Nghiên cứu vai trò của thuốc bắc trong sự hình thành hệ vi sinh vật của bánh men truyền thống việt nam

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
-----------

Formatted: Left: 1.38", Right: 0.79", Top:
0.98", Bottom: 0.98"
Formatted: Justified, Space Before: 0.9 pt,
After: 0.9 pt
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt

Formatted: Font: 5 pt

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài:

Nghiên cứu vai trò của thuốc bắc trong sự hình thành
hệ vi sinh vật của bánh men truyền thống Việt Nam
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt

Người hướng dẫn

: PGS.TS. VŨ NGUYÊN THÀNH

Sinh viên

: NGUYỄN THỊ THU

Niên khóa

: K18 -Lớp 11.02 -KS.CNSH

Formatted: English (United States)
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: 1.5 lines
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: 1.5 lines
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: 1.5 lines

Hà Nội - 2015

Formatted: Font: 14 pt


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong Khóa luận này là trung

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li

thực.
Tôi xin cam đoan, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện Khóa luận này đã được
cám ơn và các thông tin trích dẫn trong Khóa luận này đã được ghi rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2015
Sinh viên
Nguyễn Thị Thu

i


LỜI CẢM ƠN

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt

Trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu, em đã luôn nhận được rất nhiều
sự giúp đỡ, chỉ bảo, động viên của thầy cô, gia đình và bạn bè.
Lời đầu tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Vũ Nguyên Thành,
người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, tạo mọi điều kiện giúp em thực hiện khóa
luận này.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tập thể cán bộ Trung tâm Vi sinh vật
Công nghiệp, Viện Công nghiệp Thực phẩm đã luôn nhiệt tình giúp đỡ, tạo mọi điều
kiện để em hoàn thành tốt công việc.
Qua đây, em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô khoa công nghệ sinh học, Viện
Đại Học Mở Hà Nội đã tận tình dạy dỗ chúng em trong suốt 4 năm học qua.
Cuối cùng, em xin dành lời cảm ơn chân thành đến gia đình, người thân, bạn
bè những người luôn động viên, khích lệ em trên con đường học tập, làm quen với
công tác nghiên cứu khoa học.
Hà Nội, Ngày 20 tháng 5 năm 2015.
Sinh viên

Nguyễn Thị Thu
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li

ii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN
Formatted: English (United States)
Formatted: Normal, Space Before: 0.9 pt,
After: 0.9 pt

DNA

Deoxyribonucleic Acid

DNS

3,5 Dinitrosalicylic acid

dNTPs

Deoxyribonucleotide triphosphates

CFU

Colony-forming unit

OD

Opical Desity

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li

PCR

Polymerase Chain Reaction

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li

rDNA

Ribosomal Deoxyribonucleic Acid

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li

iii

Formatted: Font: 5 pt

DANH MỤC BẢNG
TT

Bảng

Nội dung

Trang

1

Bảng 1.1

Hệ vi sinh vật trong giống khởi động của các quốc gia Châu
Á

5
8

Formatted: Font: 11 pt, Font color: Auto,
English (United States)
Formatted: Normal, Space Before: 0.9 pt,
After: 0.9 pt
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li

2

Bảng 1.2

Thuốc bắc, thảo dược sử dụng cho men khởi động của các
quốc gia Châu Á

3

Bảng 3.1

Thành phần bánh men

2019

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li

4

Bảng 3.2

Tổng số các nhóm vi sinh vật trong bánh men

223

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li

5

Bảng 3.3

Số lượng nấm men trên môi trường thuốc bắc và không có
thuốc bắc

38

6

Bảng 3.4

Số lượng giả men trên môi trường có thuốc bắc và không có
thuốc bắc

389

7

Bảng 3.5

Số lượng vi khuẩn trên môi trường thuốc bắc và không có
thuốc bắc

39

8

Bảng 3.6

Kết quả phân tích một số chỉ tiêu dịch lên men

40

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9

pt
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li

iv


Formatted: Font: 11 pt, English (United
States)

DANH MỤC HÌNH
TT

Formatted: Normal, Space Before: 0.9 pt,
After: 0.9 pt

Hình

Nội dung

Trang

1

Hình 1.1

Quy trình sản xuất bánh men rượu

2

Hình 2.11

Quy trình làm bánh men

168

3

Hình 2.21

Quy trình lên men

179

4

Hình 3.1

Hình ảnh bánh men

212

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li

5

Hình 3.2

Hình ảnh phân lập bánh men trên môi trường Malt 2Bx có

kháng sinh Chloramphenicol

245

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li

6

Hình 3.3

Hình ảnh phân lập bánh men trên môi trường MRS có
kháng sinh Amphotericin B

2526

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li

5

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li

7

Hình 3.4

Hình thái khuẩn lạc và tế bào nấm mốc nuôi cấy trên môi
trường MT3

278

8

Hình 3.5

Phổ fingerprinting của 7 chủng nấm mốc

278

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt

9

Hình 3.6

Hình thái khuẩn lạc, tế bào nấm men nuôi cấy trên môi
trường MT3

2930

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li

10

Hình 3.7

Phổ fingerprinting của 4 chủng nấm men

2930

11

Hình 3.8

Hình thái khuẩn lạc, tế bào giả men nuôi cấy trên môi
trường MT3

312

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li

12

Hình 3.9

Phổ fingerprinting của 9 chủng giả men.

323

13

Hình 3.10

Hình thái khuẩn lạc và vi khuẩn trên môi trường MT4

345

14

Hình 3.11

Phổ fingerprinting của 9 chủng vi khuẩn

345

15

Hình 3.12

Hình ảnh khuẩn lạc nấm mốc trên môi trường có thuốc bắc
và không có thuốc bắc

378

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li

v

Formatted

... [1]

Formatted

... [2]

Formatted

... [3]

Formatted

... [4]


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN .....................................................................................................i
LỜI CẢM ƠN .........................................................................................................ii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN .......................................... iii
DANH MỤC BẢNG .............................................................................................. iv
DANH MỤC HÌNH ................................................................................................ v
MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ................................................................................... 2
1.1. Bánh men rượu và quá trình sản xuất rượu truyền thống Việt Nam ............... 2
1.1.1. Bánh men rượu ở Việt Nam .................................................................... 2
1.1.2. Vai trò của bánh men trong quá trình lên men rượu ............................. 222
1.1.3. Quy trình sản xuất bánh men thuốc bắc ................................................... 4
1.2. Hệ vi sinh vật trong bánh men ....................................................................... 5
1.2.1. Nấm mốc............................................................................................. 666
1.2.2. Nấm men............................................................................................. 666
1.2.3. Vi khuẩn ............................................................................................. 777
1.3. Thuốc bắc trong sản xuất bánh men rượu ...................................................... 8

1.3.1. Các vị thuốc bắc thường sử dụng trong sản xuất bánh men...................... 8
1.3.2. Vai trò của thuốc bắc trong sản xuất bánh men ........................................ 9
CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......... 101011
2.1. Nguyên liệu, dụng cụ, thiết bị, hóa chất ............................................... 101011
2.1.1. Nguyên liệu ................................................................................... 101011
2.1.2. Hóa chất ........................................................................................ 101011
2.1.3. Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm .......................................................... 111012
2.1.4. Môi trường .................................................................................... 111112
2.2. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................... 121213
2.2.1. Phương pháp vi sinh ...................................................................... 121213
2.2.2. Phương pháp phân tích .................................................................. 131315
2.2.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm ...................................................... 161617
PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 191920
3.1. Thành phần hệ vi sinh vật trong bánh men........................................... 191920
3.1.1. Bánh men thành phẩm ................................................................... 191920
3.1.2. Kết quả phân lập vi sinh vật trong các mẫu bánh men ................... 212122
3.1.3. Các nhóm vi sinh vật phân lập từ bánh men .................................. 232324
vi

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li


3.2. Ảnh hưởng của thuốc bắc tới chủng vi sinh vật ................................... 353536

3.2.1. Ảnh hưởng của thuốc bắc tới nấm mốc ......................................... 353536
3.2.2. Ảnh hưởng của thuốc bắc tới nấm men ......................................... 373738
3.2.3. Ảnh hưởng của thuốc bắc tới giả nấm men .................................... 383839
3.2.4. Ảnh hưởng của thuốc bắc tới vi khuẩn .......................................... 393939
3.3. Kết quả lên men từ bánh men .............................................................. 393940
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................... 424243
Kết luận: .................................................................................................... 424243
Kiến nghị: .................................................................................................. 424243
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 434344

vii


Viện Đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

Formatted: Border: Bottom: (Double solid
lines, Auto, 0.5 pt Line width)
Formatted: Font: 4 pt
Formatted: Font color: Black

