Hóa sinh Phân lập các hợp chất chính có tác dụng chống oxi hóa trong lá chùm ngây (Moringa oleifera lam.)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

SALIHAH

LỜI CÁM ƠN

Luận văn này được hoàn thành, đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ của nhiều
tập thể và cá nhân. Tôi xin gửi lời cám ơn chân thành đến:
∗ PGS. TS. Trần Công Luận, người thầy đã tận tình hướng dẫn, định hướng,
động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
∗ Tập thể các thầy cô trong Bộ môn Sinh hóa trường Đại học Khoa học Tự

PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT CHÍNH
CÓ TÁC DỤNG CHỐNG OXI HÓA TRONG LÁ CHÙM NGÂY
(MORINGA OLEIFERA LAM.)

Nhiên TP. HCM đã tận tình dạy dỗ, truyền đạt những kiến thức nền tản quý
báu cho tôi.
∗ Các thầy cô, anh chị và các bạn ở Trung tâm Sâm và Dược liệu TP. HCM đã
giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi và môi trường làm việc vui vẻ trong thời gian
tôi thực hiện đề tài ở đây.

Chuyên ngành: Hóa Sinh
Mã số: 60 42 30

∗ Thầy Lương Văn Thanh, chị Lê Thị Thao, chị Thái Thị Cẩm Nguyệt và các
anh chị, bạn bè đồng nghiệp của trường THPH Thủ Thiêm đã động viên, hỗ
trợ về vật chất lẫn tinh thần, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi học Cao học.
∗ Anh Văn Đức Thịnh và các bạn học viên lớp Hóa sinh K18 đã cùng chia sẽ

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA SINH

buồn vui, cổ vũ tinh thần cho tôi những lúc tôi gặp khó khăn.
∗ Cám ơn gia đình luôn là động lực cho tôi phấn đấu trên bước đường của
mình.
Xin chân thành cảm ơn!

Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Trần Công Luận

Salihah.
Tp. Hồ Chí Minh, tháng 09 năm 2011

Tp. HCM, tháng 09 năm 2011


DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.18: Giá trị IC50 của cao cồn tổng và các cao phân đoạn
Bảng 3.19: Kết quả các phân đoạn thu được từ sắc ký nhanh – cột khô

Bảng 1.1: Hàm lượng dinh dưỡng của Chùm Ngây Moringa oleifera Lam.
Bảng 1.2: Các chất chống oxy hóa và cơ chế tác dụng
Bảng 2.1: Quy trình dựng đường chuẩn acid gallic
Bảng 2.2: Nồng độ các cao phân đoạn đem định lượng
Bảng 2.3: Thông số sắc ký cột cổ điển
Bảng 2.4: Dãy nồng độ của các phân đoạn cao đem thử hoạt tính quét gốc tự do
DPPH.
Bảng 2.5: Quy trình thử hoạt tính quét gốc tự do DPPH
Bảng 2.6: Quy trình thử năng lực khử
Bảng 2.7: Quy trình thử hoạt tính quét gốc hydroxyl tự do

Bảng 3.1: Kết quả giảm khối lượng do sấy khô
Bảng 3.2: Tỷ lệ giữa cọng và lá chét
Bảng 3.3: Độ ẩm bột dược liệu
Bảng 3.4: Độ tro toàn phần
Bảng 3.5: Độ tro không tan trong HCl
Bảng 3.6: Kết quả phân tích sơ bộ hóa thực vật trong lá Chùm Ngây
Bảng 3.7: Hiệu suất thu cao toàn phần từ lá Chùm Ngây
Bảng 3.8: Kết quả thu cao phân đoạn bằng phương pháp chiết lỏng – lỏng
Bảng 3.9: Kết quả định tính hóa học các cao phân đoạn
Bảng 3.10: Mối tương quan giữa hàm lượng acid gallic và giá trị OD758nm
Bảng 3.11: Hàm lượng phenolic tổng trong cao tổng cồn và cao phân đoạn
Bảng 3.12: Thông số thử hoạt tính quét gốc tự do DPPH trên cao cồn tổng
Bảng 3.13: Thông số thử hoạt tính quét gốc tự do DPPH trên cao eter
Bảng 3.14: Thông số thử hoạt tính quét gốc tự do DPPH trên cao cloroform
Bảng 3.15: Thông số thử hoạt tính quét gốc tự do DPPH trên cao etyl acetat
Bảng 3.16: Thông số thử hoạt tính quét gốc tự do DPPH trên cao nước
Bảng 3.17: Thông số thử hoạt tính quét gốc tự do DPPH trên vitamin C

Bảng 3.20: Các phân đoạn thu được từ sắc ký cột cổ điển
Bảng 3.21: Thông số phổ 1H (500 MHz, DMSO) và 13C-NMR (125 MHz, DMSO)
của chất I đối chiếu với vitexin
Bảng 3.22: Thông số phổ 1H (500 MHz, DMSO) và 13C-NMR (125 MHz, DMSO)
của chất II đối chiếu với isoquercitrin
Bảng 3.23: Thông số thử hoạt tính quét gốc tự do DPPH trên vitexin
Bảng 3.24: Thông số thử hoạt tính quét gốc tự do DPPH trên isoquercitrin
Bảng 3.25: Giá trị IC50 về khả năng quét gốc tự do của vitexin và isoquercitrin
Bảng 3.26: Năng lực khử của vitexin và isoquercitrin
Bảng 3.27: Hoạt tính quét gốc hydroxyl tự do của vitexin và isoquercitrin
Bảng 3.28: Giá trị IC50 về khả năng quét gốc hydroxyl tự do của vitexin và
isoquercitrin

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 3.23: Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của vitexin
Hình 1.1: Chùm Ngây Moringa oleifera Lam.

Hình 3.24: Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của isoquercitrin

Hình 2.1: Quy trình chiết xuất cao phân đoạn từ lá Chùm Ngây tươi

Hình 3.25: Giá trị IC50 về hoạt tính quét gốc tự do DPPH của vitexin và

Hình 3.1: Quy trình chiết cao cồn tổng và thu cao phân đoạn từ lá Chùm Ngây

isoquercitrin so với vitamin C

Hình 3.2: Đường chuẩn acid gallic

Hình 3.26: Năng lực khử của vitexin, isoquercitrin và vitamin C

Hình 3.3: Sắc ký lớp mỏng cao tổng và cao phân đoạn (hệ 1)

Hình 3.27: Hoạt tính quét gốc hydroxyl tự do của vitexin và isoquercitrin

Hình 3.4: Sắc ký lớp mỏng cao tổng và cao phân đoạn (hệ 2)

Hình 3.28: Giá trị IC50 về khả năng quét gốc hydroxyl tự do

Hình 3.5: Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của cao cồn tổng
Hình 3.6: Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của cao eter

Hình 3.7: Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của cao cloroform
Hình 3.8: Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của cao etyl acetat
Hình 3.9: Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của cao nước
Hình 3.10: Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của vitamin C
Hình 3.11: Giá trị IC50 về hoạt tính quét gốc tự do DPPH của cao cồn tổng và các
cao phân đoạn
Hình 3.12: Sắc ký lớp mỏng phân đoạn etyl acetat hệ 2
Hình 3.13: Sắc ký lớp mỏng phân đoạn C1, C2 từ sắc ký nhanh – cột khô (hệ 1)
Hình 3.14: Sắc ký lớp mỏng phân đoạn E1, E2, E3, E4 từ sắc ký nhanh – cột khô,
(hệ 1)
Hình 3.15: Sắc ký lớp mỏng phân đoạn EM từ sắc ký nhanh – cột khô (hệ 1)
Hình 3.16: Sắc ký lớp mỏng các phân đoạn thu được từ sắc ký cột cổ điển (hệ 1)
Hình 3.17: Sắc ký lớp mỏng chất I (hệ 1)
Hình 3.18: Sắc ký lớp mỏng chất I (hệ cloroform – metanol – nước 65 : 35 : 10, lớp
dưới)
Hình 3.19: Kết tinh hình kim màu vàng của chất II
Hình 3.20: Sắc ký lớp mỏng chất II (hệ 1)
Hình 3.21: Sắc ký lớp mỏng chất II (hệ cloroform – metanol 9 : 1)
Hình 3.22: Công thức cấu tạo của chất I và chất II


1

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
CHCl3: Cloroform
DPPH: 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl

MỞ ĐẦU

Cuộc sống hiện nay mang nhiều yếu tố bất lợi đối với sức khỏe của con

người, càng ngày con người càng đối mặt với nhiều căn bệnh nguy hiểm. Hầu như

EtOAc: Etyl acetat

90% nguyên nhân của bệnh tật hay lão hóa sớm đều trực tiếp hay gián tiếp do các

EtOH: Etanol

gốc tự do. Các gốc tự do tích lũy nhiều trong cơ thể sẽ tấn công các mô, nội tạng

GAE: Gallic acid equivalent – đương lượng acid gallic.

của cơ thể và gây ra bệnh tật. Các bệnh chứng do tác động của các chất oxy hóa

HTCO: Hoạt tính chống oxi hóa

ngày càng nhiều: tiểu đường, xơ vữa động mạch, đục nhân mắt, cao huyết áp, ung

MeOH: Metanol

thư… Chất chống oxy hóa có khả năng ngăn chặn những tổn hại của quá trình oxy

SKC: Sắc ký cột

hóa gây ra bởi các gốc tự do nên có thể ngăn chặn sự xuất hiện của bệnh tật, lão hóa.

SKLM: Sắc ký lớp mỏng

Do đó chất chống oxy hóa có vai trò quan trọng và không thể thiếu trong phác đồ
điều trị cũng như liệu pháp dự phòng các bệnh thoái hóa và ác tính. Vì thế trong

thời gian gần đây, chất chống oxy hóa có nguồn gốc tự nhiên ngày càng thu hút
nhiều sự quan tâm.
Bên cạnh đó, Chùm Ngây (Moringa oleifera Lam.) là loài cây hiện đang rất
được quan tâm về hoạt tính chống oxy hóa. Nhiều công trình nghiên cứu trên thế
giới đã và đang thực hiện nhằm làm rõ hoạt tính này của Chùm Ngây. Trong khi đó,
tại Việt Nam, những nghiên cứu trên đối tượng này chỉ mới bắt đầu và mang tính
khảo sát sơ nét về thành phần hóa học. Một vài nghiên cứu dược lý về hoạt tính
chống oxy hóa của Chùm Ngây cũng được thực hiện. Tuy nhiên, chưa nghiên cứu
nào trong nước chuyên sâu về thành phần hóa học của Chùm Ngây, cụ thể là xác
định cơ chế hóa học của khả năng chống oxy hóa của Chùm Ngây. Để tìm hiểu sâu
hơn về khả năng chống oxy của Chùm Ngây, nhằm sử dụng loài cây này hiệu quả
hơn, góp phần cho mục đích phát triển Chùm Ngây như một loại thuốc hay thực
phẩm chức năng chống oxy hóa, chúng tôi thực hiện đề tài “Phân lập các hợp
chính có tác dụng chống oxy hóa trong lá Chùm Ngây (Moringa oleifera L.)”.

Đề tài được thực hiện gồm các nội dung sau:


2

-

Xây dựng tiêu chuẩn nguyên liệu.

-

Phân lập các hợp chất chính có trong lá Chùm Ngây. Dự kiến kết quả:
phân lập được 2 hợp chất chính trong lá Chùm Ngây.

-

3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về cây Chùm Ngây:
1.1.1. Danh pháp và phân loại:

Xác định cấu trúc của các chất phân lập được thông qua các phương pháp
phổ. Dự kiến kết quả: xác định cấu trúc hóa học của 2 hợp chất chính

Chùm ngây, hay còn gọi là Chùm ngây cải ngựa, có tên khoa học là
Moringa oleifera Lam., nằm trong hệ thống phân loại như sau [50]:

trong lá Chùm Ngây.
-

Thử hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất phân lập được.

