Nghiên cứu xác định hàm lượng silymarin trong một số loại thực phẩm chức năng bằng HPLC

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN KHÁNH LINH
MÃ SINH VIÊN: 1101299

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH
HÀM LƯỢNG SILYMARIN TRONG
MỘT SỐ LOẠI THỰC PHẨM CHỨC
NĂNG BẰNG HPLC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2016


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN KHÁNH LINH
MÃ SINH VIÊN: 1101299

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH
HÀM LƯỢNG SILYMARIN TRONG
MỘT SỐ LOẠI THỰC PHẨM CHỨC
NĂNG BẰNG HPLC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. TS. Lê Đình Chi
2. ThS. Cao Công Khánh
Nơi thực hiện:
Viện Kiểm Nghiệm An Toàn

Vệ Sinh Thực Phẩm Quốc Gia
HÀ NỘI – 2016


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Lê Đình
Chi và ThS. Cao Công Khánh là những người thầy đã dìu dắt tôi từ những ngày
đầu làm nghiên cứu khoa học và cũng là những người trực tiếp hướng dẫn, tận tình
chỉ bảo, giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này.
Xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo, các anh chị trong Viện Kiểm Nghiệm An
Toàn Vệ Sinh Thực Phẩm Quốc Gia, 65 Phạm Thận Duật - Hà Nội đã quan tâm,
giúp đỡ tôi trong thời gian vừa qua.
Tôi cũng xin cảm ơn Ban giám hiệu, các phòng ban, các thầy cô giáo và cán bộ
nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội – những người đã dạy bảo và giúp đỡ tôi
trong suốt 5 năm học tập tại trường.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, anh chị em
đã dành cho tôi sự giúp đỡ và động viên quý báu trong suốt thời gian qua.
Hà Nội, ngày 09 tháng 05 năm 2016
Sinh viên

Nguyễn Khánh Linh


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC HÌNH
DANH MỤC CÁC BẢNG
ĐẶT VẤN ĐỀ.............................................................................................................1
1. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ..................................................................................2
1.1. Tổng quan về silymarin ........................................................................................2

1.1.1. Cấu trúc : ..........................................................................................................3
1.1.2. Tính chất lý hóa ................................................................................................4
1.1.3. Tính chất dược động học, tác dụng dược lý .....................................................5
1.2. Tổng quan về HPLC ............................................................................................9
1.2.1. Khái niệm chung ..............................................................................................9
1.2.2. Nguyên tắc của quá trình sắc ký ......................................................................9
1.2.3. Các thông số đặc trưng trong HPLC [1], [2] ..................................................10
1.2.4. Thiết bị HPLC: ...............................................................................................13
1.2.5. Ứng dụng phương pháp HPLC ......................................................................16
1.3. Một số phương pháp phân tích silymarin ...........................................................17
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...........................24
2.1. Đối tượng nghiên cứu .........................................................................................24
2.2. Nguyên vật liệu - thiết bị ....................................................................................25
2.2.1. Nguyên vật liệu ..............................................................................................25
2.2.2. Thiết bị ...........................................................................................................25
2.2.3. Nội dung nghiên cứu ......................................................................................25
2.3. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................26


2.3.1. Khảo sát các điều kiện phân tích silymarin bằng HPLC................................26
2.3.2. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu .........................................................................27
2.3.3. Thẩm định quy trình .......................................................................................27
2.4. Phương pháp xử lý số liệu ..................................................................................30
3. CHƯƠNG 3 : THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ...........................31
3.1. Thực nghiệm và kết quả .....................................................................................31
3.1.1. Thiết lập điều kiện sắc ký để phân tích silymarin ..........................................31
3.1.2. Xây dựng quy trình xử lý mẫu .......................................................................35
3.1.3. Thẩm định phương pháp: ...............................................................................40
3.1.4. Kết quả áp dụng phương pháp xác định silymarin trong một số sản phẩm ...56
3.2. Bàn luận ..............................................................................................................60

4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................61
4.1. Kết luận...............................................................................................................61
4.2. Kiến nghị ............................................................................................................62


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

ACN

Acetonitril

AOAC

Hiệp hội các nhà hóa phân tích hóa học (Association of Official
Analytical Chemists)

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid
Chromatography)

HPCE

Điện di mao quản hiệu năng cao (High Performance Capillary
Electrophoresis )

KN

Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm

ATVSTP
LC- MS

Sắc ký lỏng khối phổi (Liquid Chromatography tandem Mass
Spectrometry )

LOD

Giới hạn phát hiên (Limit of Detection)

LOQ

Giới hạn định lượng (Limit of Quantification)

PDA

Photo Diod Arrays

PT

Phương trình

R

Hệ số hồi quy tuyến tính

RSD (%)

Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)

SD

Độ lệch chuẩn (Standard deviation)

TB

Trung bình

TLC

Sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography)

UV

Tử ngoại (Ultraviolet)

UPLC

Sắc ký lỏng siêu hiệu năng (Ultra performance liquid
chromatography)


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của Silymarin [16], [17], [18] .......................................4
Hình 1.2. Quá trình rửa giải và tách peak của chất A và chất B ...............................10
Hình 1.3. Sơ đồ nguyên lý của máy HPLC ...............................................................13
Hình 3.1. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp với chương trình 1 ..........................32
Hình 3.2. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp với chương trình 2 ..........................33
Hình 3.3. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp với chương trình 3 ..........................34
Hình 3.4. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp với chương trình 4 ..........................35

