Nghiên cứu xác định độc tố saxitoxin trong cua biển bằng phương pháp LC MS MS

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN ĐÌNH QUÂN
Mã sinh viên: 1101419

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ĐỘC TỐ
SAXITOXIN TRONG CUA BIỂN BẰNG
PHƯƠNG PHÁP LC-MS/MS
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2016


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN ĐÌNH QUÂN
1101419

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ĐỘC TỐ
SAXITOXIN TRONG CUA BIỂN BẰNG
PHƯƠNG PHÁP LC-MS/MS
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. TS. Trần Nguyên Hà
2. ThS. Nguyễn Thị Hà Bình
Nơi thực hiện:
Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc Gia

HÀ NỘI – 2016

i

LỜI CẢM ƠN
Bản khóa luận này được thực hiện và hoàn thành tại Viện Kiểm
nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc Gia với sự hướng dẫn của TS.
Trần Nguyên Hà và ThS. Nguyễn Thị Hà Bình.
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn TS.
Trần Nguyên Hà đã định hướng nghiên cứu, hướng dẫn và góp ý giúp em
hoàn thành khóa luận này.
Em xin gửi lời cảm ơn tới ThS. Nguyễn Thị Hà Bình đã hướng dẫn
và giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ban lãnh đạo Viện Kiểm nghiệm An
toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, TS. Trần Cao Sơn và các cán bộ khoa
Độc học dị nguyên, Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia
đã tạo điều kiện giúp em hoàn thành đề tài.
Cuối cùng, em xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã luôn
bên em, chia sẻ khó khăn, động viên và giúp đỡ em trong học tập và trong
cuộc sống.
Do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên không tránh những thiếu sót.
Em rất mong nhận được ý kiến đóng góp của thầy cô và các bạn sinh viên.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 12 tháng 05 năm 2016
Sinh viên
Nguyễn Đình Quân


ii

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... i
MỤC LỤC ......................................................................................................... ii
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ..................................... v
DANH MỤC CÁC BẢNG.............................................................................. vii
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ........................................................ viii
ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ............................................................................. 3
1.1. Giới thiệu về độc tố sinh học biển ............................................................. 3
1.2. Độc tố nhuyễn thể gây liệt cơ .................................................................... 4
1.3. Giới thiệu về STX ...................................................................................... 5
1.3.1. Tính chất vật lý và hóa học ................................................................. 5
1.3.2. Nguồn phát sinh STX .......................................................................... 6
1.3.4. Độc tính của STX ................................................................................ 7
1.4. Các phương pháp xác định STX ................................................................ 8
1.4.1. Phương pháp sinh học trên chuột ........................................................ 8
1.4.2. Phương pháp xét nghiệm miễn dịch ELISA ....................................... 9
1.4.3. Sắc kí lỏng hiệu năng cao ................................................................... 9
1.4.4 Sắc kí lỏng khối phổ (LC-MS/MS) .................................................... 11
1.5. Tổng quan tóm lược về sắc kí lỏng khối phổ ........................................... 13
1.5.1. Sắc kí lỏng hiệu năng cao ................................................................. 13
1.5.2. Khối phổ (Mass spectrometry) .......................................................... 14
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 18


iii

2.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................... 18
2.2. Nguyên vật liệu – trang thiết bị................................................................ 18
2.2.1. Nguyên vật liệu ................................................................................. 18

2.2.2. Dụng cụ ............................................................................................. 19
2.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 20
2.3.1. Khảo sát phương pháp....................................................................... 20
2.3.2. Thẩm định phương pháp ................................................................... 20
2.3.3. Ứng dụng phương pháp..................................................................... 20
2.4. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 20
2.4.1. Phương pháp thu thập và xử lý sơ bộ mẫu thử ................................. 20
2.4.2. Khảo sát, lưa chọn điều kiện sắc kí................................................... 20
2.4.3. Quy trình thẩm định phương pháp .................................................... 21
2.4.3.1. Tính đặc hiệu .............................................................................. 21
2.4.3.2. Giới hạn phát hiện (LOD), Giới hạn định lượng (LOQ) ........... 21
2.4.3.3. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn ........................................... 22
2.4.3.4. Độ lặp lại và độ thu hồi .............................................................. 22
2.4.4. Phương pháp xử lý số liệu................................................................. 23
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 24
3.1. Khảo sát phương pháp phân tích độc tố STX .......................................... 24
3.1.1. Khảo sát điều kiện khối phổ.............................................................. 24
3.1.1.1. Khảo sát điều kiện bắn phá đối với ion mẹ ................................ 24
3.1.1.2. Khảo sát điều kiện bắn phá ion con ........................................... 24
3.1.2. Điều kiện sắc kí lỏng ......................................................................... 26


iv

3.1.2.1. Chọn pha tĩnh ............................................................................. 26
3.1.2.2. Chọn pha động ........................................................................... 26
3.1.3. Khảo sát phương pháp xử lý mẫu ..................................................... 28
3.1.3.1. Chọn quy trình xử lý mẫu .......................................................... 28
3.1.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình chiết mẫu ......... 32
3.1.3.3. Khảo sát quá trình pha loãng dịch chiết ..................................... 34