Nhằm mục đích phân lập được các hoạt chất có khả năng chống oxy hóa có
trong lá cây Chùm Ngây.

Giới:

Thực vật

(Plantea)

Ngành:

Ngọc lan

(Magnoliophyta)

Lớp:

Ngọc lan

(Magnoliopsida)

Phân lớp:

Sổ

(Dilleniidae)

Bộ:

Màn màn

(Capparales)

Họ:

Chùm ngây

(Moringaceae)

Chi:

Chùm ngây

(Moringa Adans.)

Loài:

Chùm ngây cải ngựa

(Moriga oleifera Lam.)

Chi Chùm ngây (Moringa) là chi duy nhất trong họ Chùm ngây
(Moringaceae). Chi này có 13 loài, tất cả trong số chúng đều là các cây thân gỗ sinh
sống trong khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới. Loài phổ biến nhất là Chùm ngây
Moringa oleifera Lam.. Loài cây này được trồng nhiều nơi trong khu vực nhiệt đới,
và là loài duy nhất của chi Moringa có mặt tại Việt Nam [2].
1.1.2. Hình thái học:
Cây nhỏ hay cây nhỡ, cao 5 – 10m. Vỏ cây dày, có khía rãnh. Thân non có
lông.
Lá kép, mọc so le, 3 lần lông chim, dài 30 – 60 cm, có 6 – 9 đôi lá chét hình
trứng, mọc đối.
Cụm hoa mọc thành chùy ở kẽ lá; lá bắc hình chỉ; hoa màu trắng, hơi giống
hoa họ Đậu; đài có 5 răng hình thuôn, uốn cong; tràng có 5 cánh hình thìa; nhị 5,
chỉ nhị có lông ở gốc, bầu thượng, 1 ô, có lông. Cây ra hoa vào tháng 1 – 2.


4

5

Quả nang treo, có thiết diện tam giác, dài 25 – 30 cm hay hơn, mở làm 3

1.1.3. Sinh thái học và phân bố:
Chùm ngây là loài cây nhiệt đới và cận nhiệt đới, thích hợp với đất cát khô

mảnh; hạt có 3 cạnh và có màu trắng, dạng màng [2].

và có khả năng chịu hạn hán. Theo một số báo cáo thì chi Chùm Ngây chịu được
nhiệt độ từ 18,7 – 28,5oC và pH khoảng 4,5 – 8 [6].
Cây có nguồn gốc ở Tây Bắc Ấn Độ, sau được đưa vào trồng rộng rãi ở Ấn
Độ, Hy Lạp, Philippin, Thái Lan, Malaysia, Pakistan, Singapore, Cuba, Nigeria...
Hiện nay tồn tại quần thể Chùm ngây mọc hoang ở cận Hymalaya, từ vùng Chenab
đến phía đông của Sarda (Ấn Độ) [2]. Ngoài ra, người ta còn tìm thấy Chùm Ngây
phân bố ở châu Phi, Madagascar.
Ở nước ta, cây này mọc hoang hoặc được trồng ở các tỉnh phía Nam từ Đà
Nẵng, Nha Trang, Phan Thiết vào đến Kiên Giang và cả đảo Phú Quốc. [2]
1.1.4. Thành phần hóa học:
(a)

Rễ cây Chùm Ngây

(b)

Chứa các hợp chất glucosinolat như:

4-(α-L-rhamnosyloxy)

benzyl

glucosinolat (khoảng 1%), sau khi chịu tác động của enzym myrosinase sẽ cho 4(α-L-rhamnosyloxy) benzylisothiocyanat, glucotropaeolin (khoảng 0.05%) và
benzylisothiocyanat [16].
Nhựa cây Chùm Ngây (Gôm)

Gôm chiết từ vỏ cây có chứa arabinose, galactose, acid glucuronic và vết
rhamnose. Từ gôm, chất leucoanthocyanin đã được chiết và xác định là
leucodelphinidin , galactopyranosyl, glucopyranosid [50].
Lá cây Chùm Ngây
(c)

(d)

Hình 1.1: (a): Chùm ngây Moringa oleifera Lam. Và các bộ phận lá (b),
hoa (c), quả (d)

Chứa các hợp chất thuộc nhóm flavonoid và phenolic như kaempferol 3-O- α
-rhamnosid, kaempferol, syringic acid, gallic acid, rutin, quercetin 3-O-β- glucosid.
Các flavonol glycosid được xác định đều thuộc nhóm kaempferid nối kết với các
rhamnosid hay glucosid [39].


6

7

Hoa Chùm Ngây
Hoa chứa polysaccharid được dùng làm chất phụ gia trong kỹ nghệ dược
phẩm [50].

10

P (mg)

110

70

204

11

K (mg)

259

259

1324

12

Cu (mg)

3,1

1,1

0,054

13

Fe (mg)

5,3

7,0

28,2

Hạt chứa glucosinolat như trong rễ, có thể lên đến 9% sau khi hạt đã được

14

S (g)

137

137

870

khử chất béo. Các acid loại phenol carboxylic như 1- β - D - glucosyl 2, 6 dimethyl

15

Oxalic acid (mg)

10

101

1,6

benzoat. Ngoài ra hạt còn chứa chất béo (33 – 38%) được dùng trong dầu ăn và kỹ

16

Vitamin A - β Caroten (mg)

0,11

6,8

1,6

nghệ hương liệu, thành phần chính gồm các acid béo như acid oleic (60 – 70 %),

17

Vitamin B - cholin (mg)

423

423

-

acid palmitic (3 – 12 %), acid stearic ( 3 – 12 %) và các acid béo khác như acid

18

Vitamin B1 - thiamin (mg)

0,05

0,21

2,64

Hạt cây Chùm ngây

behenic, acid eicosanoic và acid lignoceric [1].
Chùm ngây là mặt hàng thực phẩm quan trọng, được chú ý đến như là một

1.1.5. Công dụng và bộ phận dùng:
Rễ Chùm Ngây

nguồn dinh dưỡng tự nhiên của vùng nhiệt đới. Lá Chùm ngây giàu β-caroten,
protein, vitamin C, calcium, kali và dồi dào chất chống oxi hóa tự nhiên như acid

Rễ có vị đắng, được xem như một loại thuốc bổ cho cơ thể và phổi, điều kinh,
long đàm, lợi tiểu nhẹ. Ở Nicaragua, nước sắc rễ được dùng chữa bệnh phù thủng.

ascorbic, flavonoids, phenolic và carotenoid [36].
Kết quả phân tích hàm lượng dinh dưỡng của quả, lá tươi và bột khô

Dịch rễ được dùng ngoài để điều trị chứng mẩn ngứa do dị ứng. Trong rễ và hạt,
cũng có chất kháng sinh pterygospermin [13].

của lá cây Chùm Ngây có thể được tóm tắt như bảng 1.1 [13]

Pakistan dùng vỏ rễ dùng sắc lấy nước trị đau răng, đau tai. Hay rễ tươi của
Bảng 1.1: Hàm lượng dinh dưỡng của Chùm Ngây Moringa oleifera Lam.
STT

THÀNH PHẦN DINH

TRÁI

DƯỠNG/100gr

TƯƠI

01

Nước %

02

Calori

LÁ TƯƠI

cây non dùng trị nóng sốt, phong thấp, gout, sưng gan và lá lách.
Vỏ thân Chùm Ngây

BỘT LÁ
KHÔ

Vỏ cây được dùng điều trị chứng thiếu vitamin C, đôi khi dùng trị tiêu chảy.

86,9 %

75,0 %

7,5 %

26

92

205

đau bụng khi có kinh, sâu răng, làm thuốc thoa trị hói tóc, chữa đau cổ họng (dùng
chung với hoa của cây nghệ, hạt tiêu đen), trị tiểu ra máu, trị thổ tả [17].

03

Protein (g)

2,5

6,7

27,1

04

Chất béo (g)

0,1

1,7

2,3

05

Carbohydrat (g)

3,7

13,4

38,2

06

Chất xơ (g)

4,8

0,9

19,2

07

Chất khoáng (g)

2,0

2,3

_

08

Ca (mg)

30

440

2003

09

Mg (mg)

24

25

368

Ở Ấn Độ, người ta hay dùng vỏ thân chùm ngây để trị nóng sốt, đau bao tử,

Vỏ cây được người dân Campuchia dùng làm thuốc cho phụ nữ sau khi sinh
đẻ uống như là nước chóng lại sức.
Vỏ thân được Thái Lan dùng làm thuốc thông hơi.
Hay người dân Pakistan dùng vỏ thân để phá thai bằng cách đưa vào tử cung,
gây giãn nở.
Nhựa cây có công dụng giảm đau, chống sưng tấy.

8

Lá Chùm Ngây
Lá dùng uống để điều trị chứng hạ huyết áp và vò xát vào vùng thái dương
để trị chứng nhức đầu.
Lá còn được dùng để điều trị các vết cắt ở da, vết trầy xướt, sưng tấy, nổi
mẩn ngứa hay các dấu hiệu của lão hóa da.
Dịch chiết từ lá có tác dụng chống nhiễm trùng da. Nó cũng được dùng để
điều khiển lượng đường máu trong trường hợp bị bệnh tiểu đường. Dịch chiết từ lá
có thêm nước cà-rốt là một thức uống lợi tiểu [6].
Bột làm từ lá tươi có khả năng cung cấp năng lượng làm cho năng lượng
tăng gấp bội khi dùng thường xuyên. Lá cũng được dùng chữa sốt, viêm phế quản,
viêm nhiễm mắt và tai, viêm màng cơ, diệt giun sán và làm thuốc tẩy xổ. Sản phụ
ăn lá sẽ làm tăng tiết sữa. Ở Philippines lá được chỉ định dùng chống thiếu máu, do
chứa lượng sắt cao [7].
Dùng lá giã nát đắp lên vết thương bị sưng, nhọt; trộn với mật ong để đắp
lên bên ngoài mắt trị mắt sưng đỏ.
Ở Pakistan dùng lá giả nát đắp lên vết thương, trị sưng và nhọt, đắp và bọng
dịch hoàn để trị sưng.
Hoa Chùm Ngây
Hoa Chùm Ngây được Ấn Độ dùng làm thuốc bổ, lợi tiểu.
Quả, hạt Chùm Ngây
Quả dùng trị bệnh đau gan và tỳ, đau khớp, uốn ván và chứng liệt.
Ấn Độ dùng quả Chùm Ngây giã kỹ với gừng và lá Justicia gendarussa
làm thuốc đắp trị gẫy xương.
Hạt điều trị bệnh viêm dạ dày. Dầu hạt được dùng ngoài để điều trị nấm da.
Trường Đại học San Carlos ở Guatemala đã tìm ra một loại kháng sinh có tác dụng
như neomycin có khả năng bảo vệ da khỏi sự viêm nhiễm do Staphylococcus

aureus. Loại kháng sinh này là một hỗn hợp kháng khuẩn và nấm có tên
pterygospermin, danh pháp hóa học là glucosinolat 4 alpha-L-rhamnosyloxy benzyl
isothiocyanat [40]. Nhiều nơi trên thế giới dùng bột nghiền từ hạt để khử trùng nước

