Thành phần hóa học của cây Dó bầu (Aquilaria crassna pierre)
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (6.62 MB, 50 trang )
ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
LỜI CẢM ƠN
Thực hiện một luận văn thạc sĩ là một công việc khó khăn mà em phải làm từ
trước cho đến nay. Trên con đường bắt đầu nghiên cứu khoa học thật không thể
ĐẶNG UY NHÂN
tránh khỏi nhiều bỡ ngỡ, khó khăn và nhiều lần thất bại … nếu không có những lời
động viên, sự giúp đỡ chân thành từ thầy cô, bè bạn và gia đình chắc chắn em
không thể hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp này. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành
đến tất cả mọi người.
THÀNH PHẦN HÓA HỌC LÁ CÂY DÓ BẦU
AQUILARIA CRASSNA PIERRE.
Em xin cảm ơn thầy Trần Lê Quan, người đã hết lòng lo lắng, giúp đỡ, tạo
mọi điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề tài. Thầy không chỉ truyền dạy cho
em những kiến thức chuyên môn sâu sắc mà còn hướng dẫn cho em nhiều điều bổ
ích trong cuộc sống.
CHUYÊN NGÀNH: HÓA HỮU CƠ
MÃ SỐ: 60 44 27
Em xin cảm ơn GS. Poul Erik Hansen và các cộng sự của thầy đã hết lòng
giúp đỡ em trong thời gian làm việc tại đại học Roskilde Đan Mạch.
Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến GS.TSKH. Nguyễn Công Hào, PGS.TS.
Nguyễn Ngọc Hạnh và thầy TS. Nguyễn Trung Nhân đã đóng góp nhiều ý kiến
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC
thiết thực quý báu để em hoàn chỉnh luận văn của mình.
Xin chân thành cảm ơn đến các thầy cô, các em sinh viên, những người bạn
khoa Hóa và phòng Thí nghiệm Phân tích trung tâm trường Đại học Khoa học tự
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS. TS. TRẦN LÊ QUAN
nhiên TP HCM, những người đã sát cánh cùng tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Xin cảm ơn em, vợ của tôi, người đã lo lắng, động viên, hỗ trợ hết lòng để tôi
vững bước trên con đường nghiên cứu khoa học.
Con xin cám ơn cha má, người đã sinh con ra và nuôi con khôn lớn đến ngày
hôm nay. Xin cha phù hộ cho con vững bước trên con đường này.
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – NĂM 2010
2.2.4. Hợp chất DB4.................................................................................... 25
MỤC LỤC
2.2.5. Hợp chất DB5.................................................................................... 28
Trang
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
Danh mục các chữ viết tắt
Lời mở đầu ........................................................................................................... 1
1. TỔNG QUAN ................................................................................................... 2
1.1. Giới thiệu về cây dó bầu ........................................................................... 2
1.1.1. Đặc điểm thực vật.............................................................................. 2
1.1.2. Phân bố .............................................................................................. 3
1.1.3. Phân loại ............................................................................................ 3
1.1.4. Đặc tính sinh học............................................................................... 4
1.1.5. Công dụng của trầm hương và kỳ nam ............................................. 5
1.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC ............................................................................ 6
1.2.1. Thành phần hóa học của trầm hương ................................................ 6
1.2.2. Thành phần hóa học thân cây dó bầu ................................................ 12
1.2.3. Thành phần hóa học trong lá cây dó bầu........................................... 14
1.3. PHƯƠNG PHÁP THỬ HOẠT TÍNH ỨC CHẾ GỐC TỰ DO DPPH• .................... 15
1.3.1 Khái niệm về gốc tự do ...................................................................... 15
1.3.2. Lợi ích của gốc tự do......................................................................... 16
1.3.3. Tác hại của gốc tự do......................................................................... 16
1.3.4. Gốc tự do DPPH• .............................................................................. 16
1.3.5. Phương pháp xác định khả năng chống oxy hóa............................... 17
2. NGHIÊN CỨU .................................................................................................. 19
2.1. Hoạt tính chống oxy hóa của các cao chiết từ lá cây dó bầu.................... 19
2.2. Thành phần hóa học lá cây dó bầu A. crassna.......................................... 21
2.2.1. Hợp chất DB1.................................................................................... 21
2.2.2. Hợp chất DB2.................................................................................... 22
2.2.3. Hợp chất DB3.................................................................................... 23
2.2.6. Hợp chất DB6.................................................................................... 29
2.2.7. Hợp chất DB7.................................................................................... 32
2.3. Hoạt tính chống oxy hóa của các chất cô lập ........................................... 35
2.4. Hàm lượng các chất trong lá dó bầu ......................................................... 36
3. THỰC NGHIỆM .............................................................................................. 37
3.1. Điều kiện thực nghiệm.............................................................................. 37
3.2. Thu hái – xử lý mẫu.................................................................................. 39
3.3. Thử nghiệm hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH......................................... 39
3.3.1. Quy trình thử hoạt tính ...................................................................... 39
3.4. Quy trình cô lập ........................................................................................ 41
3.4.1. Khảo sát cao ethyl acetate ................................................................. 41
3.4.2. Khảo sát cao butanol ......................................................................... 41
3.5. Định lượng các chất trong lá cây dó bầu .................................................. 43
3.5.1. Xử lý mẫu .......................................................................................... 43
3.5.2. Điều kiện phân tích............................................................................ 43
3.5.3. Xử lý số liệu phân tích ...................................................................... 45
4. KẾT LUẬN ....................................................................................................... 46
5. TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 48
PHỤ LỤC
1
LỜI MỞ ĐẦU
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Cây dó bầu hay còn gọi là cây trầm hương là loại cây có khả năng hình thành
AC
: acetone
ở phần lõi của thân một sản phẩm quí là trầm hương và kỳ nam có giá trị kinh tế rất
COSY : Correlation Spectroscopy
cao, nhất là trên thị trường quốc tế. Là loại cây đặc trưng phân bố ở vùng Đông
d
: doublet, mũi đôi
Nam Á, có khả năng tạo được sản phẩm có giá trị, lại thích nghi được với địa hình
dd
: mũi đôi đôi
đồi núi nên cây dó bầu được khuyến khích nhân giống và phát triển rộng rãi khắp
DEPT : Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer
các tỉnh trong cả nước. Theo thống kê của Hội Trầm hương đến nay đã có trên 23
DMSO : dimethyl sulfoxide
tỉnh thành trồng cây dó bầu với tổng diện tích hơn 8000 ha. Ước tính diện tích trồng
DPPH : 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl
dó bầu mỗi năm tăng từ 2400 - 4000 ha và đến năm 2010 diện tích trồng cây dó bầu
EA
trên cả nước có thể lên đến 30.000 ha.
: ethyl acetate
GC-MS : sắc ký khí ghép khối phổ
HE
: hexane
Việc phát triển loài cây quý này ngoài việc thu được nguồn lợi lớn về kinh tế
còn rất phù hợp để cải thiện tình hình môi trường ngày càng xuống cấp do nạn chặt
HMBC : Heteronuclear Multiple Quantum Correlation
phá rừng bừa bãi như hiện nay. Tuy nhiên do thời gian thu hoạch khá lâu và chưa có
HPLC : sắc ký lỏng hiệu năng cao
phương pháp cụ thể để tạo trầm, người dân chủ yếu dựa vào kinh nghiệm nên gặp
HR-MS : khối phổ phân giải cao
phải rất nhiều rủi ro. Vấn đề này ảnh hưởng rất lớn đến các doanh nghiệp trồng dó
HSQC : Heteronuclear Single Quantum Coherence
bầu nhất là các doanh nghiệp vừa và nhỏ, vì thế việc nghiên cứu một nguồn thu khác
J
: hằng số ghép spin
m
: multiplet, mũi đa
NMR
: cộng hưởng từ hạt nhân
nhanh hơn, ổn định hơn cho người dân trồng dó bầu là vô cùng cần thiết.
Đã có nhiều nghiên cứu về trầm hương (agarwood) và tinh dầu trầm được
công bố trong và ngoài nước, tuy nhiên cho đến nay có rất ít nghiên cứu về lá cây
PHPLC : sắc ký lỏng hiệu năng cao điều chế
dó bầu Aquilaria crassna. Để góp phần giải quyết vấn đề về nguồn thu cho người
q
: quartet, mũi bốn
dân cũng như mở rộng thêm những hiểu biết về cây dó bầu Việt Nam , trong đề tài
s
: singlet, mũi đơn
này chúng tôi tiến hành khảo sát thành phần hóa học trong lá của cây dó bầu A.
SKC
: sắc ký cột
crassna, thử nghiệm hoạt tính chống oxi hóa các cao chiết và hợp chất tinh khiết cô
t
: triplet, mũi ba
lập được từ đó đánh giá khả năng sử dụng lá dó bầu như nguồn nguyên liệu sản xuất
sản phẩm thứ cấp tạo nguồn thu mới cho người dân trồng dó bầu trong khoảng thời
gian chờ cây cho trầm.
2
3
Cây trên ba tuổi có thể ra hoa. Hoa nhỏ có
1. TỔNG QUAN
hình chuông màu vàng lục, trắng nhạt hoặc vàng
1.1. GIỚI THIỆU VỀ CÂY DÓ BẦU
xám. Hoa mọc thành chùm hay thành tán. Cây
Tên khoa học: Aquilaria crassna Pierre.
thường ra hoa, kết quả từ tháng 3 đến tháng 6.
Tên thông thường: cây trầm hương, dó bầu.
Họ: Trầm hương (Thymelacaceae )
Hình 1.3. Hoa dó bầu
Bộ: Mytales.
Hạt chỉ có một phần chính ở trên dạng nón và
Lớp: Magnoliopsida.
phần kéo dài ở dưới, vỏ ngoài hoá gỗ, bên trong
Hình 1.1. Cây dó bầu
mềm.
Quả khô, loại quả nang, hình quả lê có lông
1.1.1. Đặc điểm thực vật [2][3]
Cây dó bầu là loại cây thân gỗ sống lâu năm, có thể cao đến 30-40 m, đường
mịn, thông thường dài 4 cm, rộng 3 cm, dày 2 cm.