3.1.3.4. Khảo sát thể tích dung môi chiết................................................ 35
3.2. Thẩm định phương pháp .......................................................................... 37
3.2.1. Tính đặc hiệu / chọn lọc .................................................................... 37
3.2.2. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng ....................................... 38
3.2.3. Xác định khoảng tuyến tính .............................................................. 39
3.2.4. Độ lặp lại và độ thu hồi ..................................................................... 40
3.2.5. Bàn luận ............................................................................................ 42
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 44
Kết luận ........................................................................................................... 44
Kiến nghị ......................................................................................................... 45
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


v

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu
ACN

Tiếng Anh

Tiếng Việt

Acetonitrile

Acetonitril

Association of Official

Hiệp hội các nhà hóa phân

Analytical Communities

tích chính thống

ASP

Amnesic Shellfish Poisoning

Độc tố gây mất trí nhớ

CAD

Collision Gas Pressure

Áp suất khí va chạm

CE

Collision Energy

Năng lượng va chạm

CUR

Curtain Gas

Khí màng

CXP

Collision Cell Exit Potential

Thế đầu ra

DP

Declustering Potential

Thế phân mảnh

DSP

Diarrhetic Shellfish Poisoning

AOAC

dSPE

Dispersive solid phase
extraction

Độc tố nhuyễn thể gây tiêu
chảy
Chiết phân tán pha rắn

Eq

Equivalents

Tương đương

ESI

Electronspray ionization

Ion hóa phun điện tử

FLD

Fluoroscence detector

Detector huỳnh quang

GCB

Graphitized carbon black

Than hoạt tính

GS1

Ion Source Gas 1

Nguồn khí ion 1

GS2

Ion Source Gas 2

Nguồn khí ion 2

HPLC

HILIC
IS

High performance liquid
chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Hydrophilic interaction liquid

Sắc kí lỏng tương tác thân

chromatography

nước

Ionspray Voltage

Thế phun ion


vi

LC-MS/MS

Liquid chromatography tandem Sắc ký lỏng ghép khối phổ
mass spectrometry

2 lần

LOD

Limit of detection

Giới hạn phát hiện

LOQ

Limit of quantification

Giới hạn định lượng

MBA

Mouse bioassay

MS

Mass spectrometry

PSP

Paralytic Shellfish poisoning

R(%)

Recovery

Hiệu suất thu hồi

RSD(%)

Relative standard deviation

Độ lệch chuẩn tương đối

SD

Standard Deviation

Độ lệch chuẩn

SPE

Solid phase extraction

Chiết pha rắn

STX

Saxitoxin

Độc tố saxitoxin

TEM

Ion source temperature

Nhiệt độ nguồn

Thử nghiệm sinh học trên
chuột
Khối phổ
Độc tố nhuyễn thể gây liệt
cơ


vii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Cấu trúc hóa học và độc tính của một vài độc tố PSP..................... 5
Bảng 1.2: LD50 đường uống của STX trên một số loài động vật ...................... 8
Bảng 1.3: Một số nghiên cứu sử dụng phương pháp HPLC-FLD để xác định
STX .................................................................................................................. 10
Bảng 3.1: Điều kiện chạy nguồn ion hóa ESI ................................................. 24
Bảng 3.2: Kết quả bắn phá ion mẹ.................................................................. 24
Bảng 3.3: Năng lượng bắn phá các ion con của STX ..................................... 25
Bảng 3.4: Chương trình gradient .................................................................... 27
Bảng 3.5: Lựa chọn quy trình chiết mẫu ........................................................ 32
Bảng 3.6: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình chiết mẫu ............ 33
Bảng 3.7: Khảo sát quá trình pha loãng dịch chiết ........................................ 34
Bảng 3.8: Khảo sát thể tích dung môi chiết .................................................... 35
Bảng 3.9: Ion mẹ và ion con của STX ............................................................. 37
Bảng 3.10: LOD và LOQ của STX .................................................................. 39

Bảng 3.11: Sự phụ thuộc diện tích píc vào nồng độ STX ............................... 39
Bảng 3.12: Độ lặp lại và độ thu hồi của STX trên nền mẫu cua biển ............ 41
Bảng 3.13: Kết quả phân tích mẫu thực tế trên địa bàn Hà Nội .................... 43


