Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình và bước đầu áp dụng quy trình để xác định kiểu gen cyp2c19 trên bệnh nhân đặt stent động mạch vành qua da

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI
----------

LÊ THỊ NHIÊN

NGHIÊN CỨU TỐI ƢU HÓA QUY TRÌNH VÀ
BƢỚC ĐẦU ÁP DỤNG QUY TRÌNH ĐỂ XÁC
ĐỊNH KIỂU GEN CYP2C19 TRÊN BỆNH
NHÂN ĐẶT STENT ĐỘNG MẠCH VÀNH
QUA DA

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

HÀ NỘI – 2016


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI
----------

LÊ THỊ NHIÊN

NGHIÊN CỨU TỐI ƢU HÓA QUY TRÌNH VÀ
BƢỚC ĐẦU ÁP DỤNG QUY TRÌNH ĐỂ XÁC

ĐỊNH KIỂU GEN CYP2C19 TRÊN BỆNH NHÂN
ĐẶT STENT ĐỘNG MẠCH VÀNH QUA DA

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH DƯỢC LÝ – DƯỢC LÂM SÀNG
MÃ SỐ 60720405
Người hướng dẫn khoa học: 1. TS. Dƣơng Thị Ly Hƣơng
2. TS. Vũ Thị Thơm
HÀ NỘI 2016


LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận được rất
nhiều sự quan tâm, động viên và giúp đỡ tận tình từ các thầy cô, gia đình và bạn bè.
Nhân dịp này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: TS. Dương Thị Ly Hương Trưởng phòng khoa học công nghệ hợp tác quốc tế, Phó Chủ nhiệm bộ môn Dược
lý và Dược lâm sàng, Khoa Y Dược- Đại học quốc gia Hà Nội; TS. Vũ Thị Thơm Phó chủ nhiệm bộ môn Y - Dược học cơ sở, Khoa Y – Dược, Đại học quốc gia Hà
Nội là những thầy cô đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình và tạo mọi điều kiện
thuận lợi để tôi có thể hoàn thành luận văn.
Đồng thời tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến đề tài nghiên cứu khoa học
cấp Đại học Quốc gia: “Nghiên cứu ảnh hưởng đa hình gen CYP2C19 tới điều trị
chống ngưng tập tiểu cầu ở người bệnh sau đặt stent động mạch vành qua da” đã
cung cấp nguồn kinh phí giúp tôi thực hiện luận văn. Tôi xin gửi lời cám ơn đến:
Ths. Phạm Thị Hồng Nhung cùng các cán bộ công tác tại Khoa Y dược- Đại học
quốc gia Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện đề tài.
Tôi xin gửi lời cảm ơn Ban Giám hiệu cùng toàn thể các cán bộ Trường đại
học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện để tôi có thể lĩnh hội những kiến thức quý giá về
ngành Dược trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu tại trường.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè đã luôn sát
cánh, động viên tôi hoàn thành luận văn này.
Tôi xin chân thành cám ơn!

Hà Nội, ngày 25 tháng 03 năm 2016
Học viên
Lê Thị Nhiên


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................................. 1
Phần 1: TỔNG QUAN .................................................................................................... 3
1.1. Dƣợc lý di truyền và các khái niệm liên quan ...................................................... 3
1.2. Tổng quan về CYP2C19 ......................................................................................... 5
1.2.1. Đại cương về CYP2C19 ......................................................................................... 5
1.2.2. Một số các alen liên quan đến chuyển hóa thuốc của gen CYP2C19 có ý
nghĩa lâm sàng ................................................................................................................. 7
1.2.2.1.Alen mã hóa cho enzym CYP2C19 có chức năng bình thường: ........................... 7
1.2.2.2. Các alen mã hóa cho enzym giảm hoặc mất hoạt tính ........................................ 7
1.2.2.3. Alen mã hóa cho enzym có hoạt tính tăng ........................................................... 8
1.2.3. Các nghiên cứu về gen mã hóa enzym CYP2C19 trên người Việt Nam .............. 8
1.2.4. Mối liên quan giữa đa hình CYP2C19 với đáp ứng điều trị của thuốc chống
ngưng tập tiểu cầu ở bệnh nhân can thiệp động mạch vành qua da ............................ 9
1.2.5. Các nghiên cứu về ảnh hưởng của tính đa hình gen CYP2C19 lên tác dụng
chống ngưng tập tiểu cầu của clopidogrel .................................................................... 11
1.3. Các phƣơng pháp phân tích gen .......................................................................... 13
Phần 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................. 19
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu ............................................................................................ 19
2.1.1.Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân ............................................................................. 19
2.1.2. Địa điểm nghiên cứu ............................................................................................. 19
2.2. Nguyên liệu và phƣơng tiện nghiên cứu: ............................................................ 19
2.2.1 Hóa chất ................................................................................................................. 19
2.2.2. Thiết bị .................................................................................................................. 20
2.2.3. Dụng cụ ................................................................................................................. 20

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ...................................................................................... 20
2.3.1. Chọn mẫu nghiên cứu ........................................................................................... 20
2.3.2. Phương pháp tiến hành ......................................................................................... 21


2.3.2.1. Quy trình xét nghiệm gen .................................................................................. 21
2.3.2.2. Xét nghiệm gen CYP2C19 của các mẫu máu thu được ..................................... 29
2.3.3. Xử lý và phân tích số liệu ...................................................................................... 29
2.3.4. Đạo đức nghiên cứu .............................................................................................. 29
PHẦN 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................................................... 30
3.1. Kết quả tối ƣu hóa quy trình xét nghiệm gen CYP2C19 ................................... 30
3.2. Kết quả xét nghiệm gen CYP2C19 ...................................................................... 46
Phần 4: BÀN LUẬN ...................................................................................................... 49
4.1. Về tối ƣu hóa quy trình xác định gen CYP2C19 ................................................ 49
4.2. Về đa hình gen CYP2C19 ..................................................................................... 53
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................................... 56


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
STT

Chữviếttắt

1

ACS

2

ASCPT

Chữviếtđầyđủ
Acute Coronary syndrome (Hội chứng mạch vành cấp)
American Society for Clinical Pharmacology and
Therapeutics (Hội dược lý lâm sàng và điều trị Hoa Kỳ)

