NGHIÊN cứu xây DỰNG QUY TRÌNH sản XUẤT mẫu HUYẾT THANH sử DỤNG TRONG CHƯƠNG TRÌNH nội KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG xét NGHIỆM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y H NI

NGUYN XUN T

NGHIÊN CứU XÂY DựNG QUY TRìNH SảN XUấT
MẫU HUYếT THANH Sử DụNG TRONG CHƯƠNG TRìNH
NộI KIểM TRA CHấT LƯợNG XéT NGHIệM
ĐịNH LƯợNG KHáNG NGUYÊN HBSAG

KHểA LUN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA
KHÓA 2010 - 2016

HÀ NỘI – 2016


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y H NI

NGUYN XUN T

NGHIÊN CứU XÂY DựNG QUY TRìNH SảN XUấT
MẫU HUYếT THANH Sử DụNG TRONG CHƯƠNG TRìNH
NộI KIểM TRA CHấT LƯợNG XéT NGHIệM
ĐịNH LƯợNG KHáNG NGUYÊN HBSAG

KHểA LUN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA
KHÓA 2010 - 2016
Người hướng dẫn khoa học:
1 Ths. phạm thị hương trang
2 PGS TS Đặng Thị Ngọc Dung

HÀ NỘI – 2016


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn tới Ban Giám hiệu, Phòng Quản lý
đào tạo đại học trường Đại học Y Hà Nội đã giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận
lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trường.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS.TS Đặng Thị Ngọc Dung
cùng ThS. Phạm Thị Hương Trang các cơ đã nhiệt tình giúp đỡ tơi trong
q trình học tập cũng như nghiên cứu khoa học.
Tơi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô, anh chị trong khoa xét nghiệm
Bệnh viện Đại học Y Hà Nội đã giúp đỡ tơi nhiệt tình, tạo mọi thuận lợi cho
tơi trong q trình thực hiện và hồn thành khóa luận này.
Cuối cùng tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới cha mẹ, những người đã sinh
thành và nuôi dạy tơi, cùng với những người thân trong gia đình, anh em bè
bạn đã chia sẻ động viên giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập.
Hà Nội, tháng 5 năm 2016
Sinh viên
Nguyễn Xuân Đạt


LỜI CAM ĐOAN

Tôi là Nguyễn xuân Đạt, sinh viên Trường Đại học Y Hà Nội, chuyên
ngành Cử Nhân Kỹ Thuật Y Học, xin cam đoan:
1. Đây là khoá luận do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng
dẫn của PGS.TS. Đặng Thị Ngọc Dung cùng ThS. Phạm Thị Hương Trang.
2. Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hồn tồn trung thực và
khách quan.
Tơi xin hồn toàn chịu trách nhiệm về những cam kết này.
Hà Nội, tháng 5 năm 2016
Sinh viên
Nguyễn Xuân Đạt


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ...................................................................................................1
Chương 1...........................................................................................................3
TỔNG QUAN TÀI LIỆU.................................................................................3
1.1. Bệnh viêm gan B....................................................................................3
1.1.1. Lịch sử bệnh viêm gan B...................................................................3
1.1.2. Đặc điểm sinh học của bệnh viêm gan B............................................5
1.1.3. Cấu trúc của virus viêm gan B (HBV)................................................6
1.1.4. Cấu trúc kháng nguyên của virus viêm gan B (HBV).........................6
1.1.5. Dấu ấn HBsAg huyết thanh khi nhiễm HBV.....................................7
1.1.6. Phịng bệnh khơng đặc hiệu..............................................................9
1.1.7. Phịng bệnh đặc hiệu.......................................................................10
1.1.8. Phương pháp trực tiếp:....................................................................11
1.1.9. Phương pháp gián tiếp (phương pháp huyết thanh học):..................11
1.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng xét nghiệm...............................13
1.2.1. Giai đoạn trước xét nghiệm..............................................................17
1.2.2. Giai đoạn xét nghiệm.......................................................................17
1.2.3. Giai đoạn sau xét nghiệm.................................................................17

1.2.4. Yếu tố ảnh hưởng ở giai đoạn trước xét nghiệm...............................19
1.2.5. Yếu tố ảnh hưởng ở giai đoạn xét nghiệm........................................19
1.2.6. Yếu tố ảnh hưởng ở giai đoạn sau xét nghiệm..................................20
1.2.7. Kiểm tra độ chính xác......................................................................20
1.2.8. Kiểm tra độ xác thực........................................................................21
1.3 . Đơng khô mẫu huyết thanh xét nghiệm...............................................22
1.4. Cách tạo mẫu huyết thanh nội kiểm và đánh giá chất lượng mẫu huyết
thanh............................................................................................................23