9

sông, nước sông trong mùa lũ có tổng số trực trùng Escherichia coli lên tới 1.600 18.000 / 100 ml, được xử lý bằng bột hạt Chùm Ngây trong vài giờ đồng hồ đã
giảm xuống còn 1 - 200 / 100 ml.
Hạt còn dùng trị chứng trướng bụng, khó tiêu và còn có tác dụng giảm đau.
Ở Philippines, chúng được xem là bạn thân của các bà mẹ vì có tác dụng làm lợi sữa.
1.2. Tình hình nghiên cứu cây Chùm Ngây
1.2.1. Trên thế giới:
Hoạt tính kháng nấm gây bệnh
Nghiên cứu tại Institute of Bioagricultural Sciences, Academia Sinica, Đài
Bắc (Đài Loan) ghi nhận dịch chiết từ lá và hạt Chùm Ngây bằng etanol có các hoạt
tính diệt được nấm gây bệnh loại Trichophyton rubrum, Trichophyton
mentagrophyte , Epidermophyton floccosum và Microsporum canis.
Rễ Chùm Ngây có hoạt tính kháng khuẩn và chứa nhiều các hợp chất kháng
khuẩn. Yếu tố kháng vi sinh vật là pterygospermin, có hoạt tính kháng khuẩn và
kháng nấm mạnh. Phức hợp tương tự, liên quan đến hoạt tính kháng khuẩn và
kháng nấm cũng được tìm thấy ở hoa. Dịch chiết rễ cũng có hoạt tính chống vi sinh
vật do sự có mặt của hợp chất 4- α-L-rhamnosyloxybenzyl isothiocyanat. Aglycon
của deoxy-niazimicin [N-benzyl, S-ethyl thioformat] phân lập từ phân đoạn
cloroform của dịch chiết etanol vỏ rễ cũng liên quan đến hoạt tính kháng khuẩn và
kháng nấm [20].
Tác dụng của quả Chùm Ngây trên cholesterol và lipid trong máu
Nghiên cứu tại Đại học Baroda, Kalabhavan, Gujarat (Ấn Độ) về hoạt tính
trên các thông số lipid của quả Chùm Ngây, thử trên thỏ, ghi nhận: Thỏ cho ăn
Chùm Ngây (200mg/kg mỗi ngày) hay uống lovastatin (6mg/kg/ngày) trộn trong
một hỗn hợp thực phẩm có tính cách tạo cholesterol cao, thử nghiệm kéo dài 120

ngày. Kết quả cho thấy Chùm Ngây và lovastatin có tác dụng làm hạ
cholesterol, phospholipid, triglycerid, VLDL (very low density lipoprotein), LDL
(low density lipoprotein) hạ tỷ số cholesterol/phospholipid trong máu so với thỏ
trong nhóm đối chứng [40].


10

11

Metyl phydroxybenzoat và β-sitosterol trong quả Chùm Ngây đã được

chống viêm loét và bảo vệ gan trên chuột. Dịch chiết nước của lá cũng có hoạt tính

nghiên cứu và chứng minh là có hoạt tính làm giảm huyết áp [44]. Rễ, lá, hoa, chất

chống viêm loét cho thấy rằng những phức hợp chống viêm loét là phổ biến trong

gôm, dịch chiết nước hạt Chùm Ngây đều có hoạt tính lợi tiểu, và những phức hợp

loài cây này. Cũng có những nghiên cứu công bố rễ Chùm Ngây có hoạt tính bảo vệ

có tính lợi tiểu này có khả năng đóng vai trò bổ sung cho hoạt tính hạ huyết áp của

gan. Dịch chiết nước và dịch chiết cồn hoa Chùm Ngây cũng có hoạt tính bảo vệ

loài cây này [27].

gan đáng kể, có thể là do sự có mặt của quercetin, một loại flavonoid phổ biến với

Dịch chiết thô lá Chùm Ngây có hoạt tính làm giảm đáng kể cholesterol
trong huyết thanh của chuột thí nghiệm có chế độ ăn giàu chất béo. Được cho là do

hoạt tính bảo vệ gan [28].
Các chất gây đột biến gen từ hạt Chùm Ngây rang chín

sự có mặt của thành phần hóa học β-sitosterol. Quả Chùm Ngây làm giảm bớt

Một số các hợp chất các chất gây đột biến gen đã được tìm thấy trong

cholesterol, phospholipid, triglycerid, LDL, VLDL, làm giảm các chỉ số lipid gây

hạt Chùm ngây rang chín: Các chất quan trọng nhất được xác định là 4 (α

xơ vữa động mạch, giảm lipid trong gan, tim, động mạch chủ của thỏ bị tăng

Lrhamnosyloxy) phenylacetonitril;

cholesterol huyết và làm gia tăng sự bài tiết cholesterol qua phân [6].

hydroxyphenyl-acetamid [6].

Các hoạt tính chống co thắt và bảo vệ gan

4-hydroxyphenylacetonitril

và 4-

Khả năng ngừa thai của rễ Chùm Ngây

Dịch chiết bằng nước nóng của hoa, lá, rễ, hạt, vỏ thân Chùm Ngây đã được

Nghiên cứu tại Đại học Jiwaji, Gwalior (Ấn Độ) về các hoạt tính kháng

nghiên cứu tại Trung Tâm Nghiên cứu Kỹ Thuật (CEMAT) tại Guatamala City về

estrogen, ngừa thai của nước chiết từ rễ Chùm Ngây ghi nhận chuột đã bị cắt

các hoạt tính dược học, thử trên chuột. Hoạt tính chống co giật được chứng minh

buồng trứng, cho uống nước chiết, có sự gia tăng trọng lượng của tử cung.

bằng thử nghiệm trên chuột đã cô lập, hoạt tính chống sưng thử trên chân chuột bị

Khi cho chuột uống nước chiết này chung với estradiol dipropionat

gây phù bằng carrageenan và tác dụng lợi tiểu bằng lượng nước tiểu thu được khi

(EDP) thì có sự tiếp nối tụt giảm trọng lượng của tử cung so sánh với sự gia

chuột được nuôi nhốt trong lồng. Nước trích từ hạt cho thấy tác động ức chế khá rõ

tăng trọng lượng khi chỉ cho chuột uống riêng EDP. Trong thử nghiệm

sự co giật gây ra bởi acetylcholin ở liều ED50= 65.6 mg/ml môi trường; tác động ức

deciduoma liều cao nhất 600mg/kg có tác động gây rối loạn sự tạo deciduoma

chế phụ gây ra do carrageenan được định ở 1000mg/kg và hoạt tính lợi tiểu cũng ở

nơi 50 % số chuột thử. Tác dụng ngừa thai của rễ Chùm Ngây được cho là do

1000 mg/kg.

nhiều yếu tố phối hợp.

Những nghiên cứu về tính dược lý của lá Chùm Ngây đã được tiến hành rộng
rãi, cho thấy những thành phần trong dịch chiết cồn có hoạt tính chống co thắt,

Hoạt tính kháng khuẩn của hạt Chùm Ngây
4 - (α-L-Rhamnosyloxy)benzyl isothiocyanat được xác định là có hoạt

thông qua việc phong tỏa kênh calci. Hoạt tính chống co thắt của dịch chiết cồn lá

tính kháng sinh mạnh nhất trong các hoạt chất trích từ hạt Chùm Ngây (trong hạt

Chùm Ngây là do sự có mặt của hợp chất 4-[α-[L-rhamnosyloxy] benzyl]-o-metyl

Chùm Ngây còn có benzyl isothiocyanat). Hợp chất trên ức chế sự tăng trưởng của

thiocarbamat [27]. Đây là cơ sở để lý giải vì sao lá Chùm Ngây được dùng để chữa

nhiều vi khuẩn và nấm gây bệnh. Nồng độ tối thiểu để ức chế Bacillus

bệnh tiêu chảy trong y học dân gian. Ngoài ra, hoạt tính chống co thắt từ những

subtilis là 56 micromol/l và để ức chế Mycobacterium phlei là 40 micromol/l

thành phần khác nhau còn là cơ sở dược lý để loài cây này được sử dụng trong điều

[16]. Dịch ép vỏ thân cũng thể hiện hoạt tính kháng Staphylococcus aureus. Dịch

trị rối loạn nhu động ruột. Dịch chiết metanol lá Chùm Ngây thể hiện hoạt tính

ép lá tươi cũng ức chế sự sinh trưởng của Pseudomonas aeruginosa

và


12

13

Staphylococcus aureus [20].

thái và vi học, cũng như đặc điểm của bột dược liệu lá Chùm Ngây.
Ngoài ra, công trình này cũng đã định lượng được flavonoid toàn phần

Hoạt tính kháng khối u và ung thư

có trong lá cây Chùm Ngây mọc tại Tp. Hồ Chí Minh và Đồng Nai,

Makonnen và cộng sự đã phát hiện lá Chùm Ngây có tiềm năng chống khối

giữa lá non và lá già. Từ đó, rút ra được mối tương quan giữa hàm lượng

u. Hợp chất o- etyl- 4- [α-L-rhamnosyloxy] benzyl carbamat cùng với 4 [α-L-

flavonoid trong lá với nơi cây mọc, cụ thể là hàm lượng flavonoid sẽ gia

rhamnosyloxy]- benzyl isothiocyanat, niazimicin và 3- O- [6′- O- oleoyl- α- D-

tăng khi cường độ chiếu sang vào cây (cường độ tia UV) tăng và hàm

glucopyranosyl]- β-sitosterol đã được khảo sát hoạt tính chống khối u, sử dụng mô

lượng flavonoid trong cây non sẽ cao hơn trong cây già [6].

hình phân tích in vitro [29]. Kết quả cho thấy chúng có hiệu quả ức chế đáng kể
virus Epstein – Bar. Niazimicin đã được đề nghị là chất có hiệu lực ngăn ngừa

-

Một nghiên cứu khác của Trung tâm phát triển Khoa học và Công nghệ
Trẻ Tp. HCM, 2010, cũng đánh giá được thành phần hóa học của Chùm

những tác nhân hóa học gây ung thư. Dịch chiết hạt Chùm Ngây cũng được nhận

Ngây sẽ khác nhau tùy theo từng bộ phận trên cây và tùy theo nơi mọc

thấy là có hoạt tính chuyển hóa chất gây ung thư gan, chống oxi hóa và kháng khối

của cây.

u trên da của chuột thí nghiệm [14].

Trước đó, những công trình nghiên cứu về Chùm Ngây trong nước chủ yếu
1.2.2. Tại Việt Nam:
Trong những năm gần đây, tại Việt Nam bắt đầu có những nghiên cứu tập
trung vào đối tượng Chùm Ngây, chủ yếu là các nghiên cứu về thành phần hóa học

và hoạt tính sinh học, tác dụng dược lý, nhằm có những biện pháp nghiên cứu, chế
biến và sử dụng hiệu quả đối tượng này. Trong số đó, một số công trình nghiên cứu
nổi bật đã được công bố:
-

tài liệu về thực vật và cây thuốc của Võ Văn Chi và Phạm Hoàng Hộ. Những
nghiên cứu khác mang tính nhỏ lẻ và hầu như chưa được quan tâm [1],[2].
1.3. Gốc tự do và chất chống oxy hóa:
1.3.1. Gốc tự do:
Khái niệm về gốc tự do (Free Radical-FR) được đề xướng lần đầu tiên

Đại học Y dược Tp. HCM, 2011, cũng đã có công trình nghiên cứu về
tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ gan của các dạng cao chiết từ lá cây
Chùm Ngây. Kết quả nghiên cứu cho thấy, cao lá Chùm Ngây trồng tại
Việt Nam có khả năng chống oxy hóa và bảo vệ gan. Khả năng này thể
hiện rõ nhất là dịch chiết lá Chùm Ngây bằng cồn 60% ở liều 0,2g/kg.
Nhận định này được rút ra dựa trên các nghiên cứu MDA, GSH, AST,
ALT.