MỞ ĐẦU
Từ rất lâu đồ uống có cồn đã gắn liền với đời sống của con người. Có rất nhiều
loại đồ uống có cồn được sản xuất và tiêu thụ trên toàn thế giới như rượu, rượu
vang, bia và một số đồ uống có nồng độ cồn thấp khác. Trong đó mỗi sản phẩm đều
mang đậm tính đặc trưng đóng vai trò to lớn trong đời sống văn hóa và tinh thần của
con người.
Ở Việt Nam thưởng thức rượu là một nét văn hóa mang đậm bản sắc riêng của
từng vùng, từng dân tộc. Rượu được sản xuất ở hầu hết các nơi ở nước ta với nhiều

vùng sản xuất rượu nổi tiếng như: Rượu làng Vân Hà (Bắc Giang), rượu Mẫu Sơn
(Lạng Sơn), rượu Bầu Đá (Bình Định), rượu Đế (Nam Bộ), rượu Kim Sơn (Ninh
Bình) v.v…Tùy thuộc vào thành phần và quy trình sản xuất mà rượu có nhiều tên
gọi khác nhau như rượu trắng, rượu gạo, rượu nếp, rượu cần… Không những thế
rượu truyền thống còn đóng góp vào việc phát triển kinh tế, đặc biệt kinh tế hộ gia
đình ở nông thôn nước ta.
Sản xuất rượu truyền thống thường sử dụng men giống dạng viên, bánh được
chuẩn bị ở điều kiện thủ công do một số hộ gia đình tự sản xuất. Việc sản xuất bánh
men ở mỗi hộ gia đình, mỗi địa phương có sự khác nhau chính điều đó một phần
dẫn đến sự đa dạng giữa các dòng rượu của mỗi địa phương, mỗi gia đình. Hiện
nay, với xu thế muốn bảo tồn và phát triển rượu lên men truyền thống các công ty
sản xuất rượu cũng bắt đầu chú trọng vào sử dụng bánh men trong quá trình sản
xuất rượu truyền thống trên quy mô công nghiệp. Nhu cầu về bánh men và chất
lượng bánh men đặt ra nhiều thách thức cho các nhà sản xuất rượu truyền thống
muốn áp dụng trên quy mô công nghiệp.
Thành phần chính của sản xuất bánh men là men giống khởi động, cơ chất giữ
và một số thuốc bắc, thảo mộc được bổ sung. Việc sản xuất bánh men hiện nay chủ
yếu là việc truyền lại từ đời này sang đời khác của hộ gia đình vì vậy bánh men
mang tính chất địa phương và gia đình cao. Với mong muốn hiểu rõ hơn về bánh
men góp phần bảo tồn lưu giữ bánh men truyền thống, đề tài: “Nghiên cứu vai trò
của thuốc bắc trong sự hình thành hệ vi sinh vật của bánh men truyền thống Việt
Nam” được thực hiện.

Formatted: Font: 7 pt, English (United States)
Formatted: Normal, Space Before: 0.9 pt,
After: 0.9 pt

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li
Formatted: Font color: Black

Formatted: Space Before: 0 pt, After: 8 pt,
Border: Top: (Double solid lines, Auto, 0.5 pt
Line width)
Formatted: Font color: Black, Check spelling
and grammar
Formatted: Font color: Black

Nguyễn Thị Thu

1


Formatted: Font: 4 pt

Viện Đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

Formatted: Border: Bottom: (Double solid
lines, Auto, 0.5 pt Line width)
Formatted: Font color: Black

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Bánh men rượu và quá trình sản xuất rượu truyền thống Việt Nam
1.1.1. Bánh men rượu ở Việt Nam
Một số quốc gia Châu Á và Việt Nam có nhiều thế kỷ sản xuất rượu truyền
thống từ ngũ cốc. Quá trình lên men được thực hiện bởi các giống khởi động với
nhiều tên gọi khác nhau như Bukhar, Murcha (Ấn Độ), Ragi (Indonesia), Budbod
(Philippines), Look-pang (Thái Lan). Các giống khởi động được chuẩn bị theo
nhiều cách khác nhau nhưng bản chất đó chính là quá trình nuôi cấy và bảo quản vi

sinh vật trên môi trường tinh bột sống ở trạng thái khô.
Ở Việt Nam, bánh men rượu chủ yếu theo phương pháp thủ công truyền thống
đã có từ lâu đời, mỗi vùng sản xuất rượu có một bí quyết làm bánh men riêng. Dựa
vào thành phần thuốc bắc hay thảo mộc bổ sung mà bánh men Việt Nam hiện nay
chia thành 2 nhóm chính men lá, men thuốc bắc.
1.1.1.1. Men thuốc bắc
Ở Việt Nam, trong các loại bánh men thì bánh men thuốc bắc được sử dụng phổ
biến hơn cả. Nguyên liệu để sản xuất bánh men gồm có bột gạo hoặc bột sắn, được
trộn với men giống và các vị thuốc bắc khác nhau. Các thành phần này với liều
lượng khác nhau ở mỗi địa phương, ở từng gia đình và được xem là bí quyết gia
truyền. Bột gạo, thuốc bắc, thảo mộc được nghiền nhỏ được trộn với giống khởi
động từ một lô trước đó, được định hình tròn nhỏ hoặc dẹt phẳng, ủ 30ºC trong
khoảng một tuần. Trong thời gian này hệ vi sinh vật phát triển và bánh men bị mất
nước. Các bánh men này có thể bảo quản được ở nhiệt độ thường mà không làm
giảm khả năng sống của vi sinh vật trong ít nhất sáu tháng [22].
1.1.1.2. Men lá
Men lá thường được sử dụng ở các vùng núi cao. Người dân dùng các lá cây có sẵn
ở miền núi thay cho các vị thuốc bắc. Lá sử dụng thường là các loại có nhiều tinh
dầu, có mùi thơm. Tùy thuộc vào từng địa phương mà có các bài lá khác nhau. Mùi
vị của rượu thành phẩm phụ thuộc rất nhiều vào các loại lá, vào tỷ lệ sử dụng chúng
trong bánh men. Để làm men lá người K’Ho Tây Nguyên sử dụng một thân cây “
đòng” và nước triết cây “ me-kà-zut” trộn với bột gạo [3].
“đòngˮ và nước chiết cây “me-kà-zutˮ trộn với bột gạo [3].
1.1.2. Vai trò của bánh men trong quá trình lên men rượu
1.1.2.1. Quá trình sản xuất rượu truyền thống từ bánh men
Tùy thuộc vào nguồn nguyên liệu sử dụng, quy trình, công nghệ chưng cất và
quy mô sản xuất có thể thay đổi nhưng nhìn chung quá trình sản xuất rượu truyền
thống ở Việt Nam có thể tóm tắt như sau [2, 3, 8, 10]:
Nguyễn Thị Thu

2

Formatted: Font: 6 pt, English (United States)
Formatted: Normal, Space Before: 0.9 pt,
After: 0.9 pt
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt

Formatted: Indent: First line: 0", Space
Before: 0.9 pt, After: 0.9 pt

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt
Formatted: Indent: First line: 0", Right: 0",
Space Before: 0.9 pt, After: 0.9 pt

Formatted: Normal, None, Space Before: 0.9
pt, After: 0.9 pt
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt
Formatted: Font color: Black
Formatted: Space Before: 0 pt, After: 8 pt,
Border: Top: (Double solid lines, Auto, 0.5 pt
Line width)
Formatted: Font color: Black, Check spelling
and grammar
Formatted: Font color: Black

