NGHIÊN cứu xây DỰNG QUY TRÌNH sản XUẤT mẫu HUYẾT THANH sử DỤNG TRONG CHƯƠNG TRÌNH nội KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG xét NGHIỆM ĐỊNH LƯỢNG KHÁNG NGUYÊN HBsAg

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y H NI

NGUYN XUN T

NGHIÊN CứU XÂY DựNG QUY TRìNH SảN XUấT
MẫU HUYếT THANH Sử DụNG TRONG CHƯƠNG TRìNH
NộI KIểM TRA CHấT LƯợNG XéT NGHIệM
ĐịNH LƯợNG KHáNG NGUYÊN HBsAg

KHểA LUN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA
KHÓA 2010 - 2016

HÀ NỘI – 2016


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y H NI

NGUYN XUN T

NGHIÊN CứU XÂY DựNG QUY TRìNH SảN XUấT
MẫU HUYếT THANH Sử DụNG TRONG CHƯƠNG TRìNH
NộI KIểM TRA CHấT LƯợNG XéT NGHIệM
ĐịNH LƯợNG KHáNG NGUYÊN HBsAg

KHểA LUN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA
KHÓA 2010 - 2016
Người hướng dẫn khoa học:
1 ThS. Phạm Thị Hương Trang
2 PGS.TS. Đặng Thị Ngọc Dung

HÀ NỘI – 2016


LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn tới Ban Giám hiệu, Phòng Quản lý
đào tạo đại học trường Đại học Y Hà Nội đã giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận
lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trường.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS.TS. Đặng Thị Ngọc Dung
cùng ThS. Phạm Thị Hương Trang. Các cơ đã nhiệt tình giúp đỡ tơi trong
q trình học tập cũng như nghiên cứu khoa học.
Tơi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô, anh chị tại Trung tâm kiểm
chuẩn chất lượng Xét nghiệm - trường Đại học Y Hà Nội, các anh chị trong
Khoa xét nghiệm - Bệnh viện Đại học Y Hà Nội đã giúp đỡ tơi nhiệt tình tạo
mọi thuận lợi cho tơi trong q trình thực hiện và hồn thành khóa luận này.
Cuối cùng tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới cha mẹ, những người đã sinh
thành và nuôi dạy tơi, cùng với những người thân trong gia đình, anh em bè
bạn đã chia sẻ động viên giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập.

Hà Nội, tháng 5 năm 2016
Sinh viên

Nguyễn Xuân Đạt

LỜI CAM ĐOAN

Tôi là Nguyễn Xuân Đạt, sinh viên Trường Đại học Y Hà Nội, chuyên
ngành Cử Nhân Kỹ Thuật Y Học, xin cam đoan:
1. Đây là khoá luận do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng
dẫn của PGS.TS. Đặng Thị Ngọc Dung cùng ThS. Phạm Thị Hương Trang.
2. Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hồn tồn trung thực và
khách quan.
Tơi xin hồn toàn chịu trách nhiệm về những cam kết này.
Hà Nội, tháng 5 năm 2016
Sinh viên

Nguyễn Xuân Đạt


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ..................................................................................................1
Chương 1..........................................................................................................3
TỔNG QUAN TÀI LIỆU..............................................................................3
1.1. Bệnh viêm gan B....................................................................................3
1.1.1. Lịch sử bệnh viêm gan B...................................................................3
1.1.2. Nguyên nhân gây nhiễm và đặc điểm sinh học của bệnh viêm gan B.. 5
1.1.3. Dấu ấn HBsAg huyết thanh khi nhiễm HBV......................................7
1.1.4. Đặc điểm dịch tễ học.........................................................................8
1.1.5. Phòng ngừa và điều trị HBV..............................................................9
1.1.6. Chẩn đoán lâm sàng.........................................................................10
1.2. Đảm bảo chất lượng xét nghiệm...........................................................13
1.2.1. Các khái niệm về chất lượng xét nghiệm..........................................13

1.2.2. Hệ thống đảm bảo chất lượng của phòng xét nghiệm........................14
1.2.3. Hoạt động của phòng xét nghiệm [18]..............................................16
1.2.4. Yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng xét nghiệm...................................16
1.2.5. Nội kiểm tra chất lượng xét nghiệm [19]..........................................18
1.3. Mẫu nội kiểm và đặc tính của mẫu nội kiểm.......................................20
1.3.1. Mẫu thương mại..............................................................................20
1.3.2. Mẫu chưa qua thử nghiệm...............................................................20
1.3.3. Mẫu nội kiểm tự sản xuất ................................................................20
1.3.4. Nguyên tắc chung để tự tạo mẫu huyết thanh nội kiểm.....................21
1.3.5. Tiêu trí đánh giá mẫu huyết thanh nội kiểm tự tạo............................21
Chương 2 .......................................................................................................22
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................................22


