Nghiên cứu phương pháp xác định độc tố okadaic acid, DTX1, DTX2 trong vẹm vỏ xanh

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

VŨ NGỌC KHÁNH
Mã sinh viên: 1101270

NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP XÁC
ĐỊNH ĐỘC TỐ OKADAIC ACID,
DTX1, DTX2 TRONG VẸM VỎ XANH
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI – 2016


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

VŨ NGỌC KHÁNH
Mã sinh viên: 1101270

NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP XÁC
ĐỊNH ĐỘC TỐ OKADAIC ACID,
DTX1, DTX2 TRONG VẸM VỎ XANH
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. ThS. Tống Thị Thanh Vƣợng
2. TS. Trần Cao Sơn
Nơi thực hiện:
Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc Gia

HÀ NỘI – 2016

i

LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian làm khóa luận tốt nghiệp, với sự giúp đỡ tận tình của thầy cô
giáo, em đã hoàn thành khóa luận của mình.
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc em xin gửi lời cảm ơn tới ThS. Tống
Thị Thanh Vượng đã tận tình hướng dẫn, đóng góp ý kiến cho em trong suốt quá trình
thực hiện đề tài và viết khóa luận.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới lãnh đạo Viện kiểm nghiệm An toàn vệ sinh
thực phẩm Quốc Gia, PGS. TS. Lê Thị Hồng Hảo đã tạo điều kiện giúp em hoàn thành
đề tài.
Em xin chân thành cảm ơn TS. Trần Cao Sơn đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ
em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận. Em gửi lời cảm ơn tới các anh chị, những
người làm việc ở Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc Gia đã quan
tâm, giúp đỡ tạo mọi điều kiện cho em hoàn thành khóa luận này.
Cuối cùng, em xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã luôn bên em,
chia sẻ khó khăn, động viên và giúp đỡ trong học tập cũng như trong cuộc sống.
Do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên không tránh được những thiếu sót.
Em rất mong nhận được ý kiến đóng góp của thầy cô và các bạn sinh viên.
Hà Nội, ngày 12 tháng 05 năm 2016
Sinh viên
Vũ Ngọc Khánh


ii

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................................... i

MỤC LỤC ............................................................................................................................ii
DANH MỤC CÁC BẢNG ................................................................................................ vi
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ......................................................................... vii
ĐẶT VẤN ĐỀ ..................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN............................................................................................. 2
1.1.

Giới thiệu về độc tố sinh học biển ...................................................................... 2

1.2.

Độc tố sinh học biển trong thủy sản ................................................................... 3

1.3.

Khái quát chung về độc tố nhóm Okadaic acid (OA) ...................................... 3

1.3.1. Nguồn gốc tích tụ độc tố .................................................................................. 3
1.3.2. Tính chất ............................................................................................................. 4
1.3.3. Độc tính ............................................................................................................... 4
1.3.4. Cơ chế gây độc ................................................................................................... 6
1.3.5. Triệu chứng ngộ độc .......................................................................................... 6
1.3.6. Tình hình ngộ độc .............................................................................................. 6
1.4.

Các phương pháp xác định độc tố gây tiêu chảy .............................................. 7

1.4.1. Thử nghiệm sinh học ........................................................................................ 7
1.4.2. Thử nghiệm sinh hóa ........................................................................................ 8
1.4.3. Thử nghiệm hóa học ......................................................................................... 8

1.5.

Tổng quan tóm lược về sắc ký lỏng khối phổ .................................................13

1.6.

Tóm lược về phương pháp làm sạch bằng chiết pha rắn ...............................16

CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.........................18
2.1.

Đối tượng nghiên cứu.........................................................................................18

2.2.

Nguyên vật liệu-trang thiết bị............................................................................18

2.2.1. Nguyên vật liệu................................................................................................18
2.2.2. Dụng cụ.............................................................................................................19
2.3.

Nội dung nghiên cứu ..........................................................................................19


iii

2.3.1. Khảo sát phương pháp ....................................................................................19
2.3.2. Thẩm định phương pháp.................................................................................19
2.3.3. Ứng dụng phương pháp ..................................................................................20
2.4.

Phương pháp nghiên cứu ...................................................................................20

2.4.1. Phương pháp phân tích độc tố nhóm OA .....................................................20
2.4.2. Quy trình thẩm định phương pháp ................................................................21
2.4.3. Phương pháp xử lý số liệu..............................................................................23
CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...............................................................24
3.1.

Khảo sát phương pháp phân tích DSP..............................................................24

3.1.1. Khảo sát điều kiện khối phổ ...........................................................................24
3.1.2. Điều kiện sắc ký lỏng......................................................................................27
3.1.3. Khảo sát phương pháp xử lý mẫu..................................................................28
3.2.

Thẩm định phương pháp ....................................................................................34

3.2.1. Tính đặc hiệu....................................................................................................34
3.2.2. Xác định khoảng tuyến tính ...........................................................................36
3.2.3. Độ lặp lại và độ thu hồi ..................................................................................38
3.2.4. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng...................................................39
3.2.5. Bàn luận ............................................................................................................40
3.3.

Áp dụng phân tích mẫu thực tế .........................................................................41

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .........................................................................................43
Kết luận............................................................................................................................43
Kiến nghị .........................................................................................................................43

TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................................
PHỤ LỤC: MỘT SỐ SẮC KÝ ĐỒ ....................................................................................


