Nghiên cứu tổng hợp và xây dựng phương pháp định lượng tạp chất a của clopidogrel

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

-----  ------

NGUYỄN KIM CHI
Mã sinh viên: 1101050

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ
XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP
ĐỊNH LƢỢNG TẠP CHẤT A CỦA
CLOPIDOGREL
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI – 2016


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

-----  ------

NGUYỄN KIM CHI
Mã sinh viên: 1101050

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ
XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP
ĐỊNH LƢỢNG TẠP CHẤT A CỦA
CLOPIDOGREL
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

Người hướng dẫn
Thạc sĩ: Đỗ Thị Thanh Thủy
Nơi thực hiện
Bộ môn Hóa Dƣợc

HÀ NỘI – 2016


LỜI CẢM ƠN
Sau một thời gian nghiên cứu, tìm hiểu và thực hiện đề tài với rất nhiều
cố gắng, thời điểm hoàn thành khóa luận là lúc tôi xin phép được bày tỏ lòng
biết ơn chân thành với những người đã dạy dỗ, hướng dẫn và giúp đỡ tôi
trong suốt thời gian qua.
Với lòng biết sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ths. Đỗ
Thị Thanh Thủy giảng viên Bộ môn Hóa Dược - trường Đại học Dược Hà
Nội, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn và tận tình chỉ bảo tôi trong thời gian
thực hiện khóa luận này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy giáo, cô giáo và các anh chị
kỹ thuật viên của Bộ môn Hóa Dược - trường Đại học Dược Hà Nội, đã luôn
giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện khóa luận tốt nghiệp.
Cuối cùng tôi xin được gửi lời cám ơn sâu sắc đến gia đình, các anh
chị, các bạn và các em trong nhóm kiểm nghiệm tại bộ môn Hóa Dược đã
luôn động viên khích lệ và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên
cứu.

Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2016
Sinh viên

Nguyễn Kim Chi

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ…………………………………………………………………………....1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN…………………….……………………………………….3
1.1. Clopidogrel ...................................................................................... 3
1.1.1.

Một số thông tin chung về Clopidogrel...................................... 3

1.1.2.

Chỉ định................................................................................... 3

1.1.3. Các dạng bào chế của clopidogrel trên thị trường........................ 4
1.1.4. Các tạp chất của clopidogrel ...................................................... 5
1.1.4.1. Các tạp chất của clopidogrel .................................................. 5
1.1.4.2. Phương pháp xác định tạp chất liên quan của clopidogrel theo
một số dược điển................................................................................ 5
1.2. Tạp chất A của clopidogrel .............................................................. 6
1.3. Tổng quan về một số phương pháp sử dụng trong nghiên cứu đề tài .. 6
1.3.1.

Phương pháp sắc kí lớp mỏng (TLC)......................................... 6

1.3.2. Phương pháp đo năng suất quay cực .......................................... 7
1.3.3. Phương pháp đo phổ hồng ngoại (IR) ......................................... 8
1.3.4. Phương pháp phân tích khối phổ (MS) ....................................... 8
1.3.5. Phương pháp đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( NMR) ................ 9
1.3.6. Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) ....................... 10
1.4. Một số phương pháp HPLC xác định tạp A của clopidogrel ............ 11

1.4.1. Phương pháp HPLC ................................................................ 11
1.4.2. Phương pháp HPLC/MS .......................................................... 13
1.5. Tình hình nghiên cứu trong nước ................................................... 13
1.6. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ................................................. 14
Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU……………………………………………………………..…………15


2.1. Nguyên liệu .................................................................................. 15
2.2. Thiết bị......................................................................................... 15
2.3.

Nội dung nghiên cứu .................................................................... 16

2.3.1. Tổng hợp và tinh chế ................................................................. 16
2.3.2. Xây dựng phương pháp HPLC để xác định hàm lượng của tạp A. 16
2.4.