2.1. Đối tượng nghiên cứu...........................................................................22
2.1.1. Tiêu chuẩn chọn mẫu.......................................................................22
2.1.2. Tiêu chuẩn loại bỏ mẫu....................................................................22
2.1.3. Dụng cụ thiết bị và hóa chất.............................................................23
2.2. Phương pháp nghiên cứu......................................................................23
2.3. Thiết kế nghiên cứu..............................................................................23
2.4. Quy trình nghiên cứu............................................................................24
2.4.1. Giai đoạn 1: “Tạo các mẫu nội kiểm”...............................................24
2.4.2. Giai đoạn 2: “Phân điều kiện bảo quản cho lô mẫu”.........................27
2.4.3. Giai đoạn 3: “đánh giá chất lượng của lô mẫu”.................................28
Chương 3 .......................................................................................................34
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU...........................................................................34
3.1. Trực quan..............................................................................................34
3.2. Độ đồng nhất của các mẫu...................................................................36
3.2.1. Độ đồng nhất của mẫu ban đầu khi chưa đông lạnh hay đông khô.. . .36
3.2.2. Độ đồng nhất của các mẫu sau bảo quản..........................................37

3.3. Độ ổn định của mẫu..............................................................................37
3.3.1. Theo tiêu chuẩn độ ổn định dài hạn của CLIA về xét nghiệm [HbsAg]
và theo quy tắc Westgard..........................................................................37
3.3.2. Theo hướng dẫn của ILAC..............................................................45
3.4. Kết quả.................................................................................................45
Chương 4 .......................................................................................................47
BÀN LUẬN....................................................................................................47
4.1. Bàn luận về quy trình sản xuất mẫu huyết thanh nội kiểm..................47
4.2. Chất lượng của lô mẫu huyết thanh nội kiểm tự tạo............................48
4.2.1. Độ đồng nhất của mẫu.....................................................................48


4.2.2. Bàn luận về độ ổn định của lô mẫu trong suốt quá trình nghiên cứu.. 49
KẾT LUẬN...................................................................................................53
KIẾN NGHỊ...................................................................................................54
TÀI LIỆU THAM KHẢO..............................................................................1


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

WHO

: World Health Organization (tổ chức y tế thế giới)

HBsAg

: Hepatitis B surface Antige
(kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B)

HBcAg

: Hepatitis B core Antige
(kháng nguyên lõi virus viêm gan B)

HBeAg

: Hepatitis B enverlope Antige
(kháng nguyên vỏ virus viêm gan B)

HBV

: Hepatitis B virus (virus viêm gan B)

PXN

: phòng xét nghiệm

SD

: standard deviation (độ lệch chuẩn)

[HBsAg]

: Định lượng/Nồng độ kháng nguyên HBsAg

COI

: Cut-Off Index (giá trị phát hiện ngưỡng tối thiểu)

DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1: Kết quả định lượng các mẫu trước bảo quản............................36
Bảng 3.2: Thông số xác định độ đồng nhất của các mẫu trước bảo quản36
Bảng 3.3: Thông số xác định độ đồng nhất của các mẫu sau bảo quản...37
Bảng 3.4: Các giá trị thiết lập trong 20 ngày liên tiếp để vẽ biểu đồ leveyJennings cho các lô mẫu................................................................................37
Bảng 3.5: Tổng hợp số ngày chấp nhận sự ổn định của các mẫu xét
nghiệm............................................................................................................45


DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1 : Biểu đồ westgard cho thấy các kết quả phân tích lơ mẫu A
trong 32 ngày.................................................................................................39
Biểu đồ 3.2: Kết quả phân tích sau 30 ngày của lô mẫu C........................40
Biểu đồ 3.3: Kết quả định lượng của các mẫu D sau 32 ngày liên tiếp.....41
.........................................................................................................................42
Biểu đồ 3.4: Kết quả định lượng của mẫu E sau 32 ngày.........................42
.........................................................................................................................43
Biểu đồ 3.5: Kết quả phân tích mẫu L sau 30 ngày....................................43
.........................................................................................................................44
Biểu đồ 3.6: Kết quả phân tích mẫu H sau 30 ngày...................................44
Biểu đồ 3.7. Sự thay đổi nồng độ kháng nguyên HBsAg ở các mẫu nồng
độ cao trong quá trình nghiên cứu..............................................................46
Biểu đồ 3.8. Sự thay đổi nồng độ kháng nguyên HBsAg ở các mẫu nồng
độ thấp trong quá trình nghiên cứu............................................................46