Chương 2 ........................................................................................................25
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.....................................25
2.1. Đối tượng nghiên cứu...........................................................................25
2.1.1. Tiêu chuẩn chọn mẫu.......................................................................25
2.1.2. Tiêu chuẩn loại bỏ mẫu....................................................................25
2.2. Hóa chất và thiết bị...............................................................................26
2.2.1. Dụng cụ và thiết bị..........................................................................26
2.2.2. Hóa chất thiết bị sử dụng.................................................................26
2.3. Phương pháp nghiên cứu......................................................................26
2.3.1. Nguyên lý xét nghiệm [23]..............................................................26
2.3.2. Phân tích kết qủa.............................................................................27
2.3.3. Phân ngưỡng phản ứng ...................................................................28
2.4. Thiết kế nghiên cứu..............................................................................29
2.4.1. giai đoạn 1: “tạo các mẫu nội kiểm”.................................................29
2.4.2. giai đoạn 2: “phân điều kiện bảo quản cho lô mẫu”..........................29
2.4.3. giai đoạn 3: “đánh giá chất lượng của lô mẫu”..................................29
2.4.4. Thiết kế nghiên cứu.........................................................................29
2.5. Thu thập và xử lý số liệu......................................................................31
2.5.1. Thu thập số liệu...............................................................................31
2.5.2. Số liệu sử dụng trong kiểm tra độ đồng nhất và độ ổn định...............31

2.5.3. Đánh giá các giá trị thông qua tiêu chuẩn của CLIA đề ra.................31
2.5.4. Theo kiểm định toán học dưới hướng dẫn của tổ chức ILAC............31
2.5.5. Theo quy tắc kiểm tra chất lượng xét nghiệm quy tắc Westgard........32
Chương 3 ........................................................................................................36
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU..............................................................................36
3.1. Chất lượng của các mẫu huyết thanh....................................................36
3.2. Độ đồng nhất của các mẫu...................................................................38


3.2.1. Độ đồng nhất của mẫu ban đầu khi chưa đông lạnh hay đông khô.. . .38
3.2.2. Độ đồng nhất của các mẫu sau bảo quản..........................................39
3.3. Độ ổn định của mẫu..............................................................................40
3.3.1. Theo tiêu chuẩn độ ổn định dài hạn của CLIA về xét nghiệm [HbsAg]
và theo quy tắc Westgard..........................................................................40
3.3.2. Theo kiểm định toán học.................................................................48
3.4. Tổng hợp..............................................................................................49
Chương 4 ........................................................................................................50
BÀN LUẬN....................................................................................................50
4.1. Bàn luận về quy trình sản xuất mẫu huyết thanh nội kiểm..................50
4.2. Chất lượng của lô mẫu huyết thanh nội kiểm tự tạo............................51
4.2.1. Độ đồng nhất của mẫu.....................................................................51
4.2.2. Bàn luận về độ ổn định của lơ mẫu trong suốt q trình nghiên cứu.. 52
KẾT LUẬN....................................................................................................56
TÀI LIỆU THAM KHẢO...............................................................................57
DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1: kết quả định lượng các mẫu trước bảo quản...................................38
Bảng 3.2: thông số xác định độ đồng nhất của các mẫu trước bảo quản........39
Bảng 3.3: thông số xác định độ đồng nhất của các mẫu sau bảo quản............39
Bảng 3.4: Các giá trị thiết lập trong 20 ngày liên tiếp để vẽ biểu đồ leveyjenning cho các lô mẫu....................................................................................41
Bảng 3.5; Tổng hợp số ngày chấp nhận sự ổn định của các mẫu xét nghiệm.49

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Hình 3.1 : Biểu đồ westgard cho thấy các kết quả phân tích mẫu A trong 32
ngày.................................................................................................................42
Hình 3.2: Kết quả phân tích sau 30 ngày của mẫu C......................................43
Hình 3.3: kết quả định lượng của mẫu D sau 32 ngày liên tiếp......................44
Hình 3.4: kết quả định lượng của mẫu E sau 32 ngày....................................45


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Các bộ phận trên cơ thể khi sinh ra đề nắm giữ những vai trò riêng biệt
khi vai trị này mất đi thì bộ phận đó cũng sẽ tiêu biến theo thời gian. Là một
trong ngũ tạng quan trọng nhất trên cơ thể gan nắm giữ những chức năng vơ
cùng thiết yếu như: chuyển hóa glucid – lipid - protid, tổng hợp protein, dự
trữ B12 – sắt – glucid, tạo mật… Tuy nhiên song hành với cơ thể tốt thì cần đi
đơi với giữ gìn và tập luyện duy trì do có rất nhiều yếu tố có thể tác động gây
tổn hại cho cơ thể, và viêm gan virus B là một trong số đó.
Kể từ khi được phát hiện bởi Blumberg vào năm 1965 cho tới nay, theo
tổ chức y tế thế giới ước tính có khoảng 1/3 dân số thế giới đã từng nhiễm
HBV, hàng năm có khoảng 240 triệu người mắc viêm gan B mạn tính và 780
nghìn người chết bởi viêm gan B [1]. Do bệnh có những diễn biến thầm lặng
với các triệu chứng mơ hồ nhưng để lại các biến chứng nặng nề như xơ gan,
ung thư gan làm ảnh hưởng không ít đến chất lượng cuộc sống của mọi người.
Việt Nam nằm trong khu vực lưu hành cao, tỷ lệ viêm gan B trong quần
thể từ 10-15% đặc biệt có những vùng lên đến 20%. Điều này tương đương
rằng Việt Nam có khoảng 8,6 triệu người nhiễm viêm gan hàng năm [2]. Tuy