Hình 1.4. Quả dó bầu
kính 1-1.5 m, vỏ xám, tán thưa, thân thẳng, có xơ.
Cây dó bầu phân bố rải rác trong các khu rừng thuộc kiểu ẩm nhiệt đới
1.1.2. Phân bố
[2][3]
nguyên sinh hoặc thứ sinh, sống thích hợp trong rừng hỗn giao, cây lá rộng. Cây dó
Cây dó bầu thường mọc rải rác trong các vùng rừng dọc miền Trung và các
bầu có thể tái sinh bằng chồi hay bằng hạt, sinh trưởng và phát triển trong các điều
tỉnh phía Nam, xuống tận An Giang, Kiên Giang và đảo Phú Quốc, có nơi có mật độ
kiện nhiệt độ ban ngày 15-36 oC, ban đêm 5-25 oC.
cao đạt đến 120-150 cây/ha như Ba Rền (Quảng Bình), Hương Khê (Hà Tĩnh). Phân
Lá mọc so le, thuôn hay bầu dục ngọn giáo,
bố tập trung nhất và nhiều nhất là ở các tỉnh Quảng Ninh, Hà Bắc, Hoà Bình, Tuyên
nhọn ở gốc, thon hẹp ở đầu, phiến lá dài 8-10 cm,
Quang, Hà Tĩnh, Quảng Bình, Quảng Nam, Gia Lai, Kon Tum, Bình Ðịnh, Phú Yên
rộng 3.5-5.5 cm, có mép phồng lên thành vòng,
và Kiên Giang (đảo Phú Quốc và Hà Tiên).
mặt trên màu lục, sáng bóng, nhẵn, mặt dưới nhạt
1.1.3. Phân loại [5]
hơn, có lông mềm, cuống lá dài 4-6 mm.
Trên thế giới, có khoảng 25 loài dó bầu. Ở nước ta, cây dó bầu có tất cả bốn
loài A. crassna Pierre ex Lecomte, A. baillonii Pierre ex Lecomte, A. banaense
Pham-Hoang-Ho và A. rugosa L.C.Kiệt & PJ.A Kessler. A. rugosa L.C.Kiệt & PJ.A
Hình 1.2. Lá cây dó bầu
Kessler là loài được phát hiện gần đây (2005) do GS.TS Lê Công Kiệt (Việt Nam)
và TS. Paul Kessler (Hà Lan) tìm thấy ở cao nguyên Trung Bộ, đây được xem là
loài thứ 4 ở Việt Nam và thứ 25 trên thế giới.
4
5
1.1.4. Đặc tính sinh học [5]
Cây dó bầu có khả năng hình thành ở phần lõi của thân một loại sản phẩm
đặc biệt có giá trị kinh tế rất cao gọi là trầm hương hay kỳ nam. Những nghiên cứu
trước đây cho thấy, không phải bất kỳ thân cây dó bầu nào cũng có trầm hương và
kỳ nam. Chỉ có một số cây có bệnh mới chứa trầm ở phần lõi của thân cây và quá
trình này chỉ xảy ra đối với cây dó bầu còn sống.
Sản phẩm trầm hương hay kỳ nam là kết quả của cả một quá trình chuyển
hóa các bệnh lý ở những nơi cây bị bệnh, bị thương, hoặc bị tác động bởi những yếu
tố bên ngoài tạo nên vết thương. Ngày nay, người ta còn sử dụng các loài vi sinh để
Hình 1.5. Lõi cây dó bầu sau khi được cấy
tạo trầm ba tháng.
Hình 1.6. Trầm hương
tạo nên các vết thương cho cây nhằm tăng khả năng hình thành trầm hương.
Tùy thuộc vào sự tạo trầm hương mà có thể thu được những sản phẩm khác
nhau như :
Tóc: do sự biến đổi một phần chất gỗ hình thành những đường đen như sợi
tóc nhưng lượng tinh dầu ít nên chỉ được dùng làm nhang đốt.
Trầm hương: gỗ trầm hương nhẹ, có vị cay, hơi đắng, mùi thơm nhẹ, có
màu nâu hay sọc đen, ngấm tinh dầu trầm nhiều hơn tóc. Trầm hương càng tốt khi
nó càng dễ chìm trong nước. Khi đốt cháy trầm hương bốc khói lên hình vòng rồi
tan biến nhanh trong không khí.
Kỳ nam: loại tốt nhất do có sự biến đổi hoàn toàn của phần gỗ, thấm nhiều
1.1.5. Công dụng của trầm hương và kỳ nam [5]
Trong y học cổ truyền nước ta, trầm được coi là vị thuốc quý hiếm, có vị cay,
tính hơi ôn, có tác dụng giáng khí, nạp thận, tráng nguyên dương, được dùng chủ
yếu để chữa các bệnh như đau ngực, đau bụng, nôn mữa, tiêu chảy, đau dạ dày, hen
suyễn, lợi tiểu, giảm đau, trấn tĩnh, hạ sốt, á khẩu và khó thở.
Ở Ấn Độ và Trung Quốc, hương trầm còn được sử dụng để điều trị bệnh ung
thư, đặc biệt là bệnh ung thư tuyến giáp trạng.
Y học dân tộc Thái Lan dùng trầm hương để điều trị các bệnh tiêu chảy, lợi
tiểu, hạ sốt, chống nôn, bổ huyết và trợ tim.
tinh dầu trầm, sản phẩm này có thể có các màu nâu đậm, đen, xanh, vàng hay trắng.
Theo Đông y, kỳ nam dùng để trị các chứng độc thủy do phong thổ gây nên,
Kỳ nam nặng và nhuyễn, chìm trong nước, có đủ vị đắng, cay, chua, ngọt thơm,
làm tiêu chứng chướng mãn, no hơi, đau bụng, ói mửa, hen suyễn, thở gấp, hạ được
thường hình thành ở phần lõi của cây trầm hương. Kỳ nam chứa nhiều tinh dầu trầm
nghịch khí, thông chứng bế do khí hư gây nên.
nên khi cháy tạo ngọn lửa màu xanh, khói lên thẳng và cao, bay lơ lửng trong không
khí rất lâu. Người ta thường gói kỳ nam trong lá chuối thật kín rồi đem phơi nắng,
đến tối đem vào nếu có nhiều chất dầu chảy ra là tốt. Muốn giữ kỳ nam được tốt và
lâu thì nên bọc vào giấy thiếc, bỏ vào hộp có nắp đậy kín để tinh dầu khỏi bay hơi
hoặc chảy ra.
Nước sắc từ gỗ trầm có tác dụng kháng khuẩn, đặc biệt với các loại khuẩn
Mycobacterium tuberculosis và Shigella flexneri.
Trầm hương có tính cháy rất cao, khi đốt tỏa mùi rất thơm, nhiều quốc gia có
tập quán đốt trầm hương hoặc nhang sản xuất từ trầm hương trong dịp lễ cúng. Gỗ
trầm làm đồ trang trí nội thất quý giá.
6
7
R3
1.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC
1.2.1. Thành phần hóa học của trầm hương
2'
Từ những năm 1980, thành phần hóa học của trầm hương (agarwood) đã
R2
được nhóm các nhà khoa học như T. Nakanishi; nhóm Yasuo Shimada; nhóm
Masakazu Ishihara ; nhóm Tenji Konishi ; nhóm Regula Naf ... quan tâm và có
7
8
2
8'
1'
7'
6
R1
O
9
5
10 4
nhiều công trình nghiên cứu. Các báo cáo cho thấy thành phần hóa học chính trong
3'
5'
6'
3
O
1
R1 = OH, R2 =R3=H
2
R1 = OCH3, R2 =R3= H
3
R1 = R3= OCH3 ,R2 = H
4
R1 = R2= OCH3, R3= H
5
R1 = OH, R2 =H
6
R1 = H, R2 = OCH3
4'
trầm hương bao gồm các chromone và sesquiterpen. [7-11][14-18]
R1
Một số hợp chất chromone[10][11] được tìm thấy trong trầm hương như : 6hydroxy-2-(2-phenylethyl)chromone (1), 6-methoxy-2-(2-phenylethyl)chromone
O
R2
(2), 6-methoxy-2-[2-(3-metoxyphenyl)ethyl]chromone (3), 6,7-dimethoxy-2-(2phenylethyl)chromone (4), 5,8-dihydroxy-2-(2-phenylethyl)chromone (5), 6,7dimethoxy-2-[2(4'-methoxyphenyl)ethyl]chromone (6), (5S, 6S, 7R)-2-[2-(2'acetoxyphenyl)ethyl]-5,6,7-triacethoxy-5,6,7,8,8-pentahydrochromone
R2
(7),
(5S,6S,7R,8S)-2-(2-phenylethyl-6,7,8-trihydroxy-5,6,7,8-tetrahydroxy-5-[2(phenylethyl)chromonyl-6-oxy]chromone
(8),
O
R1
CH3CO
2,2'-di-(2-phenylethyl)-8,6'-
O
dihydroxyl-5,5'-bichromone (9), (5S,6S,7R,8S)-2-(2-phenylethyl)-6,7,8-trihydroxy5,6,7,8-tetrahydro-5-[2-(phenylethyl)-7-hydroxychromonyl-6-oxy]chromone
CH3CO
CH3CO
(10),
CH3CO
bi-(5S,6S,7R,8S)-2-(2-phenylethyl)-6,7,8-trihydroxyl-5,6,7,8-tetrahydro-5-[2(phenylethyl)chromonyl-6,7-dioxy]chromone (11)
O
7
O
O
O
O
O
OH O
OH
OH
8
HO
O
O
O
OH
9
8
9
(20), (-)-guaia-1(10),11-dien-15,2-olide (21), (-)-rotundone (22).