1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Các bộ phận trên cơ thể đều nắm giữ những vai trò riêng biệt, khi vai trò
này mất đi thì bộ phận đó cũng sẽ tiêu biến theo thời gian. Là một trong ngũ
tạng quan trọng nhất trên cơ thể, gan nắm giữ những chức năng vô cùng thiết
yếu như: chuyển hóa glucid - lipid - protid, tổng hợp protein, dự trữ B12 - sắt
- glucid, tạo mật… Tuy nhiên cũng có rất nhiều căn nguyên dẫn đến các bệnh
lý về gan và virus viêm gan B là một trong số đó.
Kể từ khi được phát hiện bởi Blumberg vào năm 1965 cho tới nay, theo
tổ chức Y tế Thế giới (WHO) ước tính có khoảng 1/3 dân số thế giới đã từng
nhiễm HBV, hàng năm có khoảng 240 triệu người mắc viêm gan B mạn tính
và 780 nghìn người chết bởi viêm gan B [1]. Do bệnh có những diễn biến
thầm lặng với các triệu chứng mơ hồ nhưng để lại các biến chứng nặng nề
như xơ gan, ung thư gan làm ảnh hưởng khơng ít đến chất lượng cuộc sống
của mọi người.
Việt Nam nằm trong khu vực bệnh lưu hành cao, tỷ lệ viêm gan B trong
quần thể từ 10 - 15% đặc biệt có những vùng lên đến 20%. Điều này tương
đương rằng Việt Nam có khoảng 8,6 triệu người nhiễm viêm gan hàng năm
[2]. Tuy nhiên hiểu biết của người dân về bệnh viêm gan virus B lại chưa
được đầy đủ, chính xác và cịn có cả những sai lệch.
Ở phịng xét nghiệm việc chẩn đoán viêm gan virus B chủ yếu dựa trên
việc phát hiện kháng nguyên bề mặt của virus viêm gan B. Kháng nguyên này
được phát hiện thông qua sàng lọc nhanh bằng việc kiểm tra định tính bằng
que test nhanh hay kiểm tra chính xác hơn thơng qua xét nghiệm định lượng.
Các xét nghiệm này được thực hiện bởi các bộ kit do các hãng khác nhau
cung cấp và nó được phổ biến ở hầu hết các đơn vị từ công lập cho tới đơn vị
tư nhân. Tuy nhiên chất lượng của xét nghiệm ở các phòng xét nghiệm này
đang là một vấn đề nóng mà tồn xã hội quan tâm.


2

Để tạo được niềm tin ở bệnh nhân, phòng xét nghiệm cần phải xây
dựng được cho mình một chương trình kiểm sốt chất lượng của các xét
nghiệm nói chung và của xét nghiệm viêm gan virus B nói riêng. Chương
trình này bao hàm các chương trình là: nội kiểm tra chất lượng và ngoại
kiểm tra chất lượng.
Tuy nhiên công tác nội kiểm ở nhiều phịng xét nghiệm khơng được
thường xun, thậm trí có nơi cịn bỏ ngỏ so với lịch trình nội kiểm mà các
hãng sản suất đưa ra, một số nơi có nội kiểm nhưng khơng hiểu hết về cơng
tác nội kiểm. Chính những ngun nhân này đã dẫn đến những sai lệch
trong kết quả xét nghiệm của người bệnh.
Nhằm đem lại sự chính xác trong xét nghiệm viêm gan virus B và nâng
cao niềm tin của bệnh nhân với phịng xét nghiệm chúng tơi xin tiến hành
nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất mẫu huyết
thanh sử dụng trong chương trình nội kiểm tra chất lượng xét nghiệm định
lượng kháng nguyên HBsAg” với mục tiêu:
1. Xây dựng quy trình sản xuất mẫu huyết thanh chuẩn dùng trong nội
kiểm tra chất lượng xét nghiệm định lượng kháng nguyên HBsAg.
2. Đánh giá độ đồng nhất, độ ổn định của mẫu huyết thanh đông khô và
đông lạnh sản xuất được.


3

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Bệnh viêm gan B.
1.1.1. Lịch sử bệnh viêm gan B.
Vào năm 1963, trong một nghiên cứu về các protein huyết thanh đa hình
(polymorphic) Blumberg đã phát hiện ra một protein trong máu của thổ dân
Australia mà trước đó chưa từng được biết tới. Hai năm sau đó protein này

được gọi với cái tên kháng nguyên Australia nhờ việc ứng dụng của kỹ thuật
xét nghiệm miễn dịch men. Tới năm 1968, trong nghiên cứu của Prince,
Okochi và Murakami đã xác định được kháng nguyên Australia chỉ được tìm
thấy trong huyết thanh của người nhiễm virus viêm gan B, từ đó virus viêm
gan B mới được nhận biết và xác lập đặc điểm. Nhờ phát hiện và nghiên cứu
về kháng nguyên này mà năm 1976 Blumberg đã được trao giải Nobel y học
cho công hiến của ông [5].
Tuy nhiên lịch sử loài người đã ghi nhận được rất nhiều trường hợp mắc
các bệnh khác nhau gây nên vàng da, các dấu hiệu đó có thể là tồn thân hoặc
chỉ diễn ra chủ yếu ở gan. Các biểu hiện này được y văn ghi lại với cái tên
chung là hội chứng hồng đảm.
Virchow đã mơ tả bệnh gan là bệnh vàng da xuất tiết, ông cho rằng vàng
da xuất tiết có nguyên nhân từ viêm tắc đường mật, chất nhầy bám dính làm
tắc đường mật, từ đó gây viêm chỗ nối đường mật - tá tràng và do vi khuẩn
gây ra. Năm 1908, Mc.Donald cho rằng tác nhân của vàng da xuất tiết là virus
chứ không phải vi khuẩn. Tại Thụy Điển 10 năm sau đó người ta đã đặt ra
thuật ngữ viêm gan cho bệnh vàng da xuất tiết, đồng thời cũng đã chẩn đoán
phân biệt được viêm gan dịch tễ và viêm gan huyết thanh [5].


