Enzyme bromelain

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DUY TÂN
Khoa Môi Trường
BỘ MÔN: HÓA SINH CĂN BẢN

ĐỀ TÀI: ENZYME BROMELAIN
GVHD: Phan Thị Việt Hà
Nhóm 7


I.TỔNG QUAN VỀ ENZYME PROTEASE:
-Nhóm enzyme protease xúc tác quá trình thủy phân liên kết
peptide (-CO-NH)n trong phân tử protein, polypeptide đến sản
phẩm thủy phân cuối cùng là các acid amin. Ngoài ra, nhiều
protease cũng có khả năng thủy phân liên kết este và vận
chuyển amine


MÔ HÌNH ENZYME PROTEASE THỦY PHÂN
PHÂN TỬ PROTEIN


I. Tổng quan về enzyme bromelain
1. Đặc điểm của enzyme bromelain:
•

•
•
•
•

Bromelain là tên gọi chung cho nhóm enzyme thực

vật có chứa nhóm –SH, có khả năng phân giải protein
được thu nhận từ họ Bromeliaceae , đặc biệt là ở cây
dứa (thân, chồi, trái, vỏ).
Bromelain chiếm 50% protein trong quả dứa.
Có khả năng thủy phân mạnh và hoạt động tốt ở
pH = 6-8
Trọng lượng phân tử khoảng 33000 Da
Trong dịch chiết có chứa một ít peroxydase,
photphatase acid và chất cản protease


2. Cấu tạo hóa học:
• Bromelain là một glycoprotein, mỗi phân tử có
glycan gồm 3 manose, 2 glucosamine, 1 xylose và 1
fructose.
• Sợi hydrate carbon này liên kết hoán vị với sợi
polypeptide
• Bromelain có thành phần amino acid thay đổi trong
khoảng 321-144 amino acid (thân), 283-161 amino
acid (quả).
• Bromelain thân là một sợi polypeptide có amino acid
ở đầu amin là valine và ở đầu carbonhydrate là
glycine.
• Bromelain quả có amino acid ở đầu amin la alanine


3. Cấu trúc không gian:
• Cấu trúc bậc 1:
Ser-Val-Lys-Asn-Gln-Asn-Pro-Cys-Gly-Ala-Cys-Tryp-Gly-Cys-Lys• Trong trung tâm hoạt động có chứa cysteine và 2 sợi
polypeptide liên kết với nhau bằng cầu nối -S-S-.

• Phân tử dạng hình cầu.
• Trong phân tử có chứa nhóm sulfhydryl , 5 cầu nối
–S-S- và các ion Zn2+ có vai trò trong duy trì cấu trúc
không gian của enzyme.


4. Tính chất vật lý:*: Tính bằng phương pháp sa lắng khuếch tán
**:Tính từ hằng số sa lắng và độ nhớt bên trong
***:Tính bằng phương pháp Archibald
Hằng số sa lắng

S

2,73S

Hằng số khuếch tán

D

7.77x10-7cm2/s

Thể tích riêng phần

V

0,743ml/g

Độ nhớt bên trong

[I]

0,038dl/g

Chỉ số ma sát

f/fo

1,26

Điểm đẳng điện

pI

9,55

Sự hấp thu

A1% cm ở 280nm

20,1

Trọng lượng phân tử

33.200*
32.100**
35.500***


II. Phương pháp thu nhận bromelin:
Quy trình công nghệ

Chồi, thân, lá
dứa

Xay nhuyễn

Lọc

bã


Kết tủa

Ly tâm 1

bã

Hấp phụ

Siêu lọc

Ly tâm 2

Sấy

bromelin

Dịch


1.Thu nhận Bromelin từ dứa:

b. Thu dịch enzyme
thô:
• Quả dứa (chồi ) được
xay nhuyễn, vắt kỹ, lọc
bỏ bã, thu dịch lọc ly
tâm dịch lọc với tốc độ
6000 vòng/phút trong
10 phút để loại bỏ chất
xơ, thu được dịch chiết
có chứa bromelain.


c. Tách enzyme:
• Các phương pháp:
- Phương pháp kết tủa:
Tủa bằng acetone: thêm 1 thể tích acetone lạnh hoặc
20% acetone lạnh vào một thể tích dd nước dứa sau
ly tâm, trong 1 giờ ở to 0-4oC. Ly tâm hỗn hợp 6000
vòng /phút, trong 5 phút, loại bỏ tủa. Thêm 2 thể tích
acetone lạnh, để 1h ở 0-4oC, ly tâm thu tủa và rửa tủa
bằng acetone lạnh.


Tủa bằng ethanol: làm lạnh dd nước dứa sau ly
tâm, cho ethanol 96o theo tỉ lệ 4 dứa : 1 cồn,
trộn đều để ở to 0oC từ 3-4h. Ly tâm hỗn hợp
6000 vòng/phút , trong 5 phút. Rửa tủa bằng
acetone và thu nhận tủa.
Tủa bằng ammonium sulphate: chuẩn bị 1l dd

nước dứa sau ly tâm, cho từ từ 532g amonium
sulphate vào khuấy đều. Để yên ở nhiệt độ
phòng 10-15’, ly tâm 6000 vòng/phút trong 5
phút để thu nhận tủa


- Phương pháp hấp thụ :
Có thể dùng kaolin/betonite để hấp phụ.
Cấu tạo kaolin: cấu tạo thành từng lớp, độ phân tán cao
nên tính hấp phụ tốt, có khả năng tạo hình kết dính,
kích thước < 1µm, trên bề mặt có chứa nhiều ion OHvà O2Tiến hành: kaolin khô ( hoặc đã ngâm cho trương nở) +
dd nước dứa, tỉ kệ 25mg kaolin/ ml dd nước dứa.
Khuấy đều bằng máy khuấy từ, rồi ly tâm để thu tủa (
là bromelin-kaolin)


2.Tinh sạch bromelain bằng sắc ký
lọc gel:
a. Nguyên tắc:
- Kỹ thuật sắc ký lọc gel dùng để tách những
phân tử có kích thước , trọng lượng phân tử
khác nhau bằng cách cho chúng đi qua cột
gel.
- Những phân tử có kích thước đủ nhỏ để lọt
vào bên trong lỗ gel sẽ bị trì hoãn và di
chuyển chậm qua cột.


