấy, vi khuẩn phát triển tốt nhất trên môi trường có nồng độ

NaCl từ 1,0%- 2,5%, nhiệt độ nuôi cấy từ 15ºC- 32,5ºC. Không phát triển trong môi
trường có nồng độ NaCl 0%, 8%, 10%, 12% và không thể phát triển nếu thiếu Na+.
Môi trường nuôi cấy cấp 1 tốt nhất là môi trường Brain Heart Infusion Agar (BHI
agar), Thiosulfate Citrate Bile Salt Sucrose (TCBS), Marine Agar hoặc môi trường
thạch máu cừu (2% máu cừu) không bổ sung thêm muối. Khuẩn lạc trên môi trường
thạch máu có màu xám, đục, đường kính khoảng 1mm, viền trơn, gây dung huyết
dạng β và quan sát được rõ ràng sau 48h ở nhiệt độ 28ºC [19,15].
Vi khuẩn bắt màu Gram âm, nhuộm lưỡng cực, khi nhuộm thường thấy vi
khuẩn bắt màu sẫm ở hai đầu, ở giữa nhạt hơn do hiện tượng nguyên sinh chất bị
dung giải về hai đầu của vi khuẩn. Là vi khuẩn hiếu khí, kỵ khí tùy tiện; không có
khả năng phát quang và không sinh bào tử. Dương tính với các phản ứng oxidase,
catalase, methyl red, khử nitrate, sinh acid từ glucose. Âm tính với các phản ứng
indol, citrate, phân giải gelatin, không sinh H2S (phản ứng KIA), không sử dụng
sucrose (trong môi trường TCBS) [33].

9


Bảng 1.1. Các đặc tính sinh lý, sinh hóa của chủng vi khuẩn P.damselae [33].
Các phản ứng sinh lý, sinh hóa

Photobacterium damselae

Phát triển trên TCBS

+

Arginine

+

Esculin

-

Ornithine

-

Lysine

V

Indole

-

Catalase

+

Gelatinase

-

Khử Nitrat

+

Sử dụng citrate

-

Sinh acid từ:
Glucose

+

Lactose

-

Cellobiose

+

Phát triển ở:
0% NaCl

-

1% NaCl

+

6% NaCl

+

8% NaCl

-

Phát triển ở nhiệt độ:
4°C

V

35°C

+
(+) dương tính; (-) âm tính; (V) dương tính hoặc âm tính

1.3.4. Đặc điểm gây bệnh của Photobacterium damselae
Gây bệnh trên cá:
Rất nhiều báo cáo khoa học đề cập đến bệnh do Photobacterium damselae
(P.damselae) trên cá biển nuôi công nghiệp tại nhiều quốc gia trên thế giới. Các loài
cá tự nhiên (cá Trinh nữ, cá da trơn, cá Mập, cá Đuối gai độc, vv…), cũng như các

10


loài cá có tầm quan trọng kinh tế trong nuôi trồng thủy sản (cá Mú, cá Giò, cá Tráp,
cá Bống bớp, cá Vược) đã chịu rất nhiều thiệt hại do P.damselae gây ra [7].
Các báo cáo gần đây về sự cô lập của tác nhân gây bệnh này từ cá biển bị bệnh
trên các loài nuôi mới, cho rằng P.damselae có thể được coi như là một tác nhân
gây bệnh mới nổi trong nuôi trồng thủy sản biển (Labella et al, 2011).
P.damselae được tìm thấy nhiều hơn trong các loài cá biển trong những tháng
thời tiết ấm áp, khi hầu hết các dịch truyền nhiễm đã lây lan. Phát hiện này cho thấy
P. damselae đã xuất hiện ít nhiều trong cá khỏe mạnh được nuôi trong cùng khu vực