iv

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu

Tiếng anh

Tiếng việt

AOAC

Association of Official

Hiệu hội các cộng đồng phân tích

Analytical Communites

chính thức

Atmospheric pressure chemical

Chế độ ion hóa hóa học ở áp suất

ionization

khí quyển

Amnesic Shellfish Poisoning

Ngộ độc nhuyễn thể gây mất trí

APCI

ASP

nhớ
CAD

Collision Gas Pressure

Áp suất khí va chạm

CE

Collision Energy

Năng lượng va chạm

CI

Chemical ionization

Ion hóa hóa học

CUR

Curtain Gas

Khí màng

CXP

Collision Cell Exit Potential

Thế đầu ra

DP

Declustering Potential

Thế phân mảnh

DSP

Diarrhetic Shellfish Poisoning

Ngộ độc nhuyễn thể gây tiêu chảy

DTX1

Dinophysistoxin - 1

DTX2

Dinophysistoxin - 2

EI

Electron impact

Ion hóa bằng va chạm điện tử

ESI

Electronspray ionization

Ion hóa phun điện tử

GC

Gas Chromatography

Sắc ký khí ghép khối phổ

GS

Ion Source Gas

Khí nguồn ion

HPLC

High performance liquid

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

chromatography
IP

Identification point

Điểm nhận dạng

IS

Ionspray Voltage

Thế phun ion

LC-MS/MS

Liquid chromatography tandem

Sắc ký lỏng ghép khối phổ 2 lần

mass spectrometry


v

LOD

Limit of detection

Giới hạn phát hiện

LOQ

Limit of quantification

Giới hạn định lượng

MS

Mass spectrometry

Khối phổ

MU

Mouse unit

Đơn vị chuột

NSP

Neurotoxic Shellfish Poisoning

Ngộ độc nhuyễn thể gây độc thần
kinh

PSP

Paralytic Shellfish Poisoning

Ngộ độc nhuyễn thể gây liệt cơ

R(%)

Recovery

Hiệu suất thu hồi

S/N

Signal to noise ratio

Tỉ số tín hiệu trên nhiễu

SD

Standard deviation

Độ lệch chuẩn

SPE

Solid phase extraction

Chiết pha rắn

TEM

Ion source temperature

Nhiệt độ nguồn


vi

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Độc tính tương đương một số độc tố DSP ...................................................... 5
Bảng 1.2. Liều gây ngộ độc cấp tính của độc tố DSP sau khi tiêm vào phúc mạc ..... 5
Bảng 1.3. Một số nghiên cứu sử dụng phương pháp LC-MS để xác định độc tố DSP
..............................................................................................................................................10
Bảng 3.1. Điều kiện chạy nguồn in hóa ESI ..................................................................24
Bảng 3.2. Kết quả bắn phá các ion mẹ ...........................................................................24
Bảng 3.3. Năng lượng bắn phá các ion con của độc tố nhóm DSP ............................26
Bảng 3.4. Chương trình gradient ....................................................................................27
Bảng 3.5. Khảo sát qui trình chiết mẫu ..........................................................................30
Bảng 3.6. Khảo sát cột SPE .............................................................................................31
Bảng 3.7. Khảo sát thể tích rửa giải ...............................................................................32
Bảng 3.8. Ion mẹ và ion con của độc tố gây tiêu chảy nhóm OA ................................34
Bảng 3.9. Sự phụ thuộc giữa diện tích pic và nồng độ độc tố gây tiêu chảy nhóm OA
..............................................................................................................................................36
Bảng 3.10. Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp xác định OA trong nhuyễn thể
..............................................................................................................................................38
Bảng 3.11. Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp xác định DTX1 trong nhuyễn
thể ........................................................................................................................................38
Bảng 3.12. Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp xác định DTX2 trong nhuyễn
thể ........................................................................................................................................39
Bảng 3.13. LOD và LOQ của các độc tố DSP ...............................................................39
Bảng 3.14. Kết quả phân tích độc tố DSP một số mẫu thực ........................................41

vii

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Tảo độc trong chuỗi thức ăn ............................................................................. 2
Hình 1.2. Cấu trúc hóa học các độc tố DSP .................................................................... 4
Hình 1.3. Sơ đồ cấu tạo nguyên lý hoạt động của thiết bị khối phổ ........................ 134
Hình 1.4. Sơ đồ minh họa hoạt động của hệ ESI-MS/MS ............................................14
Hình 1.5. Bộ phân tích tứ cực chập ba ...........................................................................15
Hình 2.1. Mô hình thực nghiệm .......................................................................................20
Hình 3.1. Phổ khối ion mẹ của OA và DTX2 .................................................................25
Hình 3.2. Phổ khối ion mẹ của DTX1 .............................................................................25
Hình 3.3. Phổ khối ion con của OA và DTX2 ................................................................26
Hình 3.4. Phổ khối ion con của DTX1 ............................................................................26
Hình 3.5. Sắc đồ ion tổng .................................................................................................28
Hình 3.6. Khảo sát qui trình chiết mẫu...........................................................................29
Hình 3.7. Đồ thị khảo sát ảnh hưởng của qui trình chiết .............................................30
Hình 3.8. Đồ thị khảo sát ảnh hưởng của cột chiết pha rắn SPE ...............................31
Hình 3.9. Đồ thị khảo sát thể tích dung môi chiết.........................................................32
Hình 3.10. Qui trình xử lý mẫu tối ưu.............................................................................34
Hình 3.11. Sắc đồ mẫu trắng ...........................................................................................35
Hình 3.12. Sắc đồ mẫu chuẩn 100 ng/mL và mẫu trắng thêm chuẩn của OA và DTX2
..............................................................................................................................................35
Hình 3.13 Sắc đồ mẫu chuẩn 100 ng/mL và mẫu trắng thêm chuẩn của DTX1 .......35
Hình 3.14 Đường hồi qui tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ OA .....................37
Hình 3.15 Đường hồi qui tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ DTX1 ................37
Hình 3.16 Đường hồi qui tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ DTX2 ................38
Hình 3.17 LOD của OA và DTX2 ....................................................................................40
Hình 3.18 LOD của DTX1 ................................................................................................40