Hình 3.5. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp ........................................................36
Hình 3.6. Sắc ký đồ dung dịch mẫu nang cứng chiết bằng methanol. ......................36
Hình 3.7. Sắc ký đồ dung dịch mẫu nang mềm chiết bằng methanol. ......................38
Hình 3.8. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp silymarin

..................41

Hình 3.9. Sắc ký đồ mẫu trắng ..................................................................................41
Hình 3.10. Sắc ký đồ mẫu trắng thêm chuẩn hỗn hợp ..............................................42
Hình 3.11. Đường chuẩn của Silybin A ....................................................................44
Hình 3.12. Đường chuẩn của Silybin B ....................................................................45
Hình 3.13. Đường chuẩn của isosilybin A ................................................................46
Hình 3.14. Sắc ký đồ dung dịch mẫu NC01..............................................................58
Hình 3.15. Sắc ký đồ dung dịch mẫu NC03..............................................................58
Hình 3.16. Sắc ký đồ dung dịch mẫu nang NM01 ....................................................59
Hình 3.17. Sắc ký đồ dung dịch mẫu NM02 .............................................................59


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Tính chất vật lý của một số silymarin chính [8] .........................................5
Bảng 1.2. Phân lọai sắc ký ........................................................................................15
Bảng 1.3. Một số phương pháp phân tích Silymarin ................................................17
Bảng 2.1. Danh mục các mẫu phân tích ....................................................................24
Bảng 3.1. Chương trình gradient dung môi 1 ...........................................................31
Bảng 3.2. Chương trình gradient dung môi 2 ...........................................................32
Bảng 3.3. Chương trình gradient dung môi 3 ...........................................................33
Bảng 3.4. Chương trình gradient dung môi 4 ...........................................................34
Bảng 3.5. Kết quả định lượng silybin A trong viên nang cứng theo dung môi .......36
Bảng 3.6. Kết quả định lượng silybin B trong viên nang cứng theo dung môi .......37
Bảng 3.7. Kết quả định lượng isosilybin A trong viên nang cứng theo dung môi ..37

Bảng 3.8. Kết quả định lượng Silymarin tổng trong viên nang cứng theo dung môi
...................................................................................................................................37
Bảng 3.9. Kết quả định lượng silybin A trong viên nang mềm theo dung môi ........39
Bảng 3.10. Kết quả định lượng silybin B trong viên nang mềm theo dung môi ......39
Bảng 3.11. Kết quả định lượng isosilybin A trong viên nang mềm theo dung môi .39
Bảng 3.12. Kết quả định lượng silymarin tổng trong viên nang mềm theo dung môi
...................................................................................................................................40
Bảng 3.13. Kết quả đánh giá độ thích hợp hệ thống .................................................42
Bảng 3.14. Kết quả đánh giá độ tuyến tính của Silybin A ........................................43
Bảng 3.15. Kết quả đánh giá độ tuyến tính của Silybin B ........................................44
Bảng 3.16. Kết quả đánh giá độ tuyến tính của isosilybin A ....................................46
Bảng 3.17. Giới hạn phát hiện Silybin A ..................................................................47
Bảng 3.18. Giới hạn phát hiện Silybin B ..................................................................48
Bảng 3.19. Giới hạn phát hiện Isosilybin A ..............................................................48
Bảng 3.20. Độ lặp lại của phương pháp với viên nang cứng tính theo Silybin A ....50
Bảng 3.21. Độ lặp lại của phương pháp với viên nang cứng tính theo Silybin B ....50
Bảng 3.22. Độ lặp lại của phương pháp với viên nang cứng tính theo Isosilybin A 51


Bảng 3.23. Độ lặp lại của phương pháp với viên nang mềm tính theo Silybin A ....51
Bảng 3.24. Độ lặp lại của phương pháp với viên nang mềm tính theo Silybin B ....52
Bảng 3.25. Độ lặp lại của phương pháp với viên nang mềm tính theo Isosilybin A 52
Bảng 3.26. Độ thu hồi Silybin A của phương pháp với viên nang cứng ..................53
Bảng 3.27. Độ thu hồi Silybin A của phương pháp với viên nang mểm ..................54
Bảng 3.28. Độ thu hồi Silybin B của phương pháp với viên nang cứng ..................54
Bảng 3.29. Độ thu hồi Silybin B của phương pháp với viên nang mềm ..................55
Bảng 3.30. Độ thu hồi Isosilybin A của phương pháp với viên nang cứng ..............55
Bảng 3.31. Độ thu hồi Isosilybin A của phương pháp với viên nang mềm ..............56
Bảng 3.32. Kết quả phân tích mẫu thực ....................................................................57
Bảng 4.1. Gradient pha động.....................................................................................61