bị nhiễm bệnh và số lượng cá bị nhiễm tăng khi nhiệt độ lên cao, nâng cao khả năng
nhiễm trùng cùng với loài Vibrio spp khác. Sự lây lan giữa cá bệnh sang cá khỏe
mạnh đang xảy ra ngày càng nhiều, vì có nhiều cá nhiễm P. damselae mà không có
triệu chứng biểu hiện bên ngoài nên người nuôi không biết để phòng trị.
Tác nhân gây bệnh có thể lây nhiễm sang các loài cá mới thông qua nước, và
sự lây lan của căn bệnh này phụ thuộc phần lớn vào nhiệt độ nước và độ mặn [16].
Bệnh thường xảy ra với tỷ lệ chết rất cao vào các tháng mùa hè, tại các thời điểm
khác trong năm cá chết rải rác. Sự bùng phát bệnh phụ thuộc vào nhiệt độ và thường
xảy ra khi nhiệt độ nước tăng lên trên 18oC, dưới nhiệt độ này cá ở tình trạng ủ bệnh
[32]. Dấu hiệu điển hình của cá nhiễm P.damselae là xuất hiện vùng xuất huyết và
tổn thương loét trên bề mặt cơ thể. Cá bệnh hầu hết có triệu chứng chung khá điển
hình trên nhiều loài: xuất hiện vết loét trên da, cá kém ăn hoặc bỏ ăn, da màu sẫm.
Giải phẫu bên trong cơ thể cho thấy: thận bị sưng, xuất hiện các đốm trắng dạng hạt
trong mô thận, gan tuỵ [27], mang và nội tạng xuất huyết, hoại tử trong nội tạng,
hoại tử tập trung ở thận và lá lách, gây nhiễm trùng và hoại tử rộng rãi. Bệnh cấp
tính cá chết sau 3-5 ngày với tỉ lệ cao, có thể từ 80-100%. Trong cá trinh nữ, vết
loét thường xảy ra trong khu vực của các vây ngực và cuống đuôi và có thể đạt 520mm. Trong khi ở cá bơn các triệu chứng đáng chú ý nhất là xuất huyết sâu rộng
trong mắt, miệng và hàm. Trong cá ngừ, các u hạt bao quanh mô hoại tử và vi
khuẩn thường xuất hiện nhiều trong lá lách, thận và gan của cá nhiễm [27].
Gây bệnh ở người
Hầu hết các bệnh nhiễm trùng đã được báo cáo gây ra bởi P.damselae ở người
có nguồn gốc chính từ những vết thương ngoài da khi tiếp xúc với nguồn nước biển

11


hoặc dụng cụ trong quá trình xử lý đối tượng mang mầm bệnh và một số trường hợp
xảy ra sau khi ăn hải sản [8,9,20,22,30].
Các bệnh nhân bị nhiễm P.damselae phát triển suy đa cơ quan trong vòng vài
giờ sau khi khởi phát triệu chứng ban đầu, mặc dù đã điều trị hóa trị liệu chuyên sâu

và điều trị phẫu thuật. Trong một trường hợp tử vong được báo cáo trong năm 1984,
một bệnh nhân đã bị thương trong khi xử lý cá da trơn, vết thương xảy ra trên tay và
hiện tượng phù nề đã lan rộng ra cẳng tay trong vòng chưa đầy 24 giờ [12]. Trong
một trường hợp tử vong khác được báo cáo, một bệnh nhân bị thương trong khi xử
lý cá, chủng vi khuẩn P.damselae được phân lập trong môi trường nhân tạo từ các
mẫu vết thương của người này nhưng không được phân lập từ mẫu máu [17].
Những đối tượng trong nhóm này đều có sức khỏe bình thường và chỉ bị nhiễm
bệnh khi có các vết thương hở tiếp xúc với mầm bệnh. Thông qua các dữ liệu và
quan sát cho thấy rằng, sự lây nhiễm từ cá bệnh đem lại nguy cơ rất cao gây hại cho
sức khỏe con người và những người suy giảm miễn dịch có nguy cơ lây nhiễm lớn
hơn đặc biệt là nếu họ bị thương trong khi chế biến xử lý cá. Do đó các cá nhân nên
thực hiện theo biện pháp phòng ngừa thích hợp, chẳng hạn như đeo găng tay và sử
dụng xà phòng kháng khuẩn [12].
Hiện nay, trên thế giới đã xuất hiện rất nhiều trường hợp bệnh nhân bị nhiễm
P.damselae với tỷ lệ tử vong cao.
-