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Theo ước tính của Tổ chức nông lương (FAO) một nửa xuất khẩu thủy sản
trên thế giới bắt nguồn từ các nước đang phát triển trong khi 80% nhập khẩu thuộc
về các nước phát triển. Các sản phẩm từ thủy sản là một nguồn thu ngoại tệ quan
trọng tại các nước đang phát triển, trong đó có Việt Nam.
Một trong các thị trường nhập khẩu lớn của ngành thủy sản Việt Nam là
Liên minh Châu Âu (EU). Theo quy định của Ủy ban liên minh Châu Âu, một trong
những yêu cầu để một nước ngoài khối EU xuất khẩu thủy sản vào EU là phải thực
hiện các chương trình giám sát dư lượng độc hại trong thủy sản nuôi (bao gồm
nhuyễn thể hai mảnh vỏ). Đồng thời, thủy sản phải được phân tích các chỉ tiêu theo
qui định của EU trước khi xuất khẩu cùng với các đòi hỏi nghiêm ngặt về kỹ thuật
phân tích. Hai nội dung liên quan đến kỹ thuật đóng vai trò chính trong việc thực
hiện chương trình này là định danh, phân loại tảo độc (các loài tảo độc có khả
năng sinh độc tố) và phân tích độc tố sinh học biển, trong đó độc tố gây tiêu chảy là
nhóm gây độc phổ biến nhất. Trong các loài nhuyễn thể, vẹm vỏ xanh (Perna viridis) là
loài có nguy cơ nhiễm độc tố tiêu chảy lớn nhất.
Một số phương pháp có thể ứng dụng để xác định các độc tố gây tiêu chảy
trong nhuyễn thể bao gồm các phương pháp thử sinh học, các phương pháp sinh hóa,
phương pháp sắc ký lỏng với detector huỳnh quang và phương pháp sắc ký lỏng khối
phổ. Trong số đó, phương pháp sắc ký lỏng khối phổ là phương pháp hiện đại, có độ
nhạy cao, cho phép xác định nhanh và chính xác. Do đó, chúng tôi chọn đề tài:
"Nghiên cứu phương pháp xác định độc tố Okadaic acid, DTX1, DTX2 trong vẹm
vỏ xanh". Với 2 mục tiêu sau:
1. Xây dựng phương pháp xác định độc tố Okadaic acid, DTX1, DTX2
trong vẹm vỏ xanh bằng LC-MS/MS.
2. Áp dụng phương pháp để phân tích một số mẫu vẹm tại Việt Nam.

2

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN
1.1.

Giới thiệu về độc tố sinh học biển
Với khoảng 5000 loài thực vật phù du được biết cho đến nay, trong những

điều kiện sinh sống đặc biệt, có khoảng 300 loài có tốc độ sinh trưởng lớn tạo thành
những đám tảo với mật độ dày đặc, gọi là hiện tượng nở hoa (blooms). Hiện tượng
nở hoa đôi khi có lợi cho việc nuôi trồng thủy sản cũng như môi trường sinh học
biển. Tuy nhiên trong số 300 loài thực vật phù du kể trên, có hơn 40 loài thuộc lớp
dinoflagellate và diatom là những loài sinh ra độc tố biển [15]. Chính sự phong phú
của những loài tảo độc này làm cho mật độ của chúng trong nước biển có thể lên đến
từ vài nghìn đến vài triệu tế bào trong 1 lít nước. Các độc tố biển này được tích tụ
trong nhiều loài sinh vật biển như cá, cua, nhuyễn thể hai mảnh vỏ (sò, vẹm, trai)
(Hình 1.1). Trong nhuyễn thể, độc tố được tích tụ chủ yếu ở tuyến tiêu hóa nhưng
không gây độc cho chúng. Khi con người hoặc động vật tiêu thụ một lượng nhất định
các nhuyễn thể chứa độc tố sẽ gây ngộ độc với các triệu chứng đa dạng. Trên toàn
thế giới, mỗi năm có khoảng 60000 trường hợp ngộ độc do nhiễm độc tố của các loài
tảo sản xuất. Độc tố nhuyễn thể gây hủy hoại môi trường tự nhiên và có tác động tiêu
cực đến nền kinh tế, du lịch và công nghiệp chế biển hải sản.

Hình 1.1. Tảo độc trong chuỗi thức ăn


3

1.2.

Độc tố sinh học biển trong thủy sản
Dựa vào cấu trúc hóa học của các độc tố biển mà người ta chia chúng thành 2

nhóm: thân nước và thân dầu. Các độc tố gây ra triệu chứng mất trí nhớ (ASP), độc
tố gây liệt cơ (PSP) là những độc tố nhóm thân nước, có phân tử khối dưới 500 Da.
Độc tố gây độc thần kinh (NSP). gây tiêu chảy (DSP), độc tố AZP và các độc tố khác
như PTXs, YTXs thuộc nhóm thân dầu, với phân tử khối trên 600 Da (có thể lên đến
2000 Da).
Độc tố sinh học biển trong nhuyễn thể có nguồn gốc từ sinh vật phù du. Thông
qua đường thức ăn của nhuyễn thể, độc tố được tích tụ hoặc chuyển hóa trong cơ thể
nhuyễn thể. Tất cả các loài nhuyễn thể (động vật thân mềm ăn thức ăn bằng phương
thức màng lọc) đều có nguy cơ bị nhiễm độc tố. Tuy nhiên, chúng thường thấy ở một
số loài sau: PSP thường có trong vẹm, nghêu, sò, điệp; DSP thường có trong vẹm,
trai, điệp; ASP thường chỉ có trong vẹm; NSP thường có trong trai, vẹm [10].
1.3.

Khái quát chung về độc tố nhóm Okadaic acid (OA)
Độc tố nhóm OA là thành phần chính của độc tố tiêu chảy (DSP), gồm có 3

chất: Okadaic acid, Dinophysistoxin-1 (DTX1), Dinophysistoxin-2 (DTX2). Ngoài
ra còn có Yessotoxin (YTXs) và Pectenotoxin (PTXs) cũng thuộc nhóm độc tố DSP,
thường xuất hiện cùng nhóm OA trong các trường hợp ngộ độc tuy nhiên chúng
không gây tiêu chảy. Do đó, một số người cho rằng nên loại bỏ 2 nhóm chất này ra
khỏi nhóm độc tố gây tiêu chảy.
1.3.1. Nguồn gốc tích tụ độc tố
Độc tố nhóm OA được sản xuất bởi giống tảo Dinophysis, giống tảo này trong
điều kiện môi trường thuận lợi sẽ phát triển rất nhanh và gây ra hiện tượng nở hoa.
Chúng hay bắt gặp ở các vùng biển nhiệt đới và ôn đới, cả ven biển và ngoài khơi. Ở
Việt Nam, chúng hay được bắt gặp ở vùng biển Thừa Thiên - Huế, biển Bà Lụa tỉnh
Kiên Giang [4].