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Xã hội hiện đại giúp chất lượng cuộc sống được nâng cao đáng kể, từ đó con
người càng chú trọng đến vấn đề sức khỏe. Bên cạnh việc ăn uống hợp lý, thể dục
điều độ thì bổ sung dinh dưỡng từ các loại thực phẩm chức năng đang được quan
tâm. Thế nhưng, bản chất của thực phẩm chức năng đang bị hiểu chưa đúng dẫn đến
những tranh cãi trong cộng đồng người tiêu dùng. Thực phẩm chức năng là thực
phẩm có lợi cho một hay nhiều hoạt động của cơ thể như cải thiện tình trạng sức
khoẻ và làm giảm nguy cơ mắc bệnh hơn là so với giá trị dinh dưỡng mà nó mang
lại [39]. Bộ Y tế Việt Nam định nghĩa thực phẩm chức năng: là thực phẩm dùng để
hỗ trợ chức năng của các bộ phận trong cơ thể người, có tác dụng dinh dưỡng, tạo
cho cơ thể tình trạng thoải mái, tăng sức đề kháng và giảm bớt nguy cơ gây bệnh.
Tuỳ theo công thức, hàm lượng vi chất và hướng dẫn sử dụng, thực phẩm chức
năng còn có các tên gọi sau: thực phẩm bổ sung vi chất dinh dưỡng, thực phẩm bổ
sung, thực phẩm bảo vệ sức khoẻ, sản phẩm dinh dưỡng y học.[3]
Theo các nghiên cứu thì Silymarin có các hoạt tính rất tốt như: giúp ổn định
màng tế bào gan [41], là chất chống oxy hóa, chống peroxyd hóa lipid, tăng khả
năng oxi hóa acid béo của gan, làm ổn định các tế bào gây viêm, ức chế phản ứng
viêm [5], [20], [41], giảm các nồng độ enzym gan, làm cải thiện các triệu chứng của
bệnh gan như gan nhiễm mỡ, viêm gan…[26]. Chính vì thế mà các thực phẩm chức
năng chứa Silymarin được sản xuất ngày càng nhiều và đối tượng sử dụng ngày
càng đông đảo. Do đó để bảo vệ quyền lợi người tiêu dùng cũng như hỗ trợ các cơ
quan chức năng trong việc kiểm soát tốt vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm, nhất là
đối với thực phẩm chức năng, chúng tôi tiến hành “ Nghiên cứu xác định hàm lượng
Silymarin trong một số loại thực phẩm chức năng bằng HPLC” với các mục tiêu:
- Xây dựng quy trình xác định hàm lượng Silymarin trong thực phẩm chức năng
- Ứng dụng quy trình đã xây dựng để phân tích một số sản phẩm thực phẩm chức

năng đang lưu hành trên thị trường.


2

1. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về silymarin
Silymarin là một hỗn hợp của các chất flavonoid polyphenolic được phân lập từ
cây cây kế sữa, Silybum marianum, họ Cúc [36]. Silybum marianum còn được gọi
là kế sữa, kế thánh, kế đức mẹ, cúc gai, là một loại thảo dược hàng năm, có nguồn
gốc Địa Trung Hải và Bắc châu Phi [9], [30], [36]. Cây phát triển chủ yếu ở châu
Âu, châu Phi, Nam Mỹ, Trung và Đông Á. Đây là một cây thuốc có giá trị cao, để
điều trị các bệnh về gan thận. Cây kế sữa đã được du nhập vào trồng ở Việt Nam từ
lâu, hiện nay đang phát triển tốt tại các vùng cao có đất tốt và khí hậu mát mẻ như:
Tam Đảo, Sa Pa,...; lượng dược liệu này nhu cầu ngày càng gia tăng. Cây kế sữa có
thể được trồng bằng cách gieo hạt trực tiếp xuống đất. Môi trường sinh trưởng của
cây kế sữa là ở những vùng khô ráo, nhiều ánh nắng mặt trời. Cây kế sữa trưởng
thành cao từ 1,2m đến 3m; lá lớn có chấm hoặc gân màu trắng, bông màu đỏ tím,
trái nhỏ, có vỏ cứng màu nâu bóng với nhiều chấm. Toàn thân cây và lá đều có
những gai nhỏ li ti đâm vào da rất nhức nên người ta phải mang bao tay dầy khi thu
hoạch. Hoa cây kế sữa nở từ tháng 6 đến tháng 8, các hạt màu đen được thu hoạch
vào cuối mùa hè để sử dụng cho các mục đích y học. Trà làm từ cây kế sữa đã được
sử dụng cho việc điều trị các bệnh về gan trong thời cổ đại. Từ thời Hy Lạp cổ đại
và La Mã, hạt giống của cây kế sữa đã được sử dụng để bảo vệ gan. Nó đã trở thành
một loại thuốc được chuyên dùng để điều trị các bệnh gan mật vào thế kỷ 16 và vào
năm 1960 ở trung tâm châu Âu. Quả kế sữa chứa khoảng 1,5-3% của một hỗn hợp
đồng phân flavonolignans được gọi chung là silymarin [25]. Silymarin tích tụ chủ
yếu ở mặt bên ngoài của các loại trái cây của S. marianum. Có rất nhiều nghiên cứu
đánh giá hiệu quả của sylimarin / silybinin để điều trị một loạt các bệnh về gan, túi

mật và rối loạn đường ruột. Tác dụng của silymarin rộng rãi và phổ biến nhất là các
hoạt động bảo vệ gan chống lại bệnh viêm gan cấp tính và mãn tính, xơ gan và độc
tố gây ra bệnh viêm gan [5], [6], [13]. Silymarin đã được báo cáo để bảo vệ tế bào
gan khi tiếp xúc một số loại độc tố, bao gồm acetaminophen, ethanol, asen,