Dịch tễ học
P.damselae tồn tại trong môi trường nước mặn, bắt buộc phải có Na+, chúng

được tìm thấy quanh năm nhưng chưa có một kết luận nào về mùa vụ phát triển
bệnh của nó . Tuy nhiên, vào mùa đông thì số lượng vi khuẩn rất ít, có thể phân lập
khi sử dụng môi trường tăng sinh chọn lọc.
P.damselae cũng được phân lập từ lớp dịch nhầy, chất bẩn tích tụ trong lồng
nuôi hoặc từ mẫu nước nuôi cá bị bệnh. Cá sống sót sau dịch bệnh có thể trở thành
nguồn mang mầm bệnh P.damselae trong nước [28].
Cá có thể được gây nhiễm bằng cách tiêm, ngâm, cho ăn thức ăn chứa vi
khuẩn, nuôi chung cá khoẻ với cá bệnh.
-

Khả năng gây dung huyết

12


P. damselae, tác nhân gây bệnh tụ huyết trùng ở cá. Chúng có khả năng dung
huyết trên đĩa thạch máu cừu (dạng β). Mức độ khác nhau giữa các tán huyết
P.damselae đã được phân lập. Hai kiểu hình hemolytic tách biệt có thể được quan
sát thấy trên đĩa thạch máu, với các chủng cho thấy một quầng tán huyết lớn (LH)
và các chủng sản xuất một quầng tán huyết nhỏ (SH), ngoài ra có các chủng lại có
thể được mô tả như vừa tán huyết (MH) [12,13,14,21,24].
1.3.5. Độc tố vi khuẩn và cơ chế gây bệnh
Photobacterium damselae, trước đây là Vibrio damselae, là một tác nhân gây
bệnh của một loạt các động vật biển như cá, động vật giáp xác, động vật thân mềm
và các loài thú biển. Ở con người, nó có thể gây ra nhiễm trùng và có thể phát triển
thành hoại tử fasciitis gây tử vong. Mặc dù các cơ sở di truyền về độc lực của vi
khuẩn ở đây không phải là hoàn toàn sáng tỏ, nhưng những phát hiện gần đây chứng
minh rằng phospholipase-D dly (damselysin) và các chất độc tạo thành HlyApl và
HlyAch đóng một vai trò chính trong độc lực cho homeotherms và poikilotherms.
Việc tìm ra các plasmid độc lực pPHDD1 mã hóa dly và HlyApl đã có khả năng tạo
cơ sở chính cho sự phát triển của một dòng cao huyết tán trong phân loài. Ngoài ra,
trường hợp các chủng thiếu pPHDD1 cũng có khả năng gây bệnh mạnh mẽ cho
nhiều loài cá cho thấy sự tồn tại của các yếu tố độc lực có khả năng gây bệnh rất
lớn. Phân tích sâu hơn về trình tự bộ gen hoàn chỉnh của P.damselae chắc chắn sẽ
cung cấp một bức tranh rõ ràng hơn về các yếu tố độc lực của loại vi khuẩn này gây
bệnh ở các phạm vi khác nhau [34].
Thành phần chính trong các sản phẩm ngoại bào có liên quan đến độc lực bao
gồm các protease, hemolysins (Norqvist et al., 1990; Toranzo & Barja, 1993).
Những cơ chế này có thể gây phá hủy mô tế bào và gây xuất huyết, đóng một vai trò
quan trọng trong sự xâm nhập của các vi khuẩn gây bệnh trong cơ thể cá