viii

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1: Sơ đồ của máy khối phổ .................................................................. 15
Hình 1.2: Bộ nguồn ion hóa ESI ..................................................................... 16
Hình 1.3: Bộ phân tích khối ba tứ cực ............................................................ 16
Hình 3.1: Phổ khối của STX............................................................................ 25
Hình 3.2: Sắc kí đồ chương trình gradient 4 .................................................. 28
Hình 3.3: Sơ đồ quy trình xử lý mẫu 1 ............................................................ 29
Hình 3.4: Sơ đồ quy trình xử lý mẫu 2 ............................................................ 30
Hình 3.5: Sơ đồ quy trình xử lý mẫu 3 ............................................................ 31
Hình 3.6: Sắc kí đồ STX trong quy trình 3 ...................................................... 32
Hình 3.7: Sắc kí đồ quy trình không gia nhiệt ................................................ 33
Hình 3.8: Sắc kí đồ quy trình gia nhiệt ........................................................... 33
Hình 3.9: Đồ thị khảo sát sự ảnh hưởng của quá trình pha loãng đến hiệu suất
thu hồi .............................................................................................................. 34
Hình 3.10: Quy trình xử lí mẫu tối ưu ............................................................ 36
Hình 3.11: Sắc kí đồ mẫu trắng ...................................................................... 37
Hình 3.12: Sắc kí đồ mẫu trắng thêm chuẩn STX ở mức 50 ng/mL ............... 38
Hình 3.13: Sắc kí đồ mẫu chuẩn STX ở mức 50 ng/mL .................................. 38
Hình 3.14: Sắc kí đồ STX tại LOD 10 ng/mL (tương đương 100 µg/kg trên mẫu)
......................................................................................................................... 38
Hình 3.15: Đường hồi quy tuyến tính giữa diện tích píc và nồng độ STX...... 40

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong các hệ sinh thái thủy vực, các loài vi tảo là những sinh vật sản xuất
sơ cấp đồng thời còn là nguồn dinh dưỡng chủ yếu của nhiều loài động vật phù
du, ấu trùng, tôm cua, một số loài thân mềm ăn lọc và cá, v.v. Phần lớn các loài
vi tảo là có lợi cho các sinh vật thủy sinh. Tuy vậy, một phần nhỏ trong chúng,
có chứa các độc tố gây hại cho sinh vật khác và được gọi là độc tố sinh học
biển (marine toxins).
Hiện nay, trên thế giới có 4 triệu chứng nhiễm độc thuỷ sản chính bao
gồm: nhiễm độc gây liệt cơ Paralytic Shellfish Poisoning (PSP), nhiễm độc gây
tiêu chảy Diarrhetic Shellfish Poisoning (DSP), nhiễm độc gây mất trí nhớ
Amnesic Shellfish Poisoning (ASP), nhiễm độc với hệ thần kinh Neurologic
Shellfish Poisoning (NSP). Trong các triệu chứng ngộ độc này, tỷ lệ xảy ra PSP
tuy ít nhưng mức độ nguy hiểm đến sức khỏe người bị ngộ độc lớn. Triệu chứng
ngộ độc nhẹ là bỏng rát ở lưỡi và cổ họng; ngứa và đau như kim chích ở đầu
ngón tay, ngón chân; sau đó là cảm giác nhức đầu, chóng mặt, buồn nôn, nôn.
Trong trường hợp nghiêm trọng, quá trình liệt cơ xuất hiện, đặc biệt biểu hiện
rõ nhất là liệt cơ hô hấp gây ra triệu chứng phát âm, hô hấp khó khăn và có thể
gây tử vong.
Saxitoxin (STX) là độc tố mạnh nhất nhóm PSP và hiện nay có nhiều
phương pháp xác định độc tố STX và PSP khác trong nhuyễn thể như phương
pháp thử nghiệm sinh học (MBA), phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao sử
dụng detector huỳnh quang (HPLC-FLD). Tuy nhiên phương pháp MBA có độ
nhạy thấp, không thể tự động hóa, bị ảnh hưởng bởi các đặc tính động vật và
đặc biệt là về vấn đề đạo đức, còn phương pháp HPLC-FLD thì có độ nhạy và
độ đặc hiệu đáp ứng được yêu cầu nhưng đòi hỏi tốn kém thời gian do quá trình
dẫn xuất hóa. Do vậy, trong khuôn khổ khóa luận tốt nghiệp chúng tôi tập trung

2

tìm ra điều kiện phân tích tối ưu STX trên thiết bị LC-MS/MS có tại phòng thí
nghiệm. Đề tài “Nghiên cứu xác định độc tố saxitoxin trong cua biển bằng
phương pháp LC-MS/MS” với các mục tiêu như sau:
- Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định độc tố STX trong cua biển
bằng phương pháp LC-MS/MS.
- Áp dụng phương pháp phân tích một số mẫu cua biển mua tại một số chợ
trên địa bàn Hà Nội.


3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1.