3

tetraclorua carbon, khi bị tổn thương thiếu máu cục bộ, bức xạ, ngộ độc sắt và viêm
gan siêu vi.[22]
1.1.1. Cấu trúc :
Silymarin lần đầu tiên được phân lập bởi Wagner và cộng sự [39]. Các thành
phần chính của silymarin là silybinin (Silybin A và silybin B), isosilybinin
(isosilybin A và isosilybin B), silydianin, silychristin and taxifolin [16], [17],[18].
Trong số các đồng phân, Silybinin là thành phần chính và chiếm khoảng 70-80%,
tiếp theo là silychristin (20%), silydianin (10%) và isosilybin (0,5%) [33]. Đặc điểm
chung của các hợp chất này là công thức chung C25H22O10 ( khối lượng mol 482).
Về cơ bản, cấu trúc flavonolignan gồm các dihydroflavanol taxifolin liên kết với
coniferyl alcohol qua một vòng epoxid. Nhóm epoxid chịu trách nhiệm cho các hoạt
động sinh học của silymarin, mở vòng mất hoạt tính. Chỉ silybin và isosilybin chứa
các nhóm 1,4-dioxane trong cấu trúc của chúng. Silybin và isosilybin có cấu hình
trans tại C-2, C-3 và C-7 ', C-8' [18]. Silybinin được coi là thành phần chủ yếu và
hoạt động nhất trong silymarin [6].


4

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của Silymarin [16], [17], [18]
1.1.2. Tính chất lý hóa
1.1.2.1. Độ hòa tan

- Độ tan trong nước thấp (0,04 mg/ml).


5

- Silymarin kém hòa tan trong các dung môi phân cực protic (ethanol,
methanol) và không hòa tan trong các dung môi không phân cực (chloroform, ether
dầu khí), nhưng là hòa tan trong các dung môi phân cực aprotic (Acetone,
tetrahydrofuran). [8]
Silymarin không có tính chất thân dầu mặc dù độ tan trong nước của nó thấp.
1.1.2.2. Độ hấp thụ
- Silymarin hấp thụ ánh sáng trong vùng UV-VIS. Cực đại hấp thụ tại bước
sóng 288nm [8]
Bảng 1.1. Tính chất vật lý của một số silymarin chính [8]

1.1.3. Tính chất dược động học, tác dụng dược lý
1.1.3.1. Dược động học
- Hấp thu sau khi uống là khá thấp. Nồng độ đỉnh trong huyết tương đạt được
trong 4-6 giờ, cả trong động vật và ở người [29]. Chỉ có 20-50% silymarin đường
uống được hấp thu từ đường tiêu hóa. Những nghiên cứu cho thấy có chu kỳ ruộtgan: hấp thu đường ruột, liên hợp trong gan, bài tiết qua mật, thủy phân bởi vi
khuẩn đường ruột, và tái hấp thu ở ruột [20]. Chu kỳ này làm cho việc nghiên cứu
sự hấp thu đường ruột rất khó khăn. Tuy nhiên, nghiên cứu sử dụng Silybinin ở
chuột đã cho thấy sự hấp thu đường ruột của một liều lượng 20 mg / kg xuống còn
khoảng 35% [13]. Do đó, sự hấp thụ của silymarin qua đường tiêu hóa là thấp, làm
cho sinh khả dụng kém.


6

- Phân bố: Các hợp chất đi vào huyết tương và vào mật, với lượng tương ứng

với 80% tổng liều dùng. Silybinin và các thành phần khác của silymarin nhanh
chóng kết hợp với sulfate và acid glucuronic trong gan [30].
- Sự trao đổi chất: Silymarin ( đại diện là Silybinin) trải qua giai đoạn I và giai
đoạn II chuyển hoá trong gan. Nó được chuyển hóa bởi CYP450-2C8 invitro thành
o-demethylated silybin (chủ yếu) và mono hoặc dihydroxy- silybin ( thứ yếu ).
Trong khi giai đoạn II, nhiều phản ứng liên hợp đã được quan sát bao gồm sự hình
thành của Silybin monoglucuronide, Silybin diglucuronide, Silybin monosulfate, và
Silybin diglucuronide sulfate [30].
- Thải trừ: Thời gian bán hủy của nó trong khoảng 6-8 giờ [30]. Silybinin được
bài tiết chủ yếu ở dạng chưa chuyển hóa qua nước tiểu sau khi uống hoặc tiêm tĩnh
mạch, trong khi ở mật nó được thải trừ dạng đã chuyển hóa (không bị ảnh hưởng
bởi đường dùng). Silybinin được bài tiết với lượng tối thiểu trong nước tiểu trong
vòng 48 giờ sau khi uống (2-5%) hoặc tiêm tĩnh mạch (8%). Ngược lại, lượng thải
trừ qua mật là khá cao trong cùng thời gian (khoảng 40-45% sau khi uống, và
khoảng 80% sau khi tiêm tĩnh mạch) [20].
- Sinh khả dụng của Silybinin cũng có thể được tăng cường bằng sự tạo phức
với phosphatidylcholine hay β-cyclodextrin [6].
1.1.3.2. Dược lý
Silymarin được sử dụng như một liệu pháp bảo vệ trong các bệnh gan cấp tính
và mãn tính [5], [6], [13]. Tác dụng của silymarin có thể được giải thích dựa trên
đặc tính chống oxy hóa do tính chất phenolic của flavonolignans, kích thích các tế
bào gan tái sinh và ổn định màng tế bào để ngăn chặn các tác nhân gây độc cho gan
xâm nhập vào tế bào gan [22]. Gần đây đã chứng minh được rằng flavonolignans ức
chế sản xuất leucotriene; sự ức chế này giải thích hoạt tính chống viêm và chống xơ
gan. [6]
- Chống oxy hóa
Flavonoids thường có hoạt tính chống oxy hóa tốt. Các muối natri
dehydrosuccinate hòa tan trong nước của Silybinin (hỗn hợp 2 đồng phân Silybin A