4

Các nghiên cứu ở Anh và quân y Mỹ đã chỉ ra rằng viêm gan B hiện diện
trong huyết thanh gây vàng da và thường được mang bởi người khỏe mạnh
bình thường khơng vàng da. Nhưng tới tận chiến tranh thế giới lần thứ II,
nhận thức tổng quát và chính xác về bản chất lây nhiễm của bệnh vàng da
xuất tiết mà Virchow mô tả mới được rõ ràng và chính xác. MacCallum cũng
đã đề nghị gọi viêm gan B thay cho cái tên viêm gan nhiễm huyết thanh và
thuật ngữ này đã được chấp thuận bởi Ủy ban của Tổ chức tế Thế giới vào
năm 1947 [5].

Sau cơng trình nghiên cứu của Blumberg, các nghiên cứu về viêm gan
B đã được diễn ra ngay trên chính con người. Nhờ đó mà các đặc điểm dịch
tễ, bệnh sử và phịng ngừa bệnh viêm gan B được hiểu biết rõ hơn. Tuy
nhiên nó lại dấy lên những vi phạm về đạo đức nên những nghiên cứu này
phải dừng lại.
Nhờ những tiến bộ của ngành sinh học phân tử, vào năm 1970 Dane đã
phát hiện dưới kính hiển vi điện tử các hạt nhỏ kích thước khoảng 42nm, nó
mang trên bề mặt kháng nguyên Australia trong huyết thanh của bệnh nhân
viêm gan B và những hạt này được gọi là hạt Dane.
Cũng chính nhờ sự tiến bộ khơng ngừng của ngành cơng nghệ mà chỉ
sau đó vài năm Robinson đã nhân dịng và xác định mã chuỗi nucleotide
DNA toàn phần của hạt Dane chính là virus viêm gan B. Bộ gen của virus
viêm gan B là bộ gen độc đáo trong thế giới virus do bản chất đậm đặc của
chúng, các khung đọc gối lên nhau và do phụ thuộc vào bước phiên mã
ngược, dù rằng virion chứa chủ yếu là DNA [5].
Cho tới ngày nay chúng ta đã đạt được những tiến bộ không ngừng về
sinh bệnh học, dịch tễ, chẩn đốn điều trị cũng như dự phịng bệnh viêm
gan B.


5

1.1.2. Nguyên nhân gây nhiễm và đặc điểm sinh học của bệnh viêm gan B.
Virus gây viêm gan là những virus có ái tính với tế bào gan. Sau khi
virus viêm gan xâm nhập vào cơ thể thì việc gây tổn thương cho các tế bào
khác chỉ là thứ yếu do tế bào đích mà virus hướng tới, xâm nhập nhân lên và
gây tổn thương chủ yếu là tế bào gan.
Các virus viêm gan đều có tế bào đích chung là các tế bào gan, nhưng
chúng có cấu trúc, đường xâm nhập, cơ chế lan truyền,… khác nhau. Dựa
theo kiểu gen hiện nay các virus viêm gan chính được chia làm 8 loại là:

HAV, HBV, HCV, HDV, HEV, HFV, HGV và HHV [6].
1.1.2.1. Nguyên nhân gây nhiễm viêm gan virus B.
Bệnh viêm gan virus B trước đây thường gặp sau truyền máu. Ngày nay
việc kiểm tra HBsAg của những người cho máu, nguyên nhân của nhiễm
HBV vẫn luôn là một vấn đề thời sự. Đường lây truyền chủ yếu hiện nay là do
tiêm chích, nghiện ma túy, qua đường tình dục, từ mẹ sang con, qua các thiết
bị y tế chưa được tiệt trùng,… Có nhiều con đường do vậy trách nghiệm của
người thầy thuốc rất lớn trong việc tuyên truyền cho mọi người hiểu rõ để tự
điều chỉnh hành vi phòng bệnh.
1.1.2.1. Cấu trúc của virus viêm gan B (HBV).
HBV được xếp trong họ Hepadnaviridae, là một virus hình cầu có
đường kính khoảng 42nm, trước đây được gọi là hạt Dane
Cấu tạo của virus từ ngoài vào trong gồm có: bao ngồi cùng là lớp vỏ
lipid có chứa kháng nguyên bề mặt là HBsAg, bao quanh một nucleocapsid
bên trong gồm kháng nguyên lõi viêm gan B (HBcAg) phức với polymerase
giúp mã hóa và trong cùng là bộ gen DNA của virus [7].
Cấu trúc của HBsAg có thể thay đổi để tạo thành nhiểu thứ týp khác
nhau. Trong cấu trúc HBsAg của mọi HBV đều có thành phần “a” giống nhau
còn các thành phần cấu trúc khác “y” hoặc “d” “v” “w” hoặc “r” của các thứ
týp là khác nhau [6].


6

1.1.2.2. Cấu trúc kháng nguyên của virus viêm gan B (HBV).
Hạt Dane: huyết thanh người bị nhiễm virus có chứa một số lượng lớn
những hạt có kích thước khoảng 42 nm, đó là những virus cịn ngun vẹn và
có khả năng lây nhiễm [8].