HO
O
CHO
O
OH
O
OH
O
O
OH
O
OH
13
12
R
10
14
O
O
OH
OH
O
15 R = CHO
OH
19
16 R = CH2OH
O
O
O
17 R = CO2H
OH
18 R = CO2CH3
O
H
H
H
H
O
20
O
H
O
O
21
OH
O
22
O
OH
Một số sesquiterpen có khung sườn eudesmane[9] cũng được cô lập từ trầm
11
hương (-)-selina-3,11-dien-14-al (23), (+)-selina-4,11-dien-14-al (24), (-)-methyl
OH
selina-3,11-dien-14-oate (25), (+)-methylselina-4,11-dien-14-oate (26), (+)-methyl
9-hydroxyselina-4,11-dien-14-oate
[8][24]
Một số hợp chất sesquiterpen có khung sườn guaiane
được tìm thấy
trong trầm hương như α-agarofuran (12), (-)-10-epi-γ-eudesmol (13), oxoagarospirol (14), guaiane (15), (-)-guaia-1(10),11-dien-15-ol (16), (-)-guaia1(10),11-diene-15-carboxylic
acid
(17),
methyl
guaia-1(10),11-diene-15-
carboxylate (18), (+)-guaia-1,(10),11-dien-9-one (19), (-)-1,10-epoxyguai-11-ene
(27),
(-)-dehydrojinkoh-eremol
(28),
neopetasane (29).
Năm 2006, nhóm nghiên cứu của S. Kadota đã cô lập được một sesquiterpen
có khung spirovetivane (4R,5R,7R)-1(10)-spirovetiven-11-ol-2-one (30).[30]
10
H
CHO
23
11
H
COOCH3
CHO
COOCH3
26
25
24
OH
08
(2R,4aS)-2-(4a-Methyl-1,2,3,4,4a,5,6,7-octahydro-2-napthyl)propanol
0.7
09
nor-Cetoagarofuran
0.5
10
epi-γ-Eudesmol
3.8
11
2-(1,2,3,4,5,6,7,8,8a-Octahydro-8,8a-dimethyl-2-naphtyl)propanal
0.5
12
Agarospirol
4.8
13
Jinkoh-eremol
4.7
14
Valerianol
5.6
O
O
OH
COOCH3
27
28
OH
29
30
Năm 1995, tác giả Regular Naf và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu thành
15
phần hóa học tinh dầu của một mẫu trầm hương có nguồn gốc từ Ấn Độ (A.
agallocha Roxb.), sau khi đem phân tích mẫu tinh dầu bằng các phương pháp
16
GC/MS thu được các kết quả sau [5] ( Bảng 1.1)
17
Bảng 1.1. Kết quả GC/MS của mẫu trầm hương A. agallocha Roxb. ở Ấn Độ
STT
Hợp chất
%GC/MS
18
01
(S)-4a-Methyl-2-(1-methylethyl)-3,4,4a,5,6,7-hexahydronaphthalen
0.6
02
β-Agarofuran
6.4
03
β-Vetispiren
1.4
04
4-Phenyl-2-butanon
3.5
05
α-Vetispiren
1.8
06
(1R,2R)-9-Isopropyl-2-metyl-8-oxatricyclo[7.2.1.01,6]-4,6-dodecadien
6.0
07
(1R,2R)-9-Isopropyl-2-methyl-8-oxatricyclo[7.2.1.01,6]-5-dodecadien
3.3
19
20
21
22
(1S,2S,6S,9R)-6,10,10-Trimethyl-11-oxatricyclo[7.2.1.01,6]dodecan-2carbaldehyde
4-(4-Methoxyphenyl)-2-butanon
(5R,10R)-2-Isopropyliden-10-methyl-spiro[4.5]-6-decen-6carbandehid
(2R,8S,8aS)-2-(1,2,6,7,8,8a-Hexahydro-8,8a-dimethyl-2-napthyl)-2propanol
(5R,7S,10R)-2-Isopropyliden-10-methyl-6-methylen-spiro[4.5]-7decanol
Dihydrokaranon
(2R,8R,8aS)-2-(1,2,3,5,6,7,8,8a-Octahydro-8,8a-dimethyl-2-napthyl)2-propenol
Karanon
0.9
2.4
1.1
4.4
0.6
6.6
2.7
2.2
12
13
O
1.2.2. Thành phần hóa học thân cây dó bầu[5]
H3CO
CH2OH
Năm 2007, Nguyễn Thị Thùy Trang và các cộng sự trường đại học Khoa học
tự nhiên HCM đã cô lập được một số hợp chất flavon, lignan và chromone trong
thân cây dó bầu A. crassna khi cây chưa có trầm như 5-hydroxy-7,4'dimethoxyflavone (31), 5-hydroxy-7,3',4'-trimethoxyflavone (32), 5,7-dihydroxy3',4'-dimethoxyflavone
(33),
dimethoxyphenyl)-2,3-bis
luteolin
(34),
HO
HO
CH2OH
OCH3
4-hydroxy-1,4-bis(4-hydroxy-3,5-
hydroxymethyl-1-oxo-butane
(35),
7-hydroxy-2-(2-
H3CO
OCH3
OH
phenylethyl)chromone (36), 6,7-dimetoxy-2-(2-phenylethyl)chromone (37), 5,5'35
bis [7-hydroxy-2-(2-phenylethyl)]chromone (38).
OCH3
OCH3
H3CO
O
OH
O
31
32
33
34
38
14
15
1.2.3. Thành phần hóa học trong lá cây dó bầu
Năm 2008, từ lá cây dó bầu A. sinensis phân bố ở Trung Quốc nhóm nghiên
HO
OH
OH
HO
OH
OH
cứu M. Shimazawa, M. Iinuma và các cộng sự đã cô lập được bốn hợp chất
mangiferin (39), iriflophenone 2-O-α-rhamnoside (40), genkwanin 5-O-βprimeveroside (41), iriflophenone 3,5-C,C-β-diglucoside (42), trong đó hợp chất 41
O
O
cho thấy hoạt tính nhuận tràng khi thử trên chuột thí nghiệm.[6]
HOH2C
OH
O
OH
O
44
43
OH
HO
O
HO
OH
O
HO
HO
HO
OH
OH
R2
HO
O
39
O
O
HO
O
R1
MeO
HO
O
O
OH
HO
O
HO
HO
H
OH H
OH
O
O
O
HO
HO
41
R1 = OCH3 R2 = OCH3 R3 = H R4= -1Glc6-1Xyl
O
49 R1 = OCH3 R2 = OH R3 = OH R4= OH
Mặc dù trên thế giới có rất nhiều nghiên cứu về trầm hương (agarwood )
cũng như cây dó bầu nhưng cho đến nay, chưa có nghiên cứu nào về thành phần hóa
OH
OH
46
48 R1 = OCH3 R2 = OH R3 = H R4= OH
R4
HO
O
45 R1 = -1Glc R2 = OH R3 = H R4= OCH3
47 R1 = OCH3 R2 = OH R3 = OCH3 R4=-1Glc
OH
O
O
40
OH
HO
HO
HO
R3
HO
OH
OH
OH
OH
H
O
OH
H
42
học cũng như hoạt tính chống oxy hóa của lá cây dó bầu A. crassna Pierre. phân bố
ở Việt Nam.
1.3. PHƯƠNG PHÁP THỬ HOẠT TÍNH ỨC CHẾ GỐC TỰ DO DPPH•
1.3.1. Khái niệm về gốc tự do
Năm 2009, nhóm nghiên cứu Bo-Yang Yu và các cộng sự cũng đã cô lập
Trong cơ thể chúng ta, oxygen giữ một vai trò rất quan trọng, nó tham gia
được từ lá cây dó bầu A. sinensis (Trung Quốc) một số hợp chất flavonoid và
vào hầu hết các quá trình sinh hóa trong cơ thể như hô hấp ở tế bào, sản sinh năng
benzophenone glycoside[12] là aquilarinoside A (43), 7-β-D-glucoside of 5-O-
lượng cung cấp cho mọi hoạt động sống của cơ thể, nhưng đồng thời chúng cũng
methylapigenin (44), iriflophenone (45), mangiferin (39), 5-O-xylosylglucoside 7,4-
hình thành những tiểu phân trung gian là gốc tự do như: O2•– ,... Các gốc tự do này
di-O-methylapigenin (46), 5-β-D-glucoside 7,3-di-O-methylluteolin (47), luteolin
kém bền, hoạt tính cao nên rất dễ dàng phản ứng với những đại phân tử như protein,
(34), genkwanin (48), hydroxygenkwanin (49).
lipid, DNA,… gây rối loạn quá trình sinh hóa trong cơ thể. Khi một phân tử bị các
16
17
gốc tự do tấn công, nó sẽ mất điện tử và trở thành một gốc tự do mới, tiếp tục phản
ứng với những phân tử khác tạo thành một chuỗi phản ứng thường gọi là phản ứng
dây chuyền, quá trình này gây ra các biến đổi có tác hại đối với cơ thể.
[1][19]
Gốc tự do được tạo ra bằng nhiều cách. Nó có thể là sản phẩm của những
căng thẳng thần kinh, cơ thể bị bệnh hay mệt mỏi, ô nhiễm môi trường, thuốc lá,
picrylhydrazine (DPPH-H) thì có màu vàng cam.[1][19]
Các chất có khả năng chống oxy hóa sẽ trung hòa gốc tự do DPPH• bằng
cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thu tại bước sóng cực đại và màu của dung
dịch phản ứng sẽ nhạt dần, chuyển từ tím sang vàng nhạt. Phản ứng trung hòa gốc
tự do DPPH• của chất chống oxy hóa được minh họa trong hình 1.7.
dược phẩm, tia phóng xạ mặt trời, thực phẩm có chất màu tổng hợp, nước có nhiều
chlorine và ngay cả từ oxygen ...
Ví dụ: một số gốc tự do như hydroxyl (HO•), hydroperoxyl (HOO•), peroxyl
•
(ROO ), alkoxyl (RO•), lipoperoxyd (LOO•) ...