nhiên hiểu biết của người dân về bệnh viêm gan virus B lại chưa được đầy đủ,
chính xác và cịn có cả những sai lệch.
Ở phịng xét nghiệm việc chẩn đoán viêm gan virus B chủ yếu dựa trên
việc phát hiện kháng nguyên bề mặt của virus viêm gan B. Kháng nguyên này
được phát hiện thông qua sàng lọc nhanh bằng test định tính hay xét nghiệm
định lượng. Các xét nghiệm này được thực hiện bởi các bộ kit do các hãng
khác nhau cung cấp và nó được phổ biến ở hầu hết các đơn vị từ công lập cho
tới đơn vị tư nhân. Tuy nhiên chất lượng của xét nghiệm ở các phòng xét
nghiệm này đang là một vấn đề nóng mà tồn xã hội quan tâm.


2

Để tạo được niềm tin ở bệnh nhân phòng xét nghiệm cần phải xây
dựng được cho mình một chương trình kiểm sốt chất lượng của các xét
nghiệm nói chung và của xét nghiệm viêm gan virus B nói riêng. Chương
trình này bao hàm hai chương trình con là nội kiểm tra chất lượng và ngoại
kiểm tra chất lượng.
Nội kiểm tra chất lượng là công cụ kiểm tra chất lượng hàng ngày trong
nội bộ một phòng xét nghiệm, được thực hiện bởi nhân viên của phòng xét
nghiệm nhằm đánh giá liên tục các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng xét
nghiệm, từ đó đi đến quyết định liệu kết quả xét nghiệm có đủ tin cậy trước
khi trả cho bác sỹ lâm sàng hoặc bệnh nhân [3].
Ngoại kiểm tra chất lượng là công tác đánh giá việc thực hiện xét
nghiệm của các phịng xét nghiệm thơng qua so sánh liên phịng xét nghiệm,
nghĩa là đánh giá các xét nghiệm trên cùng một mẫu thử nghiệm hay những
mẫu nghiệm tương tự được phân tích bởi hai hay nhiều phịng xét nghiệm
theo các điều kiện đã xác định trước [4]. Nhằm đem lại sự chính xác trong xét
nghiệm viêm gan virus B và nâng cao niềm tin của bệnh nhân với phòng xét
nghiệm chúng tôi xin tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu xây dựng

quy trình sản xuất mẫu huyết thanh sử dụng trong chương trình nội kiểm
tra chất lượng xét nghiệm định lượng kháng nguyên HBsAg” với mục tiêu:
1.
Nghiên cứu quy trình sản xuất mẫu huyết thanh chuẩn dùng trong xét
2.

nghiệm HBV.
Đưa ra những đánh giá ban đầu về chất lượng của mẫu huyết thanh
đông lạnh và đông khô dùng trong xét nghiệm viêm gan virus B.


3

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Bệnh viêm gan B
1.1.1. Lịch sử bệnh viêm gan B
Vào năm 1963 trong một nghiên cứu về các protein huyết thanh đa hình
(polymorphic) Blumberg đã phát hiện ra một protein trong máu của thổ dân
Australia mà trước đó chưa từng được biết tới. Hai năm sau đó protein này
được gọi với cái tên kháng nguyên Australia nhờ việc ứng dụng của kỹ thuật
xét nghiệm miễn dịch men. Tới năm 1968 trong nghiên cứu của Prince,
Okochi và Murakami đã xác định được kháng nguyên Australia chỉ được tìm
thấy trong huyết thanh của người nhiễm virus viêm gan B, từ đó virus viêm
gan B mới được nhận biết và xác lập đặc điểm.
Nhờ phát hiện và nghiên cứu về kháng nguyên này mà năm 1976
Blumberg đã được trao giải Nobel y học cho công hiến của ông [5].
Tuy nhiên lịch sử loài người đã ghi nhận được rất nhiều trường hợp mắc
các bệnh khác nhau gây nên vàng da, các dấu hiệu đó có thể là tồn thân hoặc
chỉ diễn ra chủ yếu ở gan. Các biểu hiện này được y văn ghi lại với cái tên

chung là hội chứng hồng đảm.
Virchow đã mơ tả bệnh gan là bệnh vàng da xuất tiết, ông cho rằng vàng
da xuất tiết có nguyên nhân từ viêm đường tắc mật, chất nhầy bám dính làm
tắc đường mật, từ đó gây viêm chỗ nối đường mật – tá tràng và do vi khuẩn
gây ra. Năm 1908 Mc.Donald cho rằng tác nhân của vàng da xuất tiết là virus
chứ không phải vi khuẩn.
Tại Thụy Điển 10 năm sau đó người ta đã đặt ra thuật ngữ viêm gan cho
bệnh vàng da xuất tiết, đồng thời cũng đã chẩn đoán phân biệt được viêm gan
dịch tễ và viêm gan huyết thanh.


