Luận văn thạc sĩ Kỹ thuật Nghiên cứu quá trình lên men axit lactic từ tinh bột hạt mít

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

HỒ THỊ HẢO

HỒ THỊ HẢO

NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH LÊN MEN
AXIT LACTIC TỪ TINH BỘT HẠT MÍT
NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH LÊN MEN
AXIT LACTIC TỪ TINH BỘT HẠT MÍT
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM VÀ ĐỒ UỐNG
Mã số:

60 54 02

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS.TRƯƠNG THỊ MINH HẠNH

Đà Nẵng – Năm 2011

Đà Nẵng - Năm 2011

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

HỒ THỊ HẢO

NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH LÊN MEN AXIT LACTIC
TỪ TINH BỘT HẠT MÍT

Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm và ñồ uống
Mã số:

60 54 02

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT

Đà Nẵng - Năm 2011


Công trình ñược hoàn thành tại
DANH MỤC CÁC BẢNG

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
Số hiệu
bảng

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. TRƯƠNG THỊ MINH HẠNH

Phản biện 1: PSG.TS. TRẦN THỊ XÔ

Phản biện 2: PGS.TS. PHẠM NGỌC ANH

Tên bảng

Trang

1.1

Hình thái và kiểu lên men lactic của một số vi khuẩn lactic

11

1.2

Thành phần hóa học của hạt mít

21

2.1

Thành phần môi trường lên men axit lactic

28

2.2

Thành phần môi trường MRS Agar

29

3.1

Ảnh hưởng của nồng ñộ xút ñến quá trình tách lớp vỏ nâu ở
hạt mít

31

3.2

Hàm lượng tinh bột của hạt mít

33

3.3

Kết quả ño OD của dịch kiểm chứng và mẫu thí nghiệm

34

3.4

Hàm lượng ñường khử tạo thành sau quá trình thủy phân

38

3.5

Hiệu suất lên men theo nồng ñộ dịch ñường

48

2

3.6

Các ñiều kiện thí nghiệm TYT 2

Luận văn ñược bảo vệ trước hội ñồng chấm Luận văn tốt

3.7

Kết quả thí nghiệm theo thực nghiệm TYT 22

52

nghiệp thạc sĩ Kỹ thuật họp tại Đại Học Đà Nẵng vào ngày 23

3.8

Bảng giá trị tính phương sai dư

55

tháng 4 năm 2011.

3.9

Kết quả tính bước chuyển ñộng δ j của các yếu tố

56

3.10

Kết quả thực nghiệm tối ưu hóa theo ñường lên dốc

57

* Có thể tìm hiểu luận văn tại:
- Trung tâm Thông tin - Học liệu, Đại học Đà Nẵng
- Trung tâm Học liệu, Đại học Đà Nẵng.

51


DANH MỤC CÁC HÌNH

Số hiệu

Tên hình

hình

Trang

3.8

Dịch ñường ñã chuẩn bị trước lúc lên men

43

3.9

Quá trình lên men lactic

44

3.10

Ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến hàm lượng axit lactic tạo thành