Formatted: Font: 4 pt

Viện Đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

Quá trình đường hóa: Từ các nguyên liệu như gạo, ngô, sắn được nấu chín,
sau đó được tãi nguội, khi nhiệt độ khoảng 37°C, tiến hành rắc men, ủ đống trên
nong nia qua đêm. Mục đích của quá trình này là giúp cho nấm mốc và nấm men
sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym đường hóa tinh bột. Tiếp đến khối ủ được dàn
mỏng đến độ dày khoảng 15-20 cm trong thúng nót nilon, phía trên phủ một lớp
mỏng lá chuối sạch. Khi khối cơm ủ trở nên mềm và ngọt quá trình đường hóa kết
thúc.
Quá trình lên men: Đường được tạo ra trong quá trình đường hóa được lên men
tạo rượu. Trong sản xuất rượu làng nghề, hiện nay vẫn tồn tại hai phương pháp lên
men đó là: lên men rắn và lên men lỏng.
Ở miền xuôi, quá trình lên men thường được thực hiện theo công nghệ lên men
lỏng. Gạo, sắn sau khi đã mền và ngọt, toàn bộ khối cơm ủ được chuyển vào chum
sành, nước mưa được đưa thêm vào theo tỉ lệ 1:1, lên men ở 28-30°C trong 3-5 ngày.
Trong sản xuất rượu truyền thống thời gian lên men thay đổi dài ngắn theo mùa trong
năm, mùa đông thời gian lên men thường kéo dài hơn mùa hè. Nhược điểm của công
nghệ này là quá trình lên men diễn ra nhanh và mạnh, nhiệt độ lên men thường tăng
cao, do đó hương thơm kém, hàm lượng tạp chất và các chất không mong muốn khác
cao.
Ở các vùng núi cao, với nguyên liệu dùng cho sản xuất rượu cổ truyền là ngô,
sắn thường tiến hành theo công nghệ lên men rắn. Sau quá trình đường hóa ngô, sắn
trở nên ngọt và mềm. Toàn bộ khối ngô được cho vào túi nilon buộc kín. Quá trình
lên men diễn ra trong 7-10 ngày, sau đó đem chưng cất. Ưu điểm của công nghệ này
là quá trình lên men chậm, rượu thơm hơn và ít tạp chất hơn. Nhược điểm của nó là

thời gian lên men dài.
Quá trình chưng cất: Hiện nay việc chưng cất rượu truyền thống đang tồn tại
hai công nghệ chưng cất đó là: Cất “ruột gà” và cất “thượng thủy”. Rượu chưng cất
bằng công nghệ thượng thủy thường có chất lượng tốt hơn rượu chưng cất ruột gà.
Sau quá trình chưng cất nồng độ cồn có thể đạt tới 50% v/v (khoảng 40%
w/v). Năng suất, hương vị và các thành phần chứa trong sản phẩm lên men tự nhiên
này dường như khó có thể dự đoán trước. Điều này, tạo ra nét đặc trưng riêng mang
đậm tính thủ công truyền thống cho từng loại rượu khác nhau [24].
1.1.2.2. Vai trò của bánh men trong lên men rượu
Bánh men thực chất là một hỗn hợp các giống khởi động (Starter culture),
dùng cho quá trình sản xuất rượu. Vai trò của bánh men trong quá trình lên men
chính là nhờ hệ vi sinh vật trong bánh men. Trong đó nhóm nấm mốc và vi sinh vật
sinh ra enzyme amylase chuyển hóa tinh bột thành đường, nấm men biến đổi các
đường này thành rượu [20, 21, 23].

Formatted: Border: Bottom: (Double solid
lines, Auto, 0.5 pt Line width)
Formatted: Font color: Black

Formatted: Font color: Black
Formatted: Space Before: 0 pt, After: 8 pt,
Border: Top: (Double solid lines, Auto, 0.5 pt
Line width)
Formatted: Font color: Black, Check spelling
and grammar
Formatted: Font color: Black

Nguyễn Thị Thu

3

Formatted: Font: 4 pt

Viện Đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

Giai đoạn đầu vi khuẩn phát triển hình thành các axit hữu cơ (axit hóa dịch
đường trước khi lên men) pH giảm xuống tạo điều kiện cho các loại nấm mốc phát
triển, nấm men cũng bắt đầu phát triển nhưng tốc độ chậm hơn nấm mốc [3]. Quá
trình chuyển hóa tinh bột thành đường nhờ các loại nấm mốc như Rhizopus arrhizus
(=Amylomyces rouxii, Rhizopus oryzae), R. microsporus, Mucor sp… tạo ra
amylase (α-amylase, glucoamylase) [4]. Quá trình chuyển hóa đường thành rượu
chủ yếu nhờ nấm men Saccharomyces cerevisiae, một số loài khác như Pichia
anomala, Candida spp. cũng có khả năng tham gia vào quá trình chuyển hóa này
[4].
1.1.3. Quy trình sản xuất bánh men thuốc bắc
Quá trình sản xuất bánh men là quá trình làm tăng sinh khối các vi sinh vật cần
cho sản xuất rượu và giữ chúng ở trạng thái nghỉ, dạng khô trên môi trường bột gạo
[8]. Nguyên liệu chính dùng để sản xuất bánh men là bột gạo (chiếm 90-95%); còn
lại là các vị thuốc bắc và men cái. Quy trình sản xuất bánh men được tóm tắt như
sau:
Gạo được vo sạch, ngâm 1-2 giờ, để ráo, xay thành bột. Bột gạo được trộn với
bột các vị thuốc bắc và bột men giống (gọi là giống cái) lưu trữ từ các mẻ trước đó
theo tỷ lệ 5% men giống cho 1 kg bột gạo ẩm. Hỗn hợp trên được trộn đều, bổ sung
nước đến hàm ẩm khoảng 50 ÷ 60%. Nặn thành viên tròn, dẹt, có đường kính
khoảng 3 ÷ 5cm. Xoa bột men cái sau đó đặt bánh men lên một lớp trấu mới trải
trên nong, mành sạch, tạo điều kiện thoáng khí. Đậy bánh men bằng nong hoặc phủ
trên mặt bánh men bằng lớp rơm sạch, ủ ở nhiệt độ 30°C trong khoảng 2 ÷ 3 ngày

khi thấy bánh men phồng nở đều và xung quanh bánh men mọc lông tơ, xốp, nhẹ thì
để ra chỗ thoáng, mát. Tiếp theo men được sấy tới độ ẩm khoảng 10-12%. Men
thành phẩm được sâu thành chuỗi và bảo quản trên gác bếp. Qua quá trình sấy, vi
sinh vật trong bánh men chuyển từ trạng thái hoạt động sang trạng thái nghỉ. Chúng
sẽ nhanh chóng hoạt động trở lại trong điều kiện môi trường, nhiệt độ và độ ẩm
thích hợp, hệ nấm mốc và nấm men sẽ sinh tổng hợp enzyme đường hóa và rượu
hóa [4, 9].

Formatted: Border: Bottom: (Double solid
lines, Auto, 0.5 pt Line width)
Formatted: Font color: Black

Formatted: Font color: Black
Formatted: Space Before: 0 pt, After: 8 pt,
Border: Top: (Double solid lines, Auto, 0.5 pt
Line width)
Formatted: Font color: Black, Check spelling
and grammar
Formatted: Font color: Black

Nguyễn Thị Thu

4


Formatted: Font: 4 pt

Viện Đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

Formatted: Border: Bottom: (Double solid
lines, Auto, 0.5 pt Line width)
Formatted: Font color: Black

Gạo ngâm nước

Formatted Table

Xay thành bột
Nhào bột

Các vị thuốc bắc
hoặc thuốc nam, men
giống, nước.

Định hình bánh men
Ủ men
Sấy khô

Bánh men thành
phẩm

Hình 1.1: Quy trình sản xuất bánh men rượu.
1.2. Hệ vi sinh vật trong bánh men
Đã có nhiều nghiên cứu về các nhóm vi sinh vật trong giống khởi động dùng
cho lên men rượu ở một số quốc gia Châu Á. Giống khởi động sử dụng cho quá
trình lên men rượu có hệ vi sinh vật khá đa dạng (Bảng 1.1) [12, 19, 22, 27, 28, 29].
Bảng 1.1: Hệ vi sinh vật trong giống khởi động của các quốc gia Châu Á.

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt

Formatted: Left, Space Before: 0.9 pt, After:
0.9 pt
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt

Tên gọi

Tên nước

Hệ vi sinh vật

Bakhar

Ân Độ

Mucor spp., Rhizopus spp., Amylomyces spp.

Bubud

Philippines

Mucor spp., Rhizopus spp., Amylomyces spp., Candida
spp., Saccharomyces spp., Saccharomycopsis spp.,
Torulopsis spp.