4

Các nghiên cứu ở Anh và quân y Mỹ đã chỉ ra rằng viêm gan B hiện diện
trong huyết thanh gây vàng da và thường được mang bởi người khỏe mạnh
bình thường khơng vàng da. Nhưng tới tận chiến tranh thê giới lần thứ II nhận
thức tổng quát và chính xác về bản chất lây nhiễm của bệnh vàng da xuất tiết
mà Virchow mô tả mới được rõ ràng và chính xác. MacCallum cũng đã đề
nghị gọi viêm gan B thay cho cái tên viêm gan nhiễm huyết thanh và thuật
ngữ này đã được chấp thuận bởi ủy ban của tổ chức y tế thế giới vào năm
1947 [5].
Sau công trình nghiên cứu của Blumberg, các nghiên cứu về viêm gan
B đã được diễn ra ngay trên chính con người. Nhờ đó mà các đặc điểm dịch
tễ, bệnh sử và phòng ngừa bệnh viêm gan B được hiểu biết rõ hơn. Tuy
nhiên nó lại rấy lên những vi phạm về đạo đức nên những nghiên cứu này
phải dừng lại.
Nhờ những tiến bộ của ngành sinh học phân tử vào năm 1970 Dane đã
phát hiện dưới kính hiểm vi điện tử các hạt nhỏ kích thước khoảng 42nm, nó
mang trên bề mặt kháng nguyên Australia trong huyết thanh của bệnh nhân
viêm gan B và những hạt này được gọi là hạt Dane.

Cũng chính nhờ sự tiến bộ khơng ngừng của ngành cơng nghệ mà chỉ
sau đó vài năm Robinson đã nhân dịng và xác định mã chuỗi nucleotide
DNA tồn phần của hạt Dane chính là virus viêm gan B. bộ gen của virus
viêm gan B là bộ gen độc đáo trong thế giới virus do bản chất đậm đặc của
chúng, các khung đọc gối lên nhau và do phụ thuộc vào bước phiên mã
ngược, dù rằng virion chứa chủ yếu là DNA [5]
Cho tới ngày nay chúng ta đã đạt được những tiến bộ không ngừng về
sinh bệnh học, dịch tễ, chẩn đốn điều trị cũng như dự phịng bệnh viêm
gan B.


5

1.1.2. Đặc điểm sinh học của bệnh viêm gan B
Virus gây viêm gan là những virus có ái tính với tế bào gan. Sau khi
virus viêm gan sâm nhập vào cơ thể thì việc gây tổn thương cho các tế bào
khác chỉ là thứ yếu do tế bào đích mà virus hướng tới, xâm nhập nhân lên và
gây tổn thương chủ yếu là tế bào gan. Các virus viêm gan đều có tế bào đích
chung là các tế bào viêm gan, nhưng chúng có cấu trúc, đường sâm nhập, cơ
chế lan truyền… khác nhau. Dựa theo kiểu gen hiện nay các virus viêm gan
chính được chia làm 8 loại là: HAV, HBV, HCV, HDV, HEV, HFV, HGV và
HHV [6]


6

1.1.3. Cấu trúc của virus viêm gan B (HBV)
HBV được xếp trong họ Hepadnaviridae, là một virus hình cầu có
đường kính khoảng 42nm. Trước đây được gọi là hạt Dane
Cấu tạo của virus từ ngồi vào trong gồm có: bao ngồi cùng là lớp vỏ

lipid có chứa kháng ngun bề
mặt là HBsAg. Bao quanh một
nucleocapsid bên trong gồm
kháng nguyên lõi viêm gan B
(HbcAg) phức với polymerase
giúp mã hóa và trong cùng là
bộ gen DNA của virus [7]
Cấu trúc của HBsAg có
thể thay đổi để tạo thành nhiểu
thứ týp khác nhau. Trong cấu
trúc HBsAg của mọi HBV đều
có thành phần “a” giống nhau
còn các thành phần cấu trúc
khác “y” hoặc “d” “v” “w”
hoặc “r” của các thứ týp là
khác nhau [6].
1.1.4. Cấu trúc kháng nguyên của virus viêm gan B (HBV)
Hạt Dane: huyết thanh người bị nhiễm trùng có chứa một số lượng lớn những
hạt có kích thước khoảng 42 nm, đó là những virus cịn ngun vẹn và có khả
năng lây nhiễm [8].
HBV có ba loại kháng ngun chính :
- HBsAg: có sự thay đổi giữa chính các thứ týp. Trọng lượng phân tử thay đổi
từ 21000 đến 24000 dalton. Giúp cho sự bám của virus vào tế bào gan.


7

- HBcAg: có trọng lượng phân tử từ 18000 đến 19000 dalton. HBcAg chỉ tìm
được trong tế bào gan khơng tìm được trong máu người nhiễm HBV.
- HBeAg: có cấu trúc thay đổi ở các thứ týp. Trọng lượng phân tử từ 16000

đến 19000 dalton. Kháng nguyên này cũng giống như HBsAg có thể tìm trong
máu, hut thanh bệnh nhân [9]

1.1.5. Dấu ấn HBsAg huyết thanh khi nhiễm HBV.

Hình 1 : Thay đổi về dấu ấn huyết thanh của HBV trong giai đoạn
nhiễm viêm gan B cấp tính.