45

3.11

Ảnh hưởng của tỷ lệ giống ñến lượng axit lactic tạo thành

46

Ảnh hưởng của nồng ñộ dịch ñường ñến hàm lượng axit lactic tạo

47

3.12

1.1

Hai dạng ñồng phân của axit lactic

5

1.2

Lên men axit lactic ñồng hình nhờ các phản ứng theo con ñường

8

thành
3.13

EMP
1.3

Lên men axit lactic dị hình theo các phản ứng của con ñường

49

thành
9

PP
1.4

Lactobacillus casei

1.5

Lactobacillus bulgaricus

13

1.6

Lactobacillus acidophilus

13

1.7

Streptococcus lactic

13

1.8

Thuốc Biolactyl

15

12

1.9

Cây mít

20

1.10

Hạt mít

20

1.11

Hình chụp phân tử tinh bột hạt mít

22

2.1

Máy so màu hiệu JENWAY 6305

23

2.2

Tủ sấy nguyên liệu

23

3.1

Bột hạt mít thu nhận

33

3.2

Khuẩn lạc L.casei sau khi hoạt hóa

36

3.3

Đường chuẩn glucoza

37

3.4

Dịch ñường sau thủy phân

39

3.5

Dịch ñường ñã khảo sát nồng ñộ trước lúc lên men

40

3.6

Các khuẩn lạc Lactobacillus casei ở các mức pha loãng 10-3

42

3.7

Đường cong biểu diễn mật ñộ tế bào ở các mức pha loãng

42

khác nhau

Ảnh hưởng của thời gian lên men ñến hàm lượng axit lactic tạo

3.14

Các mẫu dịch sau khi kết thúc quá trình lên men

50


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
LỜI CAM ĐOAN
EMP

: Embden-Mayerhoff-Parnas

ATP

: Adenosine Triphosphate

ADP

: Adenosine Diphosphate

PP

: Pentoza Phosphat

L.bulgaricus

: Lactobacillus bulgaricus:

L. acidophilus : Lactobacillus acidophilus
Opt

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi.
Số liệu, kết quả báo cáo trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược
công bố ở bất cứ công trình nào khác.

Tác giả

: Optimum

Hồ Thị Hảo


-1-

-2-

MỞ ĐẦU

vào việc tận dụng các phế phẩm nông nghiệp như bã mía, bã ngô, lõi ngô, cám mỳ,
rơm rạ, rỉ ñường...[16],[23],[28],[36].
Mít là loại trái cây nhiệt ñới có giá trị. Quả mít ñã ñược sử dụng ñể ăn tươi từ

1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

lâu ñời. Trong những năm gần ñây mít ñược sử dụng rất nhiều trong các ngành chế

Axit lactic là axit hữu cơ không màu, có hương vị nhẹ. Axit lactic ñược hình

biến thực phẩm ñể tạo ra các sản phẩm khác nhau như: mứt mít, mít sấy, sản xuất

thành do quá trình lên men tự nhiên trong các sản phẩm như phomai, sữa chua,

bánh kẹo,…Hạt mít ở trong quả mít chiếm trung bình từ 10 – 15% trọng lượng trái,

nước tương, bột chua, sản phẩm từ thịt, rau muối chua… Axit lactic ñược dùng sản

ngoài ra trong hạt mít chứa một hàm lượng khá lớn tinh bột và protein. Mặc dù

xuất trong một số thực phẩm như các sản phẩm bánh, ñồ uống, các sản phẩm từ

khối lượng nhiều nhưng nó chỉ ñược coi là phế phụ phẩm và thường bị loại bỏ

sữa, thịt, xà lách...Trong các sản phẩm thực phẩm ñồ uống, axit lactic ñược sử dụng

trong quá trình sử dụng, sản xuất và gây khó khăn cho việc xử lý rác thải ô nhiễm

ñể ñiều chỉnh ñộ pH hoặc như một chất bảo quản [27], [30].

môi trường. Chúng ta ñã biết sử dụng hạt mít ñể chế biến một số món ăn nhỏ tuy

Trong công nghiệp nhẹ, axit lactic là dung môi cho công nghiệp sản xuất sơn,
vecni, nhuộm và thuộc da. Trong công nghiệp rượu, axit lactic ñược dùng dưới
dạng muối của canxi. Đặc biệt là gần ñây, các nhà khoa học trên thế giới ñã nghiên