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt

Chu

Trung Quốc

Aspergillus oryzae, Rhizopus spp.

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt

Look-pang

Thái Lan

Mucor spp., Chlamydomucor oryzae, Candida spp.,
Saccharomycopsis fibuligera

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt

Bánh men

Việt Nam

Rhizopus spp., Mucor spp., Saccharomycopsis fibuligera,
Saccharomyces cerevisiae, Pichia spp., Candida spp.,

Murcha

Nepal

Mucor spp., Rhizopus spp., Saccharomyces cerevisiae,
Saccharomycopsis fibuligera

Formatted: Space Before: 0 pt, After: 8 pt,
Border: Top: (Double solid lines, Auto, 0.5 pt
Line width)

Nurook

Hàn Quốc

Aspergillus oryzae, A. niger, Rhizopus spp., Penicillium

Formatted: Font color: Black, Check spelling
and grammar

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt
Formatted: Font color: Black

Formatted: Font color: Black

Nguyễn Thị Thu

5


Formatted: Font: 4 pt

Viện Đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

Formatted: Border: Bottom: (Double solid
lines, Auto, 0.5 pt Line width)
Formatted: Font color: Black

spp., Mucor spp., Pichia anomala
Ragi

Indonesia

Mucor spp., Rhizopus spp., Aspergillus spp., Amylomyces
spp., Penicillium spp., Candida spp., Saccharomyces spp.,
Saccharomycopsis spp., Pichia spp., Candida spp.

Tapai

Malaysia

Amylomyces rouxii, Rhizopus spp., Saccharomycopsis spp.,

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9

pt

Hệ vi sinh vật trong bánh men là sự kết hợp đa dạng của nấm và vi khuẩn.
Thành phần nấm trong bánh men rất ít thay đổi. Nó bao gồm các loài sinh amylase
(Rhizopus oryzae, R. microsporus, Mucor spp., Saccharomycopsis fibuligera), các
loài sản sinh ethanol (Saccharomyces cerevisiae, Issatchenkia orientalis., Pichia
anomala, Candida tropicalis, P. ranongensis, Clavispora lusitaniae) và các sinh vật
(cơ hội) tạp nhiễm (Xeromyces bisporus, Botryobasidium subcoronatum). Trong
bánh men các vi khuẩn thay đổi rất lớn về thành phần loài và bị chi phối bởi các vi
khuẩn lactic (LAB). Các LAB thường gặp nhất là Pediococcus pentosaceus,
Lactobacillus plantarum, L. Brevis, Weissella confusa, và W. paramesenteroides.
Loài vi khuẩn Bacillus sản sinh amylase (Bacillus subtilis, B. circulans, B.
amyloliquefaciens, B. sporothermodurans), vi khuẩn sinh acetic acid (Acetobacter
orientalis, A. pasteurianus), và các vi khuẩn tạp nhiễm (Burkholderia ubonensis,
Ralstonia solanacearum, Pelomonas puraquae) [30] Theo A.C. Lee và Y. Fujio
[19] thì hệ vi sinh vật trong bánh men Việt Nam ngoài những loài trên còn có:
Mucor indicus, Mucor circinilloides và Hyphopichia burtonii, v.v.
1.2.1. Nấm mốc
Trong bánh men thuốc bắc có nhiều loại nấm mốc phát triển thuộc nhóm
Rhizopus oryzae, R. microsporus, Mucor spp. Số loại nấm mốc phụ thuộc vào các
yếu tố như: nhiệt độ, nơi sản xuất bánh men….Nhưng trong đó Rhizopus và Mucor
thấy phát triển nhiều hơn cả [7].
1.2.1.1. Rhizopus
Rhizopus spp. có màu trắng xám, rễ giả màu vàng, bọc bào tử hình cầu, bào
tử kín, phân nhánh. Chúng phân bố rộng rãi trong đất, ngũ cốc, rau quả...và có khả
năng sinh enzyme amylase, protease...
1.2.1.2. Mucor
Mucor là loại nấm màu trắng, bọc bào tử hình cầu màu trắng hoặc nhạt màu,
có hệ sợi hình ống, dạng nhung hoặc len, không có thân bò (Stolon) cuống bọc bào
tử dựng đứng, luôn luôn tận cùng bằng bọc bào tử, đơn độc hoặc phân nhánh.

1.2.2. Nấm men
Nấm men là nhóm vi sinh vật có cấu tạo đơn bào và nhân chuẩn (Eukaryote)
thường sinh sản bằng cách nẩy chồi. Hình dạng nấm rất phong phú, phụ thuộc vào
giống loài, nó có dạng hình cầu, hình trứng, hình bầu dục… Đối với nấm men trong

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt
Formatted: Font: 6 pt
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt

Formatted: Font color: Black
Formatted: Space Before: 0 pt, After: 8 pt,
Border: Top: (Double solid lines, Auto, 0.5 pt
Line width)
Formatted: Font color: Black, Check spelling
and grammar
Formatted: Font color: Black

Nguyễn Thị Thu

6


Viện Đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

quá trình hoạt động sống, chúng đồng hóa đường trong điều kiện yếm khí, thải ra
môi trường xung quanh sản phẩm dị hóa là ethanol và CO2 nhờ tác dụng của một

phức hệ các enzyme. Đây là một trong những đặc trưng quan trọng của nấm men đã
được nhân dân ta ứng dụng từ lâu đời để sản xuất rượu bằng bánh men thuốc bắc.
Trong mỗi gam bánh men có từ vài chục triệu đến vài trăm triệu tế bào nấm men.
Gồm 2 chi khác nhau: Saccharomyces (chủ yếu là Saccharomyces cerevisiae) và
Saccharomycopsis (chủ yếu là Saccharomycopsis fibuligera) [2].
1.2.2.1. Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae có tế bào hình tròn hoặc ovan, kích thước khoảng 3
– 10 × 5 - 12 µl. Là loài nấm men lên men nổi, kị khí không bắt buộc. Sinh sản vô
tính theo kiểu nẩy chồi, phân đôi bào tử. Trong điều kiện đầy đủ oxy, nấm men sinh
trưởng làm tăng sinh khối. Trong điều kiện kị khí, chúng tiến hành lên men rượu
thu năng lượng, chuyển đường thành rượu. Vì vậy trong giai đoạn đầu của quá trình
lên men người ta thường bổ sung oxy vào môi trường lên men để thúc đẩy sự sinh
trưởng của nấm men, tạo sinh khối. Sacchromyces cerevisiae có khả năng lên men
nhiều loại đường khác nhau như glucose, saccharose, fructose, maltose... Nhiệt độ
tối ưu cho chúng phát triển là 25 - 30˚C, nhiệt độ tối thiểu 2 - 3˚C. Ở 40˚C thì
ngừng sinh trưởng và chết.
1.2.2.2. Saccharomycopsis fibuligera
Saccharomycopsis là loại giả nấm men có khả năng sinh tổng hợp enzyme
amylase và glucoamylase. Có tính chất tương tự như S. cerevisiae, sinh sản dinh
dưỡng bằng nẩy chồi. Tế bào có hình bầu dục nối tiếp nhau thành những dạng sợi
gọi là khuẩn ty.
Theo những nghiên cứu gần đây, nấm men trong bánh men rượu gạo của Việt
Nam có thể phát triển trên môi trường có hàm lượng glucose tương đối cao, đặc biệt
các chủng nấm men trong bánh men thuốc bắc có khả năng chịu được thuốc sát
trùng Na2SiF6 với nồng độ 0,02 – 0,025%. Đặc điểm này rất thuận lợi cho lên men
khi cần sử dụng thuốc sát trùng. Quan trọng hơn hết là loài nấm men này có khả
năng lên men các loại nguyên liệu khác nhau như gạo, ngô, khoai, sắn. Nồng độ
rượu trong dịch lên men là 10 -12%. Nhiệt độ lên men thích hợp là từ 28 - 32ºC.
1.2.3. Vi khuẩn
Trong bánh men thuốc bắc có nhiều loại vi khuẩn phát triển. Nhưng chủ yếu là

vi khuẩn Lactobacillus spp. Acerobacter spp., Bacillus ssp.. Hai nhóm đầu thường
làm chua môi trường. Thời gian đầu quá trình lên men, quá trình này xảy ra có lợi
vì pH môi trường do chúng tạo ra sẽ thích hợp cho nấm men và nấm mốc phát triển.
Tuy nhiên pH xuống quá thấp lại ảnh hưởng cho quá trình lên men. Mặt khác trong
giai đoạn sau nếu dịch lên men có oxy thì vi khuẩn acetic sẽ oxy hóa rượu thành
acid acetic, làm giảm lượng cồn tạo thành, không có lợi. Vi khuẩn nhóm Bacillus có
Nguyễn Thị Thu