3

Bp

4

ddNTP

Dideoxynucleotide triphosphate

5

DHPLC

Denaturing high performance liquid chromatography (Sắc kí

Base pair (Cặp bazơ nitơ)

lỏng cao áp biến tính)
6

DNA

Deoxyribonucleic acid (Axit deoxyribonucleic)

7

dNTP

Deoxynucleotide triphosphate

8

EDTA

Ethylene Diamine Tetraacetic Acid(Axit ethylene diamine
tetraacetic)

9

EM

Extensive metabolizer (Chuyển hóa bình thường)

10

IM

Intermediate metabolizer (Chuyển hóa trung gian)

11

PCI

Percutaneous Coronary Intervention (đặt stent động mạch
vành qua da)

12

PCR

Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase)

13

PM

Poor Metabolizer (Chuyển hóa kém)

14

RLFP

Restriction fragment length polymorphism (Đa hình độ dài
đoạn cắt giới hạn)

15

SNP

Single Nucleotide Polymorphism (Đa hình đơn nucleotide)

16

TAE

Tris base, acetic acid and EDTA.

17

TC

Tiểu cầu

18

UM

Ultrarapid metabolizer (chuyển hóa nhanh)


DANH MỤC BẢNG
STT

Ký hiệu

Tên bảng

1

Bảng 1.1

2

Bảng 1.2

3

Bảng 2.1

Thành phần phản ứng PCR – giải trình tự

28

4

Bảng 3.1

Kết quả đo quang của các mẫu DNA tổng số

30

5

Bảng 3.2

Thành phần phản ứng PCR cho các cặp mồi

31

6

Bảng 3.3

Nhiệt độ gắn mồi cho các cặp mồi

31

7

Bảng 3.4

Pha loãng nồng độ mồi cho phản ứng PCR

35

8

Bảng 3.5

Thành phần của phản ứng PCR

35

9

Bảng 3.6

Pha loãng nồng độ DNA khuôn

37

10

Bảng 3.7

Thành phần phản ứng PCR

37

11

Bảng 3.8

Thành phần phản ứng PCR

38

12

Bảng 3.9

Thành phần phản ứng PCR

38

13

Bảng 3.10

Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng PCR

42

14

Bảng 3.11

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

42

15

Bảng 3.12

Chuẩn bị gel agarose

43

16

Bảng 3.13

Thành phần phản ứng PCR – giải trình tự

44

17

Bảng 3.14

Kết quả xét nghiệm gen CYP2C19 của 08 bệnh nhân

47

25 allen hiện đã được xác định của gen CYP2C19
Cập nhật hướng dẫn PCI 2007 về dùng 2 thuốc chống
ngưng tập tiểu cầu

Trang
7
11


DANH MỤC HÌNH
STT

Ký hiệu

1

Hình 1.1

2

Hình 1.2

3

Hình 1.3

4

Hình 1.4

4
5

Tên hình
Mô tả single nucleotide polymorphyms (SNP)
Vị trí các alen trên gen CYP2C19, hộp đen biểu thị các exon của
gen
Chuyển hóa clopidogrel trong cơ thể
Khuyến cáo của ASCPT về sử dụng thuốc chống ngưng
tập tiểu cầu dựa trên kiểu gen CYP2C19

4
7
12
14

Hình 2.1

Sơ đồ thiết kế nghiên cứu

31

Hình 3.1

Điện di DNA tổng số trên gel Agarose 0.7%

34

Kết quả điện di sản phẩm PCR tối ưu nhiệt độ gắn mồi của
6

Trang

Hình 3.2

cặp mồi CYP2C19 *2 F/R. M là marker; ĐC (-)/(+): đối

36

chứng âm, đối chứng dương
Kết quả điện di sản phẩm PCR tối ưu nhiệt độ gắn mồi của
7

Hình 3.3

cặp mồi CYP2C19 *2 F1/R1. M là marker; ĐC (-)/(+): đối

36

chứng âm, đối chứng dương.
Kết quả điện di sản phẩm PCR tối ưu nhiệt độ gắn mồi của
8

Hình 3.4

cặp mồi CYP2C19 *3 F/R. M là marker; ĐC (-)/(+): đối

37

chứng âm, đối chứng dương.
Kết quả điện di sản phẩm PCR tối ưu nhiệt độ gắn mồi của
9

Hình 3.5

cặp mồi CYP2C19 *17 F1/R2. M là marker; ĐC (-)/(+):

38

đối chứng âm, đối chứng dương
Kết quả điện di sản phẩm PCR tối ưu nhiệt độ gắn mồi của
10

Hình 3.6

cặp mồi CYP2C19 *17F1/R1; M là Maker, 59 -62-64 lần

38

lượt là các nhiệt độ thử
Kết quả điện di sản phẩm PCR tối ưu nồng độ mồi
11

Hình 3.7

CYP2C19*2F/R, Tm=59oC; 17-29-49.A, .B, .C: mẫu 17,
29, 49 với 3 nồng độ A, B, C

39


Kết quả điện di sản phẩm PCR tối ưu nồng độ mồi
12

Hình 3.8

CYP2C19*3, Tm=68oC; 17-29-49.A, .B, .C: mẫu 17, 29,

40

49 với 3 nồng độ A, B, C
13

Hình 3.9

Kết quả điện di sản phẩm PCR tối ưu nồng độ mồi
CYP2C19*17, Tm=59oC, ĐC-: đối chứng âm

40

Kết quả điện di sản phẩm PCR tối ưu lượng DNA khuôn;
14

Hình 3.10

2-17.1, .2, .3, .4, .5:mồi * 2 và *17 với 5 nồng độ DNA

41

khuôn tương ứng
15

Hình 3.11

Kết quả điện di sản phẩm PCR test lại quy trình đã tối ưu
cho allen *2 và *17; mẫu 05 và 06; ĐC(-): đối chứng âm