Có 7 loài tảo thuộc giống Dinophysis được xác nhận là sản sinh ra độc tố nhóm
OA, bao gồm: D. fortii (Nhật Bản), D. acuminata (châu Âu), D. acuta, D. norvegica


4

(Scandinavia), D. mitra, D. rotundata và D. tripos. Ngoài ra, còn 2 loài tảo khác thuộc
giống Dinophysis đang bị nghi ngờ đó là: D. caudata, D. hastata và D. sacculus [18].
Khả năng sản xuất độc tố phụ thuộc vào mỗi loài và thời điểm trong năm. D. fortii ở
bắc Nhật Bản trong tháng Ba và tháng Sáu cho nồng độ độc tố rất cao, điều này có
liên quan đến lượng độc tố được tích tụ trong nhuyễn thể. Tuy nhiên, cũng loài đó
nhưng ở Nam Nhật Bản vào tháng Năm và tháng Bảy cho nồng độ độc tố rất thấp,
còn trong nhuyễn thể thì gần như không có [19].
1.3.2. Tính chất
- Cấu trúc hóa học

Hình 1.2. Cấu trúc hóa học các độc tố DSP
-

Tồn tại ở dạng bột hoặc là tinh thể màu trắng, tan tốt trong Dimethyl

sulfoxide ( ≥1 mg/mL) và 1 số dung môi hữu cơ. Độ tan giảm trong môi trường acid,
base.
- Nhiệt độ nóng chảy: 164-166 o C.
- Bền với nhiệt.
- LC50 tiêm màng bụng trên chuột: 192 µg/kg [27].
1.3.3. Độc tính
Độc tính của mỗi độc tố DSP là không giống nhau. Do đó, để thuận tiện cho
việc tính toán độc tính của hỗn hợp các độc tố DSP, người ta dùng khái niệm độc
tính tương đương. DTX1 có độc tính mạnh nhất trong nhóm nên được chọn làm

mốc, có độc tính là 1 đơn vị, độc tính của các độc tố khác được tính toán dựa trên
việc so sánh với độc tính của DTX1. Độc tính tương đương của một số độc tố DSP
được cho trong bảng 1.1.


5

Bảng 1.1. Độc tính tương đương một số độc tố DSP
Độc tính tương

Độc tố

đương

Tham khảo

Okadaic acid
Dinophysistoxin-1
Dinophysistoxin-2

1
1
0,6

[7]

Yessotoxin
1a-homo yessotoxin
45OH yessotoxin
45OH-1a-homo yessotoxin

1
1
1
0,5

[8]

Tại châu Âu, mức giới hạn liều lượng tổng cộng các độc tố OA, DTXs, PTXs
là tương đương 160 µg OA eq./kg nhuyễn thể. Vào năm 2008, cơ quan An toàn Thực
phẩm châu Âu khuyến cáo OA, DTXs không nên vượt quá liều tương đương 45 µg
OA eq./kg nhuyễn thể. Tại Việt Nam, qui định về hàm lượng độc tố DSP trong nhuyễn
thể 2 mảnh vỏ là ở mức không phát hiện. Theo tiêu chuẩn ngành do Bộ Thủy Sản ban
hành, khi định tính bằng thử hóa sinh trên chuột, kết quả thử độc tố DSP phải âm tính.
Trong trường hợp cần thiết, kiểm chứng định lượng bằng HPLC, hàm lượng độc tố
DSP trong 100 g sản phẩm không lớn hơn 60 µg [3], [5].
Thử nghiệm độc tính cấp của một số độc tố DSP trên chuột, kết quả được cho
trong bảng 1.2.
Bảng 1.2. Liều gây ngộ độc cấp tính của độc tố DSP sau khi tiêm vào phúc mạc
Tên các độc tố
OA
DTX1
DTX3
PTX1
PTX2
YTX

Liều gây độc cấp tính
(mg/kg)
200

160-200 *
500
250
230-260 *
100 *

Tình trạng ngộ
độc
Tiêu chảy
Tiêu chảy
Tiêu chảy
Độc gan
Độc gan
Độc tim

Ghi chú: * Cho chuột đực uống với liều 80 mg/kg thể trọng 1/3 số chuột chết; với
liều 100 mg/kg thể trọng tất cả chuột đều chết [16].


6

1.3.4. Cơ chế gây độc
Độc tố nhóm OA ức chế serine và threonine phosphatase PP1 và PP2A [10]
dẫn đến làm phosphoryl hóa quá mức các protein có chứa các liên kết qui định tính
thấm của tế bào. Kết quả làm mất dịch tế bào, gây nên các triệu chứng như buồn nôn,
nôn, rối loạn tiêu hóa, đau bụng, tiêu chảy…
1.3.5. Triệu chứng ngộ độc
 Sau khi ăn, trong vòng 30 phút đến 12 giờ, nạn nhân bị tiêu chảy, buồn
nôn, ói mửa, đau ở vùng bụng.
 Sau triệu chứng trên thì xuất hiện triệu chứng ớn nóng lạnh. ít trường