7

và Silybin B) là một chất ức chế mạnh mẽ của quá trình oxy hóa của nhũ tương acid
linoleic-nước được xúc tác bởi muối Fe2 +[12]. Nó cũng ức chế một cách phụ thuộc
nồng độ các peroxy microsome sản xuất bởi NADPH-Fe2 + -ADP, một nguyên nhân
hình thành của các gốc OH- tự do. Trong các nghiên cứu được thực hiện ở chuột đã
chứng minh rằng peroxy lipid sản xuất bởi Fe (III) / ascorbate bị ức chế bởi
hemisuccinate silybinin; sự ức chế là phụ thuộc nồng độ [11], [24]. Trong báo cáo
gần đây, với các tế bào gan chuột được điều trị với tert-butyl hydroperoxide (TBH),
silymarin làm giảm sự mất của lactate dehydrogenase (LDH), làm tăng tiêu thụ oxy,
giảm sự hình thành của peroxid lipid, và làm tăng sự tổng hợp urê. Hơn nữa,
silymarin có thể vô hiệu hóa sự tăng Ca2 + được sản xuất bởi TBH, giảm nồng độ ion
xuống còn dưới 300 nmol/L. Hiệu quả bảo vệ gan của silymarin thông qua sự ức
chế lipid peroxy, và điều chỉnh Ca2+ nội bào [13].
- Tái tạo gan
Silymarin gây ra ảnh hưởng đến sự ổn định trên màng tế bào gan và có thể tăng
tốc độ tổng hợp của rRNA bằng cách kích hoạt RNA polymerase làm tăng sản xuất
protein cấu trúc và protein chức năng trong tế bào gan bị tổn thương [31].
- Chống xơ gan
Tế bào gan hình sao có một vai trò rất quan trọng trong xơ gan. Khi xuất hiện
các yếu tố nguy cơ (ví dụ dùng ethanol lâu dài hoặc carbon tetrachloride), tế bào
hình sao sinh sôi nảy nở và biến đổi thành myofibroblasts gây lắng đọng các sợi
collagen trong gan. Các kết quả đã cho thấy rằng, silymarin làm giảm sự tăng sinh
của các tế bào hình sao khoảng 75%, làm giảm sự chuyển đổi của các tế bào này
thành myofibroblasts, và giảm bài xuất và biểu hiện gen của các thành phần ngoại
bào cần cho quá trình xơ hóa [7], [31], [38].
- Ức chế cytochrome P450
Silymarin có thể ức chế cytochrome P450 (CYP) ở gan (giai đoạn I chuyển
hoá). Tác dụng này có thể giải thích sự bảo vệ gan của silymarin, đặc biệt là chống
lại nhiễm độc do Amanita phalloides (là một loại nấm độc trong ngành Nấm đảm).

Các chất độc Amatoxin trở nên độc đối với tế bào gan chỉ sau khi đã được kích hoạt


8

bởi hệ thống CYP. Ngoài ra, silymarin, cùng với các chất chống oxy hóa khác, có
thể góp phần vào việc bảo vệ chống lại các gốc tự do sinh ra bởi các enzyme của hệ
thống CYP [13], [31].
- Chống ung thư
Sự bảo vệ chống lại các yếu tố gây ung thư của silymarin đã được nghiên cứu
trên các loại tế bào khác nhau cả in vitro và in vivo: các tế bào biểu mô, tế bào khối
u tuyến tiền liệt, tế bào u, các tế bào khối u vú, các tế bào khối u ác tính…Các cơ sở
của các tác dụng chống viêm và chống ung thư của silymarin chưa được biết đến;
có thể liên quan đến sự ức chế các yếu tố phiên mã NF-B, trong đó quy định các
biểu hiện của các gen khác nhau tham gia vào quá trình viêm, trong cytoprotection
và ung thư. Silymarin điều chỉnh sự mất cân bằng giữa tế bào sống và chết theo
chương trình thông qua sự can thiệp điều chỉnh chu kỳ tế bào và protein tham gia
[13], [20], [22], [31].
- Hoạt động chống lipid peroxyd
Peroxyd lipid là kết quả của sự tương tác giữa các gốc tự do và các acid béo
không bão hòa dẫn đến thay đổi màng tế bào, rối loạn trao đổi chất lipoprotein, cả ở
gan và ở các mô ngoại vi. Silymarin thu dọn các gốc tự do, tác động đến hệ thống
enzyme kết hợp với glutathione và superoxide dismutase. Silymarin ức chế peroxyd
hóa acid linoleic xúc tác bởi lipoxygenase [5], [6], [13], [31].
- Độc tính của silymarin
Trong các thử nghiệm lâm sàng, liều trung bình hàng ngày của silymarin (420
mg/ngày cho 41 tháng) đã được tìm thấy là không độc hại so với giả dược. Tương
tác thuốc - thuốc và nhiễm độc gan do cảm ứng hoặc ức chế cytochrome P450 là
một vấn đề cần quan tâm đối với việc sử dụng các silymarin [6], [34].
- Chỉ định:

+ Bảo vệ tế bào gan và phục hồi chức năng gan
+ Những người đang sử dụng thuốc có hại tế bào gan như thuốc điều trị lao, ung
thư, thuốc NSAIDs…
+ Rối loạn chức năng gan


9

+ Phòng và hỗ trợ điều trị xơ gan, ung thư gan
- Chống chỉ định:
Bệnh nhân hôn mê gan, vàng da ứ mật và xơ gan tiên phát
1.2. Tổng quan về HPLC
1.2.1. Khái niệm chung
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance Liquid Chromatography –
HPLC) là kỹ thuật tách sắc ký trong đó các chất phân tích hòa tan trong pha động là
chất lỏng và di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh. Tùy thuộc vào ái lực của chất
phân tích với pha động và pha tĩnh mà các chất di chuyển với tốc độ khác nhau, do
đó thứ tự rửa giải khác nhau. Thành phần pha động đưa chất phân tích ra khỏi cột
được thay đổi để rửa giải các chất với thời gian hợp lý. [1], [2]
1.2.2. Nguyên tắc của quá trình sắc ký
Mẫu phân tích được hòa tan trong một pha động. Pha này có thể là một chất khí,
chất lỏng hoặc chất lỏng siêu tới hạn được cho qua pha tĩnh một cách liên tục và
không hòa lẫn với nó. Pha tĩnh được nhồi vào cột tách theo một kĩ thuật nhất định.
Các chất tan là thành phần của mẫu sẽ di chuyển qua cột theo pha động với tốc
độ khác nhau tùy thuộc vào tương tác giữa pha tĩnh, pha động và chất tan. Yếu tố
quyết định hiệu quả sự tách sắc ký ở đây là tổng các tương tác:
-

Tương tác giữa chất phân tích và pha tĩnh (F1).

-

Tương tác giữa chất phân tích và pha động (F2).

-

Tương tác giữa pha tĩnh và pha động (F3).
Trong đó tương tác F1 và F2 đóng vai trò quyết định. Kết quả là các chất khác

nhau sẽ di chuyển trong cột với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau khi ra khỏi
cột như hình 1.2.


10

Hình 1.2. Quá trình rửa giải và tách peak của chất A và chất B
Pha tĩnh là yếu tố quyết định bản chất của của quá trình sắc ký. Nếu pha tĩnh là
chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ pha thường hay pha đảo. Nếu pha tĩnh là chất
lỏng thì ta có sắc ký phân bố. Nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion thì ta có sắc ký trao
đổi ion. Ngoài ra còn có sắc ký rây phân tử. Trong đó sắc ký phân bố được sử dụng
nhiều nhất trong kiểm nghiệm do đó tôi xin trình bày kỹ về sắc ký phân bố
1.2.3. Các thông số đặc trưng trong HPLC [1], [2]
1.2.3.1. Hệ số phân bố K
Tốc độ di chuyển của chất tan qua pha tĩnh được xác định bởi hệ số phân bố K:
K=

CS
CM

Trong đó: CS là nồng độ mol của chất tan trong pha tĩnh (mol/lit)

CM là nồng độ mol của chất tan trong pha động (mol/lit)
Hệ số K phụ thuộc bản chất của pha động, pha tĩnh và chất hòa tan. Trị số K
càng lớn, sự di chuyển của chất tan qua pha tĩnh càng chậm.
Nếu các chất trong hỗn hợp có hằng số K khác nhau càng nhiều, thì khả năng
tách diễn ra càng dễ dàng hơn.
1.2.3.2. Thời gian lưu tR
Thời gian lưu tR là khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi pic đến


11

detector. Trong cùng một điều kiện sắc ký đã chọn, thời gian lưu của mỗi chất là
hằng định, điều này làm cơ sở cho phép định tính. Thời gian lưu của mỗi chất phụ
thuộc các yếu tố:
-

Bản chất của pha tĩnh

-

Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động

-

Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan

-

Một số trường hợp còn phụ thuộc pH của pha động
Trong một phép phân tích nếu tR quá nhỏ thì sự tách kém, nếu tR quá lớn thì pic

bị doãng và độ lặp lại của pic rất kém, thời gian phân tích dài đồng thời kéo theo
nhiều vấn đề khác như hao tốn dung môi, hoá chất, độ chính xác của phép phân tích
kém. Để thay đổi thời gian lưu chúng ta dựa vào các yếu tố mà tR phụ thuộc.
Thời gian chết: thời gian tM của chất không lưu giữ (tốc độ di chuyển của nó
bằng tốc độ di chuyển trung bình của các phần tử pha động).
Thời gian lưu hiệu chỉnh: tR’ = tR – tM
1.2.3.3. Hệ số dung lượng k’
Hệ số k’ là một thông số quan trọng mô tả tốc độ di chuyển của chất phân tích
A qua cột. Hệ số k’ còn được gọi là hệ số phân bố khối lương giữa hai pha:
k’ = K .