42

Kết quả điện di sản phẩm PCR test lại quy trình đã tối ưu
16

Hình 3.12

cho allen *3; mẫu 02 và 05; M: marker; ĐC(-): đối chứng

43

âm
17

Hình 3.13

Sơ đồ các công đoạn của quy trình

44

ĐẶT VẤN ĐỀ
Cytochrome P450 2C19 (CYP2C19) là một enzym thuộc siêu họ cytochrom
P450, tham gia vào quá trình chuyển hóa của các chất ngoại lai, bao gồm các thuốc
kháng tiểu cầu như clopidogrel, thuốc chống động kinh như mephenytoin,
omeprazol, diazepam và một số loại thuốc an thần...[38, 39]. Khả năng chuyển hóa
của CYP2C19 có thể được phân loại như sau: chuyển hóa siêu nhanh (Ultrarapid
metabolizer - UM), chuyển hóa bình thường (Extensive metabolizer - EM), chuyển
hóa trung gian (Intermediate metabolizer - IM), hoặc chuyển hóa kém (Poor
Metabolizer - PM) [37]. Điều này có thể dẫn đến có sự khác nhau trong phản ứng
chuyển hóa thuốc và đáp ứng giữa các cá thể.
Đặt stent động mạch vành qua da là một kỹ thuật can thiệp tim mạch tích cực.
Lần đầu tiên được triển khai và áp dụng vào năm 1984 tại Brazil và một số nước khác,
đến nay kỹ thuật này đã được mở rộng ở nhiều nước và giúp nhiều bệnh nhân có bệnh
mạch vành, nhồi máu cơ tim cải thiện đáng kể biến chứng và tử vong do tim mạch. Tại
Việt Nam, phương pháp này bắt đầu được áp dụng thành công tại Viện Tim mạch
Việt Nam vào năm 1996. Tuy nhiên, sau khi đặt stent vẫn có một tỷ lệ đáng kể bệnh
nhân bị tái hẹp do các mảng xơ vữa phát triển vào lòng stent. Do đó, việc điều trị duy
trì bằng thuốc chống kết tập tiểu cầu là liệu pháp bắt buộc đối với các bệnh nhân đặt
stent động mạch vành [17]. Asprin và clopidogrel là 2 thuốc chống kết tập tiểu cầu
được chỉ định để dự phòng huyết khối cũng như các biến cố tim mạch khác cho người
bệnh sau can thiệp stent mạch vành[16].
Clopidgrel là một tiền thuốc chưa có tác dụng, sau quá trình chuyển hóa bởi
CYP2C19 ở gan, clopidogrel sẽ được chuyển hóa thành chất có tác dụng chống kết tập
tiểu cầu, ngăn ngừa cục máu đông và giảm hình thành huyết khối. Ở những người có
kiểu gen CYP2C19 chuyển hóa bình thường hoặc siêu nhanh, sử dụng liều clopidogrel
75mg/ngày, dùng hàng ngày với thời gian tối ưu 1 năm có thể làm giảm đáng kể các
biến cố tim mạch [16, 27]. Tuy nhiên, ở những người có kiểu gen CYP2C19 chuyển

1

hóa chậm hoặc trung gian thì cần phải tăng liều clopidogrel hoặc chuyển thuốc khác
mới có tác dụng [16, 27].
Có thể nói việc xác định được kiểu gen CYP2C19 có vai trò rất quan trọng
trong tiên lượng đáp ứng thuốc, đặc biệt những thuốc chịu sự chuyển hóa qua
enzym này như clopidogrel. Một số hướng dẫn điều trị về can thiệp tim mạch thậm
chí đã đề cập đến việc cần làm xét nghiệm gen CYP2C19 trước khi chỉ định dùng
clopidogrel [30]. Để làm được điều đó, mỗi phòng thí nghiệm cần phải tối ưu hóa
được quy trình, ổn định các điều kiện thí nghiệm trước khi áp dụng quy trình một
cách thường quy.
Với mong muốn đưa ra được quy trình xác định kiểu gen CYP2C19, góp phần
nâng cao hiệu quả điều trị chống ngưng tập tiểu cầu ở người bệnh sau đặt stent động
mạch vành qua da, giảm biến chứng và nâng cao chất lượng cuộc sống người bệnh,
chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình và bước đầu áp dụng
quy trình để xác định kiểu gen CYP2C19 trên bệnh nhân đặt stent động mạch
vành qua da”. Đề tài được tiến hành với 2 mục tiêu sau:
1. Tối ưu hóa quy trình xác định kiểu gen CYP2C19.
2. Áp dụng quy trình để xác định kiểu gen CYP2C19 trên một số bệnh nhân
đặt stent động mạch vành qua da.

2


Phần 1
TỔNG QUAN
1.1.

Dƣợc lý di truyền và các khái niệm liên quan
Dược lý di truyền là một ngành học nghiên cứu sự ảnh hưởng của các yếu tố

di truyền đến tính đáp ứng thuốc giữa các cá thể. Mục tiêu của dược lý di truyền là
hướng tới tối ưu hóa hiệu quả điều trị và hạn chế tác dụng không mong muốn của
thuốc dựa trên đặc điểm di truyền của từng cá thể [20]. Kể từ năm 1953, khi lần đầu
tiên Watson và Crick phát hiện ra chuỗi xoắn kép DNA thì đến năm 1959, Fredrich
Vogel đã giới thiệu khái niệm dược lý di truyền “pharmacogenetics”. Tuy nhiên,
phải sau năm 2003, khi dự án giải mã gen người kết thúc thì các nghiên cứu về
dược lý di truyền mới thực sự bùng nổ [20].
Một số khái niệm liên quan đến dược lý di truyền:
- Đa hình đơn nucleotid (Single nucleotid polymorphisms – viết tắt là SNP –
đọc là “snip”): Mỗi gen là một đoạn ngắn trong chuỗi xoắn kép DNA, tạo nên một
bộ gen của con người. Đoạn ngắn đó lại là một chuỗi rất nhiều các nucleotid, hầu
hết các biến động về một gen giữa các cá thể chỉ do sự khác nhau của 1 nucleotid
trong gen đang xét. Đó chính là tính đa hình đơn nucleotid [11]. Ví dụ: một SNP có
thể thay đổi trình tự DNA: từ AGCCT thànhAGTCT .