7

Formatted: Border: Bottom: (Double solid
lines, Auto, 0.5 pt Line width)
Formatted: Font: 4 pt
Formatted: Font color: Black

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt

Formatted: Font color: Black
Formatted: Space Before: 0 pt, After: 8 pt,
Border: Top: (Double solid lines, Auto, 0.5 pt
Line width)
Formatted: Font color: Black, Check spelling
and grammar
Formatted: Font color: Black


Viện Đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

khả năng thủy phân tinh bột mạnh. Trong một số nghiên cứu, người ta bổ sung vào
chế phẩm bánh men nhiều chủng giống vi khuẩn có khả năng chuyển hóa tinh bột
thành đường: B. subtillis, B. diastaticus…
1.3. Thuốc bắc trong sản xuất bánh men rượu
1.3.1. Các vị thuốc bắc thường sử dụng trong sản xuất bánh men
Việc sử dụng thuốc bắc cũng như các loại thảo dược khá phổ biến trong quá
trình sản xuất giống khởi động ở các nước châu Á (Bảng 1.2) [1, 13, 14, 16, 17, 18,
25, 26, 31, 32].

Formatted: Border: Bottom: (Double solid
lines, Auto, 0.5 pt Line width)
Formatted: Font: 4 pt
Formatted: Font color: Black

Bảng 1.2: Thuốc bắc, thảo dược sử dụng cho men khởi động của các quốc gia Châu Á.
Tên nước

Cây hoặc vị thuốc

Trung Quốc
Việt Nam
Lào

Phụ tử, Đỗ quyên, Hoàng cầm,…

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt

Thảo quả, Tế tân, Bạch truật, Quế, Uất kim (nghệ vàng), Tiểu hồi,
Cam thảo, Bạc hà, Nhục đậu khấu, Đinh hương,…

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt

Binh lang (hạt cau), Ớt, Đu đủ (lá), Giã tử (dừa), Yên thảo (thuốc lá),
Trầu không, Mía, Cà (lá, quả), Gừng,…

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt

Thái Lan

Gừng

Malaysia

Quế, Hạt tiêu, Gừng,…

Indonesia

Hành, Riềng, Ớt, Quế, Chỉ xác, Giã tử (dừa), Tiểu hồi, Hạt tiêu,
Mía,…

Philippines

Đơn kim, Mía, Gừng,…

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt

Ở Việt Nam, với kinh nghiệm gia truyền, ở mỗi địa phương khác nhau, thậm
chí ở từng gia đình nhất định, số vị thuốc bắc trong một bài thuốc được dùng là rất
khác nhau. Công thức nhiều vị nhất có tới 38 vị, công thức ít chỉ có 4 vị [9]. Trong
quá trình làm bánh men các vị thuốc bắc được nghiền nhỏ trộn với bột gạo và men
cái. Tỷ lệ thuốc bắc với bột gạo khá khác nhau giữa các bài thuốc. Tỷ lệ thuốc bắc
thường sử dụng là 5 – 10% so với bột gạo, có bài thuốc tỷ lệ thuốc bắc vào khoảng 2 %.
Một số bài thuốc bắc được sử dụng phổ biến trong sản xuất bánh men thuốc
bắc như sau [6, 9]
•
Công thức bài thuốc 10 vị:

•

Formatted: Font: 6 pt
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt

Formatted: Condensed by 0.3 pt
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9

pt
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt

Nhục đậu khấu

4,5 g

Đại hồi

5,0 g

Quế chi

3,5 g

Tế tân

1,0 g

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt

Bạch truật

1,0 g

Liên kiều

1,5 g

Formatted: Font color: Black

Cam thảo

3,5 g

Tiểu hồi

1,5 g

Thảo quả

3,5 g

Sa nhân

5,5 g

Formatted: Space Before: 0 pt, After: 8 pt,
Border: Top: (Double solid lines, Auto, 0.5 pt
Line width)
Formatted: Font color: Black, Check spelling
and grammar

Công thức bài thuốc 8 vị:

Formatted: Font color: Black

Nguyễn Thị Thu

8


Viện Đại học Mở Hà Nội

•

•

•

Khoa Công nghệ sinh học

Formatted: Border: Bottom: (Double solid
lines, Auto, 0.5 pt Line width)
Formatted: Font: 4 pt

Nhục đậu khấu

4,5 g

Thảo quả

3,5 g

Formatted: Font color: Black

Quế chi

3,5 g

Tế tân

1,0 g

Bạch truật

1,0 g

Liên kiều

1,5 g

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt

Cam thảo

3,5 g

Tiểu hồi

1,5 g

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9

pt

Công thức bài thuốc 6 vị:
Nhục đậu khấu

4,5 g

Thảo quả

3,5 g

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt

Quế chi

3,5 g

Tế tân

1,0 g

Bạch truật

1,0 g

Cam thảo

3,5 g

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt

Công thức bài thuốc 4 vị:
Nhục đậu khấu

4,5 g

Thảo quả

3,5 g

Quế chi

3,5 g

Bạch truật

1,0 g

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt

Công thức bài thuốc 5 vị
Đại hồi

6g

Thảo quả

1,5 g

Quế chi

7g

Sa nhân

1,0 g

Tiểu hồi

5g

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt

1.3.2. Vai trò của thuốc bắc trong sản xuất bánh men
Theo những nghiên cứu trước đây, vai trò của các vị thuốc bắc trong bánh men
có thể chia làm 4 nhóm sau [1]:
- Nhóm chất có tác dụng dược lý sát trùng.
- Nhóm tăng cường sức đề kháng cho nấm mốc, nấm men.
- Nhóm đóng vai trò thúc đẩy sự trao đổi chất của nấm mốc, nấm men.
- Nhóm cung cấp hương gốc cho rượu.

Theo nghiên cứu của Nguyễn Văn Hiệu (1993) cho thấy trong bánh men thuốc
bắc nhờ có các vị thuốc với thành phần hợp lý mà chúng có hai vai trò chính là kích
thích sự phát triển của nấm men và ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây hại
[9]. Theo nghiên cứu Ngô Thị Phương Dung (2004) “Tiểu Hồi” và “Đinh Hương”
là có tác dụng kích thích sự sinh trưởng của nấm mốc và nấm men [24]. Mặt khác
các vị thuốc bắc đều có mùi thơm. Các hợp chất thơm này có thể phản ứng với nhau
và với những hợp chất khác, tạo ra những hợp chất mới. Kết quả tạo ra mùi vị đặc
trưng cho rượu cổ truyền.

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li
Formatted: Indent: First line: 0", Space
Before: 0.9 pt, After: 0.9 pt

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li
Formatted: Font color: Black
Formatted: Space Before: 0 pt, After: 8 pt,
Border: Top: (Double solid lines, Auto, 0.5 pt
Line width)
Formatted: Font color: Black, Check spelling
and grammar
Formatted: Font color: Black

Nguyễn Thị Thu

9


Viện Đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

Formatted: Border: Bottom: (Double solid
lines, Auto, 0.5 pt Line width)
Formatted: Font: 4 pt
Formatted: Font color: Black

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu, dụng cụ, thiết bị, hóa chất
2.1.1. Nguyên liệu
- Các chủng vi sinh vật: các chủng chuẩn Aspergillus brasiliensis ATCC
16404, Candida albicans ATCC 10231, E. coli ATCC 25922 trong bộ sưu tập giống
của Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp, Viện Công nghiệp thực phẩm.
- Mẫu bánh men làng Vân, Bắc Giang.
- Gạo Q5 xát rối, gạo Bắc Hương, trấu, nước: Yêu cầu gạo không ẩm mốc,
không có côn trùng, không mối mọt.
- Các bài thuốc bắc: bài thuốc bắc 10 vị, 5 vị, các bài thuốc bắc tổng hợp:
+ Bài thuốc 10 vị (CT1):