VS
Q
t t
t'
 S  R  R O
V M QM t O
tO

Trong đó:
VS : thể tích pha tĩnh (lít)
VM: thể tích pha động (lít)
QS: lượng chất trong pha tĩnh
QM: lượng chất trong pha động
CS: nồng độ mol chất tan trong pha tĩnh (mol/lít)
CM: nồng độ mol chất tan trong pha động (mol/lít)
K : hệ số phân bố

12

1.2.3.4. Hệ số chọn lọc α
Để đặc trưng cho tốc độ di chuyển tỉ đối của 2 chất A và B, người ta dùng hệ
số chọn lọc α:
'
t'
α = K B  k B'  R' , B

KA

kA

t R, A

Với quy ước KB> KA nên α luôn lớn hơn 1
Để tách riêng 2 chất thường chọn α dao động trong khoảng 1,05 ÷ 2. Nếu α quá
lớn thời gian phân tích sẽ dài.
1.2.3.5. Hệ số bất đối
Để đánh giá tính đối xứng của pic sắc ký người ta dùng các đại lượng:
 Hệ số bất đối AF:
F=

W
2a

Trong đó: W: Chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic
a : khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước
tại vị trí 1/20 chiều cao pic
1.2.3.6. Số đĩa lý thuyết N

Số đĩa lý thuyết là đại lượng đặc trưng cho hiệu lực cột sắc ký
t R2
t R2
N = 5.54 2  16 2
W1 / 2
W

Trong đó: W: chiều rộng đo ở đáy pic
W1/2: chiểu rộng đo ở nửa chiều cao pic
1.2.3.7. Độ phân giải R
Độ phân giải (RS) của cột đánh giá khả năng tách định lượng hai chất trong hỗn
hợp trên pic sắc ký.
R=

2t R , B  t R , A  1,18t R , B  t R , A 

WB  WA
W1/ 2 B  W1/ 2 A

Với:
tR,B, tR,A : thời gian lưu của 2 pic liền kề nhau (B và A)


13

WB, WA: độ rộng pic đo ở các đáy pic
W1/2,B, W1/2,A: độ rộng pic đo ở nửa chiều cao pic
Các giá trị trên được tính theo cùng một đơn vị
Yêu cầu RS > 1, giá trị tối ưu RS = 1,5
1.2.4. Thiết bị HPLC:

Hình 1.3. Sơ đồ nguyên lý của máy HPLC
1.2.4.1. Hệ thống cung cấp pha động:
Bình dung môi pha động
- Pha động là dung môi dùng để rửa giải chất cần phân tích ra khỏi cột tách để
thực hiện một quá trình sắc ký. Pha động có thể là nước, dung môi hữu cơ hay hỗn
hợp dung môi theo tỷ lệ nhất định.
+ Trong sắc ký pha thuận, pha động thường là các dung môi hữu cơ ít phân cực
(kỵ nước) như: n-hexan, n-heptan, benzen, cloroform... Các pha động này thường
được bão hoà.
+ Trong sắc ký pha đảo, pha động là hệ dung môi hữu cơ phân cực như: nước,
methanol, acetonitril... hay hỗn hợp của chúng. Các dung môi này có thể hòa tan
thêm một lượng nhỏ acid hay base hữu cơ.
- Yêu cầu: phải trơ đối với pha tĩnh, phải hòa tan được chất mẫu, ổn định
theothời gian, có độ tinh khiết cao, nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký.
Bộ phận loại khí
Trước khi sử dụng cần lọc và đuổi khí hòa tan trong pha động. Mục đích của bộ
khử khí nhằm loại trừ các bọt nhỏ còn sót lại trong dung môi pha động


14

Bơm cao áp
- Chức năng bơm là tạo áp suất để đẩy pha động từ bình dung môi vào qua hệ
thống sắc ký.
- Yêu cầu:
+ Tạo được áp suất cao khoảng 3000 - 6000 PSI hoặc 250 - 500 atm (1atm =
0,98 bar)
+ Tạo dòng liên tục, lưu lượng bơm từ 0,1 đến 10 ml/phút.
+ Không bị ăn mòn với các thành phần pha động

- Tốc độ bơm là hằng định theo thông số đã được cài đặt
1.2.4.2. Bộ phận tiêm mẫu:
Để đưa mẫu vào cột, hiện nay phổ biến dùng van tiêm có vòng chứa mẫu do ưu
điểm dung tích xác định và chính xác, có thể thay đổi vòng chứa mẫu với dung tích
khác nhau. Dùng van tiêm mẫu cho kết quả chính xác hơn (± 1%) so với dùng bơm
tiêm (±1-2%).
1.2.4.3. Cột sắc ký:
- Quá trình tách các chất diễn ra ở cột. Cột được chế tạo bằng thép không rỉ, trơ
với hóa chất, chịu được áp suất cao đến vài trăm bar. Cột sắc ký có nhiều cỡ khác
nhau tùy thuộc vào mức độ và mục đích của quá trình sắc ký, thông thường chiều
dài cột khoảng 10 – 30 cm, đường kính trong 1- 10 mm, hạt chất nạp cỡ 5- 10 µm.
Cột có đường kính trong lớn hơn dùng trong sắc ký điều chế.
Trong cột được nhồi pha tĩnh. Thông thường chất nạp là silicagel (pha thường)
hoặc là silicagel đã được Silan hóa hoặc được bao một lớp mỏng hữu cơ (pha đảo)
hoặc liên kết hóa học với các hợp chất hữu cơ, ngoài ra người ta còn dùng các loại
hạt khác như: nhôm oxid, polyme xốp, chất trao đổi ion…