Hình 1.1: Mô tả Single nucleotid polymorphisms (SNP)
Các nhà di truyền học phân tử hy vọng rằng việc hoàn thiện bản đồ các SNP có
liên quan đến bệnh tật, tiến đến việc giải mã chức năng của các gen ở mỗi cá thể giúp
3


tiên lượng các nguy cơ mắc bệnh, từ đó có lời khuyên thích hợp trong vấn đề phòng
bệnh đối với từng cá thể [44].
SNP là những biến thể di truyền phổ biến nhất trong DNA của con người,
xảy ra khoảng một lần trong mỗi 100 đến 300 cặp base nucleotid. Hiện nay đã có
hơn bốn triệu SNP đã được xác định trong hệ gen của con người. Các SNP xảy ra
khi một cặp nucleotid bị thay thế. Vì vậy, các SNP là sự khác biệt duy nhất, cơ sở
tồn tại giữa các cá nhân [11].
Các SNP có thể xảy ra ở exon, intron, hoặc khu vực điều hòa của một gen.
Những đột biến xảy ra ở các vùng exon có thể làm thay đổi chức năng của protein,

trong khi những đột biến ở các vùng điều hòa gen có thể làm thay đổi số lượng protein
được sản xuất. Các biến thể ở các vùng intron thường thầm lặng trừ khi chúng ảnh
hưởng đến intron nối. Nhiều SNP có thể liên kết không ổn định với nhau, có nghĩa là
hai hoặc nhiều SNP được liên kết với nhau thường xuyên hơn. Ví dụ, nếu hai SNP:
A46T và G72C có thể có trong một gen nhất định và nếu T ở vị trí 46 luôn luôn xảy ra
với một C ở vị trí 72, hai SNP được cho là hoàn thành liên kết không ổn định. Một tập
hợp các SNP liên kết lại với nhau được gọi là một haplotype [20].
Exon, intron và các vùng điều hòa gen
Ở các sinh vật bậc cao (sinh vật nhân chuẩn), thông tin di truyền mã hoá trên
các nhiễm sắc thể thường bị phân cắt thành nhiều đoạn trình tự DNA cách biệt được
gọi là các exon. Các exon bị ngăn cách bởi những trình tự không mang thông tin có ích
được gọi là các intron. Số lượng các intron trong một gen biến động lớn, có thể từ 0
đến trên 50 phân đoạn. Độ dài của các intron và exon cũng rất biến động, nhưng các
intron thường dài hơn và chiếm phần lớn trình tự của gen.
Vùng điều hòa (vùng khởi đầu): nằm ở đầu gen, mang tín hiệu khởi động và
kiểm soát quá trình phiên mã.
Trong một quần thể giao phối ngẫu nhiên kích thước lớn, nếu như không có
áp lực của các quá trình đột biến, di nhập cư, biến động di truyền và chọn lọc thì tần

4


số các alen được duy trì ổn định từ thế hệ này sang thế hệ khác. Sự duy trì ổn định
của các kiểu gen, alen này được gọi là tuân theo định luật Hardy Weinberg [2].
Trong nghiên cứu dịch tễ học di truyền, tần số phân bố của các alen trong
từng quần thể nghiên cứu cũng được tính toán theo định luật Hardy Weiberg để xác
định quần thể này đã đạt được sự ổn định về di truyền hay chưa.
1.2. Tổng quan về CYP2C19
1.2.1. Đại cương về CYP2C19
CYP2C19 là một enzym thuộc siêu họ cytochrome P450. Enzym này tham gia

vào quá trình chuyển hóa của các chất ngoại lai, bao gồm các thuốc kháng tiểu
cầu nhưclopidogrel (Plavix), thuốc chống động kinh như mephenytoin, omeprazole,
diazepam và một số loại thuốc an thần... Gen mã hóa cho CYP2C19 nằm trên trên
nhiễm sắc thể số 10 (10q24) [38, 39].
Gen CYP2C19 gồm có 9 exon và có tính đa hình cao với 25 alen hiện đã được
xác định.

Hình 1.2: Vị trí các alen trên gen CYP2C19, hộp đen biểu thị các exon của gen
Bảng 1.1: 25 alen đã đƣợc xác định của gen CYP2C19 [37]:
Alen

Biến đổi nucleotid chính

Số db SNP

Vị trí

*1 (wild type)