Phương pháp nghiên cứu .............................................................. 17

2.4.1. Tổng hợp tinh chế và xác minh cấu trúc tạp A ............................ 17
2.4.1.1. Phương pháp tổng hợp tạp chất A......................................... 17
2.4.1.2 Phương pháp tinh chế sản phẩm thô...................................... 17
2.4.1.3. Kiểm tra độ tinh khiết .......................................................... 17
2.4.1.4. Xác định dạng đồng phân của sản phẩm................................ 17
2.4.1.5. Xác định cấu trúc các chất tổng hợp được ............................. 17
2.4.2. Xác định hàm lượng sản phẩm bằng phương pháp HPLC ............ 18
Chƣơng 3.THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN…………………19
3.1. Tổng hợp tạp chất A của clopidogrel ................................................ 19
3.1.1. Nguyên tắc phản ứng ................................................................. 19

3.1.2. Khảo sát lựa chọn các điều kiện tổng hợp ................................... 19
3.1.3. Quy trình tổng hợp IAC ............................................................. 20
3.2. Tinh chế IAC .................................................................................. 21
3.3. Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng TLC và nhiệt độ nóng chảy
............................................................................................................. 22
3.3.1. Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng TLC........................... 22
3.3.2. Xác định nhiệt độ nóng chảy ...................................................... 23
3.4. Xác định cấu trúc sản phẩm ............................................................. 23
3.4.1. Xác định dạng muối kết hợp....................................................... 23


3.4.2. Đo năng suất quay cực ............................................................... 24
3.4.3. Đo phổ IR của sản phẩm IAC..................................................... 24
3.4.4. Đo phổ khối của sản phẩm IAC .................................................. 25
3.4.5. Đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân của sản phẩm IAC…………..…...25
3.4.5.1. Kết quả phân tích phổ 1H-NMR............................................ 26
3.4.5.2. Kết quả phân tích phổ 13C-NMR........................................... 26
3.4.5.2. Kết quả phân tích phổ COSY ............................................... 27
3.4.5.4. Kết quả phân tích phổ HSQC ............................................... 28
3.5.

Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng của sản phẩm IAC bằng

phương pháp HPLC ............................................................................... 30
3.5.1. Xây dựng phương pháp.............................................................. 30
3.5.2. Thẩm định phương pháp xác định hàm lượng sản phẩm IAC ....... 31
3.5.2.1 Tính thích hợp của hệ thống sắc ký........................................ 31
3.5.2.2. Độ đặc hiệu ......................................................................... 32
3.5.2.3. Độ tuyến tính ....................................................................... 33
3.5.2.4. Độ chính xác ....................................................................... 34

3.5.2.5. Độ đúng .............................................................................. 35
3.5.3. Kết quả xác định hàm lượng sản phẩm IAC ................................ 36
3.6. Bàn luận ......................................................................................... 36
3.6.1. Tính mới và hiệu quả kinh tế ...................................................... 36
3.6.2. Về quy trình tổng hợp ................................................................ 36
3.6.3. Về quy trình tinh chế.................................................................. 37
3.6.4. Về việc xác minh cấu trúc của IAC tinh chế được ....................... 38
3.6.5. Về xác định hàm lượng IAC tinh chế được bằng HPLC............... 38
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……………………………………………………40
KẾT LUẬN........................................................................................... 40


KIẾN NGHỊ .......................................................................................... 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………...41


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
Clopidogrel bisulfat

: CLS

EtOH

: Ethanol

EP (European pharmacopoeia)

: Dược điển Châu Âu

EPRS (European pharmacopoeia reference standard) : Chất chuẩn đối chiếu

của dược điển Châu Âu
GC (Gas chromatography)

: Sắc ký khí

HPLC (High performance liquid chromatography)

: Sắc ký lỏng hiệu
năng cao

IR (Infranred)

: Hồng ngoại

IAC (Impurity A of clopidogrel)

: Tạp chất A của
clopidogrel

KP (Korean pharmacopoeia)

: Dược điển Hàn Quốc

KTCL

: Kiểm tra chất lượng

MS (Mas spectrum)

: Phổ khối

NMR (Nulear magnetic resonance)

: Cộng hưởng từ hạt
nhân

PA (Pure analysis)

: Tinh khiết phân tích

PTN

: Phòng thí nghiệm

RSD (Relative standard deviation)

: Độ lệch chuẩn tương
đối

TLC

: Sắc ký lớp mỏng

TLTK

: Tài liệu tham khảo

TƯ

: Trung ương

USP (United State pharmacopoeia)

: Dược điển Mỹ


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1. Kết quả giá trị Rf khảo sát thời gian phản ứng bằng TLC

20

Bảng 3.2. Hiệu suất của toàn bộ quá trình bán tổng hợp và tinh chế IAC

22

Bảng 3.3. Kết quả kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm IAC bằng TLC