1.3.2. Lợi ích của gốc tự do đối với cơ thể
Không phải gốc tự do nào cũng có hại đối với cơ thể. Nếu được kiểm soát ở
Chất chống oxy hóa
nồng độ thích hợp, nó là nguồn cung cấp năng lượng cho cơ thể, tạo ra chất mầu
melanine cần cho thị giác, góp phần sản xuất prostaglandins có công dụng ngừa
nhiễm trùng, tăng cường tính miễn dịch, làm dễ dàng cho sự truyền đạt tín hiệu thần
kinh, co bóp cơ.[1]
1.3.3. Tác hại của gốc tự do đối với cơ thể
Gốc tự do có tác dụng không tốt cho cơ thể, ngay từ lúc con người mới sinh
Hình 1.7. Phản ứng trung hòa gốc tự do DPPH•
ra mỗi tế bào chúng ta phải chịu sự tấn công của hàng chục ngàn gốc tự do mỗi
ngày. Nếu không được kiểm soát, kiềm chế, gốc tự do có thể gây ra các bệnh thoái
1.3.5. Phương pháp xác định khả năng chống oxy hóa
hóa như ung thư, xơ cứng động mạch, làm suy yếu hệ thống miễn dịch gây dễ bị
Xác định phần trăm ức chế I (%)
nhiễm trùng, làm giảm trí tuệ, teo cơ quan bộ phận ở người cao niên.
Khả năng chống oxy hóa của các hợp chất được tính dựa trên phần trăm ức chế.
1.3.4. Gốc tự do DPPH•
Phần trăm ức chế được xác định theo công thức :
Có rất nhiều mô hình được sử dụng để xác định khả năng chống oxy hóa
nhưng hiện nay phổ biến nhất là phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH•
I (%) =
vì phương pháp này đơn giản, nhanh chóng và cho kết quả có độ ổn định cao.
DPPH• ( 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl ) là gốc tự do tương đối bền, có màu tím
đậm, không tan trong nước nhưng tan trong dung môi hữu cơ. Dung dịch DPPH• có
cực đại hấp thu tại bước sóng 517 nm, và sản phẩm khử của nó là 2,2-diphenyl-1-
Trong đó:
I (%) : phần trăm ức chế.
Ac − As
* 100%
Ac
18
Ac : Giá trị mật độ quang của dung dịch không có hoạt chất (mẫu control).
19
2. NGHIÊN CỨU
GIỚI THIỆU CHUNG
As : Giá trị mật độ quang của dung dịch có hoạt chất (mẫu thật).
Xác định IC50
IC50 là giá trị dùng để đánh giá khả năng ức chế mạnh hoặc yếu của mẫu khảo
sát. IC50 được định nghĩa là nồng độ của mẫu mà tại đó có khả năng ức chế 50% gốc
tự do hoặc enzym. Mẫu có hoạt tính càng cao thì giá trị IC50 sẽ càng thấp.
Trong đề tài này chúng tôi tiến hành khảo sát thành phần hóa học, hoạt tính
chống oxy hóa của các cao chiết và chất tinh khiết thu được trong lá cây dó bầu
Aquilaria crassna Pierre. thu hái ở Lộc Ninh – Bình Phước. Hàm lượng các chất cô
lập trong lá cây dó bầu cũng được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu
năng cao ghép đầu dò UV-VIS.
• Phương pháp xác định IC50
¾ Tiến hành khảo sát hoạt tính của mẫu ở nhiều nồng độ khác nhau.
Với những mẫu có hoạt tính biến thiên tuyến tính theo nồng độ, chúng
ta vẽ đồ thị đường thẳng y = ax + b qua tất cả các điểm (với y là % ức
chế và x là nồng độ ).
KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
2.1. Hoạt tính chống oxy hóa của các cao chiết từ lá cây dó bầu
Khảo sát khả năng chống oxy hóa của lá cây dó bầu Aquilaria crassna
Pierre. bằng phương pháp thử nghiệm hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH trên các cao
chiết methanol, hexane, ethyl acetate, butanol, ethanol và cao nước từ lá cây dó bầu.
Kết quả thu được trình bày ở bảng 2.1
Với những mẫu có hoạt tính không biến thiên tuyến tính với nồng độ,
một cách gần đúng, ta chọn hai nồng độ ức chế trên và dưới 50 % và
Bảng 2.1. Kết quả hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH của các cao chiết từ lá cây dó bầu
cũng tiến hành vẽ đường thẳng y = ax + b. Ta sẽ thu được phương
trình y = ax + b với 2 hệ số a, b đã biết.
¾ Thay y = 50 % vào phương trình ta sẽ thu được giá trị x. Đó chính là giá
STT
1
MẪU
Cao ethyl acetate
trị IC50.
% ỨC CHẾ
IC50
10 µg mL-1
5 µg mL-1
2.5 µg mL-1
1 µg mL-1
µg mL-1
55.26
42.73
20.81
16.46
7.96
100 µg mL
-1
50 µg mL
-1
25 µg mL
-1
10 µg mL
-1
2
Cao methanol
92.49
85.41
51.50
22.82
24.21
2
Cao hexane
39.74
27.69
16.93
14.34
>100
3
Cao butanol
99.82
96.12
91.24
49.32
10.24
4
Cao nước A
57.43
38.86
28.40
22.46
79.99
5
Cao ethanol
99.18
88.65
63.79
29.75
36.31
Cao nước B
93.47
67.25
36.98
26.34
42.29
6
Cao nước A : cao nước còn lại sau khi trích lần lượt với các dung môi.
Cao nước B : cao nước thu được khi đun trực tiếp lá khô với nước.
20
21
Để có cơ sở đánh giá hoạt tính của những mẫu khảo sát, chúng tôi sử dụng
2.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC LÁ CÂY DÓ BẦU A. CRASSNA
quercetin làm chất đối chứng dương vì đây là chất có hoạt tính ức chế gốc tự do
Khảo sát thành phần hóa học trong lá cây dó bầu A. crassna Pierre. thu hái ở
DPPH mạnh, được sử dụng làm chất chuẩn trong các tài liệu tham khảo. Kết quả
Lộc Ninh – Bình Phước. Từ cao ethyl acetate và cao butanol chúng tôi đã cô lập
hoạt tính của chứng dương được trình bày ở bảng 2.2.
được bảy hợp chất tinh khiết DB1-DB7. Dựa vào các phương pháp phổ nghiệm hiện
đại 1D-NMR, 2D-NMR, HR-MS… cấu trúc các hợp chất đã được xác định.
OH
2.2.1. Hợp chất DB1
OH
Hợp chất DB1 thu được có dạng tinh thể hình kim màu trắng, sắc ký lớp
HO
O
mỏng cho vết hấp thu UV ở bước sóng 254 nm.
Phổ 1H-NMR của chất DB1, ở vùng trường cao cho mũi cộng hưởng ứng với
OH
OH
một nhóm –OCH3 δ 3.90 ( 3H, s). Những tín hiệu ở vùng từ 6 – 8 ppm, cho thấy sự
O
hiện diện của một vòng benzen mang hai nhóm thế ở vị trí 1, 4, hai cặp proton còn
Quercetin
lại ghép ortho với nhau [δ 6.88 (2H, d, J=9.0, H-2,6); δ 7.96 ( 2H, d, J=9.0, H-3,5)];
tín hiệu của một nhóm –OH δ 6.49 ( 1H, s).
Bảng 2.2. Hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH của chất đối chứng dương quercetin ở nồng
độ µM và nồng độ quy đổi µg mL-1
Nồng độ
% Ức chế
Phổ 13C kết hợp với DEPT-NMR của hợp chất DB1 cho tám tín hiệu tương
ứng với tám nguyên tử carbon, trong đó có một nhóm CH3O- ở δ 52.1, bốn carbon
10 µM
(3.4 µg mL-1)
5 µM
(1.7µg mL-1)
2 µM
(0.7µg mL-1)
1 µM
(0.3µg mL-1)
79.21
37.34
15.56
7.22
IC50
CH- của vòng benzen và ba carbon tứ cấp. Ở vùng trường thấp thấy tín hiệu của
6.52 µM
(2.2 µg mL-1)
carbon nhóm carbonyl liên hợp với vòng benzen ở δ 167.5 và carbon vòng benzen
liên kết với oxygen ở δ 160.3 ppm.
Những dữ kiện trên cho thấy hợp chất DB1 có cấu tạo là một vòng benzen
Nhận xét
Qua kết quả thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH của sáu mẫu cao chiết cho
mang hai nhóm thế -OH và nhóm CH3CO- ở vị trí 1,4. So sánh với dữ liệu trên thư
viện phổ SBDS (Spectral Database for Organic Compounds) thấy có sự trùng
thấy ngoài cao hexane, các cao còn lại đều có hoạt tính chống oxy hóa trong đó cao
khớp, từ đó có thể kết luận DB1 là methyl 4-hydroxybenzoate với những dữ liệu
nhất là cao ethyl acetate (IC50 7.96 µg mL-1) và cao butanol (IC50 10.24 µg mL-1 ) từ
phổ như sau:
đó giúp định hướng cho quá trình nghiên cứu thành phần hóa học trong lá cây dó
bầu.
1
H-NMR ( CDCl3-d1 ) δH 6.88 ( 2H, d, J = 9 Hz, H-2,6 ) ,7.96 ( 2H, d, J = 9
Hz , H-3,5), 6.49 ( 1H, s, 4-OH ) , 3.90 ( 3H, s , CH3O- )
Ngoài ra, cao nước và cao ethanol chiết trực tiếp từ lá cây dó bầu cũng thể
hiện khả năng chống oxy hóa với IC50 lần lượt là 42.29 µg mL-1 và 36.31 µg mL-1 .
13
C-NMR ( CDCl3-d1 ) δC 167.5 (-COO- ), 160.3 C-4), 132 (C-2,6), 122.3
(C-1 ) , 115.3 (C-3,5 ) , 52.1 (CH3O-)
22
23
3'
4'
2'
1
8
H3CO
7
9
O
2
1'
OH
5'
6'
10
6
4
3
5
OH
O
DB2 (7-O-methylapigenin )
DB1 (Methyl 4-hydroxybenzoate )
Bảng 2.3. Số liệu phổ 1H (500 MHz ) và 13C-NMR (125 MHz ) của DB2 trong DMSO-d6
so với 7-O-methylapigenin.
2.2.2. Hợp chất DB2
Hợp chất DB2 thu được có dạng tinh thể màu vàng, sắc ký lớp mỏng cho vết
hấp thu UV ở bước sóng 254 nm.