-

-

-

*2

c.681G>A

Rs4244285

Exon 5

5


*3

c.636G>A

Rs4986893

Exon 4

*4

c.1A>G

Rs28399504

Exon 1

*5

c.1297C>T

Rs56337013

Exon 9

*6

c.395G>A

Rs72552267

Exon 3

*7

c.819 +2T >A

Rs72558286

Exon 5

*8

c.358T>C

Rs41291556

Exon 3

*9

c.431G>A

Rs17884712

Exon 3

*10

c.680C>T

Rs6413438

Exon 5

*11

c.449G>A

Rs58973490

Exon 3

*12

c.1473A>C

Rs55640102

Exon 9

*13

c.1228C>T

Rs17879685

Exon 8

*14

c.50T>C

Rs55752064

Exon 1

*15

c.55A>C

Rs17882687

Exon 1

*16

c.1324C>T

-

Exon 9

*17

c. – 806C>T

Rs12248560

Promoter

*18

c.986G>A

Rs138142612

Exon 7

*19

c.151A>G

-

Exon 1

*22

c.557G>C

Rs140278421

Exon 4

*23

c.271G>C

Rs118203756

Exon 2

*24

c.1004G>A

Rs118203757

Exon 7

*25

c.1344C>G

Rs118203759

Exon 9

*26

c.766G>A

-

Exon 5

*27

c. – 1041G>A

Rs7902257

Promoter

6


1.2.2. Một số các alen liên quan đến chuyển hóa thuốc của gen CYP2C19 có ý
nghĩa lâm sàng
1.2.2.1.Alen mã hóa cho enzym CYP2C19 có chức năng bình thường:
CYP2C19*1: là kiểu gen wild – type, quy định biểu hiện enzym CYP2C19 có
chức năng hoạt động bình thường.
1.2.2.2. Các alen mã hóa cho enzym giảm hoặc mất hoạt tính
 CYP2C19*2: là dạng alen mã hóa cho enzym CYP2C19 mất hoạt tính
phổ biến nhất với tần số xuất hiện khoảng 12% ở người da trắng, 15% ở người
Mỹ gốc Phi và 29-35% ở người châu Á [29, 31]. Trong thử nghiệm lâm sàng
TRITON-TIMI 38, các tác giả nhận thấy trong những bệnh nhân có hội chứng mạch
vành cấp được điều trị bằng clopidogrel, những người mang alen CYP2C19*2 có tỷ
lệ tử vong do nguyên nhân tim mạch, nhồi máu cơ tim hoặc đột quị cao hơn so với
những người không mang gen này (12,1% so với 8,0%, p = 0,01). Tần suất xuất hiện
huyết khối tắc stent của người mang alen CYP2C19*2 cũng cao hơn có ý nghĩa thống
kê so với những người không mang alen này (2,6% so với 0,8%, p = 0,02) [27].
rs4244285 (c.681G>A) là đa hình xác định của alen CYP2C19*2, đây là
dạng đột biến đồng hoán thay G bằng A ở exon 5 làm xuất hiện một vị trí cắt nối

intron-exon bất thường. Đột biến này làm khung đọc mRNA bị cắt ngắn hơn
bình thường và tạo ra dạng enzym không có hoạt tính CYP2C19*2.
 CYP2C19*3: cũng là dạng alen mã hóa cho enzym CYP2C19 mất hoạt tính.
Năm 2009, Simon và các cộng sự tiến hành nghiên cứu cho 2208 bệnh nhân nhồi
máu cơ tim cấp được điều trị bằng clopidogrel. Kết quả nghiên cứu cho thấy những
người có bất kỳ 2 alen nào trong số các alen mã hóa enzym CYP2C19 giảm hoạt
tính (*2, *3, *4, *5) có tần suất các biến cố tim mạch nặng sau 1 năm cao hơn rất có
ý nghĩa so với những người không có alen nào trong số này (21,5% so với 13,3%).
Khảo sát riêng ở 1535 bệnh nhân đã được can thiệp mạch vành qua da trong thời
gian nằm viện cho thấy những người có bất kỳ 2 alen nào trong số các alen mã hóa
enzym CYP2C19 giảm hoạt tính có nguy cơ bị các biến cố tim mạch nặng tăng gấp
7


3 lần so với những người không có alen nào trong số này (p = 0,005) [40].
rs4986893 (c.636G>A) là đa hình xác định của alen CYP2C19*3, đây là dạng
đột biến thay G bằng A ở exon 4 làm xuất hiện mã kết thúc sớm ở acid amin 212.
Tần số của alen CYP2C19*3 trong phần lớn các quần thể là dưới 1%; tuy nhiên tỷ
lệ này cao hơn ở người châu Á với 2–9% [31, 38, 39].
 Các alen khác
- Các alen khác mã hóa cho enzym có hoạt tính giảm hoặc mất hoạt tính là
CYP2C19*4 (rs28399504), *5 (rs56337013), *6 (rs72552267), *7 (rs72558186) và
*8 (rs41291556). Các alen này có tần số dưới 1% trong các quần thể người [31, 38].
- Một số alen khác cũng được xác định trong các quần thể khác nhau với rất ít
dữ liệu được mô tả [39].
1.2.2.3. Alen mã hóa cho enzym có hoạt tính tăng
 CYP2C19*17: rs12248560 (c.-806C>T) là đa hình xác định của alen
CYP2C19* 17 với sự thay thế C bằng T ở promoter tạo ra vị trí liên kết với nhân tố
phiên mã GATA qua đó làm tăng biểu hiện và hoạt động của enzym CYP2C19. Tần số
alen CYP2C19 * 17 là khoảng 21% ở người da trắng, 16% ở người Mỹ gốc Phi và 3%

ở người châu Á [31, 38].
1.2.3. Các nghiên cứu về gen mã hóa enzym CYP2C19 trên người Việt Nam
Nghiên cứu của Lee Sang Seop và cộng sự (năm 2007) trên 165 người Việt
Nam và 377 người Hàn Quốc khỏe mạnh cho thấy tần số phân bố của các alen
CYP2C19*1, *2 và *3 ở người Việt Nam lần lượt là 69%, 24% và 5%. Tần số kiểu
gen chuyển hóa kém (*2/*2; *2/*3; *3/*3 ở người Việt Nam lần lượt là 4,2%; 2,4%
và 0,6%). Không có sự khác biệt về tần số alen và tần số kiểu gen chuyển hóa kém
giữa người Hàn Quốc và người Việt Nam (p = 0,074) [21].
Ngoài ra, dự án giải mã 1000 gen người (1000 Genomes Project) giai đoạn 3
phân tích tất cả các gen trên nhiều chủng tộc, trong đó có chủng tộc người Kinh
sống ở thành phố Hồ Chí Minh (198 người) cho thấy tần số phân bố của các alen
CYP2C19 *2, *3 và *17 ở người Việt Nam lần lượt là 28%, 4% và 2% [43].
8


1.2.4. Mối liên quan giữa đa hình CYP2C19 với đáp ứng điều trị của thuốc
chống ngưng tập tiểu cầu ở bệnh nhân can thiệp động mạch vành qua da
Từ năm 1977, đặt stent động mạch vành qua da (Percutaneous Coronary
Intervention) được coi là một chiến lược điều trị tái thông mạch máu hiệu quả ở
bệnh mạch vành (bao gồm: cơn đau thắt ngực ổn định, cơn đau thắt ngực không ổn
định và nhồi máu cơ tim). So với điều trị nội khoa, can thiệp động mạch vành đã
làm giảm tỷ lệ biến chứng ở bệnh nhân nhồi máu cơ tim cấp cũng như làm giảm
mức độ đau ngực và cải thiện chất lượng cuộc sống ở bệnh nhân đau thắt ngực ổn
định [3, 30].
Tuy nhiên, người bệnh đặt stent động mạch vành có tỷ lệ huyết khối cao.
Huyết khối trong stent ở người bệnh sau can thiệp đặt stent mạch vành là biến
chứng nặng, có tỷ lệ tử vong cao. Chính vì thế, việc dùng thuốc ức chế ngưng tập
tiểu cầu là chỉ định bắt buộc đối với mọi người bệnh sau can thiệp đặt stent động
mạch vành [17]. Cho đến nay, clopidogrel vẫn là thuốc đầu tay cùng với aspirin
được chỉ định để dự phòng huyết khối cũng như các biến cố tim mạch khác