Hình 1.1: Cấu trúc kháng nguyên của virus viêm gan B.

( />HBV có ba loại kháng ngun chính :
- HBsAg: có sự thay đổi giữa chính các thứ týp. Trọng lượng phân tử thay
đổi từ 21.000 đến 24.000 dalton. Giúp cho sự bám của virus vào tế bào gan.
- HBcAg: có trọng lượng phân tử từ 18.000 đến 19.000 dalton. HBcAg
chỉ tìm được trong tế bào gan khơng tìm được trong máu người nhiễm HBV.
- HBeAg: có cấu trúc thay đổi ở các thứ týp. Trọng lượng phân tử từ
16.000 đến 19.000 dalton. Kháng nguyên này cũng giống như HBsAg có thể
tìm trong máu, huyết thanh bệnh nhân [9].


7

1.1.3. Dấu ấn HBsAg huyết thanh khi nhiễm HBV.

Hình 1.2: Thay đổi về dấu ấn huyết thanh của HBV trong giai đoạn nhiễm
viêm gan B cấp tính.
( />$file/AmpScrn%20HBV%20Val%20Presentation1.pdf)
HBsAg là kháng nguyên bề mặt của HBV, là dấu ấn xác nhận đang
nhiễm HBV.
HBsAg xuất hiện trong huyết thanh 1 - 10 tuần sau khi tiếp xúc cấp với
HBV, xuất hiện trước khi có triệu chứng lâm sàng và cận lâm sàng.
Đối với bệnh nhân phục hồi sau giai đoạn nhiễm cấp, HBsAg sẽ biến
mất sau 4 - 6 tháng. Nhiễm HBV mạn khi HBsAg xuất hiện kéo dài trên 6
tháng. Ở những người nhiễm mạn, tỷ lệ khơng cịn xuất hiện kháng nguyên
HBsAg khoảng 0,5% mỗi năm.


8

Sự xuất hiện anti-HBsAg chứng tỏ bệnh nhân đã miễn nhiễm với HBV

và hầu như sẽ không nhiễm HBV nữa. Một số ít trường hợp, HBsAg xuất hiện
trở lại trên người đã có anti-HBcAg và anti-HBsAg khi bị suy giảm miễn dịch
hay do sử dụng thuốc ức chế miễn dịch hay hóa trị liệu.
Hầu hết anti-HBsAg xuất hiện ngay sau khi HBsAg biến mất. Ở một số
bệnh nhân anti-HBsAg không xuất hiện ngay sau khi HBsAg biến mất mà chỉ
xuất hiện sau giai đoạn cửa sổ (window period) kéo dài vài tuần hay vài
tháng. Vì vậy, trong giai đoạn này HBsAg âm, anti-HBsAg âm chỉ có IgM
anti-HBcAg dương là một dấu ấn cho thấy đang nhiễm cấp.
Anti-HBsAg cũng được tạo ra sau chủng ngừa HBV. Chủng ngừa chỉ
có thể tạo ra một loại kháng thể duy nhất là anti-HBsAg.
Anti-HBsAg (+) có thể xảy ra trong 2 trường hợp sau:
- Anti-HBsAg (+)  đã nhiễm hiện đã lành.
- Anti-HBsAg (-)  chưa từng bị nhiễm, đáp ứng miễn dịch sau chích
ngừa HBV.
Sự hiện diện của cả hai HBsAg và anti-HBsAg trong huyết thanh gặp
trong 24% trường hợp có HBsAg (+) [24]. Trong tình huống này, cơ thể có
tạo ra Anti-HBsAg nhưng với nồng độ thấp khơng đủ trung hịa hạt tử virus
hay virion trong huyết thanh. Vì vậy, những bệnh nhân này cũng được xem
như người mang HBV.
1.1.4. Đặc điểm dịch tễ học.
Viêm gan B là một trong những bệnh truyền nhiễm phổ biến nhất và
nghiêm trọng nhất thế giới. Người ta ước tính rằng hơn một phần ba dân số
thế giới đã bị nhiễm viêm gan B. Có khoảng 5% dân số (350 triệu người)
mang HBV mạn tính. Nhiễm HBV gây ra hơn một trăm triệu ca tử vong mỗi
năm [10],[11],[12].