-

hướng vào khảo sát đặc điểm hình thái học thực vật, hệ thống phân loại thực vật và
thống kê các công dụng dân gian của Chùm Ngây. Trong số đó, tiêu biểu là những

Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp. Hồ Chí Minh (2010) đã khảo sát được
trong lá Chùm Ngây có những nhóm hợp chất là: chất béo, tinh dầu,
carotenoid, triterpenoid, coumarin, flavonoid, tannin, acid hữu cơ. Đồng
thời, tác giả cũng đã khảo sát và ghi nhận được những đặc điểm về hình

năm 1954, do bác sĩ Denham Harman, đại học Berkeley- Califonia, đưa ra trong

luận thuyết về cơ chế tích tuổi (Free Radical Theory of Aging). Gốc tự do là
những phân tử có mang 1 điện tử đơn lẻ ở quỹ đạo vòng ngoài. Các điện tử đơn
lẻ có xu hướng nhận thêm điện tử để trở về trạng thái cân bằng hóa học. Do đó,
các gốc tự do có một thuộc tính đặc biệt quan trọng là có khả năng oxy hóa rất
cao.
Gốc tự do có thể nguồn gốc nội sinh hay ngoại sinh:
-

Gốc tự do nội sinh là những gốc tự do thường xuyên được sinh ra
trong cơ thể sinh vật thông qua các chuỗi chuyển hóa biến dưỡng,
hoạt động thực bào của bạch cầu, phản ứng viêm của mô tổn


14

15

thương… Gốc tự do phổ biến trong các trường hợp này là oxy
-

Với khả năng đưa các gốc tự do về trạng thái cân bằng, chất chống oxy

nguyên tử, gốc hydroxyl, gốc peroxyd, gốc alkoxyd…

hóa giữ vai trò quan trọng trong việc bảo vệ cơ thể chống lại tác hại của gốc tự

Gốc tự do ngoại sinh có trong môi trường sống xung quanh, có

do. Hệ thống bảo vệ, chống oxy hóa này bao gồm nhiều thành phần. Sự thiếu

thể được sinh ra do bức xạ mặt trời, tia X; sinh ra trong quá trình

hụt bất kỳ thành phần nào đều có thể gây giảm trạng thái chống oxy hóa toàn

chế biến thực phẩm như chiên, nướng, cũng có trong thành phần

phần.

của rượu bia, thuốc lá; hay có trong các chế phẩm hóa học như

Các chất chống oxy hóa gồm 2 loại: chất chống oxy hóa có bản chất

thuốc xịt côn trùng… Các gốc tự do này thường đa dạng và phức

enzym và không phải enzym:

tạp hơn.

¾ Hệ thống chống oxy hóa có bản chất enzym: Trong tế bào sinh vật luôn có

Trong cơ thể sinh vật luôn tồn tại một cơ chế cân bằng nhất định các gốc tự

cơ chế bảo vệ cơ thể chống lại tác động của gốc tự do bằng enzym. Enzym

do được sinh ra lẫn dung nạp vào cơ thể nhờ các chất chống oxy hóa. Tuy nhiên,

kháng oxy hóa có khả năng trung hòa gốc tự do và mỗi phân tử enzym có thể

khi vì một lý do nào đó làm phá vỡ hệ thống cân bằng này, các gốc tự do sẽ khởi

vô hiệu hóa hàng ngàn gốc tự do. Các enzym đó thường xuyên hiện diện

động những chuỗi phản ứng dây chuyền oxy hóa những chất nền trong cơ thể,

trong cơ thể từ trước khi có phản ứng tạo ra gốc tự do. Tiêu biểu là enzym

đáng chú ý là các lipid màng tế bào. Lipid màng tế bào khi đã bị oxy hóa sẽ bị

superoxyd dismutase (SOD), glutathion (GSH), enzym glutathione

thay đổi các đặc tính lý hóa, làm thay đổi các hoạt tính đặc hiệu, ảnh hưởng đến

peroxydase (GSH-Px), enzym catalase… mỗi enzym liên hệ vào từng phản

quá trình trao đổi chất qua màng tế bào. Đồng thời, khi vào trong tế bào, các gốc

ứng riêng biệt. Tuy nhiên, sự gia tăng quá mức do tác động của các yếu tố

tự do sẽ có thể tấn công DNA, RNA, protein, lipid, tấn công ty thể và các bào

bên ngoài dẫn tới phá vỡ sự cân bằng giữa các chất oxy hóa và khả năng thu

quan khác, hay làm biến đổi enzyme và rối loạn nội tiết tố (hormone) cũng thông

dọn của hệ thống enzym trong cơ thể.

qua phản ứng oxy hóa khử.

¾ Hệ thống chống oxy hóa không phải enzym: Gồm có 3 nhóm chính: nhóm

Theo ThS. BS. Phan Bích Nga- Viện dinh dưỡng, tổn thương do các gốc tự

polyphenol, nhóm thiol và nhóm các phối tử của kim loại (thường là sắt hay

do gây ra cho tế bào là cơ sở sinh bệnh học của những trạng thái bệnh thường gặp

đồng). Chúng có sẵn trong cơ thể hay được đưa từ ngoài dưới hình thức thực

ở những người có tuổi như vữa xơ động mạnh, bệnh tiểu đường, bệnh ung thư…

phẩm hay được bổ sung theo liều lượng nhất định. Các chất chống oxy hóa

Các nghiên cứu khoa học gần đây cũng cho thấy các phân tử sinh học bị tổn

bổ sung có thể có nguồn gốc từ tự nhiên hay được tổng hợp hóa học. Tác

thương sẽ gây ra tình trạng bệnh lý của tế bào và cơ thể sống như bệnh ung thư,

dụng triệt tiêu gốc tự do của chúng thể hiện ở một số tính chất sau:

chứng xơ vữa động mạch, các bệnh tim mạch, bệnh đái tháo đường, bệnh viêm
nhiễm, bệnh về da, bệnh Alzheimer…
1.3.2. Chất chống oxy hóa:
Chất chống oxi hóa là những chất có khả năng nhường điện tử cho những

-

Dạng oxy hóa của chúng có thể chuyển thành dạng lưỡng gốc và
như vậy chúng có thể phản ứng với hai gốc tự do nữa. Tuy nhiên,

gốc tự do hay đưa các gốc tự do về trạng thái cân bằng, làm mất đi tính thiếu ổn
định và dễ gây phản ứng hóa học với những phân tử khác.

Dạng khử của chúng có thể phản ứng với gốc tự do, tạo dạng oxy
hóa (quinon)

phản ứng này yếu.
-

Đặc biệt là dạng khử và dạng oxy hóa có thể phản ứng với nhau


16

17

tạo gốc semiquinon một cách thuận nghịch. Các gốc semiquinon

những chất này được gọi là sản phẩm thứ cấp. Những hợp chất thứ cấp ñóng

rất bền, có thể tồn tại lâu và không độc nên chúng là chất trung

vai trò quan trọng gồm có: alkaloid, terpenoid, phenolic, steroid và flavonoid.

hòa gốc tự do rất tốt.

Các chất này rất đa dạng về cấu trúc và kích thước, và được tìm thấy trong rất

Các loại chất chống oxy hóa, nguồn gốc và cơ chế tác dụng của chúng có

Bảng 1.2: Các chất chống oxy hóa và cơ chế tác dụng
Nguồn gốc

Chất điển hình

Chất có sẵn trong cơ Catalase,
thể

(bản

chất

nhiều loài thực vật khác nhau, mỗi loài có một dẫn xuất khác nhau. Cho đến
nay, người ta đã tìm thấy gần 100.000 các hợp chất thứ cấp ở thực vật khác

thể được tóm tắt trong bảng 1.2.

SOD,

Cơ chế
GSHR, Khử hóa superoxyd

là GSHPO…

nhau, và hàng năm một số lượng lớn các chất mới được phát hiện thêm.
Có nhiều phương pháp để thu nhận hợp chất thứ cấp ở thực vật, một
trong những cách đơn giản đó là thu nhận từ các cơ quan: rễ, thân, lá trong thực
vật, tất cả các cơ quan này ở thực vật đều có thể sản xuất hợp chất thứ cấp, đó

enzym)

là nguồn cung cấp nguồn nguyên liệu cho dược học. Tuy nhiên, trong điều
Chất chống EDTA
oxy hóa

Tạo phức với ion kim

kiện nuôi trồng tự nhiên năng suất của các hợp chất thứ cấp không ổn định

loại

theo các giai đoạn phát triển của thực vật, vì do sự ảnh hưởng của tuổi cây,

gián tiếp
Chất bổ
sung vào

thời gian thu hoạch, điều kiện dinh dưỡng…Do vậy, để thu nhận một lượng lớn
Chất chống oxy hóa chọn lọc: Tác động trực tiếp

hợp chất thứ cấp ổn định về hàm lượng và xác định đúng thời gian thu hoạch

vitamin C, natri ascorbat, với oxy

là một điều chúng ta cần quan tâm trong công tác thu hái làm dược liệu, tạo

ascorbyl

cơ thể
(không

Chất chống

phải

oxy hóa

enzym)

trực tiếp

palmitat,

natrithiosulfit,

natri

được nguồn nguyên liệu phục vụ trong sản xuất ở qui mô công nghiệp trong y
dược học.
Flavonoid

thioglycerol…
Chất ngắt mạch: các thiol Tác động trên các gốc

Flavonoid là một nhóm hợp chất tự nhiên lớn thường gặp trong thực

hydroanisol), tự do như R-, RO....

vật, phần lớn có màu vàng. Về cấu trúc hoá học flavonoid có khung cơ bản theo

BHA

(buthyl

BHT (buthyl hydroxytoluen), như những chất ngắt

kiểu C6 – C3 – C6 (2 vòng benzen A và B nối với nhau qua một mạch 3

hydroquinone,

carbon) và được chia làm nhiều nhóm khác nhau [10]. Cũng giống vitamin C,

vitamin

E, mạch.

propyl gallat…

các flavonoid được khám phá bởi một trong những nhà sinh hóa nổi tiếng nhất
của thế kỷ 20: Albert Szent- Gyorgyi (1893-1986). Ông nhận giải Nobel năm

1.4. Tổng quan về hợp chất flavonoid
1.4.1. Sơ lược về hợp chất thứ cấp flavonoid
Thực vật sản xuất ra một lượng lớn các chất hữu cơ mà có một số
chất không tham gia trực tiếp vào quá trình sinh trưởng và phát triển của cây,

1937 với những khám phá quan trọng về các đặc tính của vitamin C và
flavonoid.
Flavonoid thuộc nhóm hợp chất thứ cấp lớn gồm nhiều loại polyphenol
như: anthocyanin, flavanon, flavanol, flavon, flavonol, isoflavonoid…Các hợp

chất flavonoid được tạo ra ở trong mô thực vật nhằm chống lại tia UV.


18

19

Có khoảng trên 6000 hợp chất flavonoid tự nhiên có trong thực vật và

H
OH

nói chung là có nhiều trong thực vật bậc cao, một số hợp chất là sắc tố trong

O

thực vật nhưng cũng là những hợp chất có hoạt tính sinh học. Hầu hết các
flavonoid đều ở dạng glycosid, đều tan trong nước và tích luỹ trong không bào

Đặc tính lý - hóa: Quercetin kết tinh từ cồn, tinh thể màu vàng và ngậm
2 phân tử nước. Nhiệt độ nóng chảy là 314°C. Tan trong acid acetic băng, dung

của tế bào thực vật [9].
Flavonoid là nhóm hợp chất thứ cấp ở thực vật có rất nhiều chức năng
quan trọng và hữu ích cho sức khoẻ con người, từ việc tách chiết RNA và phân

dịch kiềm cho màu vàng, tan trong cồn, không tan trong nước. Có vị đắng.
Hấp thu cực đại ở bước sóng 258 nm và 375 nm.

tích sự biểu hiện gen cho thấy có sự xuất hiện 5 đoạn cDNA biểu hiện cho 5

Tác dụng dược lý của Quercetin:

enzym trong quá trình sinh tổng hợp flavonoid (phenylalanin ammonia-

-

Những nghiên cứu tương quan về dịch tễ học đã chỉ ra tác động tỉ lệ
nghịch giữa lượng flavonol sử dụng và số ca tử vong do bệnh xơ vữa

lyase, chalcone synthase, flavanon 3-hydroxylase, dihydroflavanol 4-reductase
and anthocyanidin synthase). Sự hoạt hoá của các gen trong quá trình sinh tổng

động mạch vành. Tính chất chống oxy hoá của flavonol thể hiện

hợp flavonoid đồng thời có sự tập trung flavonoid và acid hydroxycinnamic

trong các cơ chế đáp ứng có tác động ngăn ngừa xơ vữa động mạch
vành đã được biết đến rộng rãi.