chongười bệnh sau can thiệp stent động mạch vành [36]. Bảng 1.2 tóm tắt đề nghị
dùng hai thuốc chống tiểu cầu hiện nay:
Bảng 1.2. Cập nhật hƣớng dẫn PCI 2007 về dùng 2 thuốc chống ngƣng
tập tiểu cầu [4, 47]
Loại I
1. Bệnh nhân đang uống dài hạn aspirin phải uống aspirin 75-325 mg trước can thiệp.
2. Bệnh nhân chưa uống aspirin phải uống 325mg ít nhất 2 giờ trước can thiệp (lý
tưởng trước 24 giờ)
3. Sau PCI, ở bệnh nhân không dị ứng hay nguy cơ chảy máu cao, phải uống 162325mg/ngày aspirin liên tục trong 1 tháng đối với stent thường, 3 tháng đối với stent
phủ sirolimus, 6 tháng với stent phủ parlitaxel. Sau đó uống dài hạn aspirin với liều
75-162mg/ngày.
9


4. Liều nạp clopidogrel, nhìn chung là 600mg trước hay khi thưc hiện can thiệp. Ở
bệnh nhân dùng tiêu sợi huyết trong vòng 12-24 giờ, liều nạp nên chỉ là 300mg.
5. Sau can thiệp, dùng clopidogrel ít nhất 1 năm cho trường hợp dùng stent phủ thuốc
nếu không có nguy cơ chảy máu. Dùng ít nhất 1 tháng cho trường hợp stent thường
và lý tưởng là tới 12 tháng (trừ khi bệnh nhân có nguy cơ chảy máu cao, khi đó có thể
cho tối thiểu 2 tuần).
Loại IIa
1. Ở bệnh nhân nguy cơ chảy máu cao, dùng liều aspirin thấp hơn (75-162mg/ngày)
trong giai đoạn đầu sau can thiệp.
Loại IIb
1. Quan tâm sử dụng clopidogrel dài hạn cho trường hợp dùng stent phủ thuốc.
Mặc dù là thuốc đầu tay cùng với aspirin trong dự phòng huyết khối cho bệnh
nhân sau can thiệp động mạch vành qua da, song vẫn có một tỷ lệ đáng kể người
bệnh còn nguy cơ tử vong, nhồi máu cơ tim, đột quỵ, huyết khối trong stent liên
quan đến khả năng ức chế kết tập tiểu cầu của clopidogrel [8].
Clopidogrel là một tiền chất không có hoạt tính, đòi hỏi phải được hoạt hóa ở

gan bởi cytochrome P450 trong đó chủ yếu là CYP2C19, trở thành chất có hoạt
tính, chất có hoạt tính này ức chế không hồi phục thụ thể P2Y12 của ADP tiểu cầu
làm ức chế quá trình kết tập của tiểu cầu [1, 8, 32].
Trong thời gian gần đây, ngày càng có nhiều chứng cứ cho thấy chính đặc
điểm chuyển hóa của clopidogrel có liên quan với di truyền đóng vai trò then chốt
trong cơ chế đề kháng với thuốc. Bản thân clopidogrel không có hoạt tính kháng
tiểu cầu. Sau khi được hấp thu ở ruột, khoảng 85% lượng thuốc hấp thu được
chuyển hóa bởi các enzym esterase thành những chất không có hoạt tính và 15%
được chuyển hóa bởi hệ enzym cytochrome P-450 thành chất có hoạt tính ức chế
thụ thể P2Y12 ở tiểu cầu. Enzym chủ yếu trong hệ cytochrome P450 biến
clopidogrel thành chất có hoạt tính kháng tiểu cầu là enzym CYP2C19. Có nhiều
alen khác nhau mã hóa sự tổng hợp enzym CYP2C19. Các alen này được chia thành
10


3 nhóm: nhóm có tác dụng làm tăng hoạt tính, giảm hoạt tính và nhóm có tác dụng
hoạt tính enzym bình thường [8].

Hình 1.3: chuyển hóa clopidogrel trong cơ thể
Những bệnh nhân có kiểu gen CYP2C19 thuộc nhóm giảm hoạt tính (chứa
alen *2, *3) thì clopidogrel với liều 75mg/ngày không có tác dụng chống ngưng tập
tiểu cầu. Những người có kiểu gen dị hợp tử CYP2C19*2 thì liều clopidogrel phải
là 225 mg/ngày mới có hiệu quả tương đương, còn với kiểu gen đồng hợp tử
CYP2C19*2 thì liều lên tới 300mg/ngày cũng không có tác dụng và phải chuyển
sang thuốc khác [16, 27].
1.2.5. Các nghiên cứu về ảnh hưởng của tính đa hình gen CYP2C19 lên tác dụng
chống ngưng tập tiểu cầu của clopidogrel
Collet, Montalescot và các cộng sự (năm 2009) theo dõi 259 bệnh nhân trẻ (<
45 tuổi) đã từng bị nhồi máu cơ tim và được điều trị bằng clopidogrel ít nhất 1 tháng.
Có 73 bệnh nhân mang alen CYP2C19*2 và 186 bệnh nhân không mang alen này.