8

/>$file/AmpScrn%20HBV%20Val%20Presentation1.pdf
HBsAg là kháng nguyên bề mặt của HBV, là dấu ấn xác nhận đang
nhiễm HBV.
HBsAg xuất hiện trong huyết thanh 1-10 tuần sau khi tiếp xúc cấp với
HBV, xuất hiện trước khi có triệu chứng lâm sàng và cận lâm sàng.
Đối với bệnh nhân phục hồi sau giai đoạn nhiễm cấp, HBsAg sẽ biến
mất sau 4-6 tháng. Nhiễm HBV mạn khi HBsAg xuất hiện kéo dài trên 6
tháng. Ở những người nhiễm mạn, tỷ lệ khơng cịn xuất hiện kháng nguyên
HBsAg khoảng 0.5% mỗi năm.
Sự xuất hiện Anti HBs chứng tỏ bệnh nhân đã miễn nhiễm với HBV và
hầu như sẽ khơng nhiễm HBV nữa. Một số ít trường hợp, HBsAg xuất hiện
trở lại trên người đã có anti HBc và anti HBs khi bị suy giảm miễn dịch hay
do sử dụng thuốc ức chế miễn dịch hay hóa trị liệu.
Hầu hết Anti HBs xuất hiện ngay sau khi HBsAg biến mất. Một số
bệnh nhân anti HBs không xuất hiện ngay sau khi HBsAg biến mất mà chỉ
xuất hiện sau giai đoạn cửa sổ (window period) kéo dài vài tuần hay vài
tháng. Vì vậy, trong giai đoạn này HBsAg âm, Anti HBs âm chỉ có IgM antiHBc dương là một dấu ấn cho thấy đang nhiễm cấp .
Anti HBs cũng được tạo ra sau chủng ngừa HBV. Chủng ngừa chỉ có
thể tạo ra một loại kháng thể duy nhất là Anti HBs.

Anti HBs (+) có thể xảy ra trong 2 trường hợp sau :
-

anti HBs (+) --> đã nhiễm hiện đã lành.

-

anti HBs (-) --> chưa từng bị nhiễm, đáp ứng miễn dịch sau chích

ngừa HBV
Sự hiện diện của cả hai HBsAg và antiHBs trong huyết tương gặp trong
24% trường hợp có HBsAg (+) [24]. Trong tình huống này, cơ thể có tạo ra


9

Anti HBs nhưng với nồng độ thấp không đủ trung hịa hạt tử virus hay virion
trong huyết thanh, vì vậy, những bệnh nhân này cũng được xem như người
mang HBV.
Đặc điểm dịch tễ học
Viêm gan B là một trong những bệnh truyền nhiễm phổ biến nhất và
nghiêm trọng nhất thế giới. Người ta ước tính rằng hơn một phần ba dân số
thế giới đã bị nhiễm viêm gan B. Có khoảng 5% dân số (350 triệu người)
mang HBV mạn tính. Nhiễm HBV gây ra hơn một trăm triệu ca tử vong mỗi
năm [10],[11],[12].
Bệnh viêm gan virus B trước đây thường gặp sau truyền máu. Ngày nay
việc kiểm tra HBsAg của những người cho máu, nguyên nhân của nhiễm
HBV vẫn luôn là một vấn đề thời sự. Đường lây truyền hiện nay do tiêm
chích, nghiện ma túy, qua đường tình dục, từ mẹ sang con, qua các thiết bị y
tế chưa được tiệt trùng… Có nhiều con đường do vậy trách nghiệm của người

thầy thuốc rất lớn trong việc tuyên truyền cho mọi người hiểu rõ để tự điều
chỉnh hành vi phịng bệnh.
Theo ước tính của tổ chức y tế thế giới khu vực Tây Thái Bình Dương
thì Việt Nam hiện có khoảng 8,6 triệu người nhiễm virus viêm gan B. Tỷ lệ
nhiễm virus mạn tính được ước tính khoảng 8,8% ở phụ nữ và 12,3% ở nam
giới [10].
Phòng ngừa và điều trị HBV.
1.1.6. Phịng bệnh khơng đặc hiệu.
Vấn đề phịng bệnh khơng đặc là rất quan trọng nó phụ thuộc vào mức
độ nhận thức của từng người để tự điều chỉnh hành vi, tránh nguy cơ lây
nhiễm. Phòng bằng tiêm huyết thanh người bình thường khơng có hiệu quả
với HBV có thể dùng globulin đặc hiệu có anti HBV phịng bệnh đặc hiệu.


10

Quan trọng nhất vẫn là nâng cao tầm hiểu biết của mọi người để mọi tự phòng
tránh vẫn là cách hiệu quả nhất.
1.1.7. Phòng bệnh đặc hiệu.
Vacxin HBsAg được sản xuất bằng cách tinh chế huyết tương của
người nhiễm HBV và hiện có vacxin HBV sản xuất tổ hợp là trụ cột của cơng
tác phịng bệnh [4]
Thế giới khuyến cáo rằng tất cả các trẻ sơ sinh cần được tiêm phòng
cáng sớm càng tốt. Tốt nhất là trong vòng 24 giờ đầu sau khi sinh.
Tiếp theo liều sau sinh, cần tiêm thêm ba liều nữa để hoàn thành loạt
tiêm ban đầu.
Những người thuộc nhóm có nguy cơ cao cũng cần được chủng ngừa.
Họ bao gồm các nhóm đối tượng:
• Những người thường xuyên cần truyền máu hoặc các sản phẩm của
máu, bệnh nhân lọc máu, người nhận ghép tạng.