được xác định trong lá đang phát triển dưới điều kiện trực tiếp của ánh sáng mặt
trời, so sánh với lá trong tối của một số thực vật tương tự. Cyanidin của

-

Riêng tác động chống cao huyết áp chỉ được biết đến gần đây.

anthocyanins và quercetin flavonol có vai trò ưu thế hơn trong việc chống lại

Nghiên cứu trên chuột bị chứng cao huyết áp tự phát, người ta nhận

ánh sáng cao của mặt trời trong lá Vaccinium myrtillus L. Flavonoid có vai trò

thấy sử dụng quercetin làm giảm huyết áp tâm trương, tâm thu, có

trong việc bảo vệ thực vật chống lại bức xạ cao của mặt trời [25].

tác động tốt đối với chứng phì đại thất trái và rối loạn chức năng nội
mô [23].

Quercetin
Nguồn gốc: Quercetin thuộc nhóm flavonol xuất hiện phổ biến trong rau,

-

Quercetin và kaempferol có tác dụng chống viêm do ức chế tác
dụng của protein kinase, phospholipase, cyclooxygenase, và

quả và rượu vang. Lượng flavonol và flavonon dùng hàng ngày khoảng 23
mg/người, trong đó quercetin chiếm 60%. Quercetin đầu tiên được chiết xuất

lipooxygenase, cũng như ức chế sự giải phóng những chất trung gian

từ cây Rhododendron cinnabarium Hook., Ericeace. Hiện nay, quercetin được

của viêm từ bạch cầu.
-

chiết xuất chủ yếu từ hoa Hòe, Mạch Ba Góc.

Quercetin được biết nhiều nhất như tác nhân kháng viêm, kháng dị
ứng do cơ chế cân bằng màng đại thực bào, ngăn ngừa sự giải phóng
histamin và các tác nhân kháng viêm khác. Vì vậy, quercetin được

Công thức hóa học:
O
H
HO

O

O
H
O

chỉ định trong các trường hợp hít phải các chất dị ứng, hen suyễn,
eczema, bệnh vảy nến, bệnh gout và viêm loét kết tràng [24].
1.4.2. Chiết xuất flavonoid
Không có một phương pháp chung nào để chiết xuất các flavonoid vì


20

21

chúng thường rất khác nhau về độ tan trong nước và trong các dung môi

Dịch chiết thường đem cô giảm áp ở nhiệt độ thấp (40-70º). Đối với

hữu cơ. Các flavonoid glycosid thường dễ tan trong các dung môi phân cực,

những chất dễ bị biến đổi thuộc các nhóm flavan-3-ol, anthocyanin, flavanon,

các flavonoid aglycon dễ tan trong các dung môi kém phân cực. Các dẫn chất

chalcon glycosid thì nên làm đông khô.

flavon, flavonol có nhóm OH tự do ở vị trí C7 tan được trong dung dịch
kiềm loãng [9].
Tuy nhiên việc chiết xuất cũng tuân theo một số nguyên tắc sau:
-

-

-

Trong định tính để đảm bảo chiết xuất đầy đủ chất, việc chiết xuất

tuy nhiên khó thực hiện ở quy mô lớn. Dược liệu khô được bảo

flavonoid được thực hiện với dung môi qua 2 bước sau: đầu tiên chiết với

quản tốt vẫn đáp ứng yêu cầu chiết xuất flavonoid.

MeOH-H2O (9:1) sau đó với MeOH-H2O (1:1). Lượng dung môi chiết nên cho

Trong dược liệu flavonoid thường ở dạng glycosid tan được

vừa đủ, để yên trong 6- 12 giờ. Lọc lấy dịch chiết qua bông gòn, bông thuỷ tinh

trong các dung môi như MeOH, EtOH nóng hoặc nguội. Dung

hay giấy lọc trong phễu Buchner. Gộp chung hai dịch chiết và cô giảm áp để

môi này có thể hoà tan 1 số flavonoid ở dạng tự do có nhiều

loại hết MeOH. Dịch chiết nước thu được có thể loại tạp ít phân cực như dầu

nhóm OH nên MeOH và nhất là EtOH cao độ (70- 90º) thường

béo, terpen, chlorophyll, xanthophyll…bằng cách lắc với hexan, heptan hay

được dùng.

ether dầu hoả. Gộp các dịch nước chứa phần lớn khối lượng flavonoid sau khi

Dược liệu được xay nhỏ thích hợp cho việc chiết xuất.

đã kiểm tra bằng SKLM để loại lớp dung môi không phân cực. Cô giảm áp để

chất thân dầu bằng Ether dầu hỏa sau đó chiết bằng nước nóng hoặc MeOH
hoặc EtOH hoặc hỗn hợp CHCl3 và EtOH:
Cồn ở các nồng độ khác nhau và nước thường chiết được phần
lớn các flavonoid.
-

Hỗn hợp CHCl3 và cồn hay dùng để chiết các dẫn chất methoxy
flavonoid.

-

được giải phóng [10].

Dược liệu tươi là thích hợp nhất cho việc chiết xuất flavonoid,

Thông thường để chiết các flavonoid glycosid, người ta phải loại các

-

Đôi khi để tinh chế hoặc tách flavonoid, người ta dùng muối chì để kết
tủa. Sau khi thu tủa người ta tách chì bằng cách sục dihidrosulfid thì flavonoid

Các chất anthocyanidin thường kém bền vững nhất là các acyl
anthocyanidin đ ược acyl hoá với các acid béo do đó người ta
thường chiết bằng MeOH có mặt của các acid yếu như acid
acetic, tartric hay citric thay vì HCl. Có tác giả dùng một lượng
nhỏ acid mạnh dễ bốc hơi là a c i d trifluoroacetic (0,5-3%) để
chiết các polyacylanthocyanin phức tạp vì acid này dễ bốc hơi
trong quá trình cô dịch chiết.

thu cắn toàn phần [3].
Đối với flanonoid phân cực:
Áp dụng quy trình như trên. Dịch chiết nước chứa phần lớn khối lượng
flavonoid và các chất phân cực. Lắc dịch chiết này với Et2O rồi với EtOAc,
phần dung dịch nước sẽ chứa đường, lớp Et2O chứa dạng tự do, lớp EtOAc
chứa dạng glycosid và 1 số dạng tự do còn sót lại. Sau đó có thể phân lập và
tinh chế bằng các phương pháp khác (SKLM, SKC, SKG, HPLC…) [3].


22 

 

23 
 

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Xây dựng tiêu chẩn nguyên liệu

2.1. Vật liệu
2.1.1. Nguyên liệu
Lá Chùm Ngây thu tại Tri Tôn, An Giang vào ngày 1/8/2010. Mẫu sử dụng
bao gồm cọng và lá chét.
Mẫu được thu hái ngoài tự nhiên về, loại bỏ bụi, lá hư, sâu… Một phần được
phơi khô ở 500C – 600C rồi xay nhỏ thành bột. Bột dược liệu được lưu trữ tại trung
tâm Sâm và Dược liệu TP Hồ Chí Minh. Một phần lá tươi được dùng để chiết etanol

2.2.1.1. Xác định độ ẩm bột dược liệu [5]
-

Cân chính xác vào bì khoảng 2g mẫu.

-

Sấy mẫu ở áp suất thường, 1050C trong 4 giờ, lấy ra để trong bình hút ẩm và
đem cân trọng lượng sau khi sấy. Ghi lại lượng cân.

-

2.1.2. Dung môi, hóa chất
Dung môi: etanol công nghiệp, dietyl eter, cloroform, etyl acetat, metanol, acid

Tiếp tục sấy mẫu ở áp suất thường, 1050C trong 2 giờ, để vào bình hút ẩm chờ
nguội và cân lại trọng lượng sau khi sấy. Lặp lại nhiều lần, mỗi lần sấy 2 giờ,

thu cao toàn phần.
-

Cân trọng lượng bì.

-

cho đến khi khối lượng không thay đổi.
-

Độ ẩm của mẫu được tính theo công thức sau:
X=

acetic, acid formic…
-

Hóa chất: acid acetic, NH4OH, FeCl3, HCl, H2SO4, KOH, Mg, CaSO4 khan,

X: độ ẩm mẫu thử (%).

Na2SO4, FeSO4, EDTA, H2O2…
-

a: khối lượng ban đầu của mẫu thử (g).

Các thuốc thử Fehling, Mayer, Dragendorff, Bouchardat, Folin Ciocalteur,

b: khối lượng sau cùng của mẫu thử (g).

Safranin-O, DPPH.
-

Chất chuẩn: vitamin C, acid gallic.

-

Bản mỏng tráng sẵn (Silicagel- Merck).

-

Silicagel hạt vừa.
2.1.3. Thiết bị

-

Tủ sấy Sanyo Mow-112 (Nhật).

-

Cân kĩ thuật Mettler Toledo Ab-204 (Thụy Sỹ).

-

Máy cô giảm áp Buchi- 114 (Thụy Sỹ).

-

Bồn chiết siêu âm Ultrasonic Branson 3510 (Mỹ).

-

Đèn soi UV-VIS Desaga Sarstedt Gruppe.

-

Máy đo quang phổ tử ngoại khả kiến Unicam, HE λ 10 SY Thermo Spectrorius.

-

Bếp cách thủy Memmert (Đức).

a − (b − c)
×100%
a

c: khối lượng bì (g).
2.2.1.2. Xác định độ tro toàn phần [5]
-

Nung một chén nung bằng sứ cho đến khi khối lượng không đổi, để nguội trong
bình hút ẩm và cân khối lượng của chén không.

-

Cân chính xác 2g mẫu cho vào chén nung. Trải đều mẫu dưới đáy chén và đốt
cẩn thận trên bếp điện cho đến khi mẫu cháy hoàn toàn và chén không còn bốc
khói.

-

Dùng kẹp sắt dài đưa chén vào lò nung ở 500 – 6000C cho đến khi vô cơ hóa
hoàn toàn (tro không còn màu đen). Dùng kẹp sắt lấy chén nung ra, để nguội
khoảng 30 phút trong bình hút ẩm. Cân và ghi lại lượng cân.

-

Đặt chén đựng tro vào lò nung và tiếp tục nung ở nhiệt độ trên trong 1 giờ nữa.
Lấy chén ra, để nguội trong bình hút ẩm. Cân.


24 
 

-

Tiếp tục làm như vậy cho đến khi kết quả 2 lần cân liên tiếp, khối lượng chén tro
không chênh lệch quá 0,5 mg.

-

25 
 

Tro toàn phần được tính theo công thức:

( a − b)
A=
× 100%
c − (c × h )

A: Độ tro toàn phần (%).

Nhóm hợp chất

Thuốc thử / cách phát hiện

Phản ứng dương tính

Tinh dầu

Bốc hơi tới cắn

Có mùi thơm

Acid béo

Nhỏ dung dịch lên giấy

Vết trong mờ

Carotenoid

H2SO4 đậm đặc

Màu xanh dương đậm

Triterpenoid

Liebermann – Burchard

nâu, lớp dung dịch trên có

Thuốc thử Mayer

Tủa trắng – vàng nhạt

Thuốc thử Bouchardat

Tủa nâu đỏ

Lớp tiếp xúc có màu đỏ

a: Khối lượng chén có tro (g).

màu xanh lục hay tím

b: Khối lượng chén không tro (g).
c: Khối lượng mẫu (g).