− Trong khi những
phân tử lớn hơn di

chuyển bên ngoài các
hạt gel nên sẽ di
chuyển nhanh và
được thoát khỏi cột
sớm hơn các phân tử
nhỏ


b. Chuẩn bị hoá chất và dụng cụ:
 Dụng cụ và thiết bị:
- Hệ thống sắc ký cột áp suất thấp, hãng Bio-Rad,
Mỹ
- Phễu đổ gel
- Bình hút chân không
- Flow Adaptor 1,5 cm
- Cột sắc ký Bio-Rad có kích thước 30x1,5cm
- Bình đựng dd đệm
- Ống nghiệm 50 cái
- Vòi hút chân không để khử bọt khí cho các dd


 Hóa chất
- Gel “Bio-gel P-100”, hãng Bio-Rad có đặc
tính: dạng hạt mịn, kích thước hạt 45-90µm;
khả năng ngậm nước: 12ml/1g gel khô; phạm
vi phân tách: 5000-100000 Daltons
- Đệm phosphate 0,1M với pH=7 khử bọt trước
khi dùng

c. Tiến hành
Chuẩn bị gel:
- Cân 5g gel “Bio-gel P-100” khô, cho bột gel từ từ
vào dd đệm phosphate 0,1M đựng trong cốc.
- Đối với các gel từ Bio-gel P-30 đến Bio-gel P-100
cần 12h ở 20oC để hydrate hóa hoặc 4h nếu bắt
đầu ở 100oC. Sau khi thể huyền phù đồng nhất của
các hạt gel hình thành không cần phải khuấy để
ổn định trong suốt quá trình hydrate hóa



- Sau khi hydrate hóa hoàn toàn, gạn lớp nổi
trên bề mặt. Chuyển dd vào bình hút chân
không khử khí của dd từ 10-15’, thỉnh thoảng
lắc nhẹ bình, không dùng đũa khuấy vì có thể
làm hư gel
- Thêm dd đệm khử khí với thể tchs gấp 2 lần
thể tích lớp nền, và lắc nhẹ. Để ổn định cho
đến khi 90-95% số hạt ổn định. Gạn hoặc loại
lớp nổi trên bề mặt bằng cách hút để loại các
hạt mịn. Lặp lại 4 lần để loại hơn 90% hạt mịn
cản trở quá trình lọc gel


- Gắn phễu, đổ gel vào cột, đóng lổ thoát của cột và
cho dd đệm làm đầy 20% thể tích cột
- Rót đều dd gel vào cột thành một dòng di chuyển
nhẹ, tránh bắn gel đảm bảo việc nhồi cột đều và
tránh bị bọt khí

- Khi lớp nền đã hình thành trong cột từ 2-5cm, mở
khóa đầu ra của cột cho đến khi cột được nạp đầy
gel
- Khi cột đã nạp đầy gel, khóa đầu ra của cột và gắn
Flow Adaptor. Mở khóa đầu ra của cột rồi và cho
dd đệm với thể tích gấp 2 lần thể tích lớp nền
- Đóng đầu ra của cột và điều chỉnh Flow Adaptor
xuống lớp nền gel. Nạp mẫu vào trên bề mặt lớp
nền bằng bơm hoặc tiêm mẫu qua Flow Adaptor.


Chuẩn bị mẫu
- Mẫu chạy sắc ký phải sạch ( không bị nhiễm
bẩn và không có các hạt rắn), hòa tan hoàn
toàn trong dd đệm.
- Lọc mẫu qua milipore (màng lọc 0,4µm) sẽ
làm gia tăng độ bền/ thời gian sử dụng của cột.
Nếu vì tính chất của mẫu mà không lọc được
thì đem ly tâm mẫu


Thu và xác định mẫu tách được
- Dịch ra khỏi cột được đo dộ hấp thụ ở 280nm
bằng Detector trong hệ sắc ký và được thể hiện
độ hấp thụ dưới dạng sắc đồ bằng phần mềm
LP Dataview trên máy tính.
- Dịch được thu tự động bằng máy thu mẫu
(Collector), mỗi phân đoạn 2ml

3. Hoạt tính của bromeline:
Có 3 hoạt tính khác nhau: peptidase, amidase và esterase.
Bromeline thân có nhiều cơ chất tự nhiên và có thể thủy
phân cả cơ chất tự nhiên, cơ chất tổng hợp.
 Khả năng phân giải các cơ chất tự nhiên của bromeline:
Cơ chất

Casein

Hoạt tính phân giải casein (UI/mg)
Bromeline
thân

Bromeline quả
xanh

Bromeline qủa
chín

7,4

4,0

3,0


 Khả năng phân giải các cơ chất nhân tạo của
Bromeline:
Hoạt tính phân giải Benzoyl-L-Arginine amide(BAA) của
bromeline:

Cơ chất

BAA

Hoạt tính phân giải (UI/mg)
Bromeline
thân

Bromeline quả
xanh

Bromelin quả chín

3,7

9,1

7,2

Hằng số Michaelis với các cơ chất tổng hợp khác nhau *
*: Ở điều kiện to=5oC, pH=6,0

Bromeline
thân

BAA

BAEE

BAEM

1,2x10-3

1,7x10-1

3,2x10-2