• Người bị giữ trong nhà tù
• Người tiêm chích ma túy.
• Người có tiếp xúc với những thành viên gia đình và quan hệ tình dục
với những người bị nhiễm vi rút viêm gan B mạn tính.
• Những người có nhiều bạn tình cũng như nhân viên y tế và những
người có thể phơi nhiễm với máu và các sản phẩm của máu trong khi
làm việc.
• Du khách chưa hồn thành liệu trình tiêm chủng vắc xin viêm gan B
cũng cần được tiêm vắc xin trước khi đến vùng có dịch lưu hành [10]
Chẩn đoán lâm sàng
Để chẩn đoán viêm gan B cấp và mạn tính, người ta đã áp dụng các thử
nghiệm phát hiện HBsAg và các kỹ thuật miễn dịch học để phát hiện kháng
nguyên và kháng thể của virus. Bên cạnh đó kỹ thuật kính hiển vi điện tử có


11

thể được sử dụng để xác định HBV trong máu hoặc trong sinh thiết các tổ
chức gan.
1.1.8. Phương pháp trực tiếp:
Là phát hiện hạt virus (hạt Dane) hoặc các thành phần cấu trúc của virus.
Cụ thể là phát hiện: hạt virus, DNA của virus, kháng nguyên HBsAg, kháng
nguyên HBeAg, kháng nguyên HbcAg trong tế bào gan(kết hợp với làm sinh
thiết gan)
1.1.9. Phương pháp gián tiếp (phương pháp huyết thanh học):
Là phát hiện các sản phẩm tương tác của virus với cơ thể (kháng thể), cụ
thể là phát hiện: HbsAg, anti - HBsAg, anti - HbeAg, anti - HBcAg
Các kỹ thuật được dùng để phát hiện bao gồm:
• Kỹ thuật sắc kí miễn dịch:
Phức hợp kháng kháng thể (KKT) gắn chất màu được phân bố đều trên bản

giấy sắc ký. Kháng nguyên (KN) đặc thù của vi sinh vật được gắn cố định tại
“vạch phản ứng”. Khi nhỏ huyết thanh cần xác định kháng thể (KT) lên bản
sắc ký, KT đặc hiệu (nếu có) trong huyết thanh sẽ kết hợp với KKT gắn màu,
phức hợp miễn dịch KT-KKT gắn màu này di chuyển trên giấy sắc ký sẽ bị
giữ lại tại “vạch phản ứng” do KT kết hợp với KN vi sinh vật, kết quả “vạch
phản ứng” hiện màu. Nếu trong huyết thanh khơng có KT đặc hiệu, ở “vạch
phản ứng” KN khơng thể giữ được KKT gắn màu, vì vậy không hiện màu.
Phương pháp này được áp dụng phổ biến ở các loại test nhanh hiện nay.
• Miễn dịch điện hóa phát quang (elctro-chemiluminescence
immunoassay: eclia ):
Khái niệm: Miễn địch điện hóa phát quang là q trình phản ứng mạnh
của các chất được tạo ra từ những chất bền vững có trước trên bề mặt của điện
cực. Phản ứng mạnh của các chất này sẽ tác động trở lại chất tương tự đông
thời phát quang.


12

Nó dựa trên việc sử dụng phức hợp ruthenium-tris (bypyridil) và
tripropylamin (TPA) và cuối cùng sản phẩm quang hóa được tạo ra tại thời
điểm phát hiện ra bước sóng.
Ba nguyên lý chính được áp đụng ở kỹ thuật này là:
- nguyên lý cạnh tranh.
- nguyên lý sandwich.
- nguyên lý bắc cầu.
Với việc định lượng HBsAg người ta sử dụng nguyên lý sandwich, mẫu
thử kết hợp với thuốc thử chứa kháng thể HBsAg được gắn biotin và hỗn hợp
kháng HBsAg đơn dòng và đa dòng được đánh dấu bằng phức hợp ruthenium
Strptavidin được bao phủ thêm những mảnh nhỏ  phức hợp ngăn cản sự
tương tác giữa biotin và strptavindin. Phức hợp thuốc thử sẽ được hút vào đến

ngăn đếm tiểu phân mang điện ngăn cách với bề mặt điện cực và giải phóng
thuốc thử được rửa sạch bởi procell. Việc gắn điện áp vào điện cực kích thích
sự phát sáng và cường độ ánh ánh phát ra được đo bằng bộ nhân quang. Ánh
sáng được phát ra tỷ lệ thuận với nồng độ HBsAg có trong mẫu thử.
Nguyên lý này thường được áp dụng rộng rãi ở các máy định lượng này nay.
• Miễn dịch gắn enzym (ELISA – Enzyme linked immunosorbent assay):
Kỹ thuật này sử dụng kháng thể hoặc kháng nguyên cố định vào một
tấm polystyren. Sau đó nó được dùng để bắt kháng nguyên hoặc kháng thể đối
ứng ở dung dịch thử nghiệm và phức hợp được phát hiện nhờ enzyme gắn với
kháng thể hoặc kháng nguyên tác động lên cơ chất đặc hiệu. Cơ chất của
enzyme thủy phân đo ở quang phổ kế, tỷ lệ với nồng độ của kháng thể hoặc
kháng nguyên không biết ở trong dung dịch thử nghiệm. Kháng nguyên hoặc
kháng thể liên hợp với enzyme vẫn giữ hoạt tính miễn dịch. Enzyme được sử
dụng có thể là photphatase kiễm hoặc peroxydase. Thử nghiệm cho kết quả
khách quan và rất nhạy. Thử nghiệm miễn dịch liên kết enzyme được áp dựng
để chẩn đoán những vi khuẩn như giang mai, Brucella, Salmonella , vi khuẩn
tả..và các virus như virus viêm gan, virus sởi, virus rota...