Kết quả theo dõi cho thấy các bệnh nhân mang alen CYP2C19*2 có tỷ lệ tử vong,
11


nhồi máu cơ tim hoặc tái tưới máu mạch vành khẩn và tần suất huyết khối tắc stent
cao hơn so với nhóm bệnh nhân không mang alen nàymột cách có ý nghĩa [9].
Trong nghiên cứu TRITON-TIMI 38 (năm 2009), Mega, Sabatine và các cộng
sự nhận thấy những người mang alen CYP2C19*2 (chiếm 30% dân số nghiên cứu)
có nồng độ của chất chuyển hóa có hoạt tính của clopidogrel trong huyết tương thấp
hơn 32,4% (p < 0,001) và mức ức chế tiểu cầu tối đa thấp hơn 9% (p < 0,001) so với
những người không mang alen này. Đồng thời các tác giả cũng nhận thấy trong số
những bệnh nhân có hội chứng mạch vành cấp tham gia TRITON-TIMI 38 được điều
trị bằng clopidogrel, những người mang alen CYP2C19*2 có tỷ lệ tử vong do nguyên
nhân tim mạch, nhồi máu cơ tim hoặc đột quị cao hơn so với những người không
mang alen này (12,1% so với 8,0%, p = 0,01). Tần suất huyết khối tắc stent của người
mang alen CYP2C19*2 cũng cao hơn có ý nghĩa (2,6% so với 0,8%, p = 0,02) [12].
Simon và các cộng sự tiến hành nghiên cứu cho 2208 bệnh nhân nhồi máu cơ
tim cấp được điều trị bằng clopidogrel. Kết quả nghiên cứu cho thấy tần suất mắc
các biến cố tim mạch nặng sau 1 năm ở nhóm người có 2 alen bất kỳ trong số các
alen mã hóa enzym CYP2C19 giảm hoạt tính (*2, *3, *4, *5) cao hơn rất có ý nghĩa
so với những người không có alen nào trong số này (21,5% so với 13,3%). Khảo sát
riêng ở 1535 bệnh nhân đã được can thiệp mạch vành qua da trong thời gian nằm
viện cho thấy nguy cơ mắc các biến cố tim mạch nặng trên các bệnh nhân này tăng
gấp 3 lần so với nhóm không mang alen mã hóa enzym CYP2C19 giảm hoạt tính (p
= 0,005) [40].
Nghiên cứu ELEVATE-TIMI 56 là một nghiên cứu đa trung tâm, ngẫu nhiên,
mù đôi tiến hành trên 333 bệnh nhân tim mạch tại 32 điểm từ tháng 10/2010 đến
tháng 9/2011. Nghiên cứu chỉ ra với các bệnh nhân mang kiểu gen dị hợp tử
CYP2C19*2, liều clopidogrel 225 mg có tác dụng dược lý tương đương với liều
chuẩn 75 mg, còn với bệnh nhân mang kiểu gen đồng hợp tử CYP2C19*2 thì với

liều 300 mg cũng không có tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu [19].
Năm 2013, Hội dược lý lâm sàng và điều trị Hoa Kỳ (American Society for
12


Clinical Pharmacology and Therapeutics - ASCPT) đã đưa ra khuyến cáo sử dụng
thuốc chống ngưng tập tiểu cầuclopidogrel cho bệnh nhân đặt stent động mạch vành
qua da dựa trên kiểu gen CYP2C19 như sau [31]:
Cân nhắc điều trị chống
ngưng tập tiểu cầu với
clopidogrel cho bệnh nhân
ACS/PCI

Kết quả kiểu gen
CYP2C19

chuyển hóa siêu
nhanh(*1/*17,*17
/*17)

chuyển hóa trung
gian (*1/*2,
*1/*3, *2/*17)

chuyển hóa
bình thường
(*1/*1)

chuyển hóa
kém (*2/*2,

*2/*3, *3/*3)

Xem xét điều trị thay thế
(prasugrel, ticagrelor)

Sử dụng liều chuẩn của
clopidogrel

Hình 1.4: khuyến cáo của ASCPT về sử dụng thuốc chống ngưng tập tiểu
cầu dựa trên kiểu gen CYP2C19[31]
1.3. Các phƣơng pháp phân tích gen
Trên thế giới hiện nay, nhiều phương pháp phân tích SNP được phát triển để
ứng dụng trong sinh học phân tử như giải trình tự gen, kĩ thuật đa hình độ dài đoạn
cắt giới hạn (Restriction fragment length polymorphism, viết tắt là RFLP), kĩ thuật
sử dụng đầu dò DNA (DNA- probe), kỹ thuật đa hình cấu tạo sợi đơn (single strand
conformational polymorphism, viết tắt là SSCP), sắc kí lỏng cao áp biến tính
(Denaturing high performance liquid chromatography, viết tắt là DHPLC), Real time PCR, Mutiplex PCR, chip DNA (SNP microarray)…[44].

13


Trình tự nucleotid của một phân đoạn DNA có thể được xác định bằng cách sử
dụng một quy trình hóa học được Alan Maxam và Walter Gilbert phát triển đầu tiên
hay một quy trình enzym được phát triển bởi Fred Sanger, quy trình của Sanger
thường được gọi là phương pháp dideoxynucleotid, và hiện nay quy trình này là cơ
sở để phát triển những phương pháp giải trình tự hiện đại [14]. Phương pháp
enzyme được phát triển bởi Sanger và các cộng sự năm 1977 đã nhanh chóng trở
thành phương pháp được lựa chọn rộng rãi vì dễ tiến hành và có độ tin cậy cao [37].
Phương pháp giải trình tự của Maxam và Gilbert: Năm 1976-1977, Allan
Maxam và Walter Gilbert đã phát triển một phương pháp giải trình tự DNA dựa trên

sự cải biến hóa học DNA và sự phân cắt giới hạn tại những nucleotid đặc hiệu [22].
Phương pháp này đòi hỏi phải gắn phóng xạ tại đầu 5’ kết thúc của sợi DNA
(thường bằng một phản ứng kinase sử dụng gamma-32P ATP) và đoạn DNA giải
trình tự phải được tinh sạch. DNA được xử lý với hóa chất tạo ra các điểm gãy ở
một vị trí nhỏ của một hoặc hai trong số bốn nucleotid của một trong bốn phản ứng
(Dimethyl sunphat phá hủy G, Glicosidic phá hủy A + G, Hydrazin phá hủy C,
Hydrazin+ NaCl phá hủy C + T). Phân tử DNA cải biến này sau đó được làm đứt
bởi piperidine nóng ở vị trí các nucleotid cải biến. Nồng độ của các chất hóa học
được điều khiển để trung bình chỉ có một cải biến trên mỗi phân tử DNA. Như vậy,
một loạt các đoạn đứt có đánh dấu được tạo ra. Các đoạn đứt trong bốn phản ứng
được điện di trong làn cạnh nhau trên gel polyacrylamide. Để quan sát kích thước
các đoạn đứt, gel được đưa lên phim chụp phóng xạ tự ghi X-ray để phát hiện vạch,
từ các vạch đó đó ta suy ra trình tự đoạn DNA ban đầu [22].
Phương pháp giải trình tự của Maxam-Gilbert ít được sử dụng vì những
nhược điểm bộc lộ ngày càng rõ như những phức tạp về mặt kỹ thuật không thể sử
dụng trong các kit sinh học phân tử tiêu chuẩn, cũng như việc phương pháp này sử
dụng nhiều hóa chất độc hại và gặp những khó khăn trong việc mở rộng quy mô và
cải tiến phương pháp [32].