Giới thiệu về độc tố sinh học biển
Trong khoảng 5000 loài sinh vật phù du được biết, dưới những điều kiện

thuận lợi, có khoảng 300 loài có tốc độ phát triển rất nhanh, dẫn đến hình thành
những đám tảo có mật độ dày đặc, gọi là hiện tượng nở hoa của tảo. Hiện tượng
này thường có lợi đối với hệ thuỷ sinh. Tuy nhiên, trong số 300 loài sinh vật
phù du nói trên có khoảng hơn 40 loài thuộc lớp tảo giáp (dinoflagellates) và
tảo cát (diatom) có thể tạo thành các độc tố sinh học biển. Độc tố sinh học biển
có thể tích lũy trong nhiều loài sinh vật biển khác nhau như cá, cua hoặc thân
mềm như trai, hàu, sò và ngao. Trong các loài thân mềm, độc tố có thể tích luỹ
trong hệ tiêu hoá mà không gây độc cho các loài đó. Tuy nhiên, khi vào cơ thể
con người, chúng có thể gây ngộ độc nghiêm trọng [12].
Dựa trên các đặc tính hoá học của các độc tố sinh học biển có thể chia
làm hai nhóm lớn: nhóm thân nước (hydrophilic) và nhóm thân dầu (lipophilic).

- Các độc tố biển thân nước có khối lượng phân tử dưới 500 Da bao gồm
[12], [13]:
+ Độc tố gây triệu chứng mất trí nhớ ASP (Amnesic Shellfish Poisoning)
do các loài tảo khuê Pseudonitzschia multiseries, P. pseudodelicatissima, P.
australis,... sản sinh ra.
+ Độc tố gây liệt cơ PSP (Paralytic Shellfish Poisoning) do các loài tảo
giáp Alexandrium acatenella, A. catenella, A. cohorticula,... sản sinh ra.
- Các độc tố thân dầu có khối lượng phân tử trên 600 Da đến 2000 Da
bao gồm [12], [13]:
+ Độc tố gây triệu chứng thần kinh NSP (Neurologic Shellfish
Poisoning) do loài Gymnodinium breve, Gymnodinium G. cf.breve (New
Zealand),… sản sinh ra.


4

+ Độc tố gây tiêu chảy DSP (Diarrhetic Shellfish Poisoning) do các loài
tảo giáp Dinophysis acuta, D. acuminata, D. fortii, D. norvergica,… sản sinh
ra.
+ Độc tố cá Ciguatera, gây chết đột ngột CFP (Ciguatera Fish Poisoning)
do các loài tảo giáp Gambierdiscus toxicus, Ostreopsis spp, Prorocentrum
spp,… sản sinh ra.
1.2. Độc tố nhuyễn thể gây liệt cơ
Độc tố nhuyễn thể gây liệt cơ PSP là một nhóm các độc tố alkaloid gây
độc trên thần kinh. STX là độc tố PSP được phát hiện sớm nhất vào năm 1957,
và kể từ đó đến nay đã có 57 dẫn xuất được mô tả [24].
Độc tố PSP là những độc tố thân nước và chịu được nhiệt độ cao nên khó
có thể bị phá hủy khi nấu ăn hay đun nóng [15], [18]. Chúng có thể được chia
thành 4 phân nhóm chính [4], [18], [24]:
+ Độc tố carbamate gồm: saxitoxin (STX), neosaxitoxin (NEO),

gonyautoxins (GTX1-4) có độc tính mạnh nhất.
+ Độc tố decarbamoyl gồm: decarbamoyl saxitoxin (dcSTX), decarbamoyl
neosaxitoxin (dcNEO), decarbamoyl gonyautoxins (dcGTX1-4) có độc tính
trung bình, được báo cáo xuất hiện trong một vài động vật hai mảnh vỏ, nhưng
ít được tìm thấy trong các loài tảo độc.
+ Các độc tố N-sulfocarbamoyl như: B1 [GTX5], B2 [GTX6] and C1-4 ít
mạnh hơn.
+ Nhóm thứ 4 là deoxycarbamoyl nhưng độc tính của nó chưa được xác
định 1 cách rõ ràng [8].
STX là độc tố mạnh nhất trong nhóm PSP. Độc tính của các PSP khác
được xác định dựa trên độc tính của STX bởi Oshima được trình bày ở bảng
1.1 [20].


5

Bảng 1.1: Cấu trúc hóa học và độc tính của một vài độc tố PSP
Độc tố

R1

R2

R3

Hệ số độc

M

STX

-H

-H

-H

1

299

NEO

-OH

-H

-H

0,92

315

GTX1

- OH

-H

-OSO3-

0,99

411

GTX2

-H

-H

-OSO3-

0,36

395

GTX3

-H

-OSO3-

-H

0,64

395

GTX4

- OH

-OSO3-

-H

0,73

411

R4

O

NH2
O

1.3. Giới thiệu về STX
1.3.1. Tính chất vật lý và hóa học
STX là chất bột màu trắng, tan tốt trong nước (0,847 mg/mL).
Tên đầy đủ: [(3aS,4R,10aS)-2,6-diamino-10,10-dihydroxy-3a,4,9,10tetrahydro-1H,8H-pyrrolo[1,2-c]purin-4-yl]methyl carbamate.
- Công thức phân tử: C10H17N7O4
- Công thức cấu tạo:


6

- Trọng lượng phân tử: 299,28 g/mol
STX có cấu trúc 3,4-propinoperhydropurine tricyclic với nhóm

guanidines phân cực. STX tan tốt trong nước, methanol, ethanol nhưng không
tan trong dung môi hữu cơ [4], [10], [18], [24]. STX bền với nhiệt và môi
trường acid nhưng dễ bị oxi hóa trong môi trường base [4], [18].
1.3.2. Nguồn phát sinh STX
Trong môi trường nước biển, STX và các PSP khác được sản xuất bởi
các

loài

tảo

giáp

(Dinoflagellata)

như

Alexandrium,

Pyrodinium,

Gymnodinium. Thông qua chuỗi thức ăn, các độc tố này có thể tích tụ trong các
loài ăn tảo mà không gây hại cho những loài đó như các loài động vật không
xương sống ăn lọc như nhuyễn thể hai mảnh vỏ, động vật giáp xác, động vật
thân mềm hay những loài chân bụng và phù du [5], [24]. Vẹm xanh (Mytilus
edulis) và sò vỏ mềm (Mya arenaria) là những loài có khả năng tích tụ STX
cao nhất. Những loài giáp xác như cua Zosimus aeneus được báo cáo có chứa
tới 300000 µg STX eq./100 g thịt cua tại Nhật Bản [5].
Trong môi trường nước ngọt, chúng có thể được tạo ra bởi các vi khuẩn
lam đơn bào (cyanobaccteria) như Anabaena, Cylindrospermopsis,

Aphanizomenon, Planktothrix hay Lyngbya. Ở thời kì nở hoa của các loài vi
khuẩn lam, các PSP được tạo thành có thể gây ô nhiễm các nguồn nước ngọt.
Trước đây, hàm lượng cao các PSP trong nước đã được báo cao ở nhiều quốc
gia như Australia, Brazil, USA, Mexico, Đức và Trung Quốc [24].


7

1.3.3. Tình hình ngộ độc STX và dẫn chất
Trường hợp ngộ độc PSP đầu tiên được báo cáo vào năm 1920 tại
California (Mỹ) làm 6 người tử vong. Cho tới những năm 1970 độc tố PSP mới
chỉ được phát hiện tại châu Âu, Bắc Mỹ và Nhật Bản. Ngày nay, ngộ độc PSP
được báo cáo tại nhiều nước như Chile, Nam Phi, Úc và nhiều quốc khác [14].
Tháng 10, năm 2010 tại Đông Timo, một người đàn ông đã tử vong vài
giờ sau khi ăn cua Zosimus aeneus. Phân tích mẫu thức ăn thừa cho thấy có
chứa 162,8 µg STX eq./100 g (tương đương 162,8 µg STX/100 g mẫu) (bao
gồm các loại độc tố như GTX2, GTX3, NEO, dcSTX và STX) [16].
Oikawa và cộng sự chỉ ra rằng loài cua biển Telmessus acutidens có thể
tích lũy và lưu giữ các độc tố STX sau khi chúng ăn mẫu trai bị ô nhiễm (Mytilus
galloprovincialis) [19].
Ở Việt Nam, năm 2006, 165 du khách phải nhập viện do ăn phải
thực phẩm được xác định có độc tố PSP tại Nha Trang. Hai mẫu thực phẩm là
súp măng cua và tôm sú hấp đã được kiểm nghiệm và phát hiện thấy có độc tố
PSP và độc tố tetrodotoxin.
Ngày 8/5/2015 ba người bị ngộ độc đã phải nhập viện khi ăn phải cua
mặt quỷ ở đảo Lý Sơn (Quảng Ngải). Các triệu chứng như tê lưỡi và chân tay
cho thấy khả năng bệnh nhân đã bị nhiễm độc tố PSP. Một số ý kiến chuyên
gia cho rằng, loài cua này có chứa nhiều STX trong thịt và trứng gây ra ngộ
độc.
1.3.4. Độc tính của STX

Độc tố STX và các PSP khác gây ức chế kênh Na+ làm giảm điện thế
màng trên tế bào thần kinh. Các triệu chứng lâm sàng của ngộ độc STX là ngứa,
tê xung quanh môi sau đó lan xuống cổ và mặt gây hoa mắt, chóng mặt, nôn
mửa, đau bụng, tiêu chảy, thậm chí gây mù lòa và tử vong [4], [18], [24]. Các
thử nghiệm trên động vật đã được tiến hành và cho kết quả như sau:


8

Bảng 1.2: LD50 đường uống của STX trên một số loài động vật [18], [23]
Đối tượng

LD50
(μg/kg)