9

Theo ước tính của tổ chức y tế thế giới khu vực Tây Thái Bình Dương

thì Việt Nam hiện có khoảng 8,6 triệu người nhiễm virus viêm gan B. Tỷ lệ
nhiễm virus mạn tính được ước tính khoảng 8,8% ở phụ nữ và 12,3% ở nam
giới [10].
1.1.5. Phòng ngừa và điều trị HBV.
1.1.5.1. Phịng bệnh khơng đặc hiệu.
Vấn đề phịng bệnh khơng đặc là rất quan trọng nó phụ thuộc vào mức
độ nhận thức của từng người để tự điều chỉnh hành vi, tránh nguy cơ lây
nhiễm. Việc nâng cao tầm hiểu biết của mọi người để mọi tự phòng tránh vẫn
là cách hiệu quả nhất trong cơng tác phịng chống bệnh khơng đặc hiệu
1.1.5.2. Phịng bệnh đặc hiệu.
Vacxin HBV được sản xuất bằng cách tinh chế huyết thanh của người
nhiễm HBV và hiện có vacxin HBV sản xuất tái tổ hợp là trụ cột trong cơng
tác phịng bệnh [4].
WHO khuyến cáo rằng tất cả các trẻ sơ sinh cần được tiêm phòng càng
sớm càng tốt. Tốt nhất là trong vòng 24 giờ đầu sau khi sinh.
Tiếp theo liều sau sinh, cần tiêm thêm ba liều nữa để hoàn thành loạt tiêm.
Những người thuộc nhóm có nguy cơ cao cũng cần được chủng ngừa.
Họ bao gồm các nhóm đối tượng:
- Những người thường xuyên cần truyền máu hoặc các sản phẩm của
máu, bệnh nhân lọc máu, người nhận ghép tạng.
- Người bị giữ trong nhà tù
- Người tiêm chích ma túy.
- Người có tiếp xúc với những thành viên gia đình và quan hệ tình dục
với những người bị nhiễm vi rút viêm gan B mạn tính.


10

- Những người có nhiều bạn tình cũng như nhân viên y tế và những
người có thể phơi nhiễm với máu và các sản phẩm của máu trong khi

làm việc.
- Du khách chưa hồn thành liệu trình tiêm chủng vắc xin viêm gan B
cũng cần được tiêm vắc xin trước khi đến vùng có dịch lưu hành [10].
1.1.6. Chẩn đốn lâm sàng.
Để chẩn đoán viêm gan B cấp và mạn tính, người ta đã áp dụng các thử
nghiệm phát hiện HBsAg và các kỹ thuật miễn dịch học để phát hiện kháng
nguyên và kháng thể của virus. Bên cạnh đó kỹ thuật kính hiển vi điện tử có
thể được sử dụng để xác định HBV trong máu hoặc trong sinh thiết các tổ
chức gan.
1.1.6.1. Phương pháp trực tiếp:
Đây là phương pháp phát hiện hạt virus (hạt Dane) hoặc các thành phần
cấu trúc của virus. Cụ thể là phát hiện: hạt virus, DNA của virus, kháng
nguyên HBsAg, kháng nguyên HBeAg, kháng nguyên HbcAg trong tế bào
gan bằng các xét nghiệm PCR, real-time PCR…
1.1.6.2. Phương pháp gián tiếp (phương pháp huyết thanh học):
Đây là phương pháp phát hiện các sản phẩm tương tác của virus với cơ
thể (kháng thể), cụ thể là phát hiện: HBsAg, anti-HBsAg, anti-HBeAg, antiHBcAg.
Các kỹ thuật được dùng để phát hiện bao gồm:
- Kỹ thuật sắc kí miễn dịch:
Phức hợp kháng kháng thể (KKT) gắn chất màu được phân bố đều trên
bản giấy sắc ký. Kháng nguyên (KN) đặc thù của vi sinh vật được gắn cố
định tại “vạch phản ứng”. Khi nhỏ huyết thanh cần xác định kháng thể (KT)
lên bản sắc ký, KT đặc hiệu (nếu có) trong huyết thanh sẽ kết hợp với KKT
gắn màu, phức hợp miễn dịch KT-KKT gắn màu này di chuyển trên giấy sắc
ký sẽ bị giữ lại tại “vạch phản ứng” do KT kết hợp với KN vi sinh vật, kết


11

quả “vạch phản ứng” hiện màu. Nếu trong huyết thanh khơng có KT đặc

hiệu, ở “vạch phản ứng” KN khơng thể giữ được KKT gắn màu, vì vậy
khơng hiện màu.
Phương pháp này được áp dụng phổ biến ở các loại test nhanh hiện nay.
- Miễn dịch điện hóa phát quang (elctro-chemiluminescence
immunoassay: ECLIA):
Khái niệm: Miễn địch điện hóa phát quang là quá trình phản ứng mạnh
của các chất được tạo ra từ những chất bền vững có trước trên bề mặt của điện
cực. Phản ứng mạnh của các chất này sẽ tác động trở lại chất tương tự đồng
thời phát quang.
Nó dựa trên việc sử dụng phức hợp ruthenium-tris (bypyridil) và
tripropylamin (TPA) và cuối cùng sản phẩm quang hóa được tạo ra tại thời
điểm phát hiện ra bước sóng.
Ba nguyên lý chính được áp đụng ở kỹ thuật này là:
+ Nguyên lý cạnh tranh.
+ Nguyên lý sandwich.
+ Nguyên lý bắc cầu.
Với việc định lượng HBsAg người ta sử dụng nguyên lý sandwich, mẫu
thử kết hợp với thuốc thử chứa kháng thể HBsAg được gắn biotin và hỗn hợp
kháng HBsAg đơn dòng và đa dòng được đánh dấu bằng phức hợp ruthenium
Streptavidin được bao phủ thêm những mảnh nhỏ  phức hợp ngăn cản sự
tương tác giữa biotin và strptavindin. Phức hợp thuốc thử sẽ được hút vào đến
ngăn đếm tiểu phân mang điện ngăn cách với bề mặt điện cực và giải phóng
thuốc thử được rửa sạch bởi procell. Việc gắn điện áp vào điện cực kích thích
sự phát sáng và cường độ ánh ánh phát ra được đo bằng bộ nhân quang. Ánh
sáng được phát ra tỷ lệ thuận với nồng độ HBsAg có trong mẫu thử.
Nguyên lý này thường được áp dụng rộng rãi ở các máy định lượng này nay.
- Miễn dịch gắn enzym (ELISA - Enzyme linked immunosorbent assay):