14


Phương pháp enzym (phương pháp Sanger): Vì phương pháp Sanger có
hiệu quả cao hơn đồng thời sử dụng ít hóa chất độc hại cũng như ít các chất phóng
xạ hơn phương pháp của Maxam và Gilbert, nó nhanh chóng trở thành phương pháp
được chọn lựa phổ biến hơn.
Nguyên lý:
+ Dựa vào hoạt động của enzyme DNA polymerase và dideoxynucleotid
(ddNTP) trong quá trình tổng hợp DNA. Dideoxynucleotid là các nucleotid mất cả 2
nhóm OH ở vị trí Cacbon số 2 và 3 trên phân tử đường pentose.

+ Khi DNA polymerase gặp các ddNTP thì dừng lại. Cụ thể là: Enzyme
DNA polymerase xúc tác gắn các nucleotid vào mạch đơn đang tổng hợp ở vị trí
3'OH (vị trí này cần cho việc hình thành liên kết phosphodiester ở chuỗi
polynucleotid đang hình thành với các nucleotid kế tiếp), khi gặp nucleotid không
có nhóm 3'OH ở ddNTP, phản ứng tổng hợp bị dừng lại và tạo ra các đoạn DNA
chênh lệch nhau 1 nucleotid [13].
Ví dụ : . Nếu ta thêm ddCTP vào hỗn hợp phản ứng đang tổng hợp DNA thì
quá trình tổng hợp chuỗi polynucleotid sẽ dừng lại ở vị trí C. Nếu thêm ddGTP vào
hỗn hợp thì khi gặp ddGTP chuỗi polynucleotit sẽ dừng lại ở vị trí G.
+ Điện di các đoạn ADN này với việc bổ sung 1% các loại ddNTP riêng biệt
(ddATP, ddCTP, ddTTP, ddGTP) sẽ được 4 bản điện di khác nhau. Các băng ADN
xác định nhờ việc gắn đồng vị phóng xạ vào mồi, hoặc các ddNTP. Dựa vào đó để
đọc trình tự ADN.
Các vạch DNA được hiện hình bằng cách chụp phóng xạ tự ghi hoặc soi trên
tia cực tím, và trình tự DNA có thể được đọc trực tiếp trên film X-ray hoặc hình ảnh
của gel.
Những thay đổi trong kỹ thuật giải trình tự bằng chất kết thúc chuỗi chủ yếu
nằm ở việc gắn các nucleotid với đuôi phospho có chứa phóng xạ, hoặc sử dụng
mồi có gắn chất nhuộm huỳnh quang ở đuôi 5’. Việc gắn chất nhuộm vào mồi tạo
điều kiện phát triển một hệ thống quang học để có thể phân tích nhanh hơn, kinh tế
15


hơn và dễ dàng tự động hóa. Sau này, Leroy Hood và các đồng nghiệp của ông đã
sử dụng hai phương pháp gắn chất nhuộm huỳnh quang lên các ddNTPs và mồi để
mở ra kỷ nguyên tự động hóa và giải trình tự công suất lớn [41].
Phương pháp gắn chất nhuộm ở vị trí kết thúc (tức là đánh dấu thuốc nhuộm
vào các ddNTP) cho phép giải trình tự trong một phản ứng duy nhất thay vì phải
tiến hành cả bốn phản ứng như trong phương pháp đánh dấu mồi. Trong phương
pháp này, mỗi loại dideoxynucleotid kết thúc chuỗi được gắn 1 loại chất nhuộm

huỳnh quang riêng, và mỗi loại trong đó sẽ phát ra ánh sáng ở một bước sóng khác
nhau. Do tính thiết thực và tốc độ cao, phương pháp giải trình tự gắn chất nhuộm ở
vị trí kết thúc hiện nay là phương pháp được áp dụng chủ yếu trong giải trình tự tự
động. Phương pháp giải trình tự gắn chất nhuộm ở vị trí kết thúc cùng với các phân
tích trình tự DNA tự động công suất lớn hiện tại đang là phương pháp được sử dụng
trong phẩn lớn các dự án giải trình tự [35].
Giải trình tự bằng phản ứng lai: là một phương pháp không sử dụng enzym
mà sử dụng một DNA microarray. Một giếng chứa các DNA mẫu được đánh dấu
huỳnh quang và lai tạo một dãy chứa các chuỗi trình tự đã biết. Phương pháp khối
phổ được sử dụng sau đó để xác đinh khối lượng những đoạn DNA khác nhau về
khối lượng được tạo ra trong các phản ứng kết thúc chuỗi [24].
Pyrosequencing: Kỹ thuật này dựa trên nguyên lý “giải trình tự bằng tổng
hợp” bao gồm khởi động một sợi DNA được giải trình tự, và giải trình tự sợi DNA
bổ sung bằng phản ứng của enzyme. Nguyên lý “giải trình tự bằng việc tổng hợp”
cũng dựa trên việc nhận biết các pyrophosphate được giải phóng trong quá trình gắn
nucleotid, tạo ra một tín hiệu ánh sáng, hiệu quả hơn kỹ thuật kết thúc chuỗi bằng
dideoxynucleotide. Thay vì giải trình tự từng ống riêng biệt hay các giếng trên đĩa
microtiter, các chuỗi DNA được khuếch đại bằng phản ứng emulsion PCR trực tiếp
trên bề mặt của hàng ngàn hạt agarose. Mỗi hạt agarose có thể chứa trên bề mặt đến
1 triệu bản sao của đoạn DNA ban đầu. Sau khi khuếch đại, các hạt được giải trình
tự và thu tín hiệu. Hàng ngàn hạt được cho lên bề mặt đĩa 5 picotiter (T), trên đó có
16