Chuột nhắt

260-263

Khỉ

277-800

Mèo

254-280

Thỏ

181-200

Chó

180-200

Lợn

128-135

Chim bồ câu

91-100

Trên người, mức độ ngộ độc là khác nhau giữa từng cá thể. Nhìn
chung, lượng gây ngộ độc là 144-1660 μg STX eq./người. Ngộ độc gây tử
vong đã được báo cáo sau khi tiêu thụ 456 -12400 μg STX eq./người [11],
[18].
Ở Việt Nam và EU quy định mức giới hạn tối đa cho phép trong nhuyễn
thể là 800 µg STX eq./kg thịt nhuyễn thể (tương đương 800 µg STX/kg) [2],
[9]. Chưa có quy định cụ thể về giới hạn hàm lượng riêng lẻ STX trong nhuyễn
thể cũng như cua biển.
1.4. Các phương pháp xác định STX
1.4.1. Phương pháp sinh học trên chuột
Hiện nay, thử nghiệm sinh học trên chuột (MBA) vẫn là phương pháp
thử nghiệm chính trong hầu hết các chương trình giám sát ngộ độc thủy sản.
MBA được sử dụng phổ biến trên thế giới trong hơn 50 năm qua và là phương
pháp chính thức của AOAC.
PSP trong mẫu được chiết tách bằng dung dịch HCl 0,1 N, dịch chiết
được tiêm vào chuột theo tỷ lệ 1 ml dịch/20 g chuột, quan sát biểu hiện của

9

chuột trong vòng 60 phút và xác định thời gian chết của chuột. Dựa vào thời
gian chết của chuột tra bảng Sommer sẽ xác định được giá trị đơn vị chuột
(MU), từ đó tính được nồng độ độc tố PSP trong mẫu [18], [25].
Giới hạn phát hiện của phương pháp là 40 µg/100 g STX eq.
- Ưu điểm: thời gian thực hiện nhanh, có khả năng đánh giá được tổng các
độc tố và không đòi hỏi trang thiết bị phức tạp.
- Nhược điểm là độ nhạy thấp, không thể tự động hóa, bị ảnh hưởng bởi
các đặc tính động vật và đặc biệt là vấn đề đạo đức [17], [18].
1.4.2. Phương pháp xét nghiệm miễn dịch ELISA
ELISA (Enzym-linked immunosorbent assay) là một kĩ thuật sinh hóa để
phát hiện kháng nguyên hay kháng thể trong mẫu xét nghiệm, và thường được
quan sát bởi sự thay đổi màu sắc. Usleber và cộng sự bằng cách sử dụng các
kháng thể đa dòng đã phát triển thành công kit thử nghiệm cho STX. Giới hạn
phát hiện là 4 ng/g mô nhuyễn thể [21].
- Ưu điểm: Dễ thực hiện và thời gian phân tích ngắn.
- Nhược điểm: chi phí mua kit thử đắt, không có khả năng định danh và
phân loại các thành phần của độc tố PSP. Do đó, khi phát hiện mẫu thử dương
tính phải dùng phương pháp sắc ký để kiểm tra [18].
1.4.3. Sắc kí lỏng hiệu năng cao
Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao sử dụng detector huỳnh quang
(HPLC-FLD) là phương pháp chính thức trong phân tích STX và các dẫn chất
được AOAC công nhận. Ưu điểm của phương pháp là tự động, độ nhạy và độ
chọn lọc cao; nhược điểm là tốn nhiều thời gian vì STX phải được dẫn xuất hóa
trước cột hoặc sau cột để phân tích bằng detector huỳnh quang. Ngoài ra, việc
xác định STX phức tạp hơn do sự chồng chéo các sản phẩm oxi hóa các chất
tương tự STX trong trường hợp oxi hóa trước cột.

10

Bảng 1.3: Một số nghiên cứu sử dụng phương pháp HPLC-FLD để xác định
STX
Nền mẫu và điều kiện phân tích

TLTK

Kết quả

- Nền mẫu: sinh khối tảo khô
- Điều kiện sắc kí
+ Cột C18
+ Kênh A: acid octanesulfonic và heptanesulfonic
6 mmol/L, ammonium photphat 48 mmol/mL và
tetrahydrofuran 0,75% trong nước
[7]

+ Kênh B: acid octanesulfonic và heptanesulfonic
7 mmol/L, ammonium photphat 48 mmol/mL,
tetrahydrofuran 1% và ACN 10% trong nước
+ Oxi hóa trước cột

LOD =
0,035
(µg/g)
LOQ =
0,07
(µg/g)

+ Tốc độ dòng 1 mL/phút
+ Bước sóng kích thích: 330 nm
+ Bước sóng phát xạ: 390 nm.
- Nền mẫu: Trai, nghêu, sò, hàu
- Điều kiện sắc kí
+ Cột Angilent Zorbax Bonus RP (3,5 µm; 4,7 x 150
mm)
+ Kênh A: Heptane sulfonat 11 mM, H3PO4 5,5 mM
[22]

trong nước (pH = 7,1)
+ Kênh B: Heptane sulfonat 11 mM, H3PO4 16,5 mM,
methylnitril 11,5% trong nước (pH = 7,1)
+ Oxi hóa sau cột
+ Tốc độ dòng 0,8 mL/phút
+ Bước sóng kích thích và phát xạ: 330 nm và 390 nm

LOD =
0,017
µg/g
LOQ =
0,051
µg/g
Độ thu
hồi: 88%
– 113%


11

- Nền mẫu: Hàu, sò, hến
- Điều kiện sắc kí
+ Cột Supelcosil LC-18 (5 µm; 4,6 x 15 mm)
+ Kênh A : ammonium formate 0,1 M
[15]