23

Bảng 3.4. Kết quả đo NSQC của sản phẩm IAC

24

Bảng 3.5. Kết quả đánh giá tính thích hợp của hệ thống sắc ký

31

Bảng 3.6. Kết quả khảo sát tuyến tính

33

Bảng 3.7. Kết quả thẩm định độ chính xác của phương pháp

35

Bảng 3.8. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp

35


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của clopidogrel

3

Hình 1.2. Một số sản phẩm chứa clopidogrel trên thị trường

4

Hình 1.3. Một số sản phẩm phối hợp của clopidogrel với hoạt chất khác

4

Hình 1.4. Công thức cấu tạo tạp chất A của clopidogrel

6

Hình 2.1. Tạp chuẩn A của clopidogrel EPRS

15

Hình 3.1. Sơ đồ phản ứng tổng hợp tạp A của clopidogrel dự kiến

19

Hình 3.2. Kết quả khảo sát thời gian phản ứng bằng TLC

20

Hình 3.3. Sơ đồ phản ứng tổng hợp IAC

21

Hình 3.4. Sắc ký lớp mỏng sản phẩm IAC với 3 hệ dung môi

23

Hình 3.5. Phổ IR của sản phẩm IAC và mẫu chuẩn

25

Hình 3.6. Phổ khối của sản phẩm IAC

25

Hình 3.7. Cấu trúc của sản phẩm IAC xác định bằng các phương pháp phổ 26
Hình 3.8. Phổ 1H NMR của sản phẩm IAC

26

Hình 3.9. Phổ 13C NMR của sản phẩm IAC

27

Hình 3.10. Tương tác COSY

28

Hình 3.11. Phổ COSY của sản phẩm IAC

29

Hình 3.12. Phổ HSQC của sản phẩm IAC

30

Hình 3.13. Sắc ký đồ mẫu trắng

32

Hình 3.14. Sắc ký đồ mẫu chuẩn

32

Hình 3.15. Sắc ký đồ mẫu thử

33

Hình 3.16. Đồ thị biểu diễn sự phục thuộc giữa nồng độ và diện tích
pic IAC

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Theo thống kê của tổ chức Y tế thế giới, hàng năm trên thế giới có 17,5
triệu người tử vong do các bệnh lý tim mạch. Hơn 80% số người tử vong do
bệnh tim mạch xảy ra ở các nước có thu nhập thấp và trung bình trong đó có
Việt Nam.
Clopidogrel là thuốc được sử dụng rộng rãi trong điều trị bệnh tim mạch,
nó làm giảm đáng kể tỷ lệ tai biến do thiếu máu cục bộ so với aspirin. Được
biết đến với nhiều biệt dược như: Lodovat, Clopidogrel, Pidocar,
Plavix…trong đó có Plavix là thuốc được kê đơn phổ biến và bán chạy thứ hai
trên thế giới năm 2010.
Để đảm bảo chất lượng thuốc đến tay người sử dụng, cần tiến hành kiểm
tra các chỉ tiêu chất lượng của nguyên liệu, và thành phẩm, trong quá trình sản
xuất cũng như lưu thông phân phối và bảo quản. Theo tiêu chuẩn một số dược
điển cần phải kiểm tra chỉ tiêu các tạp chất liên quan của clopidogrel trong
nguyên liệu cũng như các thành phẩm có chứa clopidogrel. Trong quá trình
xác định chỉ tiêu này phải sử dụng các dung dịch tạp chuẩn A, B, C của
clopidogrel [20],[21]. Nhưng các tạp chuẩn này hiện chưa có mặt tại Việt
Nam, phải đặt mua ở nước ngoài với giá thành cao và thời gian đặt hàng khá
lâu.
Xuất phát từ nhu cầu thực tế chúng tôi tiến hành tổng hợp và tinh chế tạp A
của

clopidogel (acid

(+)-(S)-α-(2-chlorophenyl)-6,7-dihydrothieno[3,2-c]

pyridin-5(4H)-acetic), để tiến tới thiết lập tạp chuẩn góp phần chủ động trong
công tác kiểm tra chất lượng thuốc.
Đề tài “ Nghiên cứu tổng hợp và xây dựng phương pháp xác định hàm
lượng tạp A của clopidogrel” được thực hiện với 3 mục tiêu sau:
1. Nghiên cứu được phương pháp tổng hợp tạp chất A của clopidogrel.
2. Tinh chế tạp A đạt hàm lượng ≥ 95%.