12

Kỹ thuật này sử dụng kháng thể hoặc kháng nguyên cố định vào một
tấm polystyren. Sau đó nó được dùng để bắt kháng nguyên hoặc kháng thể đối
ứng ở dung dịch thử nghiệm và phức hợp được phát hiện nhờ enzyme gắn với
kháng thể hoặc kháng nguyên tác động lên cơ chất đặc hiệu. Cơ chất của
enzyme thủy phân đo ở quang phổ kế, tỷ lệ với nồng độ của kháng thể hoặc
kháng nguyên không biết ở trong dung dịch thử nghiệm. Kháng nguyên hoặc
kháng thể liên hợp với enzyme vẫn giữ hoạt tính miễn dịch. Enzyme được sử
dụng có thể là photphatase kiềm hoặc peroxydase. Thử nghiệm cho kết quả
khách quan và rất nhạy. Thử nghiệm miễn dịch liên kết enzyme được áp dụng
để chẩn đoán những vi khuẩn như giang mai, Brucella, Salmonella , vi khuẩn
tả,… và các virus như virus viêm gan, virus sởi, virus rota,…
- Miễn dịch huỳnh quang:
Những thuốc nhuộm huỳnh quang như Fluorescein, Rhodamin có thể
kết hợp với kháng thể mà khơng phá hủy tính chất đặc hiệu của kháng thể.
Kháng thể liên hợp ấy có khả năng kết hợp với kháng nguyên và phức hợp
kháng nguyên - kháng thể có thể quan sát ở kính hiển vi huỳnh quang. Kháng
thể được liên hợp với thuốc nhuộm huỳnh quang rồi cho tác dụng với kháng
nguyên (phương pháp trực tiếp) hoặc kháng thể được cho tác dụng trực tiếp
với kháng nguyên rồi cho kết hợp với kháng globulin người liên hợp với
Fluorescein. Trước hết cho kháng nguyên cố định lên tiêu bản rồi cho tác
dụng với huyết thanh bệnh nhân, rửa để loại bỏ kháng thể thừa sau đó nhỏ
một giọt globulin người gắn Fluorescein rồi quan sát ở kính hiển vi huỳnh
quang (phương pháp gián tiếp).
- Miễn dịch phóng xạ (Radioimmunoassay- RIA):
Dùng đồng vị phóng xạ như Thymidin, Cacbon 14, I125,… đánh dấu
kháng nguyên hoặc kháng thể để theo dõi phản ứng kết hợp kháng ngun
kháng thể. Có thể xác định vị trí của kháng nguyên (hoặc kháng thể) đã đánh
dấu đồng vị phóng xạ bằng cách cho nhũ tương ảnh lên trên tiêu bản tổ chức

13

học, sau đó phát hiện bằng các phương pháp chụp ảnh thông thường. Để phát
hiện và đo lường đồng vị phóng xạ trong mơi trường lỏng, ví dụ các đồng vị
phát xạ beta (như thymidin H3, Cacbon C14), cần dùng một dung dịch nhấp
nháy và đo trong máy đếm tự động. Phương pháp đồng vị phóng xạ khơng
những có thể khu trú vị trí kết hợp một cách chính xác mà còn làm tăng độ
nhạy cảm phản ứng lên hàng nghìn lần.
1.2. Đảm bảo chất lượng xét nghiệm.
1.2.1. Các khái niệm về chất lượng xét nghiệm.
- Chất lượng (Quality): Là mức độ của tập hợp các đặc tính vốn có
đáp ứng các yêu cầu.
- Quản lý chất lượng (Quality Management - QM): Là một loạt các hoạt
động có phối hợp để định hướng và kiểm soát một tổ chức về chất lượng.
Việc định hướng và kiểm soát về chất lượng một tổ chức nói chung bao gồm:
chính sách chất lượng, mục tiêu chất lượng, hoạch định chất lượng, kiểm soát
chất lượng, đảm bảo chất lượng và cải tiến chất lượng.
- Kiểm soát chất lượng (Quality Control - QC): Các hoạt động và kỹ
thuật được sử dụng nhằm đáp ứng đầy đủ các yêu cầu chất lượng.
- Đảm bảo chất lượng (Quality Assurance - QA): Tất cả các hoạt
động hệ thống được lập kế hoạch thiết yếu nhằm cung cấp độ tin cậy chắc
chắn rằng sản phẩm hoặc dịch vụ thỏa mãn các yêu cầu chất lượng.
- Ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm (External Quality Assessment EQA): còn được gọi là ngoại kiểm tra bao gồm ba phương thức triển khai là
thử nghiệm thành thạo, kiểm tra phân tích lại và đánh giá tại chỗ. Trong đó
thử nghiệm thành thạo là phương thức được sử dụng phổ biến nhất [13],[14].
- Nội kiểm tra chất lượng (Internal Quality Control - IQC), gọi tắt là nội
kiểm tra, là công cụ kiểm tra chất lượng hàng ngày trong nội bộ một PXN,
được thực hiện bởi nhân viên của PXN nhằm đánh giá liên tục các yếu tố ảnh