+ Kênh B : ammonium forrmate 0,1 M trong 5%
ACN/H2O (pH = 6)
+ Oxi hóa trước cột
+ Tốc độ dòng 2 mL/phút
+ Bước sóng kích thích: 330 nm

LOD =
0,02 µg/g
LOQ =
0,06 µg/g
Độ thu
hồi: 70 –
104%

+ Bước sóng phát xạ: 390 nm

1.4.4. Sắc kí lỏng khối phổ (LC-MS/MS)
Gần đây phương pháp sắc kí lỏng tương tác ưa nước kết hợp với detector
2 lần khối phổ cho độ nhạy, độ đặc hiệu cao khi phân tích các PSP (HILICMS/MS).
Liyang Zuo [26] đã sử dụng kĩ thuật QuEChERS (nhanh, dễ dàng, giá
rẻ, hiệu quả, bền và an toàn) cho việc tách chiết, làm sạch và phát hiện 10 độc
tố PSP trong thực phẩm biển bằng HILIC-MS/MS ở chế độ ESI dương.
- Nền mẫu: nhuyễn thể + cá.

- Dung môi chiết: ACN/H2O (90:10, v/v).
- Làm sạch: dSPE (chất hấp phụ HLB và than hoạt tính GCB).
- Điều kiện sắc kí:
+ Cột: TSK-gel Amide-80® (3 µm; 2,0 x 150 mm).
+ Kênh A: HCOOH 0,1% trong ammonium formate 2 mmol/L.
+ Kênh B: HCOOH 0,1% trong ACN.
+ Chạy theo chương trình gradient.


12

Kết quả: Các nghiên cứu ở ba mức thêm chuẩn PSP trong khoảng 8,1225,5 µg/kg cho độ thu hồi trung bình từ 71,3% đến 104,6% với độ lệch chuẩn
tương đối (RSD) ≤ 15,8%.
Mattarozzi [17] đã tối ưu hóa phương pháp xử lý mẫu bằng kĩ thuật
QuEchERS để phân tích độc tố PSP bằng phương pháp HILIC-MS/MS.
- Nền mẫu: trai.
- Dung môi chiết: HCOOH 0,1%.
- Làm sạch: dSPE (chất hấp phụ polymeric ABS Elut – NEXUS).
- Điều kiện sắc kí:
+ Cột: TSK-gel Amide-80 (3 µm; 2,0 x 150 mm).
+ Kênh A: acetonitril 95% với 5% là amoni format 20 mM và acid
formic 26 mM (pH = 3,2).
+ Kênh B: 95% nước và 5% là amoni format 20 mM và acid
formic 26 mM (pH = 3,2).
+ Chạy theo chương trình gradient.
Kết quả: Phương pháp cho giới hạn phát hiện của các STX là 3 µg/kg,
giới hạn định lượng là 7 µg/kg; hiệu suất thu hồi trong khoảng từ 98 – 109%
tại mức thêm chuẩn LOQ và mức giữa đường chuẩn xây dựng.
Aversano [6] đã tiến hành phân tích các độc tố PSP bằng phương pháp
HILIC-MS. Nhóm tác giả đã tiến hành khảo sát dung môi pha động và lựa chọn

cột HILIC với các điều kiện như sau:
- Nền mẫu: Trai, sinh vật phù du.
- Dung môi chiết : ACN/H2O chứa HCOOH 0,1%.
- Điều kiện sắc kí:
+ Cột: TSK-gel Amide-80® (4,6 µm; 2,0 x 250 mm).
+ Kênh A: H2O chứa ammonium format 2 mM, HCOOH 3,6 mM
(pH = 3,5).


13

+ Kênh B: ACN/H2O (95/5, v/v) chứa ammonium format 2 mM,
HCOOH 3,6 mM (pH = 3,5).
+ Chạy theo chương trình gradient.
Kết quả: Có khả năng tách tốt với các độc tố STX, dcSTX, NEO. Tuy
nhiên các GTX không tách hoàn toàn khi đi qua cột Amide - 80 do hiện tượng
dính píc.
1.5. Tổng quan tóm lược về sắc kí lỏng khối phổ
Sắc kí lỏng khối phổ (LC-MS) là kĩ thuật phân tích dựa trên sự kết nối
giữa sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) và detector khối phổ (MS).
Phân tích khối phổ có tính chọn lọc, độ nhạy, độ đặc hiệu cao. Do vậy,
phân tích khối phổ càng được áp dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khoa học
công nghệ như xác định các đồng vị, xác định công thức cấu tạo, định tính, định
lượng các chất có trong dịch sinh học và trong các sản phẩm có nguồn gốc tự
nhiên. Đặc biệt dùng để phân tích hàm lượng vết trong mẫu có thành phần phức
tạp [1].
1.5.1. Sắc kí lỏng hiệu năng cao
Sắc kí lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột với pha tĩnh là chất rắn, pha
động là chất lỏng. Các chất phân tích di chuyển qua cột, tốc độ di chuyển khác
nhau liên quan đến ái lực tương đối của chất với pha tĩnh và pha động. Thành