Phổ 1H-NMR của chất DB2 cho các mũi cộng hưởng ứng với sự hiện diện
của một nhóm – OCH3 liên kết với vòng benzen δ 3.87 (3H, s, 7-OCH3 ), một nhóm
–OH kiềm nối ở δ 12.97 ( 1H, s, 5-OH ), một proton olefin δ 6.85 (1H, s, H-3 ) . Ở
vùng trường thấp thấy xuất hiện các tín hiệu tương ứng với hai vòng benzen, một
vòng mang bốn nhóm thế, hai proton còn lại ghép meta với nhau [δ 6.38 ( 1H, d,
J=2.0, H-6 ); δ 6.78 ( 1H, d, J=2.0, H-8 )]; vòng thứ hai mang hai nhóm thế ở vị trí
1,4 bốn proton còn lại chia thành hai cặp ghép ortho với nhau [δ 6.94 (2H, d, J=7.0,
H-3’,5’); δ 7.97 ( 2H, d, J=7.0, H-2',6')]
Phổ 13C NMR của chất DB2 cho các mũi cộng hưởng ứng với sự hiện diện
của 16 carbon, vùng trường thấp có tín hiệu của một nhóm carbonyl liên hợp δ
181.9 (C-4 ), năm carbon hương phương liên kết với oxygen δ 165.1 (C-7), δ 164.1
Carbon
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1'
2'
3'
4'
5'
6'
5-OH
7-OCH3
DB2
δH
6.85 ( 1H, s)
6.38 ( 1H, d, J=2.4 )
6.77 ( 1H, d, J=2.4 )
7.98 ( 1H, d, J=9 )
6.95 ( 1H, d, J=9 )
6.93 ( 1H, d, J=9 )
7.96 ( 1H, d, J=9 )
12.96 ( 1H, s )
3.87 ( 3H, s)
δC
164.0
103.0
181.9
157.2
97.9
165.1
92.7
161.3
104.6
121.0
128.5
116.0
161.2
116.0
128.5
56.0
7-O-methylapigenin
δC
164.1
103.1
182.0
157.3
98,0
165.2
92.7
161.4
104.7
121.1
128.6
116.0
161.2
116.0
128.6
56.1
(C-2), δ 161.3 (C-5), δ 161.2 (C-4' ) và δ 157.2 (C-9 ), ở vùng trường cao còn có tín
hiệu của nhóm CH3O- liên kết với vòng benzen δ 56.0 (7-OCH3 )
Các tín hiệu phổ trên cho thấy chất DB2 là một flavonoid có khung sườn
apigenin với một nhóm thế CH3O- ở vị trí C-7. So sánh với tài liệu tham khảo
xác định hợp chất DB2 là 7-O-methylapigenin.
[25]
2.2.3. Hợp chất DB3
Hợp chất DB3 thu được dưới dạng tinh thể hình kim màu vàng, sắc ký lớp
mỏng cho vết hấp thu UV ở bước sóng 254 nm.
Phổ 1H-NMR của hợp chất DB3 cho những tín hiệu tương tự hợp chất DB2,
24
25
cho thấy đây cũng là hợp chất flavonoid có khung sườn apigenin. Tuy nhiên ở hợp
chất DB3 ở vùng trường cao còn xuất hiện thêm tín hiệu của một nhóm methoxy δ
3.89 ( 3H, s, 4'-OCH3 ), do vẫn còn tín hiệu nhóm -OH kiềm nối 12.81 (1H, s, 5OH) , nên nhóm methoxy này chỉ có thể liên kết với khung apigenin ở vị trí C-4'.
Phổ 13C kết hợp với DEPT-NMR của chất DB3 cũng cho thấy hợp chất có
tất cả 17 carbon, trong đó có hai nhóm CH3- , bảy nhóm -CH- và tám carbon tứ cấp.
Vùng trường thấp có tín hiệu của một nhóm carbonyl liên hợp δ 182.5 (C-4), năm
carbon hương phương liên kết với oxygen δ 165.5 (C-7), δ 164.1 (C-2), δ 162.6 (C4'), δ 162.2 (C-5) và δ 157.7 (C-9), ở vùng trường cao còn có hai tín hiệu của nhóm
CH3O- liên kết với vòng benzen δ 55.8 (7-OCH3 ) và δ 55.5 (4'-OCH3 )
Từ những dữ liệu trên kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo[32] có thể kết
luận hợp chất DB3 có cấu trúc xác định là 7,4'-O-dimethylapigenin.
9
10
1'
2'
3'
4'
5'
6'
5-OH
7-OCH3
4'-OCH3
7.84 ( 1H, d, J=7 )
7.03 ( 1H, d, J=7 )
7.03( 1H, d, J=7 )
7.84 ( 1H, d, J=7 )
12.81 ( 1H, s )
3.88 ( 3H, s )
3.89 ( 3H, s )
157.7
105.6
123.6
128.1
114.5
162.5
114.5
128.1
55.8
55.5
157.6
105.5
123.4
127.9
114.4
162.5
114.4
127.9
55.7
55.4
2.2.4. Hợp chất DB4
Hợp chất DB4 thu được dưới dạng tinh thể hình kim màu trắng. Sắc ký lớp
mỏng cho vết hấp thu UV λ 254 nm.
Phổ 1H-NMR của hợp chất DB4 cho thấy những mũi cộng hưởng với sự
hiện diện của một nhóm -OCH3 gắn trên vòng benzen ở δ 3.90 ( 3H, s, 7-OCH3 ); Ở
vùng trường thấp từ 6-8 ppm xuất hiện tín hiệu của hai vòng benzen. Vòng thứ nhất
mang bốn nhóm thế ở vị trí 1, 2, 3, 5, hai proton còn lại ghép meta với nhau [δ 6.86
(1H, d, J=2.0, H-6); 7.02 (1H, d, J=2.0, H-8 )],vòng thứ hai mang hai nhóm thế ở vị
trí 1, 4 , bốn proton còn lại chia thành hai cặp đối xứng ghép ortho với nhau [ δ 7.93
(2H, d, J =9, H-2',6'); δ 6.92 (2H, d, J=9, H-3', 5' )], một proton olefin δ 6.70 ( s,
DB3 (7,4'-O-dimethylapigenin )
1H, H-3 ). Ở vùng trường từ 3-5 ppm thấy xuất hiện tính hiệu của hai đơn vị đường
với hai proton anomer β-glucose δ 4.80 (1H, d, J=7.5 ) và đường β-xylose δ 4.19
1
13
Bảng 2.4. Số liệu phổ H (500 MHz ) và C-NMR (125 MHz ) của DB3 trong methanol-
Khối phổ HR-ESI-MS của DB4 cho mũi [M+H]+ ở m/z 579.1778 ( lý thuyết
d4 khi so với 7,4'-O-dimethylapigenin.
Carbon
2
3
4
5
6
7
8
DB3
δH
6.57 ( 1H, s)
6.37 ( 1H, d, J=2.4 )
6.48 ( 1H, d, J=2.4 )
(1H, d, J=7.5).
δC
164.0
104.4
182.5
162.2
98.0
165.4
92.6
7,4'-O-dimethylapigenin
δC
163.9
104.2
182.3
162.1
98.0
165.4
92.5
579.1708) tương ứng với công thức phân tử C27H30O14.
Phổ 13C-DEPT NMR của chất DB4 cho các mũi cộng hưởng ứng với sự hiện
diện của 27 carbon trong đó có bảy carbon tứ cấp, một carbon -CH3, hai carbon CH2, 16 carbon -CH. Ở vùng trường thấp có tín hiệu của một nhóm carbonyl liên
hợp δ 177 ppm (s, C-4); năm carbon hương phương liên kết với oxy ở δ 155-165
ppm. Ở vùng từ δ 60- 80 ppm thấy xuất hiện nhóm tính hiệu hiện diện của hai đơn
26
27
vị đường glucose và xylose và tín hiệu của carbon anomer của đường glucose δ
Bảng 2.5. Số liệu phổ 1H (500 MHz ) và 13C-NMR (125 MHz ) và tương quan HMBC của
103.5 ppm và đường xylose δ 104.4 ppm.
DB4 trong DMSO-d6
Từ các dữ kiện trên cho thấy hợp chất BD4 là một flavonoid có khung
apigenin mang nhóm thế methyl và hai đơn vị đường β-glucose và β-xylose.
Phổ HMBC của DB4 cho các tín hiệu tương tác giữa H-3 với C-2, C-4, C-10,
C-1' ; giữa H-6 với C-5, C-7, C-8, C-10 ; H-8 với C-6, C-7, C-9, C-10 ; H-2',6' và
H-3',5' cùng tương tác với C-4. Ngoài ra còn có tương tác giữa proton nhóm CH3Ovà C-7, proton anomer của đường glucose H-1'' và C-5, proton anomer đường
xylose và C-6'' .Từ đó có thể xác định được tất cả các tín hiệu carbon, proton và
cách liên kết của khung apigenin và phần đường..
Từ phổ NMR một chiều và hai chiều, kết hợp với tài liệu tham khảo[6] xác
định chất DB4 là 7-O-methylapigenin 5-O-[β–D-xylopyranosyl-(1→6)-β-Dglucopyranoside] có cấu trúc như sau.
H
H
H
6
4'''
HO
HO
5'''
4''
3'''
1'''
2'''
OH
H
HO
HO
H
6"
O
O
5''
3''
2''
7
9
5
O
O
3'
OH
4'
1
O
8
H3CO
2'
10
4
2 1'
6'
3
H
5'
H
H
O
1''
OH
H
DB4 (7-O-methylapigenin 5-O-[β –D-xylopyranosyl-(1→6)- β-D-glucopyranoside])
Carbon
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1'
2'
3'
4'
5'
6'
7-OCH3
1''
2''
3''
4''
5''
6''
1'''
2'''
3'''
4'''
5'''
DB4
δH
6.70 ( 1H, s )
6.86 ( 1H, d, J=2 )
7.02 ( 1H, d, J=2 )
7.93 ( 1H, d, J=9 )
6.92 ( 1H, d, J=9 )
6.92 ( 1H, d, J=9 )
7.93 ( 1H, d, J=9 )
3.90 ( 3H, s)
4.80 ( 1H, d, J=7.5 )
2.97 ( H, m )
3.11 (1H, m )
3.27 (1H, m )
3.30 (1H, m )
3.65 (1H, m )
3.98 (1H, m )
4.19 (1H, d, J=7.5)
3.56 (1H, m )
3.23 (1H, m )
3.02 (1H, m )
3.68 (1H, m )
δC
161.4
105.8
177.0
158.1
102.8
163.6
96.5
158.5
109.1
121.1
128.2
116.0
160.9
116.0
128.2
56.2
103.5
73.5
76.6
69.5
75.6
HMBC
C-4, C10, C-1', C2
C-7, C-8, C-10
C-6, C-7, C-9, C-10
C-4', C-6'
C-1', C-5'
C-1', C-3'
C-2', C-4'
C-7
C-5
68.7
104.4
73.5
75.9
69.8
65.6
C-6''
28
29
Bảng 2.6. Số liệu phổ 1H (500 MHz ) và 13C-NMR (125 MHz ) của DB5 trong DMSO-d6
2.2.5. Hợp chất DB5
Hợp chất DB5 thu được dưới dạng tinh thể màu vàng nhạt. Sắc ký lớp mỏng
cho vết hấp thu UV λ 254 nm.