2

3. Xây dựng phương pháp HPLC để xác định hàm lượng của tạp A.


3

Chƣơng 1. TỔNG QUAN
1.1. Clopidogrel
1.1.1. Một số thông tin chung về Clopidogrel
- Dạng dược dụng của clopidogrel là clopidogrel bisulfat.
- CTPT: C16H16 Cl NO2S. H2SO4
- Phân tử lượng: 419,9
- CTPT: hình 1.1

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của clopidogrel.
Tên khoa học: Methyl (+)-(S)-α-(2-chlorophenyl)-6,7-dihydrothieno[3,2-c]
pyridin-5(4H)-acetat sulfat [21],[22].
- Tính chất:
+ Bột kết tinh màu trắng, thực tế không tan trong nước ở pH trung tính,
nhưng dễ tan ở pH 1. Dễ tan trong methanol, tan ít trong methylen clorid,
thực tế không tan trong ethyl ether [11].

+ Có khả năng hấp thụ UV và IR.
1.1.2. Chỉ định
-

Nhồi máu cơ tim (từ vài ngày cho đến khi ít hơn 35 ngày), đột quỵ (từ 7

ngày cho đến khi ít hơn 6 tháng) hoặc bệnh lý động mạch ngoại biên đã thành
lập [2],[10],[16],[23].
- Kết hợp với aspirin để điều trị cho bệnh nhân bị hội chứng mạch vành cấp
tính mà không có đoạn ST chênh lên (đau thắt ngực không ổn định hoặc
không nhồi máu cơ tim không Q-sóng) [2],[10],[16],[23].


4

- Phòng ngừa các biến cố xơ vữa huyết khối và rung tâm nhĩ. Ở những bệnh
nhân bị chứng rung tâm nhĩ có ít nhất một yếu tố nguy cơ biến cố mạch máu,
không phù hợp cho việc điều trị bằng thuốc kháng vitamin K và những người
có nguy cơ chảy máu thấp [2],[10],[16],[23].
1.1.3. Các dạng bào chế của clopidogrel trên thị trƣờng
Hiện nay trên thị trường Việt Nam lưu hành 188 biệt dược có chứa hoạt
chất clopidogrel. Clopidogrel được bào chế đơn thành phần hoặc kết hợp với
các hoạt chất khác như aspirin để làm tăng tác dụng [13],[17].
Các sản phẩm chứa clopidogrel được sản xuất và phân phối bởi các công ty
trong nước và nước ngoài như: công ty cổ phần dược phẩm GLOMED, công
ty cổ phần Dược phẩm Hà Tây, công ty NAVANA PHARMACEUTICALS
LTD….

Hình 1.2. Một số sản phẩm chứa clopidogrel trên thị trường

Hình 1.3. Một số sản phẩm phối hợp của clopidogrel với hoạt chất khác.


5

1.1.4. Các tạp chất của clopidogrel
1.1.4.1. Các tạp chất của clopidogrel
- Tạp chất A: Acid (+)-(S)-α-(2-chlorophenyl)-6,7-dihydrothieno[3,2-c]
pyridin-5(4H)-acetic [21],[22].
- Tạp chất B: Methyl (±)-α-(2-chlorophenyl)-6,7-dihydrothieno[3,2-c]
pyridin-6(7H)-acetat, hydroclorid [21],[22].
- Tạp chất C: Methyl (-)-(R)-α-(2-chlorophenyl)-6,7-dihydrothieno[3,2-c]
pyridin-5(4H)-acetat, hydrogen sulfat [21],[22].
1.1.4.2.

Phƣơng pháp xác định tạp chất liên quan của clopidogrel

theo một số dƣợc điển.
- Xác định bằng phương pháp HPLC với các điều kiện sắc ký [21],[22].
+ Sử dụng cột L57 theo USP (150 mm x 4,6 mm; 5 μl)
+ Pha động là hỗn hợp gồm đệm phosphat : acetonitril tỷ lệ 75:25
+ Tốc độ dòng 1,0 ml/phút
+ Detector: 220 nm
- Dung dịch chuẩn: Hòa tan chất chuẩn clopidogrel bisulfat và các tạp chuẩn
A, B, C của clopidogrel trong methanol để được dung dịch có nồng độ lần
lượt là 20 µg/ml, 40 µg/ml, 120 µg/ml, 200 µg/ml. Sau đó pha loãng với pha
động để được dung dịch có nồng độ tương ứng là 0,5 µg/ml; 1 µg/ml; 3µg/ml;
5 µg/ml.
- Dung dịch thử: Hòa tan 100 mg nguyên liệu clopidogrel bisulfat trong 5 ml
methanol rồi thêm pha động vừa đủ 200 ml.