13

• Miễn dịch huỳnh quang:
Những thuốc nhuộm huỳnh quang như Fluorescein, Rhodamin có thể
kết hợp với kháng thể mà khơng phá hủy tính chất đặc hiệu của kháng thể.
Kháng thể liên hợp ấy có khả năng kết hợp với kháng nguyên và phức hợp
kháng nguyên – kháng thể có thể quan sát ở kính hiển vi huỳnh quang. Kháng
thể được liên hợp với thuốc nhuộm huỳnh quang rồi cho tác dụng với kháng
nguyên (phương pháp trực tiếp) hoặc kháng thể được cho tác dụng trực tiếp
với kháng nguyên rồi cho kết hợp với kháng globulin người liên hợp với
Fluorescein. Trước hết cho kháng nguyên cố định lên tiêu bản rồi cho tác

dụng với huyết thanh bệnh nhân, rửa để loại bỏ kháng thể thừa sau đó nhỏ
một giọt globulin người gắn Fluorescein rồi quan sát ở kính hiển vi huỳnh
quang (phương pháp gián tiếp).
• Miễn dịch phóng xạ (Radioimmunoassay- RIA):
Dùng đồng vị phóng xạ như Thymidin H 3, Cacbon 14, I 125 ... đánh
dấu kháng nguyên hoặc kháng thể để theo dõi phản ứng kết hợp kháng
nguyên kháng thể. Có thể xác định vị trí của kháng nguyên (hoặc kháng thể)
đã đánh dấu đồng vị phóng xạ bằng cách cho nhũ tương ảnh lên trên tiêu bản
tổ chức học, sau đó phát hiện bằng các phương pháp chụp ảnh thơng thường.
Để phát hiện và đo lường đồng vị phóng xạ trong mơi trường lỏng, ví dụ các
đồng vị phát xạ beta (như thymidin H3, Cacbon C14), cần dùng một dung
dịch nhấp nháy và đo trong máy đếm tự động. Phương pháp đồng vị phóng xạ
khơng những có thể khu trú vị trí kết hợp một cách chính xác mà cịn làm tăng
độ nhạy cảm phản ứng lên hàng nghìn lần.
1.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng xét nghiệm.
Các khái niệm về chất lượng xét nghiệm.
• Chất lượng (Quality): Là mức độ của tập hợp các đặc tính vốn có đáp
ứng các yêu cầu.


14

•

Quản lý chất lượng (Quality Management-QM): Là một loạt các hoạt

động có phối hợp để định hướng và kiểm sốt một tổ chức về chất lượng.
Việc định hướng và kiểm sốt về chất lượng một tổ chức nói chung bao gồm:
chính sách chất lượng; mục tiêu chất lượng; hoạch định chất lượng; kiểm
soát chất lượng; đảm bảo chất lượng và cải tiến chất lượng.

•

Kiểm sốt chất lượng (Quality Control-QC): Các hoạt động và kỹ

thuật được sử dụng nhằm đáp ứng đầy đủ các yêu cầu chất lượng.
•

Đảm bảo chất lượng (Quality Assurance-QA): Tất cả các hoạt động

hệ thống được lập kế hoạch thiết yếu nhằm cung cấp độ tin cậy chắc chắn
rằng sản phẩm hoặc dịch vụ thỏa mãn các u cầu chất lượng.
•

Đánh giá chất lượng bên ngồi (External Quality Assessment-EQA):

còn được gọi ngoại kiểm hay thử nghiệm thành thạo phịng thí nghiệm:
Việc xác định hoạt động thử nghiệm của phịng thí nghiệm bằng so sánh liên
phịng [13],[14].
•

Nội kiểm tra chất lượng (Internal Quality Control – IQC), gọi tắt là nội

kiểm tra, là công cụ kiểm tra chất lượng hàng ngày trong nội bộ một PXN,
được thực hiện bởi nhân viên của PXN nhằm đánh giá liên tục các yếu tố ảnh
hưởng đến chất lượng XN, từ đó đi đến quyết định liệu kết quả XN có đủ tin
cậy trước khi trả cho bác sỹ lâm sàng hoặc bệnh nhân [11]
•

Ngoại kiểm tra chất lượng (External Quality Assessment – EQA) thường

được diễn giải là công tác đánh giá việc thực hiện XN của các PXN thông qua
so sánh liên PXN, nghĩa là đánh giá các XN trên cùng một mẫu thử nghiệm
hay những mẫu nghiệm tương tự được phân tích bởi hai hay nhiều PXN theo
các điều kiện đã xác định trước [12]
•