phần pha động đưa chất phân tích di chuyển qua cột cần được điều chỉnh để rửa
giải các chất phân tích với thời gian hợp lý [1].
- Pha tĩnh trong HPLC
Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi cột có nhiệm vụ tách hỗn hợp gồm
nhiều thành phần. Đó là chất rắn xốp, có kích thước nhỏ, đường kính 3 – 10
µm, có độ phân cực khác nhau. Pha tĩnh được chế tạo từ các nhóm chức khác
nhau ghép hóa học trên giá mang, thường là các hạt silica. Tùy theo bản chất
pha tĩnh, người ta phân ra hai loại:


14

+ Sắc kí pha thuận: Pha tĩnh có bề mặt là các chất phân cực như triethylen
glycol; pha động là các dung môi hữu cơ ít phân cực như : n-hexan, toluen,
isopropyl ether. Trong sắc kí pha thuận, chất ít phân cực nhất được rửa giải đầu
tiên. Khi tăng độ phân cực của pha động, thời gian lưu giảm dần.
+ Sắc kí pha đảo: pha tĩnh là các silica đã được alkyl hóa, ít phân cực.
Trong sắc ký pha đảo, các chất phân cực nhất được rửa giải đầu tiên, khi tăng
độ phân cực của pha động thời gian lưu tăng lên [1].
- Pha động trong HPLC
Pha động là dung môi rửa giải các chất phân tích ra khỏi cột sắc kí. Pha
động có thể là dung môi hữu cơ, hoặc hỗn hợp dung môi theo tỷ lệ nhất định.
Trong sắc kí pha thuận, pha động là các dung môi hữu cơ ít phân cực như : nhexan, benzen, chloroform… Trong sắc kí pha đảo, pha động là hệ dung môi
hữu cơ phân cực như: methanol, acetonitril… hay hỗn hợp của chúng [1].
- Detector trong HPLC
Detector là bộ phận dùng để phát hiện các chất sau khi được tách riêng
và rửa giải ra khỏi cột sắc kí. Một chất khi đi qua detector sẽ cho tín hiệu đáp
ứng khác biệt với nền pha động, qua đó cho phép đánh giá, định tính, định
lượng các thành phần trong mẫu phân tích. Tùy thuộc vào tính chất lý hóa của
đối tượng chất cần phân tích, detector sẽ được lựa chọn thích hợp để những

chất này có đáp ứng với detector. Các loại detector thường được sử dụng trong
HPLC: hấp thụ UV-VIS, huỳnh quang, độ dẫn, khối phổ [1].
1.5.2. Khối phổ (Mass spectrometry)
Khối phổ là thiết bị phân tích dựa trên cơ sở xác định khối lượng phân
tử của các hợp chất hóa học bằng việc phân tách các ion theo tỉ số giữa khối
lượng và điện tích (m/z) của chúng. Các ion được tạo thành trong buồng ion
hóa, được gia tốc và tách riêng nhờ bộ phận phân tích khối trước khi đến
detector. Tín hiệu tương ứng với các ion sẽ được thể hiện bằng số vạch (píc) có


15

cường độ khác nhau tập hợp thành phổ khối. Nó cung cấp thông tin định tính
(khối lượng phân tử, nhận dạng các chất) xác định cấu trúc và định lượng các
chất [1].
Cấu tạo của thiết bị khối phổ gồm 3 phần chính : nguồn ion, thiết bị phân
tích, detector.
Hệ chân không
Nguồn ion

Phân tích khối

Detector

Bơm chân
không

Xử lý và ghi
số liệu

Hình 1.1: Sơ đồ của máy khối phổ
- Nguồn ion
Trong máy khối phổ có nhiều cách để ion hóa phân tử, nguyên tử mẫu ở
trạng thái khí hoặc hơi. Một số kỹ thuật ion hóa được sử dụng trong sắc kí lỏng
khối phổ: ion hóa phun điện tử, ion hóa hóa học,..Trong nghiên cứu này chúng
tôi sử dụng kĩ thuật ion hóa phun điện tử (ESI) [1].
Trong kĩ thuật ESI, các phân tử hóa chất và dung môi sau khi ra khỏi cột
sắc kí được đưa vào một ống mao quản bằng kim loại cao thế (3 – 5 kV). Sau
đó được phun mịn bằng khí N2 thoát ra xung quanh ống mao quản. Dưới tác
động của điện thế cao, có sự tạo thành các hạt nhuyễn mang điện tích thoát ra
từ đầu ống mao quản. Các phân tử dung môi bốc hơi, các hạt mang điện tích có
thể nhỏ dần. Sau đó các ion dương hay âm được tạo thành được đưa vào bộ
phận phân tách ion. Dung môi và khí trơ N2 được hút ra ngoài do một dòng khí
[1].