Phổ 1H-NMR của hợp chất DB5 cho thấy tín hiệu của nhóm –OH kiềm nối ở
vùng trường thấp δ 13.82 (1H, s), sự hiện diện của ba proton vòng benzen ở δ 7.36
(1H, s), 6.82 (1H, s ) và 6.37 (1H, s ). Nhóm tín hiệu ở vùng từ 3-5 ppm cho thấy sự
hiện diện của một phân tử đường với proton anomer nằm ở vùng trường cao δ 4.58
(1H, d, J = 10 ), giá trị hằng số ghép lên đến 10 Hz, cho phép dự đoán đây là một
hợp chất C-glucoside.
Khối phổ HR-ESI-MS của DB5 cho mũi [M+H]+ ở m/z 423.0922 ( lý thuyết
423.0921) tương ứng với công thức phân tử C19H18O11.
Phổ
13
C và DEPT-NMR của hợp chất DB5 cho thấy những tín hiệu cộng
hưởng tương ứng với 19 carbon trong đó có tám nhóm -CH-, một nhóm -CH2- và
so với mangiferin.
DB5
Carbon
Mangiferin
δH
δC
δC
1
-
161.7
161.8
2
-
107.5
107.6
3
-
163.7
163.9
4
6.37, s
93.2
93.3
4a
-
156.1
156.2
5
6.82, s
102.4
102.6
6
-
154.7
154.3
7
-
143.9
143.3
8
7.36, s
107.6
108.0
8a
-
111.2
111.6
10 carbon tứ cấp. Ở vùng trường thấp có sự hiện diện của nhóm carbonyl tham gia
9
-
179.0
179.1
liên hợp δC 178.9, sáu carbon vòng benzen liên kết với oxygen δC 163.7 (C-3),
9a
-
101.2
101.3
161.7 (C-1), 156.1 (C-4a), 150.9 (C-4b), 143.9 (C-7). Nhóm tín hiệu ở vùng δC 60 –
10a
-
150.9
150.9
95 ppm cũng cho thấy sự hiện diện của một đơn vị đường C-glucoside với carbon
1'
4.58, d, J = 10
73.0
73.1
anomer ở δC 73.0 ppm.
2'
4.05, t, J = 9
70.6
70.7
3'
3.20, m
79.0
79.0
4'
3.14, m
70.2
70.2
5'
3.16, m
81.6
81.6
61.5
61.5
-
-
Từ những dữ liệu trên cho thấy DB5 là một xanthone C-glycoside, kết hợp
so sánh với số liệu đã công bố trong những nghiên cứu trước đây
[13]
có thể kết luận
DB5 là mangiferin.
3.68, d, J = 10.5
6'
HO
3
4
4a
O
10a
9
8a
10
5
6
OH
3.47, m
1-OH
13.81, s
6'
HO
HO
HO
4'
5'
O
2'
3'
1'
OH
7
2
9a
1
OH
8
O
OH
2.2.6. Hợp chất DB6
\
Hợp chất DB6 thu được dưới dạng dầu không màu, sắc ký lớp mỏng cho vết
hấp thu UV λ254 nm. Giá trị góc quay cực [α]D25 -148.5 (c = 0.017, CH3OH).
DB5 (mangiferin )
30
31
Phổ 1H-NMR của hợp chất DB6, ở vùng từ trường thấp có tín hiệu của ba
Kết hợp những dữ liệu phổ trên cho thấy hợp chất DB6 có cấu trúc tương tự
proton olefin δH 5.89 (1H, s, H-4), 5.98 (1H, d, J = 15.5, H-7), 5.73 (1H, dd, J =
với hợp chất (6R,9S)- roseoside, so sánh số liệu phổ đã công bố thấy có sự tương
15.5;7.5, H-8), hai proton H-7, H-8 ghép trans với nhau. Ở vùng từ 3-5 ppm có sự
hợp[31] , do đó đề nghị cấu trúc của hợp chất DB6 là (6R,9S)- roseoside.
hiện diện của một nhóm tín hiệu, tương ứng với một đơn vị đường β-D-glucose với
OH
proton anomer δH 4.28 (1H, d, J = 8, H-1’), một proton của carbon liên kết với
6'
oxygen δH 4.54 (1H, quint, J = 6.5, H-9).
4'
HO
Cặp tín hiệu tại δH 2.61 (1H, d, J = 16.5, H-2a) và δH 2.18 (1H, d, J = 16.5,
12
11
1'
2'
3'
H-2b) cho thấy sự hiện diện của hai proton metylen ở vị trí α so với nhóm carbonyl.
O
5'
HO
O
OH
H
H
7
Ở vùng từ trường cao có bốn tín hiệu của bốn nhóm methyl ở δH 1.04 (3H, s,
2
H-11), δH 1.06 (3H, s, H-12), δH 1.30 (3H, d, J = 6.5, H-10), và δH 1.96 (3H, s, H-
6
3
13) trong đó H-12 và H-11 là hai proton của hai carbon cùng gắn trên cùng một
carbon tứ cấp.
5
4
O
9
10
8
1
OH
13
H
H
DB6 [ (6R,9S)- roseoside ]
Khối phổ HR-ESI-MS của DB6 cho mũi [M+Na]+ ở m/z 409.1872 ( lý
thuyết 409.1832) tương ứng với công thức phân tử C19H30O8.
Phổ 13C-NMR và DEPT cho thấy tín hiệu tương ứng với 19 carbon trong đó
có bốn carbon tứ cấp, hai nhóm -CH2- , bốn nhóm CH3, chín nhóm CH. Tín hiệu
Bảng 2.7 Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz ) và 13C-NMR (125 MHz ) trong methanol-d4
của DB6 so với (6R, 9S)-roseoside.
của nhóm carbonyl liên hợp trong vòng ở δC 201.2 (C-3) và hai liên kết đôi C=C ở
δC 133.8 (C-7), 133.8 (C-8), 127.1 (C-4), 167.1 (C-5). Ở vùng 60-80 pmm cũng cho
Carbon
thấy sự hiện diện của một đơn vị đường glucose với carbon anomer ở δC 101.3 ppm
1
Dựa vào phổ COSY và HSQC ta có thể xác định được proton và các carbon
mang proton phần aglycone và phần đường của hợp chất DB6.
Phổ HMBC cho thấy tương tác giữa proton anomer với C-9 nên nhóm đường
β-D-glucopyranosyl liên kết với C-9. Tín hiệu tương tác giữa H-8 với C-6, H-7 với
C-6 và C5 giúp xác định vị trí của liên kết đôi C=C với C-6.
Mặt khác, ta thấy có sự tương quan giữa H-13 với C-6, C-4, C-5 nên nhóm
CH3-13 gắn ở vị trí C-5. Tương quan giữa H-11, H-12 với C-2, C-6, C-1 vậy hai
nhóm CH3-11 và CH3-12 gắn với C-1 và C-1 sẽ gắn với C-2 và C-6.
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
DB6
δH
2.18 ( 1H, d, J = 16.5 )
2.61( 1H, d, J = 16.5 )
5.89 ( 1H, s )
5.98 ( 1H, d, J = 15.5 )
5.73 ( 1H, dd, J = 15.5; 7.5 )
4.54 ( 1H, quint, J = 6.5 )
1.30 ( 3H, d, J = 6.5 )
1.04 ( 3H, s )
1.06 ( 3H, s )
δC
42.4
(6R, 9S)-Roseoside
δC
42.3
50.8
50.6
201.3
127.2
167.1
80.0
133.8
133.7
74.7
22.3
23.5
24.7
201.1
127.2
166.9
80.0
134.1
133.8
74.7
22.2
23.4
24.8
32
1.96 ( 3H, s )
4.28 ( 1H, d, J = 8.0 )
3.19 ( 1H, m )
3.37 ( 1H, m )
3.28 ( 1H, m )
3.17 ( 1H, m )
3.63 ( 1H, dd, J = 6.0; 11.5)
3.85 ( 1H, dd, J = 2.5; 11.5)
13
1'
2'
3'
4'
5'
6'
33
19.6
101.3
75.0
78.4
71.7
78.2
19.4
100.9
75.0
78.2
71.7
78.1
62.9
62.9
tứ cấp tại vị trí δC 105.4 (C-3), δC 159.0 (C-2), δC 160.3 (C-4), những tín hiệu tương
tác trên giúp xác định sự liên kết trong phân tử và có hai nhóm đường glucoside đối
xứng nhau liên kết với vòng benzen thứ hai và tại carbon C-3, C-5.
Từ những dữ liệu trên cho thấy hợp chất DB7 là hợp chất có khung sườn
iriflophenone liên kết với hai đường tại vị trí 3,5 của vòng benzen.
13
So sánh số liệu phổ
C-NMR với hợp chất iriflophenon 3,5-C,C-β-
diglucopyranoside trình bày trong bảng dưới cho thấy có sự tương hợp[12] , do đó đề
2.2.7. Hợp chất DB7
Hợp chất DB7 thu được dưới dạng dầu màu vàng nâu. Sắc ký lớp mỏng cho
nghị cấu trúc của hợp chất DB7 là iriflophenon 3,5-C,C-β-diglucopyranoside.
vết hấp thu UV λ 254 nm
Phổ 1H-NMR của hợp chất DB7, ở vùng từ trường thấp xuất hiện tín hiệu
OH
HO
của vòng benzen mang hai nhóm thế ở vị trí 1,4, hai cặp proton còn lại ghép ortho
4'''
với nhau [ δH 7.68 (1H, d, J = 8.5, H-2',6') và 6.81 (1H, d, J = 8.5, H-3',5') ]. Vùng
3'''
6'''
từ 3-5 ppm cũng cho thấy nhóm tín hiệu tương ứng với đơn vị đường β-D-glucose
đoán đây là một hợp chất C-glucoside.