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt

Formatted: Indent: First line: 0.38", Space
Before: 0.9 pt, After: 0.9 pt

Nhục đậu khấu

4,5 g

Đại hồi

5,0 g

Quế chi

3,5 g

Tế tân

1,0 g

Bạch truật

1,0 g

Liên kiều

1,5 g

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt

Cam thảo

3,5 g

Tiểu hồi

1,5 g

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt

Thảo quả

3,5 g

Sa nhân

5,5 g

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt

+ Bài thuốc 5 vị (CT4):
Đại hồi

6g

Thảo quả

1,5 g

Quế chi

7g

Sa nhân

1,0g

Tiểu hồi

5g

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt
Formatted: Indent: First line: 0.5", Space
Before: 0.9 pt, After: 0.9 pt, Tab stops: Not at
0" + 1.87" + 3.25" + 4.33" + 4.93"

+ Bài thuốc tổng hợp Kim Sơn, Ninh Bình (CT5).
+ Bài thuốc tổng hợp Chương Mỹ, Hà Nội (CT6).
2.1.2. Hóa chất
- Hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu đều là các hóa chất tinh khiết và
chuyên dụng. Các hóa chất dùng cho sinh học phân tử phần lớn có nguồn gốc từ các
hãng: Sigma (Mỹ), Merck (Đức), Difco (Mỹ), Invitrogen (Mỹ), Fermentas (Đức),
Roth (Đức).
- Hóa chất dùng cho nuôi cấy: Peptone, Meat Extract, Yeast Extract, DGlucose, Polysorbate 80, Ammonium Citrate, Sodium Acetate, Magnesium Sulfate,
Manganese Sulfate, Dipotassium Phosphate, Agar, Malt, Chloramphenicol,
Amphotericin B. Các hóa chất dùng cho nuôi cấy, phân tích có nguồn gốc từ Thụy

Điển, Việt Nam, Trung Quốc.

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Tab stops: 0", Right,Leader: … + Not at 1"
+ 2" + 2.18"
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt
Formatted: Font color: Black
Formatted: Space Before: 0 pt, After: 8 pt,
Border: Top: (Double solid lines, Auto, 0.5 pt
Line width)
Formatted: Font color: Black, Check spelling
and grammar
Formatted: Font color: Black

Nguyễn Thị Thu

10

Formatted: Font: 4 pt

Viện Đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

2.1.3. Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm
- Dụng cụ: Bình tam giác (100 -1000 ml), Que cấy (tre, thủy tinh), ống Falcon,
ống nghiệm, ống nút xoáy, bình Schott, ống đong, Eppendorf, pipet, đèn cồn, đĩa
Petri, đầu tip 200 µl, 1000µl, 5 ml, 10 ml.
- Thiết bị: Box cấy (BioblockScientific, Pháp), cân điện tử (Precisa, Thụy
Điển), máy đo pH (Toledo, Anh), máy lắc ổn nhiệt (Eppendorf, Đức), máy ly tâm
cao tốc (Heraeus–Sepatech), nồi hấp thanh trùng (Himayatoko, Nhật), tủ lạnh giữ
giống (Electrolux, Thụy Điển), tủ nuôi cấy (Sanyo, Nhật), kính hiển vi quang học
(Eclipse E600, Nikon, Nhật), thiết bị bộ điện di ngang (Pharmacia Biotech, Gibco),
máy phá tế bào (Mini Beadbeater, Biospec Products), máy chụp ảnh gel (Olympus),
máy PCR (PE-GeneAmp PCR System 9700), máy soi gel (Syngene).
2.1.4. Môi trường
2.1.4.1. Môi trường phân lập
- Môi trường Matl 2°Bx có Chloramphenicol 100 mg/ l (MT1)
Thành phần : Malt 2%, Agar 1,5%, nước.
Chuẩn bị: Cân các thành phần với tỷ lệ như trên. Cho hỗn hợp vào bình Schott
sau đó bổ sung Chloramphenicol với tỷ lệ 100 mg Chloramphenicol/1000 ml môi
trường đem khử trùng ở 121°C trong 15 phút để môi trường nguội xuống 50- 60°C,
lắc đều và đổ ra đĩa Petri trong điều kiện vô trùng. Bảo quản ở tủ mát sau khi môi
trường khô.
- Môi trường MRS có Amphotericin B 5 mg/l (MT2)
Thành phần: Peptone 10,0 g, Meat Extract 10,0 g, Yeast Extract 5,0 g, DGlucose 20,0 g, Polysorbate 80 1,0 g, Ammonium Citrate 2,0 g, Sodium Acetate 5,0
g, Magnesium Sulfate 0,1 g, Manganese Sulfate 0,05 g, Dipotassium Phosphate 2,0
g, Agar 18,0 g, Nước 1000ml, pH = 6,5 ± 0,2.

Chuẩn bị: Cân các thành phần với tỷ lệ như trên. Cho hỗn hợp vào bình
Schott sau đó đem khử trùng ở 121°C trong 15 phút để môi trường nguội xuống 5060°C, bổ sung dịch Amphotericin B 5 mg/1ml với tỷ lệ 1 ml Amphotericin B /1000
ml môi trường, lắc đều và đổ ra đĩa Petri trong điều kiện vô trùng. Bảo quản ở tủ
mát sau khi môi trường khô.
2.4.1.2. Môi trường làm sạch và giữ giống
- Môi trường Matl 2°Bx không có Chloramphenicol (MT3)
Thành phần: Malt 2%, Agar 1,5%, nước.
Chuẩn bị:
- Cân các thành phần, cho hỗn hợp vào bình Schoot rồi hấp khử trùng ở
121°C trong 15 phút sau đó để nguội môi trường xuống 70-80°C đổ ra đĩa Petri
trong điều kiện vô trùng.

Formatted: Border: Bottom: (Double solid
lines, Auto, 0.5 pt Line width)
Formatted: Font color: Black
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt

Formatted: Font color: Black
Formatted: Space Before: 0 pt, After: 8 pt,
Border: Top: (Double solid lines, Auto, 0.5 pt
Line width)
Formatted: Font color: Black, Check spelling

and grammar
Formatted: Font color: Black

Nguyễn Thị Thu

11


Viện Đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

- Cân các thành phần, hòa tan agar sau đó dùng pipet hút 10 ml cho vào ống
nghiệm nút xoáy, rồi hấp khử trùng ở 121 °C trong 15 phút, sấy nhẹ môi trường cho
khô rồi bảo quản vào tủ mát.
- Môi trường MRS không có Amphotericin B (MT4)
Thành phần: Peptone 10,0 g, Meat Extract 10,0 g, Yeast Extract 5,0 g, DGlucose 20,0 g, Polysorbate 80 1,0 g, Ammonium Citrate 2,0 g, Sodium Acetate 5,0
g, Magnesium Sulfate 0,1 g, Manganese Sulfate 0,05 g, Dipotassium Phosphate 2,0
g, Agar 18,0 g, nước 1000ml, pH = 6,5 ± 0,2.
Chuẩn bị:
- Cân các thành phần, cho hỗn hợp vào bình Schoot rồi hấp khử trùng ở
121°C trong 15 phút sau đó để nguội môi trường xuống 70-80°C đổ ra đĩa Petri
trong điều kiện vô trùng.
- Cân các thành phần, hòa tan agar sau đó dùng pipet hút 10 ml cho vào ống
nghiệm nút xoáy, rồi hấp khử trùng ở 121°C trong 15 phút, sấy nhẹ môi trường cho
khô rồi bảo quản vào tủ mát.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp vi sinh
2.2.1.1. Phương pháp phân lập
- Sau khi tạo thành bánh men thành phẩm ta tiến hành cấy chang trên môi

trường MT1, MT2 để xác định số lượng vi vi sinh vật có trong bánh men.
- Tiến hành: Bánh men được nghiền nhỏ mịn sau đó lấy 3 g bánh men cho vào
27 ml dung dịch pha loãng NaCl 0,89%, vortex đều rồi pha loãng về các nồng độ
10-2, 10-3, 10-4, 10-5,10-6… Hút 0,1 ml dịch pha loãng rồi phân lập trên môi trường
MT1 đối với nấm men, giả men và nấm mốc, ủ ở 30°C, trên môi trường MT2 đối
với vi khuẩn, ủ vi hiếu khí ở 37°C.
- Đếm số lượng khuẩn lạc vi sinh vật phát triển trong đĩa petri theo thời gian
(ngày thứ nhất có thể đếm được nấm mốc và giả men; ngày thứ 2 đếm nấm men và
vi khuẩn; ngày thứ 3 có thể phân biệt rõ các khuẩn lạc khác nhau và đếm lại) từ đó
tính ra số lượng tế bào trong 1 g mẫu bánh men theo công thức:

Trong đó:
- N: là tổng số CFU trong 1 g (ml) mẫu
- ∑C: là tổng khuẩn lạc đếm được trên 2 đĩa giữ lại từ 2 độ pha loãng liên
tiếp và trong đó ít nhất một đĩa có chứa tối thiểu 10 khuẩn lạc
- V: thể tích dịch nuôi cấy trên mỗi đĩa, tính bằng ml
- n1: số đĩa giữ lại ở nồng độ thứ nhất
- n2: số đĩa giữ lịa ở nồng độ thứ hai
Nguyễn Thị Thu

12

Formatted: Border: Bottom: (Double solid
lines, Auto, 0.5 pt Line width)
Formatted: Font: 4 pt
Formatted: Font color: Black

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9

pt

Formatted: Font color: Black
Formatted: Space Before: 0 pt, After: 8 pt,
Border: Top: (Double solid lines, Auto, 0.5 pt
Line width)
Formatted: Font color: Black, Check spelling
and grammar
Formatted: Font color: Black


Viện Đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

- d: hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất được giữ lại.
- Từ các đĩa phân lập tiến hành làm sạch trên các môi trường tương ứng. Đối
với nấm mốc và nấm men, giả men thì cấy trên môi trường MT3, vi khuẩn thì cấy
trên môi trường MT4. Chọn những khuẩn lạc đặc trưng, riêng rẽ, cấy giữ giống vào
ống nghiệm thạch nghiêng.
2.2.1.2. Phương pháp nhuộm Gram
Chuẩn bị hóa chất:
- Dung dịch Crystal Violet (tím violet): Hòa tan 2 g Crystal Violet với 20 ml
Ethanol 95%. Sau đó bổ sung thêm 80 ml nước cất. Bảo quản dung dịch trong 24 h,
lọc qua giấy lọc trước khi dùng. Bảo quản trong lọ tối.
- Dung dịch Iodine: Cân 1 g Iodine, 2 g Potassium Iodide (KI) hòa tan vào 300
ml nước cất. Bảo quản trong lọ tối.
- Dung dịch tẩy: Ethanol 95% (70%) và Acetone (30%).
- Dung dịch nhuộm Fuchsin: Hòa tan 0,2 g Fuchsin vào 100 ml nước cất.
Chuẩn bị mẫu: Các mẫu cần nuôi cấy trong vòng 18 – 24 h.

Quy trình nhuộm:
- Làm tiêu bản vết bôi. Nhỏ một giọt nước lên trên lam kính, dùng đầu que cấy
lấy một ít sinh khối vi khuẩn, làm tan đều vào giọt nước.
- Để khô tiêu bản tự nhiên hoặc hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn
- Nhỏ 1 giọt dung dịch tím violet lên vết bôi. Để trong 1 phút.
- Rửa nhẹ lam kính cho đến khi sạch tím violet.
- Nhỏ 1 giọt dung dịch Iodine lên và để trong 1 phút.
- Rửa lam kính cho sạch bằng nước, làm khô.
- Nhỏ dung dịch tẩy lên vết bôi trong khoảng 15 – 30 giây.
- Nhỏ dung dịch Fuchsin lên tiêu bản để 30 giây – 1 phút.
- Rửa sạch lam kính và lau khô.
- Soi kính ở độ phóng đại 100, có dầu.
Kết quả:
- Vi khuẩn Gram dương: Nhuộm mầu tím, xanh tím
- Vi khuẩn Gram âm: Nhuộm mầu đỏ hoặc hồng
2.2.2. Phương pháp phân tích
2.2.2.1. Phương pháp xác định nồng độ cồn
Dịch sau lên men được ly tâm và đem cất cồn. Sử dụng bộ cất cồn phòng thí
nghiệm Salleron Dujardin của Pháp. Thiết bị này cho phép ta biết được độ cồn thu
được trong dịch sau quá trình lên men qua nhiệt độ sôi của dịch.
Quá trình cất cồn được thực hiện như sau:
- Làm sạch bình bằng nước cất.
Nguyễn Thị Thu

13

Formatted: Border: Bottom: (Double solid
lines, Auto, 0.5 pt Line width)
Formatted: Font: 4 pt
Formatted: Font color: Black

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt
Formatted: Font color: Black
Formatted: Space Before: 0 pt, After: 8 pt,
Border: Top: (Double solid lines, Auto, 0.5 pt
Line width)
Formatted: Font color: Black, Check spelling
and grammar
Formatted: Font color: Black


Viện Đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

- Đo nhiệt độ sôi của nước cất để xác định điểm 0 trên bảng.
- Tráng bình cất bằng bằng dung dịch mẫu sau đó cho 30 ml mẫu vào bình
chứa mẫu. Đun bằng đèn cồn và kiểm tra nhiệt kế trên thiết bị phân tích, ghi lại
nhiệt độ sôi của mẫu.
- Dựa vào nhiệt độ sôi của mẫu để xác định độ cồn tương ứng bằng bảng quy đổi.
2.2.2.2. Phương pháp xác định độ pH
Dùng máy đo pH Mettler Toledo.
2.2.2.3. Phương pháp xác định nồng độ đường khử bằng DNS
Tiến hành: Chuẩn bị dãy pha loãng để thu được hàm lượng đường phù hợp
cho phương pháp đo mật độ quang học của dung dịch màu có khả năng hấp phụ ánh
sáng.

- Cho vào các eppendorf 0,3 ml đương chuẩn, sử dụng nước cất làm mẫu
blank.
- Bổ sung vào các eppendorf 0,6 ml DNS, mix đều. Phản ứng màu ở 100°C
trong 5 phút, làm lạnh nhanh bằng nước đá.
- Lấy 0,4 ml dịch phản ứng + 1,8 ml nước cất, mix đều.
- Đo OD 540 nm
Xây dựng đường chuẩn glucose:
- Chuẩn bị dung dịch glucoza: đường D-glucose (EU-G7) được sấy 105°C
trong 2 h. Cân 0,5 g glucose hoà với 40 ml nước cất trong cốc thuỷ tinh, sau đó định
mức đến 50 ml thu được dung dịch stock 10 mg/ml (bảo quản -20°C).
- Chuẩn bị dãy pha loãng: 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,2
Nồng độ glucose (mg/ml)
OD 540nm

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0,138

0,345

0,506

0,730

0,976

1,062

Đường chuẩn thu được có phương trình:
Y= 0,9624x – 0,0475 ; R2= 0,99
Từ giá trị OD thu được, dựa vào đường chuẩn và nồng độ pha loãng có thể xác
định được hàm lượng đường có trong mẫu phân tích theo công thức:

Trong đó:
D: hệ số pha loãng
a, b: hệ số phương trình đường chuẩn D-Glucose
2.2.2.4. Phương pháp đánh giá khác biệt di truyền vi sinh vật bằng PCRfingerprinting
Chuẩn bị:

Formatted: Border: Bottom: (Double solid
lines, Auto, 0.5 pt Line width)
Formatted: Font: 4 pt
Formatted: Font color: Black

Formatted: Condensed by 0.2 pt

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt

Formatted: Font color: Black
Formatted: Space Before: 0 pt, After: 8 pt,
Border: Top: (Double solid lines, Auto, 0.5 pt
Line width)
Formatted: Font color: Black, Check spelling
and grammar
Formatted: Font color: Black