cứu tổng hợp nhựa axit polylactic (PLA) – một loại nhựa sinh học từ axit lactic.
PLA là sự lựa chọn thích hợp thay cho nhựa có nguồn gốc từ dầu mỏ, vì nó vừa có
thể phân huỷ ñược, vừa ít ñộc tính ñối với con người. PLA ñược sử dụng làm
nguyên liệu sản xuất bao bì phân bón, thực phẩm và các loại bát, ñĩa dùng một lần.
Đặc biệt trong y học và dược học, kết hợp với sự phát triển của công nghệ sinh học
và di truyền, axit lactic ñược nghiên cứu nhằm sản xuất phục vụ những nhu cầu
thiết yếu về sức khỏe của con người. Trong phẫu thuật chỉnh hình, các hợp chất cao
phân tử tổng hợp từ axit lactic và những dẫn xuất của nó là những chất liệu cấy
ghép sinh học thích hợp và hiệu quả cao. Canxi lactat là loại dược phẩm nhằm bổ
sung canxi dưới dạng dễ hấp thu cho cơ thể. Sắt lactat ñược sử dụng ñể chữa bệnh thiếu
máu…[16], [28], [37].
Axit lactic ñược sản xuất từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau như rỉ ñường,
củ cải ñường, nước mía, tinh bột... Nhằm ñể hạ chi phí sản xuất axit lactic, ngày
nay ñang có rất nhiều nghiên cứu thay thế nguồn cacbon và nitơ ñắt tiền trong môi
trường lên men bằng các nguyên vật liệu rẻ tiền hơn. Trong ñó, tập trung chủ yếu

nhiên sự hiểu biết về các thành phần dinh dưỡng còn hạn chế [35].
Quá trình nghiên cứu xác ñịnh thành phần dinh dưỡng của hạt mít ñã ñược
khảo sát trong thời gian gần ñây, trong hạt mít có chứa tới 77,76% tinh bột và là
một nguồn nguyên liệu rẻ tiền, sẵn có [38], [43]. Thủy phân tinh bột từ hạt mít ñể
lên men sản xuất cồn và axit lactic là một hướng mới nhưng chưa ñược nghiên cứu nhiều.
Việc tận dụng ñược nguồn phụ phẩm rẻ tiền, dễ kiếm, cũng như nhằm hạn
chế lượng chất thải trong quá trình chế biến, chống ô nhiễm môi trường là một
thiên hướng lớn ñối với các nhà nghiên cứu. Trong công nghệ sản xuất axit lactic,
việc sử dụng các nguồn nguyên liệu như ñường, rỉ ñường, nước mía ép, củ cải
ñường, tinh bột…ñã ñược nghiên cứu nhiều nhưng hiện nay việc sử dụng tinh bột
hạt mít ñể sản xuất axit lactic thì chưa thấy công bố.
Ở nước ta, việc sử dụng axit lactic trong công nghệ thực phẩm và phi thực
phẩm khá nhiều nhưng chủ yếu là thu mua từ nước ngoài với giá thành cao.
Nghiên cứu quá trình thủy phân tinh bột hạt mít (một nguồn phế phẩm công nghiệp

khổng lồ và rẻ tiền) ñể làm nguyên liệu trong công nghệ lên men lactic nhằm hạ giá
thành cho sản phẩm axit lactic là thật sự có ý nghĩa không chỉ về mặt kinh tế mà
còn có ý nghĩa rất lớn về bảo vệ môi trường sống của chúng ta.
Chính vì những thực tế trên, chúng tôi mạnh dạn chọn ñề tài “Nghiên cứu quá
trình lên men axit lactic từ tinh bột hạt mít” là một việc làm cấp thiết hiện nay.


-32. MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU

-4-

- Tối ưu hóa các ñiều kiện lên men bằng phương pháp quy hoạch thực

- Sử dụng hạt mít làm nguyên liệu chính ñể tiến hành thủy phân thu nhận dịch lên men.

nghiệm và phương pháp tối ưu nhằm thu ñược hàm lượng axit lactic là cao nhất.