hợp tử vong, bình phục sau 3 ngày.
 Trường hợp nặng: sau khi ăn, nạn nhân thấy ngứa, tê môi, cảm giác
nghẹt thở...và có thể chết vì liệt cơ hô hấp trong vòng 2-24 giờ sau khi
ăn.
1.3.6. Tình hình ngộ độc
Trường hợp ngộ độc độc tố DSP đầu tiên được ghi nhận tại Hà Lan trong những
năm 1960, tiếp theo là các báo cáo tương tự tại Nhật Bản cuối những năm 1970. Kể
từ đó, hơn 1300 trường hợp đã được báo cáo từ Nhật Bản, với mùa cao điểm từ tháng
tư đến tháng chín. Những trường hợp ngộ độc khác cũng được ghi nhận tại châu Âu
và Nam Mỹ. Tại Tây Ban Nha, hơn 5000 trường hợp đã được báo cáo năm 1981. Tại
Pháp năm 1984 và 1986, trên 2000 trường hợp được báo cáo hàng năm và trên 300
trường hợp ngộ độc tại Scandinavia năm 1984. Trai xuất khẩu từ Đan Mạch đến Pháp
gây ra ngộ độc cho hơn 400 người trong năm 1990. Năm 1991, hơn 100 người ở Chile
bị ngộ độc. Năm 1992, độc tố DSP được phát hiện ở nồng độ cao gây nguy hiểm
trong sò ốc tại Uruguay. Tại Việt Nam, ngày 03/05/2/2013, Cục Quản lý Chất lượng
Nông Lâm sản và Thủy sản Nam Bộ (NAFIQAD-SRA) đã gửi thông báo cảnh báo
về việc phát hiện mật độ tảo độc Dinophysis (sản sinh độc tố DSP) vượt quá giới hạn
cảnh báo tại vùng thu hoạch Bà Lụa , tỉnh Kiên Giang. Mặc dù xuất hiện rộng rãi trên
toàn cầu nhưng những khu vực bị ảnh hưởng nhiều nhất vẫn ở châu Âu và Nhật Bản
[4], [9], [10].


7

1.4.

Các phương pháp xác định độc tố gây tiêu chảy

1.4.1. Thử nghiệm sinh học
 Thử nghiệm in vivo

Phương pháp sử dụng phổ biến nhất là thử nghiệm trên chuột, được phát
triển bởi Bộ Sức khỏe và An toàn Nhật Bản. Độc tố được chiết ra từ thịt nhuyễn thể
bằng aceton, sau đó đem đi cô quay đến khi còn cặn, cặn thu được hòa tan vào một
lượng nhỏ thể tích Tween 60 1%. Dịch chiết sau đó tiêm màng bụng vào chuột có cân
nặng khoảng 20 g và theo dõi sự sống sót của chuột từ 24 đến 48 giờ. Một đơn vị
chuột (MU) được định nghĩa là liều lượng nhỏ nhất của độc tố cần thiết để giết chết
một con chuột trong vòng 24 giờ. Độc tính của mẫu (MU/g nhuyễn thể) được xác
định là liều lượng nhỏ nhất mà tại đó giết chết ít nhất 2 trong 3 con chuột trong vòng
24 giờ. Tại nhiều nước, giới hạn qui định được đặt ở mức 0,05 MU/g nhuyễn thể.
Trong bài viết này, tất cả các thành phần của nhóm DSP đã được phát hiện, bao gồm
cả những độc tố không gây tiêu chảy (PTXs và YTXs) [16].
Do vậy, nhược điểm lớn nhất của phương pháp này đó là thiếu tính đặc hiệu
(không phân biệt được giữa các độc tố trong nhóm DSP), tính chủ quan về thời gian
chết của động vật và vấn đề đạo đức về việc giết hại động vật trong phòng thí nghiệm.
Hơn nữa, thí nghiệm này rất đắt và tốn thời gian nhưng lại có thể cho kết quả không
chính xác do ảnh hưởng của một vài chất béo khác (những acid béo rất độc đối với
chuột) đồng thời kết quả khác nhau giữa dịch chiết trong toàn bộ nhuyễn thể và trong
gan tụy [13].
 Thử nghiệm in vitro
Năm 1991, Aune cùng cộng sự đã phát triển thử nghiệm dựa trên sự thay
đổi hình thái của gan tụy tươi chuột thí nghiệm khi phơi nhiễm với độc tố DSP.
Phương pháp này có khả năng phân biệt được các độc tố trong nhóm DSP: OA, DTX1
và những độc tố không gây tiêu chảy PTX1 và YTX. Giới hạn phát hiện của OA và
DTX1 là 0,5 µg/mL, PTX là 5 µg/mL, YTX là 10 µg/mL. Phương pháp này là một
công cụ nghiên cứu có giá trị trong việc tách giữa độc tố gây tiêu chảy và không gây


8

tiêu chảy trong nhóm DSP. Tuy nhiên, có vài nhược điểm là tốn thời gian và kết quả

sẽ không chính xác khi có mặt của đồng thời nhiều độc tố khác [11].
1.4.2. Thử nghiệm sinh hóa
Có một số phương pháp thử nghiệm miễn dịch để xác định độc tố nhóm DSP
như là RIA (miễn dịch phóng xạ) hoặc ELISA (xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết
enzym), chúng đều dựa trên nguyên tắc là sự kết hợp giữa một kháng thể được chuẩn
bị sẵn với tác nhân kháng nguyên là OA. Miễn dịch phóng xạ (RIA) cho OA được
phát triển bởi Levine và cộng sự [25]. Kháng thể với OA được chuẩn bị bằng cách
gây miễn dịch ở thỏ với okadaic acid liên hợp với albumin bò tại vị trí nhóm carboxy
để hình thành nhóm amino của chất mang kháng thể. Giới hạn phát hiện của phương
pháp khoảng 0,2 pg/mL [21].
Bộ thử nghiệm ELISA đã được phát triển và thương mại hóa trên toàn cầu.
DSP-Check ELISA được sản xuất tại khu công nghiệp UBE, Tokyo, Nhật Bản đã
được sử dụng rộng rãi để nhận biết sự có mặt của OA và DTX1 với giới hạn phát hiện
là 20 ng/g. Một số báo cáo cho thấy bộ thử trên cho kết quả sai trong một số trường
hợp. Tuy nhiên, khi so sánh với phương pháp LC [24], bộ DSP-Check cho thấy khả
năng định lượng độc tố DSP trong tất cả các mẫu chỉ chứa okadaic acid, nhưng không
phát hiện được ở dạng ester. Bộ thử có độ nhạy cao, độ đặc hiệu và tốc độ phân tích
nhanh hơn so với LC. Trong DSP-Check chỉ chứa kháng thể đơn dòng do đó nó cũng
có thể xác định được DTX1 với nồng độ tương đương OA nhưng không phát hiện
được PTXs và YTXs [21].
1.4.3. Thử nghiệm hóa học
1.4.3.1.