Alkaloid

h: Độ ẩm (%)

Thuốc thử Dragendorff

2.2.1.3. Xác định độ trong không tan trong acid clohydric [3]
-

Lấy chén nung đã xác định tro toàn phần ở trên, thêm vào đó 15ml nước cất và
10 ml HCl 10%. Đậy chén bằng một mặt kính đồng hồ, đun sôi cẩn thận trong
10 phút. Để nguội. Rửa mặt kính đồng hồ bằng 5ml nước cất rồi cho vào chén
nung.

-

Lọc chất không tan bằng giấy lọc không tro. Rửa giấy lọc và tro bằng nước cất
nóng cho tới khi dịch lọc trung tính (thử bằng giấy quỳ).

-

Cho tất cả giấy lọc và tro trở lại chén nung, sấy khô rồi đốt, nung ở 500 – 6000C
trong 2h. Để nguội trong bình hút ẩm và cân.

-

Nung tiếp cho đến khi giữa hai lần cân liên tiếp, khối lượng không chệnh lệch
nhau quá 1mg.

-

Tính tỉ lệ phần trăm tro không tan trong acid với tro tan trong acid so với lượng
mẫu đã sử dụng.
2.2.1.4. Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật [3], [5], [9], [10]
Dựa vào độ hòa tan của các hợp chất trong dược liệu để tách chúng bằng các

dung môi có độ phân cực tăng dần: kém phân cực, phân cực trung bình, phân cực
mạnh bằng cách chiết lần lượt với các dung môi: dietyl eter, cồn và nước. Sau đó
xác định các hợp chất trong từng dịch chiết bằng các phản ứng đặc trưng.

Tủa đỏ cam
Phát huỳnh quang mạnh

Coumarin

KOH 10%

Anthraquinon

NaOH 10%

Tăng màu

Tanin

Dung dịch FeCl3

Màu xanh rêu

Flavonoid

Mg, HCl đậm đặc

Màu hồng tới đỏ

dưới đèn tử ngoại 365 nm

Saponin

Lắc mạnh

Tạo bọt bền

Chất khử

Fehling A, Fehling B

Tủa đỏ gạch

Acid hữu cơ

Na2CO3

Sủi bọt khí

Polyuronid

Cồn 960

Tủa bông

2.2.2 Phương pháp chiết xuất dược liệu và thu phân đoạn cao
2.2.2.1 Chiết xuất cao toàn phần
Thu cao toàn phần bằng phương pháp chiết ngâm dầm, với dung môi chiết là
cồn 96%, theo tỉ lệ 6 : 1.
Cân 10 kg lá Chùm ngây tươi cho vào bình ngấm có lót bông ở đáy. Rót dung

môi vào bình cho đến xấp xấp bề mặt của mẫu. Giữ yên ở nhiệt độ phòng trong một
ngày cho dung môi xuyên thấm vào cấu trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất
tự nhiên. Thu dịch chiết và tiếp tục rót dung môi mới vào bình. Gộp dịch chiết lại,


26 
 

27 
 

đem cô giảm áp để thu hồi dung môi và có được cao toàn phần (cao cồn tổng) [5],
[10].

Hòa mỗi cao phân đoạn trong 4 ml dung dịch acid hydrocloric1%. Chia dung
dịch acid vào 4 ống nghiệm nhỏ. Định tính alkaloid bằng các thuốc thử Mayer,

2.2.2.2 Chiết cao phân đoạn từ cao toàn phần [5], [10]

Bouchardat, Dragendorff [3].

Cao cồn tổng ban đầu chứa hầu hết các hợp chất hữu cơ từ phân cực đến kém
phân cực. Sử dụng kỹ thuật chiết lỏng – lỏng để phân chia cao cồn tổng ban đầu
thành những phân đoạn có tính phân cực khác nhau.

Lá Chùm ngây tươi
10 kg

Việc chiết lỏng – lỏng được thực hiện trong bình lắng gạn, ở điều kiện nhiệt

Chiết cồn 96%
Tỉ lệ 6 : 1

độ phòng.
Hòa tan cao cồn tổng cồn vào một lượng tối thiểu cồn, sau đó rót thêm một

Bã dược liệu

Dịch cồn

lượng lớn nước.
Lắc phân đoạn phần dịch này lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng

Cô giảm áp

dần: Dietyl eter, Cloroform, Etyl acetat. Tiến hành lắc cho đến khi không còn chất
hòa tan vào dung môi thì mới chuyển sang dung môi phân cực hơn.

Cao cồn tổng

Thu các phân đoạn, đem cô giảm áp để loại dung môi. Ta thu được 4 phân
Lắc phân đoạn

đoạn cao: cao Eter, cao Cloroform, cao Etyl acetat và phần dịch lắc còn lại sau cùng
là cao nước [5], [10].
Tóm tắt quay trình theo sơ đồ trong hình 2.1.
Các phân đoạn cao thu được sẽ được khảo sát các thành phần hóa học và thử
hoạt tính chống oxi hóa nhằm chọn ra phân đoạn có tiềm năng cao nhất. Phân đoạn
này sẽ tiếp tục được phân tích để xác định và tách chiết ra các hợp chất có hoạt tính
chống oxi hóa.

2.2.3 Khảo sát các cao phân đoạn
2.2.3.1. Định tính bằng phương pháp hóa học cao phân đoạn

Dịch lắc
eter

Dịch lắc
cloroform

Dịch lắc
etyl acetat

Dịch nước
còn lại

Cô giảm áp

Cô giảm áp

Cô giảm áp

Cô giảm áp

Cao eter

Cao cloroform

Cao etyl acetat

Cao nước

Các phân đoạn cao Eter, cao Cloroform, cao Etyl acetat, cao nước được đem
phân tích định tính sự hiện diện của các nhóm chất chính đã cho kết quả dương tính

Hình 2.1: Quy trình chiết xuất cao phân đoạn từ lá Chùm ngây tươi.

trong phần khảo sát sơ bộ hóa thực vật.
• Xác định nhóm Alkaloid:

-

Thuốc thử Mayer: tủa trắng – vàng nhạt

-

Thuốc thử Bouchardat: tủa đỏ nâu

-

Thuốc thử Dragendorff: tủa đỏ cam


28 
 

29 
 

So sánh kết quả với ống chứng không có thuốc thử. Nếu dung dịch đục hơn so
với ống chứng hoặc có tủa: có alkaloid.

• Xác định nhóm Flavonoid:
¾ Tác dụng với H2SO4 đậm đặc:
Hòa tan mỗi cao phân đoạn vào H2SO4 đậm đặc: flavon và flavonol cho màu

¾ Coumarin:
Hòa cao trong 2ml cồn 70%. Chia đều dịch chiết vào 2 ống nghiệm nhỏ. Thêm
vào ống thứ nhất 0.5ml KOH10% và ống thứ hai một lượng nước cất tương đương.

vàng đậm đến vàng cam và có phát huỳnh quang đặc biệt. Chalcon, auron cho màu

Đun cách thủy cả 2 ống nghiệm trong 2 phút, để nguội và soi dưới đèn tử ngoại

đỏ hoặc xanh dương – đỏ. Flavanon cho màu từ cam đến đỏ.

365nm. Dung dịch trong ống một phát huỳnh quang mạnh hơn dung dịch trong ống

¾ Tác dụng với dung dịch NaOH 1% / etanol:
Nhỏ dung dịch NaOH vào một dung dịch có cao đã hòa tan trong etanol, sẽ có
màu từ vàng đến cam - đỏ. Nếu là flavon, isoflavon, chalcon, leucoantocyanidin sẽ
có màu vàng. Flavonol cho màu từ vàng đến cam. Auron cho màu đỏ đến đỏ tím.
¾ Phản ứng cyanidin của Wilstatter:
Chuẩn bị 2 ống nghiệm, cho vào mỗi ống 2 ml cao chiết hòa tan trong
methanol. Ống 1 làm đối chứng. Với ống số 2: cho thêm 1 ml alcol tert – butyl,
0.5ml HCl đậm đặc, 3-5 hạt magnesium kim loại. Đun nhẹ trong vài phút , sẽ xuất
hiện màu ở lớp alcol phía trên.
Nếu cao chiết có chứa flavon, flavanon, flavonol, flavanonol, xanthon dung
dịch trong ống 2 sẽ có màu cam, đỏ hoặc tím. Nếu cao chiết có chứa isoflavon,
isoflavanon, auron dung dịch không đổi màu.
¾ Tác dụng với FeCl3:
Phản ứng cho màu từ xanh lục đến xanh đen

• Xác định nhóm polyphenol:
¾ Anthraquinon:
Phản ứng Liebermann: Hòa cao vào dung dịch NaOH 10% lắc đều và pha loãng
với nước. Thêm vào một ít bột kẽm và đun sôi dung dịch. Anthraquinon làm dung
dịch có màu đỏ. Màu sẽ mất khi lắc dung dịch ngoài không khí và xuất hiện trở lại
khi đun nóng.

thứ 2 là có coumarin.
¾ Tannin :
Lấy 2ml dịch lọc, thêm vào 5 giọt dung dịch gelatin – muối, khuấy đều, so sánh
với ống chứng chỉ chứa dịch lọc và ống chứng chỉ chứa thuốc thử (dung dịch gelatin
– muối). Nếu có tủa bông trắng là có tannin.
• Xác định nhóm terpenoid:
¾ Phản ứng Liebermann – Burchard để phát hiện steroid –
triterpenoid:
Anhydrid acetic (1ml), chloroform (1ml), làm lạnh ống nghiệm rồi thêm 1 giọt
H2SO4 đđ. Cho mẫu vào ở dạng rắn. Phản ứng dương tính là dung dịch đổi thành
màu xanh dương, lục, cam hoặc đỏ, màu này bền không đổi.
¾ Phản ứng Rosenthler để phát hiện steroid – triterpenoid:
Dung dịch mẫu thử (1ml), dung dịch 1% vanilin trong etanol (2 giọt), HCl đậm
đặc (1 giọt). Phản ứng dương tính là dung dịch đổi thành màu xanh lục hay tím.
¾ Phản ứng Salkowski để phát hiện steroid:
Hòa tan mẫu thử (1-2mg) trong cloroform (1ml) và nhỏ thêm vào H2SO4 đđ
(1ml). Phản ứng dương tính là dung dịch đổi thành màu đỏ đậm, xanh, xanh tím.
¾ Phản ứng Carr – Price để phát hiện steroid – triterpenoid:
Dung dịch mẫu thử (1ml), dung dịch 20% SnCl3 trong cloroform (1-2 giọt), nếu
có màu đặc trưng, bền , khi so với ống chứng là dương tính.


30 

 

31 
 

• Xác định hợp chất saponin:
¾ Thử nghiệm tính tạo bọt:
Hòa tan cao vào 5ml nước nóng. Lọc vào một ống nghiệm và để nguội, thêm
nước cho đủ 10ml, dùng ngón tay bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh, dứt khoát
theo chiều dọc ống nghiệm trong 1 phút. Để yên ống nghiệm, quan sát lớp bọt và

-

Soi đèn UV 254 nm.

-

Soi đèn UV 365 nm.

-

Thuốc thử FeCl3 5% trong cồn.
2.2.3.3 Phương pháp định lượng phenolic tổng

đánh giá kết quả.
Đánh giá kết quả:
-

Bọt bền trong 15 phút: +

-

Bọt bền trong 30 phút: ++

-

Bọt bền trong 60 phút:+++
¾ Thử nghiệm Fontan – Kaudel:

Lấy một lượng cao hòa tan với 10ml nước. Chia đều vào 2 ống nghiệm.
Ống 1: thêm 2ml HCl 0,5N (pH=1).
Ống 2: thêm 2ml NaOH 0,5N (pH=13).
Lắc trong 1 phút , quan sát và so sánh chiều cao cột bọt giữa 2 ống:
-

Nếu cột bọt trong 2 ống tương đương nhau: sơ bộ kết luận dược liệu có
saponin triterpen.