HO
Khối phổ HR-ESI-MS của DB7 cho mũi [M+H] ở m/z 571.1723 ( lý thuyết
6''
4''
571.1657) tương ứng với công thức phân tử C25H30O15 trong khi đó phổ 13C-NMR
Phổ
O
OH
+
của DB7 chỉ cho thấy 15 tín hiệu, điều đó cho thấy DB7 có cấu trúc đối xứng.
13
C-DEPT NMR, ở vùng trường thấp cho thấy tín hiệu của một nhóm
carbonyl δC 198.7 (C-7), bốn carbon vòng benzen liên kết với oxygen δC 163.1 (C4'), 160.2 (C-4 ), 159.0 (C-2,6 ). Ở vùng từ 60-90 ppm, những tín hiệu cho thấy sự
hiện diện của đơn vị đường β-D-glucopyranosyl với carbon anomer ở δC 77.0, điều
này cũng cho thấy DB7 là hợp chất C-glucoside.
Phổ 2D-NMR, những tín hiệu trên COSY và HSQC cho phép xác định các
proton và các carbon mang proton phần aglycone và phần đường.
Phổ HMBC cho thấy có sự tương tác giữa tín hiệu proton của H2’,6’ và
nhóm carbonyl (C-7); H-2', 6' và C-3',5'; tương quan giữa proton anomer với carbon
2'''
5'''
HO
với proton anomer δH 4.95 (1H, d, J = 10), hằng số ghép lên đến 10 Hz cho phép dự
HO
HO
5''
3''
OH
1'''
5
6
4
OH
5'
6'
4'
O
1''
2"
OH
1
3
7
2
OH
1'
3'
2'
O
DB7 ( Iriflophenon 3,5-C,C-β-diglucoside)
OH
34
Bảng 2.8 Số liệu phổ 1H (500 MHz ) và
35
13
C-NMR (125 MHz ) của DB7 trong
methanol-d4 so với iriflophenon 3,5-C,C-β-diglucopyranoside
2.3. Hoạt tính chống oxy hóa của các chất cô lập được từ lá cây dó bầu A.
crassna Pierre.
Khả năng chống oxy hóa của các chất DB1-DB7 cô lập được từ lá cây dó
Iriflophenon 3,5-Cβ-diglucopyranoside
DB7
Carbon
δH
δC
δC
1
-
132.9
132.7
2, 6
-
159.0
158.9
3, 5
-
105.4
105.3
4
-
160.2
160.1
3', 5'
6.81 (2H, d, J = 8.5)
115.7
115.6
7
-
198.7
198.6
1'
-
108.6
108.7
2', 6'
7.68 (2H, d, J = 8.5)
133.1
133.0
1'', 1'''
4.95 (2H, d, J = 10)
77.0
76.9
2'', 2'''
3.71 (2H, m )
74.3
3'', 3'''
3.53 (2H, m )
4'', 4'''
5'', 5'''
6'', 6'''
bầu A. crassna Pierre. cũng được xác định bằng phương pháp thử nghiệm hoạt tính
ức chế gốc tự do DPPH. Kết quả thu được trình bày ở bảng 2.9
Bảng 2.9. Kết quả hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH của các chất DB1-DB7
% ỨC CHẾ
STT
1
MẪU
DB5
IC50 µM
50 µM
25 µM
12.5 µM
5 µM
99.53
94.80
87.94
48.94
100 µM
50 µM
25 µM
10 µM
5.14
2
DB1
7.24
6.15
5.58
2.51
>100
3
DB2
19.85
18.91
16.31
16.07
>100
4
DB3
16.23
14.58
10.16
4.84
>100
74.1
5
DB4
38.18
22.69
16.31
10.95
>100
79.4
79.1
6
DB6
4.43
4.21
3.35
2.50
>100
3.52 (2H, m )
71.1
70.9
7
DB7
41.60
35.78
34.99
30.26
>100
3.44 ( 2H, m )
82.7
82.5
Nhận xét
62.1
61.9
Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH của bảy hợp chất cô
3.80 (2H, m )
3.85 (2H, m )
lập từ lá cây dó bầu A. crassna cho thấy hợp chất DB5 ( mangiferin ) có hoạt tính
rất mạnh với IC50 5.14 µM so với chất đối chứng dương quercetin IC50 6.52 µM.
36
37
2.4. Hàm lượng các chất trong lá dó bầu Aquilaria crassna
3. THỰC NGHIỆM
Hàm lượng các hợp chất cô lập từ lá dó bầu DB1-DB7 được xác định bằng
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC-UV. Kết quả phân tích được trình
bày ở bảng 2.10.
3.1. ĐIỀU KIỆN THỰC NGHIỆM
Quá trình nghiên cứu thành phần hóa học, thử nghiệm hoạt tính chống oxy
hóa và xác định hàm lượng các chất được thực hiện trong điều kiện như sau
Dung môi- hóa chất
Bảng 2.10. Hàm lượng các chất DB1-DB7 trong lá cây dó bầu Aquilaria crassna.
Acetonitril ( Merck, HPLC )
Butanol (Trung Quốc )
Hàm lượng ( mg/g)
Ethanol ( Merck, Analysis )
MẪU
DB1
DB2
DB3
DB4
DB5
DB6
DB7
0.09
5.49
4.34
2.56
17.16
0.04
5.74
Ethyl acetate ( ChemSol )
Chloroform ( ChemSol )
Lá dó bầu khô
Nhận xét
Kết quả hàm lượng các hợp chất trong lá cây dó bầu cho thấy hàm lượng
DB5 ( mangiferin ) trong lá cây dó bầu rất cao lên đến 17.16 mg/g ( tương đương
1.7% trong lá khô) chứng minh đây là hợp chất chính trong lá. Điều này hứa hẹn
khả năng sử dụng lá cây dó bầu như nguồn nguyên liệu chiết xuất mangiferin cung
cấp cho ngành công nghiệp dược trong nước.
Hexane ( ChemSol, 60oC-90 oC )
Methanol ( Merck, HPLC )
Methanol ( ChemSoL, 99.9% )
DPPH ( Sigma )
Quercetin ( Sigma )
Dụng cụ - thiết bị
Sắc ký lớp mỏng tráng sẵn ( Merck, Kielselgl 60 F254, 250 μm). Các cấu
tử trên bảng mỏng được phát hiện bằng đèn UV ở bước sóng 254 nm
hoặc sử dụng H2SO4 20%, đun nóng.
Sắc ký cột được thực hiện trên silica gel Merck (40-60 μm, Merck )
Máy quang phổ Shimadzu UV-1800
Máy đo quang A. Kruss Optronic sử dụng để đo góc quay cực
Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao điều chế LC-8A ghép đầu dò UV-VIS
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân được đo trên máy Varian 300 MHz ( đại học
Roskilde Đan Mạch ) và máy Bruker AV 500 MHz ( đại học Khoa học tự
nhiên HCM )
Khối phổ phân giải cao HR-MS được đo trực tiếp trên đầu dò Bruker
microQ-TOF
38
39
Hình 3.1. Hình ảnh một số thiết bị sử dụng trong đề tài
3.2. THU HÁI – XỬ LÝ MẪU
Nguyên liệu lá cây dó bầu A. crassna Pierre. được thu hái ở Lộc Ninh – Bình
Phước được cung cấp bởi công ty TNHH Trầm Hương Việt. Lá cây tươi được phơi
trong mát trong hai tuần và sấy ở 60oC trong 24 giờ, sau đó nghiền nhỏ để sử dụng
trong thực nghiệm.
Lá cây dó bầu khô (2.5 kg) được trích bằng phương pháp đun hoàn lưu với
methanol trong ba giờ (mỗi mẫu đun ba lần), thu hồi dung môi ở áp suất kém thu
được 130 g cao metanol. Lấy cao thô này hòa tan vào nước và trích lỏng-lỏng lần
lượt với các dung môi như hexane, ethyl acetate, butanol thu được các cao tương
ứng và dịch nước còn lại (cao nước A). Các cao này được sử dụng để khảo sát thành
phần hóa học và thử nghiệm hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH.
Điều chế cao nước B: lá dó bầu khô ( 2 g ) cắt nhỏ đun hoàn lưu trong nước
ba lần, mỗi lần 30 phút, lọc và đem cô quay ở 40oC thu được cao nước.
Máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker 500 MHz
Máy cộng hưởng từ hạt nhân Varian 300 MHz
Điều chế cao ethanol: lá dó bầu khô ( 2 g ) cắt nhỏ đun hoàn lưu trong dung
dịch ethanol trong ba lần, mỗi lần 30 phút, lọc và đem cô quay ở 40oC thu được cao
ethanol.
3.3. THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH ỨC CHẾ GỐC TỰ DO DPPH
3.3.1. Quy trình thử hoạt tính
• Dung dịch DPPH : cân chính xác 3,94 mg DPPH pha trong bình định mức
100 mL bằng ethanol thu được dung dịch DPPH có nồng độ 100 µM.
• Dung dịch mẫu thử: cân một lượng xác định mẫu thử (khoảng từ 4-5 mg ),
Sắc ký hiệu năng cao điều chế PHPLC-LC8A
Khối phổ phân giải cao microQ-TOF
hòa tan trong 1000 µL ethanol. Sau đó pha loãng thành dung dịch có nồng độ 500
µg/ml rồi từ dung dịch này pha lần lượt thành các dung dịch có nồng độ là: 100
µg/ml, 50 µg/ml, 25 µg/ml, 10µg/ml theo thể tích trình bày trong bảng 3.1.