Sắc ký lớp mỏng (TLC)
Độc tố DSP có thể được phát hiện bằng sắc ký lớp mỏng. Dịch chiết sau

khi làm sạch được đưa trực tiếp lên bản silica gel sau đó rửa giải với hỗn hợp dung
môi toluen-aceton-methanol. Cả dạng acid và dạng ester đều cho màu hồng đỏ sau
khi nhúng vào dung dịch vanillin trong acid sulfuric và ethanol rồi để ở nhiệt độ
phòng trong vài phút. Tuy nhiên, dạng acid có màu đậm hơn so với dạng ester. Khi

dịch chiết đã làm sạch được cho lên bản TLC, có thể xác định được đến 1 µg độc tố,


9

với dịch chiết thô chưa làm sạch cần 2 đến 3 µg để có thể phát hiện. Giới hạn phát
hiện cao chính là một hạn chế của phương pháp TLC trong phân tích độc tố DSP [21].
1.4.3.2.

Sắc ký khí (GC)
Sắc ký khí được phát triển để xác định và phân tách độc tố nhóm OA. Dịch

chiết độc tố trong diethyl ether được làm sạch và tinh chế bằng acid silicic. Tuy nhiên
trong thực tế phương pháp này ít được sử dụng [22].
1.4.3.3.

Sắc ký lỏng với detector huỳnh quang (LC-FLD)
Đây là phương pháp được sử dụng phổ biến trong xác định OA và DTX1.

Thịt nhuyễn thể được chiết lần lượt với methanol, ether và chloroform, sau đó dẫn
xuất với 9-anthryldiazomethane (ADAM), làm sạch bằng cột silica Sep-pak, xác định
bằng HPLC với detector huỳnh quang. Phương pháp có độ nhạy cao, có thể xác định
đến 10 pg OA. Giới hạn phát hiện của phương pháp không bị hạn chế bởi độ nhạy
của detector mà do ảnh hưởng của tín hiệu nhiễu hóa học, do đó, giới hạn phát hiện
thực tế của phương pháp chỉ là 100 ng/g nhuyễn thể. Nếu chỉ phân tích độc tố trong
tuyến tiêu hóa thì giới hạn phát hiện trong khoảng 10 đến 20 ng/g nhuyễn thể [28].
1.4.3.4.

Sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS)
Năm 1995, Hallegraeff cùng cộng sự [21] phân tích dạng diol ester của OA,

DTX1, DTX3 sử dụng máy LC kết hợp với khối phổ. Phương pháp cho thấy có tốc
độ cao và độ nhạy tốt đối với độc tố nhóm DSP. Kết quả cho thấy giới hạn phát hiện
có thể xuống tới 1 ng/g trong toàn bộ phần ăn được của nhuyễn thể.
Để làm sạch mẫu, có nhiều phương án được đưa ra. Suzuki [26] sử dụng
cột alumina B ; Hummert và cộng sự [23] sử dụng sắc ký rây phân tử để làm sạch
dịch chiết thô từ tảo và nhuyễn thể. Mặc dù có sự cải thiện nhưng những phương pháp
trên thất bại trong việc chứng minh có thể loại bỏ hoàn toàn ảnh hưởng của nhiễu
trong mẫu phân tích.
Giữa năm 2002, Holland và cộng sự [21] đã thực hiện một nghiên cứu liên
phòng để đánh giá việc áp dụng phương pháp LC-MS mới trong phân tích độc tố DSP
và ASP trong nhuyễn thể. Tám phòng thí nghiệm đã tham gia chương trình, tất cả đều
cho giới hạn phát hiện ở mức thấp ( dưới 5 ng/mL, tương đương 0,05 mg/kg). Nhìn


10

chung, độ nhạy của phương pháp đủ để đạt được LOD yêu cầu phân tích độc tố DSP
và ASP trong nhuyễn thể.
Do có độ nhạy và độ chính xác cao nên kỹ thuật LC-MS đã được sử dụng
trong nhiều nghiên cứu để phân tích độc tố DSP.
Bảng 1.3. Một số nghiên cứu sử dụng phương pháp LC-MS để xác định độc tố DSP
TL

Điều kiện phân tích

TK

Kỹ

Kết quả

thuật
 Nền mẫu: Trai
 Dung môi chiết: Methanol
 Điều kiện chạy sắc ký:
-

[10]

Kênh A: H2 O, 2 mM HCOONH4 , 50 mM
HCOOH

-

Kênh B: ACN/H2 O (95:5 v/v), 2 mM

LCMS/MS

HCOONH4, 50 mM HCOOH
-

- LOD: 22 pg
- R(%):
71,1 - 128,4

Cột sắc ký: Thermo Finnegan BDS Hypersil
C8 (2,1 x 50 mm, 3 µm)

-

Tốc độ dòng: 0,2 mL/phút

 Nền mẫu: Trai
 Dung môi chiết: Methanol
 Điều kiện chạy sắc ký
-

Kênh A: H2 O, 6,7 mM NH4OH

-

Kênh B: ACN/H2O (90:10 v/v), 6,7 mM

[10]

NH4 OH
-

Cột: Waters XBridge C18 (4,6 x 150 mm,
3,5 µm)

-

Tốc độ dòng: 0,2 mL/phút

LCMS/MS

- LOD: 9 pg
- R(%):

79,6 - 123,6


11

 Nền mẫu: Trai
 Dung môi chiết: Methanol
 Điều kiện chạy sắc ký

[10]