-

Hàm lượng phenolic tổng được xác định bằng phương pháp Folin-Ciocalteu
theo Waterman và Mole (1994) [18].
¾ Nguyên tắc:
Trong thành phần thuốc thử Folin-Ciocalteu có phức hợp phospho-wolframphosphomolybdat. Phức hợp này sẽ bị khử bởi các hợp chất phenolic tạo thành sản
phẩm phản ứng có màu xanh dương, hấp thụ cực đại ở bước sóng 758 nm. Hàm
lượng phenolic có trong mẫu tỉ lệ thuận với cường độ màu.
¾ Hóa chất:
-

Thuốc thử Folin-Ciocalteu.

-

Dung dịch Na2CO3 20%.

-

Chất chuẩn acid gallic.

¾ Tiến hành thí nghiệm:
-

Nếu ống 2 (pH=13) có cột bọt cao hơn ống 1 (pH=1) gấp 2-3 lần: sơ bộ kết
luận dược liệu có saponin steroid.

2.2.3.2. Sắc ký lớp mỏng (SKLM) [3], [9]

8,5 cm.
¾ Chuẩn bị dung dịch mẫu
Mẫu được hòa tan trong metanol.
¾ Hệ dung môi khai triển
-

Hệ 1: Etyl acetat – metanol – nước (100 : 17 : 13)

Hút một thể tích xác định mẫu (Chất chuẩn acid gallic hoặc mẫu cần định
lượng được pha loãng ở nồng độ thích hợp) cho vào bình định mức 10 ml.

-

Thêm 6 ml nước cất vào bình định mức. Lắc đều.

-

Cho vào bình 0,5 ml thuốc thử Folin-Ciocalteu. Lắc đều. Để yên trong 5

¾ Chuẩn bị bản mỏng
Sử dụng bản mỏng silicagel – 60 F254, quãng đường di chuyển của dung môi là

Hệ 2: Etyl acetat – acid formic – acid acetic – nước (100 : 11 : 11 : 27)

¾ Phát hiện

phút.
-

Thêm vào bình định mức 1,5 ml Na2CO3. Lắc đều.

-

Thêm nước vào bình cho vừa đủ 10ml. Lắc đều.

-

Để yên trong tối 2h. Sau đó tiến hành đo độ hấp thu ở bước sóng 758 nm.


32 

33 

 

 

9 Dựng đường chuẩn acid gallic
Pha dung dịch chuẩn:
Cân 20 mg acid gallic, định mức chính xác đến 10 ml bằng nước cất, được

Cao Cloroform

2000

200

0,4

Cao Ethyl acetate

2000

50

0,1

Cao nước

2000

200

0,4

dung dịch có nồng độ 2 mg/ml. Pha loãng tiếp 10 lần được dung dịch có nồng độ
0,2 mg/ml.

Tiếp tục tiến hành thí nghiệm theo các bước nêu trên.

Từ dung dịch chuẩn này, hút vào bình định mức những thể tích khác nhau để
được giai mẫu có hàm lượng acid gallic là 10 μg, 20 μg, 30 μg, 40 μg, 50 μg.
Tiếp tục tiến hành thí nghiệm như trên.

Dựa vào đường chẩn acid gallic để xác định hàm lượng phenolic tổng có
trong mẫu. Hàm lượng phenolic tổng được tính bằng đương lượng acid gallic
(GAE) có trong 1 mg cao đem định lượng, theo công thức:

Bảng 2.1: Quy trình dựng đường chuẩn acid gallic.
Bình định mức

1

2

3

4

5

6

Hút từ dung dịch chuẩn (μl)

0

50

100

150

200

250

Hàm lượng acid gallic (μg)

0

10

20

30

40

50

Nước cất (ml)

6

6

6

6

6

6

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

1,5

1,5

1,5

1,5

Thuốc thử Folin-Ciocalteu (ml)

Lắc đều, để yên 5 phút
Dung dịch Na2CO3 (ml)

1,5

1,5

Định mức bằng nước cất đế 10ml. Để yên trong tối 2h

m: khối lượng cao đem định lượng (mg).
f(A): phương trình đường chuẩn.
X: độ ẩm cao (%)
2.2.4 Phân lập các hợp chất chống oxi hóa
2.2.4.1. Xác định các thành phần có hoạt tính chống oxi hóa bằng phương
pháp sắc ký lớp mỏng
Sau khi khảo sát các phân đoạn cao, xác định được phân đoạn có tiềm năng

Đo OD758 nm

chống oxi hóa cao nhất. Phân đoạn cao được chọn sẽ được khảo sát tiếp để xác định

9 Định lượng phenolic tổng trong cao cồn tổng và cao phân đoạn
Xác định hàm lượng phenolic tổng trong cao cồn tổng và các cao phân đoạn:
cao Eter, cao Cloroform, cao Etyl acetat và cao nước.

các thành phần có hoạt tính chống oxi hóa bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng.
Mẫu cao được hòa trong metanol. Tải lên bản mỏng sắc ký có chiều dài 10
cm, đường di chuyển cùa dung môi là 8,5 cm.
Hệ dung môi khai triển: Etyl acetat – metanol – nước (100 : 17 : 13)

Pha nồng độ dung dịch mẫu theo bảng 2.2.
Bảng 2.2: Nồng độ các cao phân đoạn đem định lượng.
Nồng độ

Hút vào bình

Khối lượng cao

(μg/ml)

định mức (μl)

định lượng (mg)

Cao tổng

2000

200

0,4

Cao Ether

2000

200

0,4

Mẫu

P: hàm lượng phenolic tổng (μg GAE/mg).

Sau khi khai trển, bản mỏng được quan sát dưới đèn UV 254 nm và UV 365
nm. Các vết chất được ghi nhận bằng giá trị Rf của chúng.
Phun thuốc thử DPPH 0,05% lên bề mặt của bản mỏng. Ủ ở nhiệt độ phòng
trong 10 phút.
Những thành phần có hoạt tính chống oxi hóa sẽ tạo những vạch màu vàng
trên nền tím của bản mỏng, do chất chống oxi hóa làm mất màu tím của thuốc thử


34 
 

35 
 

DPPH. Dựa vào những vạch này, có thể xác định được những thành phần có hoạt

-

tính chống oxi hóa trong cao phân đoạn.

Nén chặt chất hấp phụ bằng cách gõ cột, kết hợp với áp suất hút ở phía dưới

cột và nén cơ học trên định cột. Đặt phía trên bề mặt chất hấp phụ một miếng

Chứng dương sử dụng trong thí nghiệm này là vitamin C. So sánh bằng mắt

giấy lọc để ổn định mặt cột.

thường độ mất màu của vạch chứng dương và các vạch có hoạt tính khác để xác

¾ Nạp mẫu:

định mức độ mạnh yếu của hoạt tính.

-

Khối lượng mẫu 20 g.

-

Nạp mẫu ở dạng bột khô. Cho hết lượng mẫu khô phủ lên trên đầu cột, vừa

Những vạch có hoạt tính chống oxi hóa được ghi nhận lại bằng giá trị Rf của
chúng.

khỏ nhẹ thành ngoài của phễu vừa dùng muỗng để trải đều phần bột này để
2.2.4.2. Sắc ký cột nhanh – cột khô

có một lớp mỏng. Đặt lên trên bề mặt cột một miếng giấy lọc để bề mặt
không bị xáo trộn khi rót dung môi.

Với những cao chiết từ cây có có nhiều hợp chất khác nhau, ít có phương

pháp sắc ký cột hiệu quả chỉ một lần mà tách ra được các đơn chất nên phải thực

¾ Triển khai sắc ký:

hiện nhiều lần sắc ký cột. Đối với lượng mẫu cao lớn thì phải tốn nhiều thời gian

-

sắp xếp của các chất trong quá trình sắc ký. Sắc ký nhanh cột khô được áp dụng để
khắc phục những nhược điểm này [5], [9].

Cho máy bơm hoạt động. Rót một thể tích dung môi lên bề mặt phễu. Dung
môi được hút xuống bình tam giác bên dưới. Chờ cho phễu khô tương đối,

(nhiều ngày) thực hiện sắc ký cột. Việc gián đoạn để nghỉ có thể làm xáo trộn vị trí

ngắt áp suất, rót phần dung môi vừa giải ly ra.
-

Hệ dung môi giải ly:

Sau khi tiến hành khảo sát phân đoạn có hoạt tính chống oxi hóa cao (phân

-

Cloroform 100%

đoạn etyl acetat), xác định được Rf của các thành phần có hoạt tính chống oxi hóa.

-

Etyl acetat 100%

Tiến hành sắc ký nhanh – cột khô để bước đầu tách thành những phân đoạn có độ

-

Etyl acetat – metanol (50 : 50)

phân cực khác nhau, thành phần đơn giản hơn. Từ những phân đoạn đơn giản này,

-

Thể tích phân đoạn giải ly: 500 ml.

dễ dàng phân lập tiếp các chất có hoạt tính chống oxi hóa bằng sắc ký cột cố điển

-

Kiểm tra các phân đoạn:

một cách hiệu quả hơn.

-

¾ Chuẩn bị cột sắc ký, dụng cụ:

Sắc ký lớp mỏng kiểm tra các phân đoạn. Hệ dung môi khai triển là etyl
acetat – metanol – nước (100: 17: 13).

Cách tiến hành
-

Các phân đoạn giống nhau được gộp chung. Cô đến cắn và cân khối lượng.

-

Phễu Buchner thành cao đường kính trong 10 cm.

2.2.4.3. Sắc ký cột cổ điển [11],[ 24]

-

Bình tam giác.

Sau khi sắc ký cột nhanh, thu được các phân đoạn đơn giản hơn. Lựa chọn

-

Máy hút chân không áp suất 70 mmHg.

¾ Chuẩn bị chất hấp phụ:
-

Silicagel hạt vừa 40 – 60 μm.

-

Chất hấp phụ được nhồi vào cột theo phương pháp bột khô. Chiều cao lớp
hấp phụ: 5 cm.

phân đoạn phù hợp, có thành phần đơn giản, chứa những hợp chất có hoạt tính
chống oxi hóa để tiến hành sắc ký cột cổ điển phân lập các chất tinh khiết.


36 
 

37 
 

-

Bảng 2.3: Thông số sắc ký cột cổ điển.

Dung dịch DPPH: Pha dung dịch DPPH 0,6mM trong metanol bằng

Khối lượng mẫu nạp

6g

cách hòa tan 5,915mg DPPH vào 17,5ml MeOH cho vào bình định mức sau

Chất hấp phụ

Silicagel hạt vừa (40 – 63 μm)

đó thêm nước cho đủ 25ml.
-

Mẫu thử: Khảo sát hoạt tính quét gốc DPPH của các mẫu: cao tổng,

Khối lượng chất hấp phụ

350 g

Quy cách cột

4 x 50 cm

cao eter, cao cloroform, cao etyl acetat và cao nước. Chứng dương là vitamin

Dung môi ly giải

Etyl acetat : metanol

C. Các mẫu thử được tiến hành khảo sát ở 7 nồng độ khác nhau theo bảng

Tốc độ dòng

20 giọt/phút

Thể tích mỗi phân đoạn

20 ml

2.4
Bảng 2.4: Dãy nồng độ của các phân đoạn cao đem thử hoạt tính quét gốc tự
do DPPH.

2.2.5. Đánh giá hoạt tính chống oxi hóa
2.2.5.1. Phương pháp quét gốc tự do DPPH
Phương pháp quét gốc tự do DPPH là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện. 
Phương pháp này dùng để thực hiện phản ứng mang tính chất sàng lọc tác dụng
chống oxi hóa của mẫu nghiên cứu trong thử nghiệm ban đầu.
¾ Nguyên tắc:
DPPH là gốc tự do ổn định, không tự kết hợp đề tạo thành nhị nhân tử. Gốc
tự do có màu tím nhờ vào điện tử N chưa ghép đôi. Chất có tác dụng chống oxi hóa
sẽ làm giảm màu của DPPH. Sự mất màu này là do các gốc tự do DPPH đã kết hợp
với một H của chất nghiên cứu để tạo thành DPPH dạng nguyên tử. Hoạt tính quét
gốc tự do của chất nghiên cứu tỉ lệ thuận với độ mất màu của DPPH. Xác định bằng
cách đo độ hấp thụ ở bước sóng 516 nm [8].