- Đánh giá kết quả: Tạp A không quá 0,2 %
Tạp B không quá 0,3 %
Tạp C không quá 1,0%
Các tạp khác không quá 0,1 %


6

Tổng tạp không quá 1,5 %
1.2. Tạp chất A của clopidogrel
- CTPT: C15H14ClNO2S.HCl
- Phân tử lượng: 344,4
- CTCT: hình 1.4
HO

O

Cl

N

. HCl

S

Hình 1.4. Công thức cấu tạo tạp chất A của clopidogrel.
- Tên khoa học: Acid

(+)-(S)-α-(2-chlorophenyl)-6,7-dihydrothieno[3,2-c]

pyridine-5(4H)-acetic hydroclorid.
- Tính chất: Bột màu vàng nhạt. Tan tốt trong nước, methanol, và acetonitril
[7]
- Tạp chất A của clopidogrel là sản phẩm thủy phân của clopidogrel trong
môi trường kiềm hoặc là sản phẩm chuyển hóa của clopidogrel khi vào cơ thể
dưới dạng tác dụng của enzym (esterase) [9],[11],[17],[18],[20].
- Độc tính của tạp chất A của clopidogrel: Gây độc trên tế bào người đặc biệt
là tế bào tủy xương [21].
1.3. Tổng quan về một số phƣơng pháp sử dụng trong nghiên cứu đề tài
1.3.1. Phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)
- Sắc ký lớp mỏng là một phương pháp sắc ký dùng chất hấp thụ làm pha tĩnh
trải thành lớp mỏng trên tấm kính, nhựa hay kim loại. Quá trình tách các hợp
chất xảy ra khi cho pha động là dung môi di chuyển qua pha tĩnh [1].
- Ứng dụng [1]:
+ Định tính và thử tinh khiết: xác định nhờ chỉ số Rf. Tuy nhiên vì có quá
nhiều yếu tố ảnh hưởng đến Rf của một chất nên trong thực tế người ta thường


7

xác định các chất bằng cách sắc ký so sánh chất thử với chất chuẩn trên cùng
một sắc ký đồ. Nếu vết chất thử ngang với vết chất chuẩn (Rf của thử bằng
Rf của chuẩn) trên các sắc ký đồ với các hệ dung môi khác nhau thì có thể
xác định chắc chắn chất thử là chất chuẩn. Chất thử được coi là tinh khiết khi
trên sắc ký đồ không có vết lạ.
+ Bán định lượng và định lượng: có hai cách
Tách chiết chất phân tích trong vết sắc ký bằng dung môi thích hợp. Sau
khi làm sạch dịch chiết, định lượng các chất bằng một kĩ thuật thích hợp (phổ
hấp thụ, huỳnh quang…).
Định lượng trực tiếp trên bản mỏng: đo diện tích hay cường độ màu của

vết sắc ký.
1.3.2. Phƣơng pháp đo năng suất quay cực
- Chất làm quay mặt phẳng phân cực theo chiều kim đồng hồ được gọi là chất
hữu tuyền, kí hiệu là (+). Chất làm quay mặt phẳng phân cực ngược chiều kim
đồng hồ được gọi là chất hữu tuyền, kí hiệu là (-). Nếu không có hướng dẫn
riêng, góc quay cực α được xác định ở nhiệt độ 20oC và với chùm tia đơn sắc
có bước sóng ứng với vạch D (589,3) của đèn natri qua lớp chất lỏng hay
dung dịch có bề dày 1 dm [1],[3].
- Ứng dụng:
+ Định tính: Với một chất ở điều kiện đo nhất định (về nhiệt độ và bước
sóng) thì [α] của nó là một hằng số. Vì thế việc xác định [α] giúp nhận biết
được chất đó cũng như mức độ tinh khiết của nó.
+ Định lượng: dựa vào định luật Bio, khi đã biết chiều d của ống đo và năng
xuất quay cực [α], đo góc quay cực φ của dung dịch. Từ đó sẽ xác định được
nồng độ của dung dịch.
+ Ngoài ra trong hóa học hữu cơ, việc nghiên cứu góc quay cực của một chất


8

giúp cho việc xác định đồng phân quang học. Điều này có ý nghĩa trong
nghiên cứu hóa học lập thể.
1.3.3. Phƣơng pháp đo phổ hồng ngoại (IR)
- Phổ hồng ngoại là phương pháp đo sự hấp thụ bức xạ hồng ngoại (IR) khi
nó đi qua một lớp chất cần thử ở các số sóng khác nhau. Xác định sự có mặt
của các nhóm chức trong phân tử dựa vào phổ IR để định tính các chất. Trong
kiểm nghiệm thuốc hầu hết các dược điển chủ yếu sử dụng IR vào việc định
tính, ít được dùng trong định lượng [1],[3],[5].
- Ứng dụng phổ hồng ngoại trong định tính [1],[5].
+ Định tính sử dụng chất chuẩn:

Chuẩn bị mẫu chuẩn so sánh và mẫu thử rồi đo phổ chúng từ 4000 đến 670
cm-1 trong cùng điều kiện. Cực đại hấp thụ ở phổ của mẫu thử phải tương ứng
với phổ của chất chuẩn về vị trí và trị số.
+ Định tính dùng phổ chuẩn trong atlas hoặc thư viện phổ.
1.3.4. Phƣơng pháp phân tích khối phổ (MS)
-

Nguyên tắc của phương pháp phổ khối là dùng chùm điện tử có năng

lượng trung bình để bắn phá phân tử hữu cơ ở chân không cao. Trong quá
trình đó chất hữu cơ bị ion hóa và vỡ ra thành từng mảnh. Ngoài ion phân tử,
phổ MS còn có các pic ion mảnh khác, dựa vào đó người ta có thể xác định
được cơ chế phân mảnh và xác định lại cấu trúc hóa học các hợp chất. Tín
hiệu tương ứng với các ion sẽ được thể hiện bằng một số vạch có cường độ
khác nhau tập trung thành một khối phổ đồ hoặc phổ khối [5].
- Ứng dụng [5].
+ Xác định đồng vị: các nguyên tử đồng vị của một nguyên tố có cùng số
điện tích hạt nhân chỉ khác nhau số neutron nên khối lượng nguyên tử khác
nhau. Có thể dùng MS để xác định thành phần đồng vị của các nguyên tố trong


9

mẫu.
+ Định tính: phân tích khối phổ có thể cho rất chính xác khối lượng các phân
tử M+, (M+1)+, (M+2)+. Bên cạnh đó xem xét thêm các pic đồng vị, tỷ số
cường độ của chúng cùng với khối lượng của vài mảnh ion có thể xác định
được công thức của chất phân tích. Trong ngành dược thường sử dụng GCMS, LC-MS so sánh với thư viện phổ hoặc phổ chất đối chiếu để định tính
mẫu.
+ Xác định công thức cấu tạo: dùng kĩ thuật ion hóa thích hợp phân tích chất

nghiên cứu thành nhiều mảnh ion để làm rõ cấu tạo ghép nối của chúng. Việc
biện giải phổ nên kết hợp với phổ NMR và IR.
+ Định lượng: thường dùng kết nối LC-MS hoặc GC-MS để làm tăng tính
chọn lọc, giới hạn định lượng cho phương pháp phân tích. Điểm nổi bật của
phân tích khối phổ là tính chọn lọc và độ nhạy. Nên kĩ thuật này thường dùng
để phân tích hàm lượng vết trong mẫu phức tạp.
1.3.5. Phƣơng pháp đo phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR)
- Đây là phương pháp phổ hiện đại và được dùng nhiều trong xác định cấu
trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ nói chung. Với việc sử dụng kết hợp các
kỹ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều có thể xác định chính xác cấu trúc
của hợp chất kể cả cấu trúc lập thể của phân tử. Nguyên lý chung của phương
pháp phổ NMR là sự cộng hưởng của các tần số khác nhau của các hạt nhân
từ (1H,

13

C) dưới tác dụng của từ trường. Các tần số cộng hưởng khác nhau

được biểu diễn bằng độ dịch chuyển hóa học. Ngoài ra đặc trưng của phân tử
còn được xác định dựa vào các tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau
[5].
- Các đại lượng đặc trưng
+ Độ dịch chuyển hóa học δ: là vị trí khác nhau giữa vị trí hấp thụ của hạt
nhân hydro trên phổ NMR của mẫu phân tích và của chất chuẩn.