40
41
Bảng 3.1. Bảng pha nồng độ quy trình thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH
100 µg mL-1
Nồng độ
50 µg mL-1
25 µg mL-1
3.4. QUY TRÌNH CÔ LẬP
10 µg mL-1
Control
B
S
B
S
B
S
B
S
V1 mẫu (µL)
0
1200
600
600
300
300
150
120
60
V2 ethanol (µL)
1500
4800
900
5400 1200 5700 1350 5880 1440
V1 DPPH (µL)
1500
0
1500
0
1500
0
1500
0
1500
B : mẫu blank. S : mẫu thử.
-1
Mỗi mẫu ban đầu được thử ở bốn nồng độ khác nhau 100, 50, 25,10 µg mL .
Mỗi nồng độ được tiến hành ba lần, thu được ba giá trị phần trăm ức chế (I %). Lấy
trung bình ba giá trị đó ta sẽ xác định được giá trị phần trăm ức chế ứng với từng
nồng độ khảo sát.
Đối với những mẫu có hoạt tính mạnh IC50 < 10 µg mL-1 (hoặc µM ), pha
loãng dung dịch làm việc xuống nồng độ 50 µg mL-1 ( đối với mẫu cao chiết ) hay
50 µM ( đối với chất cô lập ) và tiến hành pha dung dich như bảng 3.1 được các
nồng độ (10, 5, 2.5, 1 µg mL-1 hay µM ) để xác định giá trị IC50.
Sau khi pha xong dung dịch mẫu thử, đem ủ trong bóng tối trong vòng 30
phút rồi đem đo quang tại bước sóng 517 nm quy trình thực hiện theo sơ đồ 1.
Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH của các cao chiết cho
thấy cao ethyl acetate và cao butanol có hoạt tính chống oxy hóa mạnh với IC50 lần
lượt là 7.96 µg mL-1 và 10.24 µg mL-1. Vì thế trong quá trình nghiên cứu thành
phần hóa học chúng tôi tập trung nghiên cứu trên hai loại cao trên.
3.4.1. Khảo sát cao ethyl acetate
Cao ethyl acetate (21 g ) được tiến hành sắc ký cột trên silica gel với hệ dung
môi hexane : ethyl acetate ( 9 : 1 tăng dần đến 1 : 9, kết thúc bằng metanol 100% )
thu được bảy phân đoạn từ AE1-AE7.
Phân đoạn AE2 (1.2 g ) : thực hiện sắc ký cột trên silica gel pha thuận với
hệ dung môi giải ly hexane : ethyl acetate ( 8 : 2 ) thu được hợp chất tinh khiết màu
trắng đặt tên là DB1 (15 mg ).
Phân đoạn AE3 ( 1.5 g ) : thực hiện sắc ký cột trên silica gel pha thuận với
hệ dung môi CHCl3-MeOH-H2O ( 90 : 10 : 0.1 ) thu được hai hợp chất tinh khiết
DB2 (32 mg ) và DB4 (10 mg ).
Phân đoạn AE5 (0.9 g ): thực hiện sắc ký cột tương tự với hệ dung môi
hexane : acetone ( 5 : 5 ) thu được hợp chất tinh khiết màu vàng DB3 (35 mg ).
3.4.2. Khảo sát cao butanol
V1 μL mẫu
V2 μL ethanol
Cao butanol (28 g ) được tiến hành sắc ký cột trên silica gel pha thuận với
hệ dung môi chloroform : methanol : nước ( 20:6:1; 14:6:1 ; 10:5:1, kết thúc bằng
metanol 100% ) thu được 25 phân đoạn BU1-BU25.
1500 μL dung dịch mẫu
− Thêm 1500 μL DPPH (100 μM)
− Ủ trong bóng tối 30 phút
Dung dịch sau ủ
Phân đoạn BU2 (2g ) thực hiện sắc ký cột với hệ dung môi chloroform :
methanol : H2O ( 80:20:2 ), thu được hợp chất màu vàng nâu kết tinh lại trong
methanol : chloroform 5 : 5 thu được tinh khiết màu vàng nhạt DB5 (1.2 g ).
Phân đoạn BU10 (0.8 g ) thực hiện sắc ký cột trên silice gel pha thuận với
hệ dung môi chloroform : aceton : metanol (4 : 3 : 1 ) thu được năm phân đoạn
BU10.1-BU10.5. Sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao điều chế (preparative HPLC )
Đo quang ở 517 nm
Sơ đồ 3.1. Quy trình thử nghiệm hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH
phân đoạn BU10.2 trên cột C18, hệ dung môi metanol : nước (24 : 76 ), tốc độ dòng
5 ml/phút, đầu dò UV ở bước sóng 254 nm thu được hợp chất DB6 (7 mg )
42
Phân đoạn BU20 (1.2 g ) thực hiện sắc ký cột silicagel pha thuận với hệ
43
3.5. ĐỊNH LƯỢNG CÁC CHẤT TRONG LÁ CÂY DÓ BẦU
dung môi ethyl acetate : methanol : nước (8 :1 :1) thu được sáu phân đoạn BU20.1-
Tiến hành xác định hàm lượng các hợp chất DB1 methyl 4-hydroxybenzoate ,
BU20.6. Sử dụng HPLC điều chế phân đoạn BU20.5 trên cột C18 với hệ dung môi
DB2 7-O-methylapigenin, DB3 7,4'-O-dimethylapigenin, DB4 7-O-methylapigenin
methanol : nước (17 : 83 ), tốc độ dòng 5 ml/phút, đầu dò UV ở bước sóng 254 nm
5-O-[β –D-xylopyranosyl-(1→6)- β-D-glucopyranoside], DB5 mangiferin, DB6
thu được hợp chất DB7 ( 25 mg )
(6R,9S)- roseoside và DB7 iriflophenon 3,5-C-β-diglucoside trong lá cây dó bầu A.
Khảo sát thành phần hóa học trong cao ethyl acetate và butanol của lá cây dó
bầu A. crassna Pierre. thu được bảy hợp chất DB1-DB7, sơ đồ quá trình cô lập được
miêu tả trong sơ đồ 3.2.
crassna Pierre.
3.5.1. Xử lý mẫu
Lá dó bầu khô được cân một lượng xác định (khoảng 1 g ) đun trong
methanol trong hai giờ (ba lần ). Ba lần được gộp chung lại và thu hồi dung môi ở
áp suất kém thu được cao methanol, hòa tan lại cao methanol trong bình định mức
25 mL, làm sạch mẫu qua cột SPE chuẩn bị tiêm vào máy.
3.5.2. Điều kiện phân tích
Hàm lượng các chất được phân tích trên máy sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép
đầu dò UV-VIS ( HPLC Shimadzu ), cột phân tích Supelco Ascentis TM C-18
25cm x 4.6mm 5µm điều kiện phân tích thay đổi tùy theo mỗi hợp chất như sau.
¾ Phân tích DB1: dung môi methanol : H2O 50 : 50 ( nước pH=2.5 điều
chỉnh bằng phosphoric acid ), tốc độ dòng 0.8 ml/phút, đầu đò ở bước sóng 254 nm.
Sắc ký đồ chuẩn và mẫu được trình bày trong hình 3.2-3.3.
Hình 3.2. Sắc ký đồ chuẩn DB1
Hình 3.3. Sắc ký đồ phân tích DB1 trong lá dó bầu
¾ Phân tích DB2, DB3: dung môi methanol : H2O 60 : 40 ( nước pH=2.5
điều chỉnh bằng phosphoric acid ), tốc độ dòng 0.7 ml/phút, đầu đò ở bước sóng 238
nm. Sắc ký đồ chuẩn và mẫu được trình bày trong hình 3.4-3.5.
Sơ đồ 3.2. Quá trình cô lập các chất trong lá cây dó bầu A. crassna Pierre.
44
45
¾ Phân tích DB6: dung môi methanol : H2O 22 : 78 ( nước pH=2.5 điều
chỉnh bằng phosphoric acid ), tốc độ dòng 0.8 ml/phút, đầu đò ở bước sóng 254 nm.
Sắc ký đồ chuẩn và mẫu được trình bày trong hình 3.10-3.11.
Hình 3.4. Sắc ký đồ chuẩn DB2, DB3
Hình 3.5. Sắc ký đồ phân tích DB2, DB3 trong lá dó bầu
¾ Phân tích DB4: dung môi methanol : H2O 40 : 60 ( nước pH=2.5 điều
chỉnh bằng phosphoric acid ), tốc độ dòng 0.8 ml/phút, đầu đò ở bước sóng 254 nm.
Hình 3.10. Sắc ký đồ chuẩn DB6
Hình 3.11. Sắc ký đồ phân tích DB6 trong lá dó bầu
Sắc ký đồ chuẩn và mẫu được trình bày trong hình 3.6-3.7.
¾ Phân tích DB7: dung môi methanol : H2O 15 : 75 ( nước pH=2.5 điều
chỉnh bằng phosphoric acid ), tốc độ dòng 0.9 ml/phút, đầu đò ở bước sóng 254 nm.
Sắc ký đồ chuẩn và mẫu được trình bày trong hình 3.12-3.13.
Hình 3.6. Sắc ký đồ chuẩn DB4
Hình 3.7. Sắc ký đồ phân tích DB4 trong lá dó bầu
¾ Phân tích DB5: dung môi acetonitril : H2O 25 : 75 ( nước pH=2.5 điều
chỉnh bằng phosphoric acid ), tốc độ dòng 0.9 ml/phút, đầu đò ở bước sóng 254 nm.
Sắc ký đồ chuẩn và mẫu được trình bày trong hình 3.8-3.9
Hình 3.12. Sắc ký đồ chuẩn DB7
Hình 3.13. Sắc ký đồ phân tích DB7 trong lá dó bầu
3.5.3. Xử lý số liệu phân tích
Kết quả hàm lượng được tính toán theo công thức :
S V
Hàm lượng = C ∗ 1 *
S Mm
2
Hình 3.8. Sắc ký đồ chuẩn DB5
Hình 3.9. Sắc ký đồ phân tích DB5 trong lá dó bầu
*f
C : Nồng độ của chuẩn (mg/ml )
f : hệ số pha loãng.
V : thể tích định mức (ml )
Mm : khối lượng mẫu (g )
S1 : diện tích peak mẫu.
S2 : diện tích peak chuẩn.