15

Có thể phân loại chất nạp theo gốc R của dẫn chất Siloxan. Tùy vào độ phân
cực của pha tĩnh và pha động sắc ký được chia thành 2 loại
Bảng 1.2. Phân lọai sắc ký
Sắc ký pha thuận

Sắc ký pha đảo

Pha tĩnh

R là các nhóm phân cực (ưa

R là các nhóm ít phân cực như
nước): nhóm OH hoặc các octyl, octadecyl, phenyl, được điều
alkylamin (–CH2NH2), alkyl chế bằng cách alkyl hóa các nhóm
nitril (– CH2 – CN)
OH bề mặt silica trung tính bằng các
gốc alkyl-R của mạch carbon
(C2;C8;C18) hay các gốc carbon
vòng phenyl

Pha động

Các dung môi hữu cơ ít
Hệ dung môi hữu cơ phân cực
phân cực (kỵ nước) như: n- như: nước, methanol, acetonitril...
hexan, n-heptan, benzen, hay hỗn hợp của chúng
cloroform...

1.2.4.4. Detector:
Là bộ phận phát hiện chất phân tích và đo các tín hiệu sinh ra khi có chất ra
khỏi cột.
- Yêu cầu:
+ Có vùng tuyến tính rộng giữa nồng độ chất cần phân tích và cường độ đáp
ứng của detector.
+ Có đáp ứng kém hoặc không có đáp ứng với dung môi pha mẫu, pha động.
+ Cho đáp ứng nhanh, ổn định, dễ đo đạc.
- Hiện tại, thiết bị HPLC thương mại có rất nhiều loại detector đa dạng để đáp
ứng các nhu cầu phân tích khác nhau, ví dụ như: detector hấp thụ UV-VIS, detector
huỳnh quang, detector chỉ số khúc xạ, detector tán xạ bay hơi, detector điện hóa,
detector khối phổ. Riêng kỹ thuật HPLC sử dụng detector khối phổ có những đặc
điểm khác biệt rõ rệt so với các loại detector khác nên thường được tách riêng thành

sắc ký lỏng khối phổ (liquid chromatography – mass spectrometry). Do vậy, về mặt


16

ứng dụng thực tế, nếu nhắc tới HPLC thường người ta ám chỉ các kỹ thuật sử dụng
detector không phải là khối phổ.
Trong nghiên cứu này, để quy trình xây dựng được có khả năng ứng dụng rộng,
chúng tôi lựa chọn detector PDA, loại detector phổ biến trong cấu hình tiêu chuẩn
của thiết bị HPLC hiện tại. Về bản chất, đây là một detector UV-Vis cho phép đồng
thời ghi nhận tín hiệu hấp thụ đồng thời trên toàn dải phổ UV gần và Vis. Dải bức
xạ UV-Vis (thường các detector PDA có dải bước sóng trong khoảng 190 – 800
nm) sau khi đi qua tế bào đo được đưa đến một cách tử để phân thành các tia đơn
sắc đi đến một mảng diod quang. Mỗi diod quang đón nhận một phần dải bức xạ
tương ứng với một khoảng bước sóng hẹp. Như vậy, mỗi một diod có thể phát hiện
một sự hấp thu ở một bước sóng nhất định. Toàn bộ dãy diod được quét nhiều lần
trong 1 giây bởi bộ phận vi xử lý. Kết quả phổ có thể hiện trên màn hình máy tính
hoặc được lưu trữ để in ra dưới dạng bản phổ bằng máy in.
Ưu điểm của detector này là tạo được phổ UV của các chất phân tích trong
khoảng bước sóng đã chọn, kiểm tra sự tinh khiết của sản phẩm và định danh được
sản phẩm bằng cách so sánh phổ tương ứng của đỉnh sắc ký với phổ của một ngân
hàng dữ liệu hoặc với phổ của chất chuẩn biết trước
1.2.4.5. Hệ thống thu nhận và xử lý dữ liệu:
Để ghi tín hiệu phát hiện do detector truyền sang, các máy thế hệ mới đều dùng
phần mềm chạy trên máy tính nó có thể lưu tất cả các thông số, và các thông số của
peak như tính đối xứng, hệ số phân giải... trong quá trình phân tích đồng thời xử lý,
tính toán các thông số theo yêu cầu của người sử dụng như: nồng độ, RSD
1.2.5. Ứng dụng phương pháp HPLC
- Phân tích định tính: thường dựa vào thời gian lưu.
- Phân tích định lượng: có thể chia thành 4 bước :

+ Lấy mẫu thử
+ Tiến hành sắc ký
+ Đo tín hiệu detector
+ Phương pháp định lượng