(Finkelstein et al., 1992; Silva et al., 2003). Tuy nhiên, Osorio và các cộng sự
(2000) đã chứng minh rằng sự có mặt của các sản phẩm ngoại bào này không phải
là điều kiện quyết định cho khả năng phát sinh độc lực gây bệnh của chủng vi khuẩn
này. Một số protease trong sản phẩm ngoại bào của vi khuẩn cũng được coi là yếu
tố độc lực ở nhiều vi khuẩn gây bệnh (Ishihara et al., 2002; Miyoshi et al., 2002;

13


Farto et al., 2006). Protrease hạn chế sự hoạt động của enzym đã được phát hiện ở
P.damselae bao gồm cả phosphatases, esteraza, amylase và glycosidases [34].
Rất ít thông tin về các yếu tố độc lực của P. damselae gây nhiễm trùng huyết ở
động vật thủy sản và con người. Một thông tin ban đầu đã được quan sát thấy giữa
khả năng gây bệnh của P.damselae ở chuột và cho sản lượng lớn một độc tố tiêu tế
bào. Chuẩn bị dly lấy từ phần tinh khiết trong môi trường nuôi cấy cho thấy khả
năng chống lại hồng cầu của 16 loài động vật homeotherm, và chuột là loài động vật
nhạy cảm hơn. Các nghiên cứu khác đã báo cáo rằng các sản phẩm ngoại bào của vi
khuẩn này cũng có hoạt tính gây dung huyết trên hồng cầu cá bơn. Một đặc tính sâu
sắc hơn về dly cho thấy nó có hoạt động D-phospholipase chống sphingomyelin,
phosphatidylcholine và phosphatidylethanolamine. Các gen độc tố dly, được nhân
bản vô tính và trình tự của nó đã được xác định. Tuy nhiên, bối cảnh của bộ gen của
gen dly vẫn khó nắm bắt, các quan sát ban đầu thấy rằng chủng cao huyết tán mang
lại đột biến tự phát và giảm đáng kể hoạt động tán huyết khi đã bị mất gen dly [13].
Nghiên cứu ban đầu đã chứng minh rằng, ảnh hưởng lớn nhất của khả năng
dung huyết của P.damselae gây nguy hiểm cho chuột. Trên thực tế, các nghiên cứu
trước đây đã báo cáo rằng liều gây tử vong cho người, cá gần như giống nhau đến
50% liều gây tử vong cho chuột. Các nghiên cứu khác đã báo cáo rằng, các chủng
thiếu gen dly vẫn cho thấy tính độc đối với chuột và cá, điều này chỉ ra rằng dly
không phải là một điều kiện tiên quyết cho độc lực vi khuẩn này [14, 21, 24]. Ngoài
ra, các sản phẩm ngoại bào của chủng độc lực không có sự hiện diện của gen dly

cũng gây chết cho cá và chuột, cũng như gây độc cho người [14, 21]. Điều này cho
thấy các yếu tố độc lực khác không phải là gen dly cũng có thể đóng một vai trò
quan trọng trong yếu tố gây bệnh của vi khuẩn này, nhưng bản chất của chúng vẫn
chưa được biết.
1.3.6. Khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn Photobacterium damselae
Theo nghiên cứu của Pasqualina Laganà và cộng sự (2011) [25], thử nghiệm
tính mẫn cảm của các chủng P.damselae phân lập ở một số trang trại nuôi trồng
thủy sản ở Ý cho thấy các chủng P.damselae phân lập có khả năng kháng với một
số loại kháng sinh bao gồm: ampicillin, carbenicillin, kanamycin, cefalothin; trong