Mẫu thử

Nồng độ gốc (μg/ml)
Ống 1

Ống 2

Ống 3

Ống 4

Ống5

Ống 6

Cao tổng

50

100

200

300

400

500

600

Cao eter

200

400

600

800

1000

1200

1400

Cao cloroform

200

300

400

500

600

700

800

Cao etyl acetat

50

75

100

125

150

175

200

Cao nước

200

300

400

500

600

700

800

vitamin C

10

15

20

25

30

35

40

¾ Tiến hành thí nghiệm
-

Hút 0,5 ml mẫu thử vào ống nghiệm.

-

Thêm vào 3 ml metanol.

-

Cho vào ống nghiệm 0,5 ml dung dịch DPPH. Lắc đều.

-

Mẫu được giữ trong tối, ở nhiệt độ phòng. Sau thời gian 30 phút, tiến
hành đo độ hấp thu ở bước sóng 516 nm.

-

Hoạt tính chống oxi hóa (HTCO) được tính theo công thức:

HTCO (%) =

¾ Chuẩn bị thuốc thử và mẫu:

Ống 7

(ODc − ODt )
× 100
ODc


38 

39 

 

 

ODc: Mật độ quang của dung dịch DPPH và MeOH.

Cường độ màu tỉ lệ thuận với hàm lượng ion ferrocyanid được tạo thành. Do

ODt: Mật độ quang của DPPH và mẫu thử.

đó cường độ màu càng cao chứng tỏ năng lực khử của mẫu thử càng cao.

Từ HTCO (%) và nồng độ mẫu dựng được đường chuẩn. Dựa vào đường

¾ Tiến hành thí nghiệm:

chuẩn tính được IC50 (khả năng đánh bắt 50% DPPH của mẫu). Giá trị IC50 càng

-

thấp tương ứng với HTCO càng cao và ngược lại.

-

Hút 1 ml mẫu thử vào mỗi ống nghiệm.

-

Thêm 2,5 ml đệm sodium phosphat 0,2 M pH 6,6. Lắc đều.

Ống mẫu thử với dãy

-

Thêm 2,5 ml dung dịch potassium ferricyanid 1%. Ủ ở 500C trong 20 phút.
Thêm 2,5 ml dung dịch acid tricloacetic 5% (TCA) để ngừng phản ứng.

Bảng 2.5: Quy trình thử hoạt tính quét gốc tự do DPPH

Pha mẫu thử theo dãy nồng độ từ 200 μg/ml đến 1000 μg/ml.

Ống trắng

Ống chứng

nồng độ thích hợp

-

Mẫu (ml)

0

0

0,5

-

Lắc đều hỗn hợp, tiến hành ly tâm hoặc lọc, thu dịch lọc.

Metanol (ml)

4

3,5

3

-

Hút 1 ml dịch lọc vào các ống nghiệm khác, thêm 2 ml nước cất và 0,5 ml

Dung dịch DPPH (ml)

0

0,5

0,5

Để trong tối, ở nhiệt độ phòng trong 30 phút

dung dịch FeCl3 1%. Lắc đều.
-

Sau 5 phút, tiến hành đo độ hấp thu ở bước sóng 700 nm.
Bảng 2.6: Quy trình thử năng lực khử.

Đo OD 516 nm
2.2.5.2. Phương pháp xác định năng lực khử
Năng lực khử của một chất là khả năng chất đó cho điện tử khi tham gia vào
phản ứng oxi hóa khử. Khi xác định năng lực khử ta cũng xác định được năng lực
kháng oxy hóa của một chất.

Ống nghiệm

0

1

2

3

4

5

Nồng độ (μg/ml)

0

200

400

600

800

1000

Mẫu (ml)

1

1

1

1

1

1

Đệm phosphat (ml)

2,5

2,5

2,5

2,5

2,5

2,5

K3[Fe(CN)6] (ml)

2,5

2,5

2,5

2,5

2,5

2,5

2,5

2,5

2,5

Ủ ở 500C trong 20 phút

¾ Nguyên tắc:
Xác định năng lực khử theo phương pháp của Yen và Duh (1993) [4]. Trong

TCA (ml)

đó, chất khử (chất có hoạt tính oxi hóa) sẽ khử potassium ferricyanid (K3[Fe(CN)6])
thành potassium ferrocyanid (K4[Fe(CN)6]). Ion Fe3+ trong phân tử potassium
ferricyanid bị khử thành ion Fe2+ trong phân tử potassium ferrocyanid.

2,5

2,5

2,5

Lọc / ly tâm. Hút 1ml dịch lọc
Nước cất (ml)

2

2

2

2

2

2

FeCl3 1%

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

X + K3[Fe(CN)6] → K4[Fe(CN)6]

Đo OD 700nm

X + [Fe(CN)6]3+ → [Fe(CN)6]4+
Khi bổ sung Fe3+, Fe3+ sẽ phản ứng với ion ferrocyanid tạo thành một phức
hợp ferric ferrocyanid màu xanh dương có công thức Fe4[Fe(CN)6]3. Phức hợp này
có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 700 nm.
4 [Fe(CN)6]4+ + 3 [Fe(CN)6]4+ → Fe4[Fe(CN)6]3 (Màu xanh)

2.2.5.3. Phương pháp thử hoạt tính quét gốc hydroxyl tự do
Hoạt tính kháng gốc hydroxyl tự do được xác định theo phương pháp của Li

và cộng sự (2007) [38].


40 
 

41 
 

¾ Nguyên tắc:

Bảng 2.7: Quy trình thử hoạt tính quét gốc hydroxyl tự do.

Hoạt tính kháng gốc hydroxyl tự do được xác định trên nguyên tắc của phản
ứng Fenton. Phản ứng Fenton là phản ứng hydroperoxid (H2O2) với ion Fe2+. H2O2
sẽ gây oxi hóa Fe2+ để tạo thành Fe3+, một ion hydroxyl (OH-) và một gốc hydroxyl
tự do (OH•)
Fe2+ + H2O2 → Fe3+ + OH- + OH•
Các chất có khả năng quét gốc hydroxyl tự do sẽ phân hủy các gốc hydroxyl
mới sinh ra từ phản ứng Fenton. Hàm lượng gốc hydroxyl còn lại sẽ làm giảm
cường độ màu của thuốc thử Safranin-O. Cường độ màu của thuốc thử Safranin-O

Hút 1 ml mẫu vào ống nghiệm.
Thêm vào 1,7 ml đệm sodium phosphat 0,15 M pH 7,4. Lắc đều.

-

Hút vào 1 ml dung dịch EDTA – Fe2+ 20 mM.

-

Thêm 0,3 ml dung dịch Safranin-O 1,14 mM vào ống nghiệm. Lắc đều.

 

Hút 1 ml H2O2 3% vào ống nghiệm để bắt đầu phản ứng.

 

-

Ổn định phản ứng ở nhiệt độ 370C trong thời gian 30 phút.

 

-

Đo độ hấp thu của dung dịch sau phản ứng ở bước sóng 520 nm.

-

Hiệu quả kháng gốc hydroxyl tự do của mẫu thử được tính theo công thức

A mẫu: độ hấp thu của mẫu thử ở bước sóng 520 nm.
A thử không: độ hấp thu của mẫu thử không ở bước sóng 520 nm.
A đối chứng: độ hấp thu của mẫu đối chứng ở bước sóng 520 nm.
Mẫu thử không là mẫu mà trong đó chất thử nghiệm được thay bằng đệm.
Mẫu đối chứng là mẫu mà H2O2 và EDTA – Fe2+ được thay bằng đệm.

4

5

Nồng độ (μg/ml)

0

200

400

600

800

1000

Mẫu (ml)

1

1

1

1

1

1

Đệm phosphat (ml)

1,7

1,7

1,7

1,7

1,7

1,7

EDTA – Fe2+ (ml)

1

1

1

1

1

1

Safranin-O (ml)

0,3

0,3

0,3

0,3

0,3

0,3

H2O2 (ml)

1

1

1

1

1

1

 
 

-

Hoạt tính quét gốc OH•

3

 

Pha mẫu thử thành các dãy nồng độ từ 200 μg/ml đến 1000 μg/ml.

-

2

Đo OD 520nm

¾ Tiến hành thí nghiệm

-

1

Ủ ở 370C trong 30 phút

càng cao thể hiện khả năng quét gốc hydroxyl tự do của mẫu càng cao.
-

0

Ống nghiệm

 


42 

43 

 

 

9 Xác định tro toàn phần

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

Bảng 3.4: Độ tro toàn phần

3.1. Xây dựng tiêu chuẩn nguyên liệu

Nguyên liệu

Lần 1

Lần 2

Lần 3

Khối lượng nguyên liệu (g)

2,0078

2,0393

2,0306

Bảng 3.1: Kết quả giảm khối lượng do sấy khô

Tro toàn phần (%)

13,311

13,318

13,262

Trung bình (%)

3.1.1. Xác định độ tinh khiết của nguyên liệu
9 Xác định giảm khối lượng do sấy khô

13,297 %

Lá

Khối lượng ban đầu

Khối lượng sau khi

Mất khối lượng do

Chùm Ngây

(g)

sấy khô (g)

sấy khô (%)

1

500 g

110 g

78 %

2

500 g

108 g

78,4 %

3

500 g

110 g

78 %

Nguyên liệu

Lần 1

Lần 2

Lần 3

Trung bình

500 g

109,33 g

78,13 %

Khối lượng nguyên liệu (g)

2,0078

2,0393

2,0306

Tro không tan trong HCl (%)

0,366

0,401

0,324

9 Xác định tro không tan trong HCl
Bảng 3.5: Độ tro không tan trong HCl

Trung bình (%)

9 Xác định tỷ lệ giữa cọng và lá chét

0,363 %

Bảng 3.2: Tỷ lệ giữa cọng và lá chét
Mẫu

Cọng

Lá Chùm

3.1.2. Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật

Lá chét

Ngây

Khối lượng

Tỉ lệ

Khối lượng

Tỉ lệ

1

110 g

50 g

45,45 %

60 g

54,55 %

2

108 g

46 g

42,59 %

62 g

57,41 %

3

110 g

50 g

45,45%

60 g

54,55 %

Trung bình

109,33 g

48,66 g

44,51 %

60,67 g

55,49 %

9 Xác định độ ẩm bột dược liệu
Bảng 3.3: Độ ẩm bột dược liệu
Nguyên liệu

Lần 1

Lần 2

Lần 3

2,0000

2,0001

2,0003

Độ ẩm (%)

8,87

8,85

8,85

8,857 %

Bảng 3.6: Kết quả phân tích sơ bộ hóa thực vật trong lá Chùm Ngây
Nhóm hợp

Thuốc thử / cách

Phản ứng

chất

phát hiện

dương tính

Tinh dầu

Bốc hơi tới cắn

Có mùi thơm

Acid béo

Khối lượng nguyên liệu (g)
Trung bình (%)

Bằng các phản ứng hóa học đặc trưng, đã xác định được một số nhóm chất
có mặt trong lá Chùm Ngây.

Carotenoid

Triterpenoid

Nhỏ dung dịch
lên giấy
H2SO4 đậm đặc
Liebermann –
Burchard

Vết trong mờ
Màu xanh

Kết quả định tính dịch

Kết

chiết

quả

Eter

Cồn

Nước

chung

++

++

+

+

+++

+++

dương đậm
Đỏ nâu – tím ,
lớp trên có

màu xanh lục

++

++

+

++