10

+ Sự tương tác spin-spin: tương tác từ của các nhóm proton khác nhau cho
biết:

Số lượng H ở nguyên tử C bên cạnh.
Mối tương quan của các nguyên tử H với nhau.
- Ứng dụng [5]
+ Phổ proton (1H-NMR): Xác định sự có mặt của các nhóm có proton, bộ
khung của hợp chất, số lượng proton ở C láng giềng, số lượng tương đối của
proton cho tín hiệu cộng hưởng, phân biệt các dạng đồng phân, tính đồng nhất
và sự có mặt của tạp chất.
+ Phổ carbon, (13C-NMR): cho tín hiệu của vạch phổ carbon, mỗi nguyên
tử carbon sẽ cộng hưởng ở một trường khác nhau và cho một tín hiệu phổ
khác nhau.
+ Phổ cộng hưởng từ 2 chiều (2D-NMR):
- Phổ COSY: biểu diễn tương tác H-H chủ yếu của các proton đính với
carbon liền kề nhau. Phổ này nối ghép các phần của phân tử lại với nhau.
- Phổ HSQC: tương tác trực tiếp C-H được xác định nhờ vào các pic giao
nhau trên phổ HSQC. Trên phổ này, một trục là phổ 1H-NMR còn trục kia là
13

C-NMR

1.3.6. Phƣơng pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)
- Nguyên tắc: HPLC là một kĩ thuật tách trong đó các chất phân tích di
chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh dưới tác động của pha lỏng. Quá trình
sắc kí dựa trên cơ sở hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hoặc phân loại theo kích
cỡ. Tùy theo bản chất của chất phân tích mà sử dụng detector thích hợp. Hiện
nay có nhiều loại detector như: UV-VIS, huỳnh quang, tán xạ bay hơi, độ dẫn,
MS,…. nhưng sử dụng nhiều nhất vẫn là detector UV-VIS [1],[3].
- Ứng dụng
+ Định tính:

11

Dựa vào sự giống nhau của thời gian lưu của chất phân tích trên sắc kí đồ
dung dịch chuẩn và dung dịch thử.
Trên các máy detector hiện đại với DAD (diod array detector) ta có thể vẽ
phổ UV-VIS của pic chuẩn và pic thử rồi chồng 2 phổ lên nhau và đánh giá
tương đồng thông qua hệ số Match.
+ Định lượng: so sánh độ lớn tín hiệu thu được từ pic chuẩn và pic thử (diện
tích pic và chiều cao pic) trong cùng điều kiện sắc ký xác định là cơ sở cho
phép định lượng.
+ Xác định tạp liên quan: tính % tạp dựa vào tạp chuẩn, hoặc đối với phép thử
tạp chất liên quan khi không biết tên tạp chất hoặc không có tạp chuẩn thì có
thể tính % tạp chất dựa vào % diện tích pic của tạp đó so với tổng diện tích
các pic (gồm các pic tạp và pic chính).
1.4. Một số phƣơng pháp HPLC xác định tạp A của clopidogrel
1.4.1. Phƣơng pháp HPLC
 Phương pháp 1
Phương pháp HPLC để xác định chỉ tiêu “tạp chất liên quan” trong nguyên
liệu clopidogrel bisulfat theo USP 37 và KP X đã trình bày ở phần “1.1.4.2.
Phương pháp xác định tạp chất liên quan của clopidogrel theo một số dược
điển” [21],[22].
 Phương pháp 2 [13]
- Sử dụng cột C18 (250 mm x 4,6 mm; 5 µm)
- Pha động gồm: là hỗn hợp dinatri hydrophosphat dihydrat 0,1 M được điều
chỉnh đến pH 2,2 ± 0,2 bằng dung dịch axit photphoric và acetonitril tỷ lệ
50:50 v/v.
- Tốc độ dòng của pha động 1,0 ml/phút .
- Thể tích tiêm mẫu 20 µl.

12

- Detector: 250 nm
 Phương pháp 3 [20]
- Sử dụng cột C18 (300 mm x 3,9 mm; 10µ)
- Pha động là hỗn hợp dung dịch Na2HPO4 0,01M đã được điều chỉnh đến
pH = 4 và acetonitril tỷ lệ 80:20.
- Tốc độ dòng 0,5 ml/phút
- Detector: 235 nm
 Phương pháp 4 [12]
- Sử dụng cột C8 (250 mm × 4,6 mm; 5 μm)
- Pha động là hỗn hợp acetonitril và dung dịch đệm KH2PO4 0.01M ( pH
2,75 ) và được chạy chương trình gradient dung môi.
- Tốc độ dòng: 1 ml/phút
- Detector: 235 nm
- Thể tích tiêm: 4 μl
 Phương pháp 5 [13]
- Sử dụng cột C18 (150 mm x 4,6 mm; 3 μm)
- Pha động gồm: kênh A là hỗn hợp methanol và dung dịch natri octan
sulfonat tỷ lệ 5:95 điều chỉnh đến pH 2,5 bằng dung dịch H3PO4 loãng; kênh
B là hỗn hợp methanol và acetonitril tỷ lệ 5:95
- Được chạy chương trình gradient dung môi với tốc độ dòng 1,0 ml/phút
- Nhiệt độ cột 35oC
- Detector: 220 nm
 Phương pháp 6 [11].
- Sử dụng cột Chiralcel OJ-H (250 mm x 4,6 mm, 5 μm)
- Pha động gồm n-Hexan: ethanol: diethylamin tỷ lệ 95:5:0,05
- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút
- Nhiệt độ cột được duy trì ở 25°C