14


khi đó lại mẫn cảm với các loại kháng sinh gồm: chloramphenicol, nitrofurantoin và
tobramycin.
Theo nghiên cứu của Toranzo et al. (1991), Bakopoulos et al. (1995) và
Sano (1998) các kháng sinh được sử dụng rộng rãi nhất để điều trị tụ huyết trùng
bao gồm Amoxicillin, Chloramphenicol, Erythromycin, Florfenicol, Flumequine,
axit oxolinic, oxytetracycline, nitrofurazone, trimethoprim sulfadiazine- và
tetracycline [11].
Tuy nhiên, Thyssen và Ollevier (2001) đã nghiên cứu tính nhạy cảm với một
số kháng sinh của P.damselae phân lập từ các khu vực địa lý khác nhau. Cho thấy,
phần lớn các chủng (93%) kháng với Erythromycin và một tỷ lệ thấp (dưới 10%)
kháng với Amoxicillin, Ampicillin, Florfenicol và Trimethoprim-sulfamethoxazole.
Trong khi đó các chủng vi khuẩn lại rất nhạy cảm với Kanamycin, Florfenicol và
trimethoprim-sulfamethoxazole [29].
Nghiên cứu khả năng kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn gây bệnh là cơ
sở quan trọng để đưa ra các biện pháp trong phòng và điều trị bệnh trên cá nuôi
biển. Hiện nay, chưa có một công trình nghiên cứu nào trong nước công bố về khả
năng kháng kháng sinh của vi khuẩn P.damselae phân lập tại Việt Nam.

1.3.7. Các phương pháp kiểm tra sự có mặt của Photobacterium damselae
Có nhiều phương pháp được sử dụng để phát hiện P.damselae như dựa vào
quan sát hình thái dưới kính hiển vi điện tử, các đặc tính sinh hóa và các kỹ thuật
sinh học phân tử như PCR, RAPD…
Theo Kudo và cộng sự, các loài P.damselae khi nuôi cấy trên môi trường chọn
lọc Thiosulfate Citrate Bile Salt Sucrose (TCBS) có khuẩn lạc màu xanh lá cây
[28]. Ngoài ra, P.damselae còn phát triển trên môi trường khác là môi trường thạch
nước biển cho thấy các khuẩn lạc có màu nâu đỏ hoặc trắng đục, trơn, tròn và lồi.

15


PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Các mẫu cá biển có các biểu hiện của bệnh tụ huyết trùng được thu thập ở
vùng biển quanh khu vực đảo Cát Bà.
2.1.2. Động vật thí nghiệm
Động vật thí nghiệm: Cá mú có trọng lượng 50-100g, khỏe mạnh được nuôi
trong bể nuôi phòng thí nghiệm.
2.1.3. Môi trường và hóa chất
Một số môi trường sử dụng cho phân lập và nuôi cấy
-

Môi trường Marine agar
Thành phần

Khối lượng

Peptone

5g

Cao nấm men

1g

Ferric citrate

0,1g

Sodium Chloride

19,45g

Magnesium Chloride

8,8g

Sodiumm Sulfate

3,24g

Cancium Chloride

1,8g

Potassium Chloride

0,55g

Sodium Bicacbonat

0,16g

Potassium Bromide

0,08g

Chloride Strantium

34mg

Acid Boric

22mg

Sodium Silicat

4mg

Sodium Fluorid

2,4mg

Ammonium nitrat

1,6mg

Disodium Phosphate

8mg

Agar

15g

Nước

1000ml

16


-

-

Môi trường Brain Heart Infusion (BHI) Broth
Thành phần

Khối lượng

Dịch não dê

200 g

Dịch tim bò

250 g

Polypeptone

10 g

NaCl

5g

Na2HPO4

2,5 g

Dextrose

2g

Nước cất

1000 ml

Môi trường Thiosulfate Citrate Bile Salt Sucrose (TCBS)
Thành phần

Khối lượng

Peptone

10 g

Cao nấm men

5g

Natri citrat

10 g

Natri thiosulfat

10 g

Mật bò khô

5g

Natri clorid

10 g

Natri cholat

3g

Feric citrat

1g

Sucrose

20 g

Dung dịch xanh thymol

4 ml

1%

17


Dung dịch xanh

20 ml

bromothymol 0,2%
Thạch sợi

-

15 g

Môi trường Indol:
Thành phần

Khối lượng

Tryptone

2%

Cao nấm men

0.5 %

NaCl

0.5 %

Peptone

1 %

18