Nguyễn Thị Thu

14


Viện Đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

- Tách chiết DNA: Tế bào được nuôi trong MT3 đối với nấm mốc, nấm men
và giả nấm men, nuôi trong môi trường MT4 đối với vi khuẩn. Lấy tất cả sinh khối
tế bào cho vào Eppendorf vô trùng và thêm 750 µl SSC 2× vào mỗi ống. Lắc đều và
đun ở 100°C trong 10 phút. Ly tâm 12000 rpm trong 1 phút. Hút bỏ phần dịch và
tiến hành rửa tế bào 2 lần bằng nước cất vô trùng. Qua mỗi lần rửa ly tâm 12000
rpm trong 1 phút, loại bỏ dịch nổi. Thêm 100 µl nước cất vô trùng, 100 µl hạt thủy
tinh, 150 µl dung dịch phenol/chlorofom (tỷ lệ 1:1), đặt vào máy phá tế bào trong 1
phút. Đem ly tâm ở 12000 rpm trong 10 phút. Lấy phần dịch trong phía trên có
chứa DNA, sau đó DNA được giữ ở -20°C.
- Tinh chế DNA: Do DNA còn chứa nhiều chất ức chế PCR nên trước khi
dùng DNA làm khuôn cho phản ứng PCR, chúng tôi tiến hành tinh chế DNA bằng
Silica bead DNA Gel extraction Kit. Hút 50 µl dịch trong chứa DNA cho vào

Eppendorf vô trùng. Bổ sung 150 µl dung dịch Binding buffer có chứa Silica. Đem
ly tâm ở 12000 rpm trong 2 phút. Hút bỏ dịch do DNA đã bám trên bề mặt các hạt
thủy tinh. Rửa 3 lần bằng Washing buffer. Sau đó phơi khô rồi bổ sung 15 µl nước
cất vô trùng dùng cho PCR. Ly tâm 12000 rpm trong 1 phút, DNA ở phần dịch nổi
là DNA đã được tinh chế. DNA sau khi tinh chế có thể dùng làm khuôn cho phản
ứng PCR, phần còn lại giữ ở -20°C.
Tiến hành:
- Phản ứng PCR finger printing được tiến hành với thành phần phản ứng như sau:
Đệm phản ứng (10x)
10 µl
MgCl2 (25mM)
4 µl
dNTPs (20mM mỗi loại)
2 µl
Mồi MST2 (GAC)5 (20µM)
4 µl
Taq DNA polymerase (5u/µl)
0,5 µl
DNA khuôn
1,5 µl
Nước dùng cho PCR
78,5 µl
Tổng cộng
100 µl
- Chu trình gia nhiệt như sau:
Biến tính 94°C trong 3 phút.
Tiếp theo mẫu được nhân lên bởi 35 chu kì liên tiếp với các bước: biến tính ở
94°C trong vòng 1 phút, gắn mồi ở 52°C trong vòng 1 phút và kéo dài ở 72°C trong
vòng 2 phút.
- Các sản phẩm sau khi chạy PCR được điện di trên gel agarose 1 % với dung

dịch đệm là 0,5 × TAE. Để chuẩn bị gel điện di, agarose 1 % được làm tan trong đệm
TAE. Đợi nhiệt độ gel hạ xuống 60 - 70°C, đổ gel vào phiến nhựa điện di (kích
thước tùy theo số lượng mẫu cần điện di) được đặt thăng bằng trên mặt phẳng nằm

Formatted: Border: Bottom: (Double solid
lines, Auto, 0.5 pt Line width)
Formatted: Font: 4 pt
Formatted: Font color: Black
Formatted: Space Before: 0 pt

Formatted: Condensed by 0.2 pt

Formatted: Font color: Black
Formatted: Space Before: 0 pt, After: 8 pt,
Border: Top: (Double solid lines, Auto, 0.5 pt
Line width)
Formatted: Font color: Black, Check spelling
and grammar
Formatted: Font color: Black

Nguyễn Thị Thu

15


Viện Đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

ngang đã đặt sẵn lược. Để gel đông lại ở nhiệt độ phòng, gỡ bỏ lược, đặt bản gel vào

buồng điện di ngang sao cho bản gel chìm hẳn trong dung dịch đệm TAE. Dùng
micropipette nhỏ các sản phẩm sau PCR vào các giếng của bản gel. Nhỏ 3-5 µl mẫu
cho mỗi giếng. Điện di với hiệu điện thế 50 V trong 20 phút sau đó chuyển sang
100V trong 25 phút.
- Bản gel sau khi điện di được ngâm trong dung dịch Ethidium Bromide 0,5
µg/ml pha trong nước cất (trong 30 phút), sau đó vớt bản gel ra và rửa bằng nước
cất để loại bỏ Ethidium Bromide bám không đặc hiệu. Sau khi rửa, các băng DNA
được quan sát bằng máy soi gel (Syngene).
2.2.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm
2.2.3.1. Phương pháp làm bánh men
- Gạo ngâm 8 giờ sau đó xay thành bột nước và lọc hỗn hợp lấy bột gạo ẩm
khoảng 50 – 55%. Sau đó bột gạo được nhào trộn đều với các thành phần men
giống gốc và thuốc bắc. Ủ bột 30 phút sau đó định hình thành dạng viên có đường
kính 3-4 cm, dày 1-2 cm, đặt vào các khay có lót trấu sạch và ủ trong thời gian thích
hợp (khoảng 40 - 48 giờ ở điều kiện 30ᵒC để vi sinh vật trong bánh men phát triển.
Khi bánh men nở xốp thì tiến hành hong khô trong điều kiện nhiệt độ thường. Bánh
men thành phẩm được bảo quản trong điều kiện khô để dùng cho các thí nghiệm
tiếp theo.
- Quy trình làm bánh men được thực hiện theo sơ đồ sau:

Formatted: Border: Bottom: (Double solid
lines, Auto, 0.5 pt Line width)
Formatted: Font: 4 pt
Formatted: Font color: Black

Formatted: Space Before: 0 pt, Line spacing:
Multiple 1.2 li
Formatted: Space Before: 0 pt

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9

pt

Gạo ngâm nước 8h
Xay nước
Lọc bột
Phối trộn thành phần
Th
Ủ bột nhào (30’)
Nặn bánh, xếp khay

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt
Formatted: Font: 12 pt

Đậy kín, ủ men (30˚, 40h)

Formatted: Font color: Black
Formatted: Space Before: 0 pt, After: 8 pt,
Border: Top: (Double solid lines, Auto, 0.5 pt
Line width)

Phơi men

Formatted: Font color: Black, Check spelling
and grammar

Bảo quản nhiệt độ thường

Nguyễn Thị Thu

Formatted: Font color: Black

16


Formatted: Font: 4 pt

Viện Đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

Formatted: Border: Bottom: (Double solid
lines, Auto, 0.5 pt Line width)
Formatted: Font color: Black

Hình 2.1: Quy trình làm bánh men
2.2.3.2. Phương pháp lên men rượu sử dụng bánh men
- Chuẩn bị: gạo + nước theo tỷ lệ 1:1 vào bình schoot ngâm 2 giờ rồi hấp chín
121°C trong 15 phút, để nguội môi trường xuống 30 - 35°C, làm tơi trong điều kiện
vô trùng.
- Ủ cơm ở 30ᵒC trong 2 ngày: giai đoạn này vi sinh vật cần nhiều oxy để đường
hóa nên để nắp bình thoáng khí.
- Sau khi đường hóa, bổ sung nước RO vô trùng theo tỉ lệ 1 gạo: 2 nước. Bịt
kín miệng bình tạo điều kiện yếm khí, lên men 30ºC, trong 4 ngày.
- Sau khi kết thúc quá trình lên men, dịch lên men được ly tâm xác định độ
cồn, pH, hàm lượng đường sót.
- Quy trình lên men rượu được thực hiện theo sơ đồ sau:
Gạo + Nước (tỉ lệ 1:1)
Ngâm 4h
Hấp (121°C, 30’)

Để nguội, đánh tơi

Phối trộn với men thuốc bắc
(tỉ lệ 2%/gạo)
Ủ cơm (30°C, 48h)

Pha nước (tỉ lệ 1:1)

Lên men (30°C, 4ngày)

Ly tâm tách dịch

Bã

Dịch sau lên men

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt

Hình 2.2: Quy trình lên men
2.2.2.4. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của thuốc bắc tới chủng vi sinh vật
Chuẩn bị: Sử dụng hai công thức thuốc bắc CT1 bổ sung bài thuốc bắc này
vào trong môi trường MT3, MT4 với tỉ lệ 5% thuốc bắc, để trong các bình riêng,

Formatted: Font color: Black
Formatted: Space Before: 0 pt, After: 8 pt,
Border: Top: (Double solid lines, Auto, 0.5 pt
Line width)
Formatted: Font color: Black, Check spelling

and grammar
Formatted: Font color: Black

Nguyễn Thị Thu

17