14

hưởng đến chất lượng xét nghiệm, từ đó đi đến quyết định liệu kết quả XN có
đủ tin cậy trước khi trả cho bác sỹ lâm sàng hoặc bệnh nhân [11].
- Thử nghiệm thành thạo (proficiency testing - PT): thường được diễn
giải là công tác đánh giá việc thực hiện XN của các PXN thông qua so sánh
liên PXN, nghĩa là đánh giá các XN trên cùng một mẫu thử nghiệm hay
những mẫu nghiệm tương tự được phân tích bởi hai hay nhiều PXN theo các
điều kiện đã xác định trước [12]
- So sánh liên phòng: Việc tổ chức, thực hiện và đánh giá các thử nghiệm
trên cùng một mẫu thử nghiệm hoặc mẫu thử nghiệm tương tự được thực hiện
bởi hai hay nhiều phòng xét nghiệm theo các điều kiện xác định trước.
1.2.2. Hệ thống đảm bảo chất lượng của phòng xét nghiệm.
Hệ thống quản lý chất lượng (QLCL) do Viện tiêu chuẩn phòng xét
nghiệm và lâm sàng CLSI Hoa Kỳ đề xuất, hệ thống này bao hồm 12 thành tố
cơ bản bao trùm tất cả các hoạt động của phịng xét nghiệm.
Mơ hình của QLCL hồn tồn phù hợp với các tiêu chuẩn quốc tế
(International Organization for Standardization - ISO) ISO 90001/ISO
15189/ISO 17025. Chính vì vậy, Tổ chức Y tế thế giới đã phối hợp với CLSI
và CDC Hoa Kỳ ban hành cuốn cẩm nang Quản lý hệ thống phòng xét
nghiệm để các phòng xét nghiệm của các nước trên thế giới có thể và áp dụng
nhằm nâng cao chất lượng [15],[16].
- Tổ chức: Để có hệ thống quản lý chất lượng có chức năng tốt,
phịng xét nghiệm phải có cơ cấu tổ chức, quản lý nhằm thực hiện được các
chính sách về chất lượng.
- Nhân sự: Nguồn lực của phòng xét nghiệm là vấn đề quan trọng nhất,
đó là những nhân viên đủ năng lực, năng động, có tầm nhìn và điều quan
trọng phải có sự khích lệ thúc đẩy các cán bộ tận tâm với công việc và tuân
thủ các quy định.

15

- Trang thiết bị: Thiết bị phải phù hợp với kỹ thuật xét nghiệm, các thiết
bị đảm bảo hoạt đọng tốt và có bảo dưỡng định kỳ.
- Mua sắm và kiểm kê: Quản lý về cung ứng sinh phẩm và vật tư
phòng xét nghiệm nhằm đảm bảo các sinh phẩm và vật tư có chất lượng tốt,
sử dụng đúng mục đích.
- Kiểm sốt q trình: Bao gồm nhiều yếu tố để đảm bảo chất lượng
của phòng xét nghiệm trong quá trình thực hiện xét nghiệm. Những yếu tố
này bao gồm kiểm sốt chất lượng, thẩm định và cơng nhận.
- Quản lý thơng tin: Các thơng tin phịng xét nghiệm cần được quản lý
cẩn thận đảm bảo sự chính xác và bí mật.
- Tài liệu và hồ sơ: Tài liệu và hồ sơ luôn được lưu giữ cẩn thận để đảm
bảo sự chính xác và có thể đánh giá được.
- Quản lý sự cố: Phịng xét nghiệm ln cần một hệ thống để phát hiện
những vấn đề và sự cố, hành động khắc phục, tìm hiểu nguyên nhân và đưa ra
những hành động để không tái diễn các sự cố.
- Đánh giá: Q trình đánh giá chính là cơng cụ để kiểm sốt việc thực
hiện của phịng xét nghiệm và so sánh với các chuẩn mực để đánh giá.
- Cải tiến q trình: Mục đích đầu tiên của HTQLCL là sự cải tiến liên
tục các q trình trong phịng xét nghiệm và sự cải tiến được thực hiện một
cách hệ thống.
- Dịch vụ khách hàng: Đảm bảo khách hàng nhận được các dịch vụ cần
thiết cho họ.
- Cơ sở vật chất và an toàn: Cơ sở vật chất và an toàn bao gồm nhiều
vấn đề như: An ninh, an toàn, sức khỏe, môi trường làm việc.