-

Kênh A: H2 O, 0,1% HCOOH

-

Kênh B: ACN/H2O (1:1 v/v), 0,1%
HCOOH

-

LC ToF-MS

LOD:
8,1 - 11 pg

Cột: Acquity UPLC BEH C18 (2,1 x 50 mm,
1,7 µm)

-

Tốc độ dòng: 0,02 mL/phút

 Nền mẫu: Sò điệp
 Dung môi chiết: Methanol
 Điều kiện sắc ký

[10]

-

Kênh A: H2 O, 6,7 mM NH4OH

-

Kênh B: ACN/H2O (90:10 v/v), 6,7 mM
NH4 OH

-

LC -

-R(%):

MS/MS

86,9 - 97,8

Cột: Waters XBridge C18 (4,6 x 150 mm,

3,5 µm)

-

Tốc độ dòng: 0,2 mL/phút

 Nền mẫu: Trai Địa Trung Hải
 Dung môi chiết: Aceton
 Điều kiện sắc ký
-

Kênh A: CH3CN/H2O (90:10 v/v), 0,1%
TFA

[29]

-

Kênh B: H2 O, 0,1% TFA

-

Cột: Supelcosil LC18-DB (4,6 x 250 mm, 5
µm)

-

Tốc độ dòng: 0,8 mL/phút

LOD:

LC -

0,04 µg/g

MS/MS

R(%):
92,8 - 93,7


12

 Nền mẫu: Tảo D.acuta
 Dung môi chiết: Methanol
 Điều kiện sắc ký
[12]

Kênh A: H2O, 1,0 mM CH3COONH 4 ,
0,005% TFA

-

Kênh B: ACN/H2O (85:15 v/v), 1,0 mM

LC MS/MS

CH3 COONH4, 0,005% TFA
-

LOD:

0,29 - 0,64
ng/g

Cột: Zorbax Eclipse XDB-C8 (2,1 x 150
mm, 3,5 µm)

-

Tốc độ dòng: 0,2 µL/phút

 Nền mẫu: Trai
 Dung môi chiết: Methanol
 Điều kiện sắc ký
[17]

-

Kênh A: H2 O, 2 mM HCOONH4 , 50 mM

LOD:

HCOOH

UPLC -

483,1 pg/mL

Kênh B: ACN/H2O (85:15 v/v), 2 mM

MS/MS

R(%):

HCOONH4, 50 mM HCOOH
-

85,8 - 101,6

Cột: Acquity UPLC BEH C18 (2,1 x 100
mm, 1,7 µm)

-

Tốc độ dòng: 0,4 mL/phút

 Nền mẫu: Sò
 Dung môi chiết: Methanol
 Điều kiện sắc ký
[20]

-

Kênh A: CH3COOH

-

Kênh B: ACN/H2O (95:5 v/v)

-

Cột: Symmetry C18 (2,1 x 150 mm, 3,5 µm)

-

Tốc độ dòng: 0,1 mL/phút

LOD:
LC-

5 - 10 ng/g

MS/MS

R(%):
92 - 104


13

Tổng quan tóm lược về sắc ký lỏng khối phổ

1.5.

Sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) là kỹ thuật phân tích dựa trên sự kết nối giữa
sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và thiết bị khối phổ (MS). Phương pháp phân tích
phổ khối lượng vừa có thể ion hóa mẫu, vừa đo lường, xác định được tỉ lệ khối
lượng/điện tích (m/z) của các ion có trong mẫu qua đó xác định (định tính, định lượng)
các phần tử có trong một mẫu hỗn hợp. Hơn nữa, trong phương pháp phổ khối lượng
các mẫu có thể được phân tích ở trạng thái rắn, lỏng hoặc khí và giải khối lượng phân
tử của các chất được nghiên cứu có thể từ một vài Dalton tới vài trăm nghìn Dalton.

Sắc ký lỏng – khối phổ có độ đặc hiệu – chọn lọc cao đối với chất phân tích, độ nhạy
tốt, LOD, LOQ nhỏ nên được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực kiểm
nghiệm [28].
 Khối phổ (Mass spectrometry)
Phương pháp phổ khối lượng là một kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và
điện tích của ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của
mẫu.

Hệ chân không

Nguồn ion

Phân tích khối

Bơm chân
không

Detector

Xử lý và ghi số
liệu

Hình 1.3. Sơ đồ cấu tạo nguyên lý hoạt động của thiết bị khối phổ


14



Nguồn ion

Đây là nơi diễn ra quá trình chuyển chất phân tích thành các ion/tiểu phân

mang điện ở pha khí bằng các kỹ thuật ion hóa khác nhau. Các ion tạo thành sẽ được
gia tốc, hội tụ để đi vào bộ phận phân tích phổ khối, còn những tiểu phân, dung
môi…không bị ion hóa, không mang điện sẽ bị hút ra ngoài. Một số kỹ thuật ion hóa
được sử dụng trong sắc ký lỏng khối phổ: ion hóa hóa học (CI), ion hóa phun điện tử
(ESI), ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (APCI)…Trong nghiên cứu này, chúng
tôi sử dụng kỹ thuật ion hóa phun điện tử (ESI).
ESI là một kỹ thuật ion hóa dược ứng dụng cho những hợp chất không bền
nhiệt, có tính phân cực, có khối lượng phân tử lớn. ESI có khả năng tạo thành những
ion đa điện tích (dương hoặc âm, tùy thuộc vào áp cực điện thế), là kỹ thuật ion hóa
mềm. Trong ESI, tại đầu ống dẫn mao quản, dưới ảnh hưởng của điện thế cao và sự
hỗ trợ của khí mang, chất phân tích được phun thành những hạt sương nhỏ mang điện
tích ở bề mặt. Khí ở xung quanh các giọt này tạo nhiệt năng làm bay hơi dung môi ra
khỏi giọt sương đó, khi đó, mật độ điện tích tại bề mặt hạt sương gia tăng. Mật độ
điện tích này tăng đến một điểm giới hạn để từ đó hạt sương phân chia thành những
hạt nhỏ hơn vì lực đẩy lúc này lớn hơn sức căng bề mặt. Quá trình này được lặp đi
lặp lại nhiều lần thành những hạt rất nhỏ. Từ những hạt rất nhỏ mang điện tích cao
này, các ion phân tích được chuyển thành thể khí bởi lực đẩy tĩnh điện sau đó đi vào
bộ phân tích khối. Trong kỹ thuật ESI, chất phân tích nhất thiết phải được biến thành
chất điện ly tan trong dung dịch dùng để phun sương. Điều này phụ thuộc vào: dung
môi sử dụng, pKa của chất điện ly và pH của dung dịch. Sơ đồ cấu tạo và nguyên lý
ion hóa bằng kỹ thuật ESI được trình bày ở hình 1.4 [1].