So sánh liên phịng: Việc tổ chức, thực hiện và đánh giá các thử

nghiệm trên cùng một mẫu thử nghiệm hoặc mẫu thử nghiệm tương tự được


15

thực hiện bởi hai hay nhiều phịng thí nghiệm theo các điều kiện xác định
trước
Hệ thống đảm bảo chất lượng của phòng xét nghiệm
Hệ thống quản lý chất lượng (HTQLCL) do Viện tiêu chuẩn
phịng thí nghiệm và lâm sàng CLSI Hoa Kỳ đề xuất , hệ thống này bao
hồm 12 thành tố cơ bản bao trùm tất cả các hoạt động của phịng thí
nghiệm.
Mơ hình của HTQLCL hồn tồn phù hợp với các tiêu chuẩn quốc tế
(International Organization for Standardization -ISO) ISO 90001/ISO
15189/ISO 17025. Chính vì vậy, Tổ chức Y tế thế giới đã phối hợp với CLSI
và CDC Hoa Kỳ ban hành cuốn cẩm nang Quản lý hệ thống phịng thí
nghiệm

để

các

phịng thí nghiệm

của

các nước trên thế

giới

có thể và áp dụng
nhằm nâng cao

chất

lượng [15],[16].
Tổ chức:
có hệ thống quản

Để
lý

chất lượng có
chức năng tốt,
phịng thí nghiệm

phải

có cơ cấu tổ chức, quản lý nhằm thực hiện được các chính sách về chất lượng.
• Nhân sự: Nguồn lực của phịng thí nghiệm là vấn đề quan trọng
nhất, đó là những nhân viên đủ năng lực, năng động, có tầm nhìn

16

và điều quan trọng phải có sự khích lệ thúc đẩy các cán bộ tận tâm với công
việc và tuân thủ các quy định.
Trang thiết bị: Thiết bị phải phù hợp với kỹ thuật xét nghiệm, các
thiết bị đảm bảo hoạt đọng tốt và có bảo dưỡng định kỳ.
Mua sắm và kiểm kê: Quản lý về cung ứng sinh phẩm và vật tư
phịng thí nghiệm nhằm đảm bảo các sinh phẩm và vật tư có chất lượng tốt,
sử dụng đúng mục đích.
Kiểm sốt q trình: Bao gồm nhiều yếu tố để đảm bảo chất
lượng của phịng thí nghiệm trong q trình thực hiện xét nghiệm. Những
yếu tố này bao gồm kiểm sốt chất lượng, thẩm định và cơng nhận.
Quản lý thơng tin: Các thơng tin phịng thí nghiệm cần được quản lý
cẩn thận đảm bảo sự chính xác và bí mật.
Tài liệu và hồ sơ: Tài liệu và hồ sơ ln được lưu giữ cẩn thận để
đảm bảo sự chính xác và có thể đánh giá được.
Quản lý sự cố: Phịng thí nghiệm ln cần một hệ thống để phát hiện
những vấn đề và sự cố, hành động khắc phục, tìm hiểu nguyên nhân và đưa ra
những hành động để không tái diễn các sự cố.


17

Đánh giá: Q trình đánh giá chính là cơng cụ để kiểm sốt việc
thực hiện của phịng thí nghiệm và so sánh với các chuẩn mực để đánh giá.
Cải tiến q trình: Mục đích đầu tiên của HTQLCL là sự cải tiến liên
tục các q trình trong phịng thí nghiệm và sự cải tiến được thực hiện một
cách hệ thống.
Dịch vụ khách hàng: Đảm bảo khách hàng nhận được các dịch vụ cần

thiết cho họ.
Cơ sở vật chất và an toàn: Cơ sở vật chất và an toàn bao gồm
nhiều vấn đề như: An ninh, an tồn, sức khỏe, mơi trường làm việc.
Hoạt động của phòng xét nghiệm [18]
Hoạt động của phòng xét nghiệm được chia thành ba giai đoạn: Giai
đoạn trước xét nghiệm, giai đoạn trong xét nghiệm và giai đoạn sau xét
nghiệm.
1.2.1. Giai đoạn trước xét nghiệm
Là giai đoạn chuẩn bị làm xét nghiệm, chuẩn bị cho việc lấy bệnh phẩm
, chuẩn bị bênh nhân, chuẩn bị thuốc thử và các trang thiết bị - dụng cụ cần
thiết cho việc làm xét nghiệm.
1.2.2. Giai đoạn xét nghiệm
Bao gồm tất cả các bước tiến hành xét nghiệm, tiến hành làm bằng tay
bằng máy và tính kết quả xét nghiệm
1.2.3. Giai đoạn sau xét nghiệm
Sử dụng kết quả xét nghiệm vào các mục đích đặt ra.
Ở các giai đoạn trên đều có những ngun nhân dẫn đến sai số. Vì vậy
cần phối hợp mọi khâu, mọi giai đoạn để khắc phục và loại trừ sai số để cho
ra kết quả xét nghiệm có độ tin cậy.