13

- Detector: 240 nm
- Thể tích tiêm là 10 µl
1.4.2. Phƣơng pháp HPLC/MS
 Phương pháp 1 [8]
- Sử dụng cột nhồi carbon graphit (10 cm x 2,1 mm; 2,7 µm)
- Pha động gồm: Dung dịch methanol trong nước nồng độ 70% có thêm 0,1%
trifluoroacetic với tốc độ dòng 0,25 ml/phút.
- Sử dụng máy đo phổ khối để xác định các chất cần phân tích.
 Phương pháp 2 [17]
- Sử dụng cột C8 (10 cm x 2,1 mm; 2,7 µm)
- Pha động gồm kênh A là hỗn hợp methanol: nước tỷ lệ 55:45 có thêm 0,1%
acid formic; kênh B là methanol có thêm 0,1% acid formic và được chạy
chương trình gradient dung môi với tốc độ dòng 0,35 ml/phút.
- Sử dụng máy đo phổ khối bẫy ion để xác định các chất phân tích.
 Phương pháp 3 [16]
- Sử dụng cột C18 (10 cm x 2,1 mm; 3,5 µm)
- Pha động: kênh A là nước có thêm 0,1% acid formic; kênh B là acetonitril
có thêm 0,1% acid formic và được chạy chương trình gradient dung môi với
tốc độ dòng 0,35 ml/phút.
- Sử dụng máy đo phổ khối để xác định các chất phân tích.
1.5. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc
Hiện tại ở Việt Nam chưa có nghiên cứu về tổng hợp và tinh chế các tạp
chất của clopidogrel để sử dụng làm nguyên liệu thiết lập các tạp chuẩn dùng
trong công tác kiểm tra chất lượng clopidogrel. Mới chỉ có đề tài “Nghiên cứu
quy trình công nghệ tổng hợp Clopidogrel bisulfat làm thuốc điều trị các bệnh
tim mạch” của TS.Nguyễn Văn Tài, Viện Dược liệu [6]. Trên thực tế trong đề

14

tài này để kiểm tra chất lượng sản phẩm clopidogrel bisufat tổng hợp được tác
giả phải sử dụng các tạp chuẩn được đặt mua ở nước ngoài.
1.6. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Trên thị trường đã có tạp chuẩn A do USP và EP sản xuất được bán với giá
thành khá cao, tuy nhiên thời gian đặt mua lâu. Hiện chưa có công bố nào về
quy trình tổng hợp và thiết lập các tạp chuẩn của clopidogrel.
Một số phương pháp xác định tạp chất A trong các tài liệu tham khảo mà
chúng tôi tham khảo được là các phương pháp HPLC, HPLC-MS. Trong các
phương pháp tác giả có chuẩn bị mẫu thử có chứa tạp A bằng các phản ứng
thủy phân, nhưng đó mới là cách chuẩn bị các dung dịch thử để phân tích chứ
chưa phải là một quy trình tổng hợp và tinh chế tạp chất A.


15

Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu
- Clopidogrel bisulfat do Viện Dược liệu sản xuất, lô B 21, hàm lượng 98,0%
- Chất đối chiếu: Chất chuẩn Clopidogrel impurity A (Chất chuẩn dược điển
châu âu EPRS, lô 2, code Y0001335)

Hình 2.1: Tạp chuẩn A của clopidogrel EPRS
- Hóa chất, dung môi:
+ Ethanol PA

+ Ethyl acetat PA

+ Natri hydroxyd P

+ Aceton PA

+ Lithi hydroxyd PA

+ Acid acetic băng PA

+ Acid hydrocloric PA

+ Natri dihydro phosphat PA

+ Acetonitril dùng cho HPLC

+ Methanol dùng trong HPLC

+ Diclomethan PA

+ AgNO3 PA

+ Propanol PA

+ Acid nitric PA

+ n-Hexan PA

+ Nước cất

+ Ether dầu hỏa PA

2.2. Thiết bị
- Bản mỏng silicagel GF 254 (Merck).