Hình 1.4. Sơ đồ minh họa hoạt động của hệ ESI-MS/MS


15

 Bộ phân tích khối

Các ion hình thành ở nguồn ion hóa có khối lượng m và điện tích z sẽ đi vào
bộ phận phân tích khối. Bộ phận phân tích khối có nhiệm vụ tách các ion có số khối
m/z khác nhau thành từng loại riêng biệt nhờ tác dụng của từ trường, điện trường
trước khi đến bộ phận phát hiện và xử lý số liệu. Có thể chia bộ phân tích khối thành
4 loại gồm: bộ phân tích từ, bộ phân tích tứ cực, bộ phân tích thời gian bay, bộ phân
tích cộng hưởng cyclotron.
Bộ phân tích khối chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu này là bộ ba tứ cực. Bộ ba tứ
cực bao gồm 3 bộ phân tích tứ cực ghép nối với nhau (Hình 1.5) [1].

Hình 1.5. Bộ phân tích tứ cực chập ba
Cấu tạo gồm 3 bộ tứ cực mắc nối tiếp nhau Q1 , Q2 , Q3 . Q1 sẽ tách các ion và
lựa chọn một hoặc một số ion ban đầu (ion mẹ) đưa vào tứ cực Q2. Trong buồng Q2
với áp suất cao, ion mẹ bị phân mảnh do va chạm với các khí trơ có mặt trong buồng
như nitrogen, agon, heli. Nhờ va chạm này năng lượng động học của các ion chuyển
thành nội năng nên chúng phân mảnh ion mẹ tạo ra các ion nhỏ hơn (ion con). Các
ion con mới hình thành được dẫn đến Q3 phân tích khối tách riêng và đến bộ phận
phát hiện. Các hợp chất cấu tạo khác nhau sẽ có cơ chế phân mảnh khác nhau và hình
thành nên các ion con có số khối khác nhau. Nói cách khác, các ion ban đầu nếu có
số khối giống nhau nhưng có cấu tạo khác nhau, khi phân mảnh sẽ tạo ra các ion con
có số khối khác nhau tùy thuộc vào cấu tạo của ion mẹ. Do vậy, so với thiết bị MS tứ
cực đơn, thiết bị MS tứ cực chập ba có độ đặc hiệu, độ nhạy cao hơn. Ngoài ra, nó
còn cung cấp thêm các thông tin về cấu tạo của hợp chất.


16

 Bộ phận phát hiện
Sau khi được phân tách và đi ra khỏi bộ phận phân tích khối lượng, các ion
được đưa tới phần cuối của thiết bị khối phổ là bộ phận phát hiện ion. Bộ phận phát
hiện cho phép khổi phổ tạo ra một tín hiệu của các ion tương ứng từ các electron thứ

cấp đã được khuếch đại hoặc tạo ra một dòng do điện tích di chuyển. Có hai loại bộ
phận phát hiện phổ biến là bộ phát hiện nhân electron và bộ phát hiện nhân quang
trong đó bộ phát hiện nhân electron phổ biến hơn. Bộ phận phát hiện nhân electron
là một trong những detector phổ biến nhất, có độ nhạy cao. Các ion đập vào bề mặt
dinot làm bật ra các electron. Các electron thứ cấp sau đó được dẫn tới các dinot tiếp
theo và sẽ tạo ra nhiều electron thứ cấp hơn nữa tạo thành dòng các electron. Các
electron được thu nhận và số lượng của chúng tỷ lệ với cường độ tín hiệu – tức là số
lượng ion đến detector [1].
1.6.

Tóm lược về phương pháp làm sạch bằng chiết pha rắn
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp chiết pha rắn (SPE)

để làm sạch mẫu phân tích.
Chiết pha rắn (hay chiết rắn-lỏng) là quá trình phân bố chất tan giữa 2 pha lỏng
và rắn. Trong đó, chất tan ban đầu ở trong pha lỏng (nước hoặc dung môi hữu cơ),
chất hấp phụ chất tan ở dạng rắn (dạng hạt, nhỏ xốp) gọi là pha rắn.
-

Pha rắn (còn gọi là pha tĩnh) thường là các hạt silica gel xốp trung tính, hạt
oxit nhôm, silica gel trung tính đã được alkyl hóa nhóm –OH bằng các gốc
hydrocacbon mạch thẳng –C2, -C4, -C8, -C18 ,…hay nhân phenyl, các polyme
hữu cơ, các loại nhựa hoặc than hoạt tính…Các hạt này được nhồi vào cột
chiết nhỏ (thể tích 5-10 ml) hoặc nén dưới dạng đĩa dày 1-2 mm với đường
kính 3-4 cm (đĩa chiết).

-

Pha lỏng là pha chứa chất cần phân tích, chúng có thể là dung môi hữu cơ,
dung dịch đệm…Khi cho pha lỏng đi qua cột chiết, pha rắn tương tác với chất

phân tích và liên kết với một (hoặc một số nhóm) trên chất phân tích và lưu
giữ chất phân tích lại, các chất còn lại đi ra khỏi cột cùng với dung môi hòa
tan mẫu. Như thế, ta sẽ thu được nhóm chất phân tích trên pha tĩnh. Sau đó