- Xác ñịnh các thông số công nghệ tốt nhất như nồng ñộ dịch ñường, nhiệt

7. Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

ñộ lên men, thời gian lên men, pH lên men cho quá trình lên men axit lactic bằng
cách sử dụng phương pháp quy hoạch thực nghiệm và tối ưu hóa nhằm thu ñược
hàm lượng axit lactic sau lên men là cao nhất.
- Đề xuất ñược quy trình lên men axit lactic từ tinh bột hạt mít.
3. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
- Sử dụng hạt mít làm nguồn nguyên liệu chính ñể tiến hành thủy phân thu
nhận dịch ñường.
- Sử dụng chế phẩm enzyme α-amylaza do hãng Novozymes – Đan Mạch sản

- Tận dụng lượng phế phụ phẩm trong quá trình chế biến các sản phẩm từ
quả mít ñể tạo ra nguồn nguyên liệu chính ñể sản xuất axit lactic.
- Giải quyết ñược vấn ñề ô nhiễm môi trường, bảo vệ sức khỏe cộng ñồng,
nâng cao hiệu quả kinh tế trong sản xuất.
- Tăng nguồn thu nhập cho người trồng mít
- Giảm lượng axit lactic ngoại nhập, chủ ñộng sản xuất, tiết kiệm ngoại tệ.
8. CẤU TRÚC CỦA LUẬN VĂN
Ngoài phần mở ñầu, kết luận và kiến nghị, tài liệu tham khảo, phụ lục, trong

xuất và chế phẩm γ-amylaza của Genencor Bio-products Co.Ltd, China sản xuất.

luận văn gồm có các chương sau:

- Sử dụng chủng vi khuẩn Lactobacillus casei ñể lên men dịch sau thủy phân.

+ Chương 1: Tổng quan.

4. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
- Sử dụng hạt mít ñược thu mua tại các ñầu mối nguyên liệu của Công ty cổ
phần Vinamit trên Daklak.
- Lên men axit lactic từ dịch thủy phân từ tinh bột hạt mít.
5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Phương pháp lấy mẫu, chuẩn bị mẫu và bảo quản mẫu.
- Phương pháp hóa lý
- Phương pháp hóa học
- Phương pháp hóa sinh
- Phương pháp vi sinh vật
- Phương pháp toán học
6. Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI

- Phân tích và xác ñịnh hàm lượng tinh bột của hạt mít, thành phần dịch lên
men và xác ñịnh hàm lượng axit lactic bằng các phương pháp hóa học.
- Thực hiện lên men axit lactic trên môi trường lỏng.

+ Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu.
+ Chương 3: Kết quả và thảo luận.


-5-

-6-

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

Axit lactic là axit hữu cơ không màu, có mùi nhẹ, tan trong nước và trong
cồn. Trong cấu tạo phân tử của chúng có một cacbon bất ñối xứng nên chúng có
hai ñồng phân quang học: D-axit lactic và L-axit lactic. Hai ñồng phân quang học

1.1. Tổng quan về axit lactic

này có tính chất hóa lý giống nhau, chỉ khác nhau khả năng làm quay mặt phẳng

1.1.1. Lịch sử lên men lactic

phân cực ánh sáng, một quay sang phải và một quay sang trái. Do ñó tính chất sinh

Lên men lactic là quá trình chuyển hóa kỵ khí ñường tạo thành axit lactic ñã

học của chúng hoàn toàn khác nhau.

ñược biết và sử dụng từ lâu ñời trong dân gian như: lên men chua rau quả, làm sữa chua…

Loại L-axit lactic ở dạng tinh thể không màu. Chúng có khả năng tan trong

Năm 1780 nhà bác học Thụy Điển Shale lần ñầu tiên ñã tách ñược axit lactic

nước, tan trong cồn etylic, tan trong eter, không tan trong CHCl3. Nhiệt ñộ nóng

từ sữa bò lên men chua. Năm 1857 Pasteur ñã chứng minh ñược sự lên men chua
sữa là do nhóm vi khuẩn lactic. Năm 1878 Lister phân lập thành công vi khuẩn
lactic ñầu tiên và ñặt tên là Bacterium lactis, nay gọi là Streptococus lactic. Về sau
các nhà khoa học liên tiếp phân lập ñược nhiều loại vi khuẩn lactic khác nhau. Từ
ñó công nghiệp lên men sản xuất axit lactic ñược hình thành từ năm 1881 [1], [3].

chảy là 28oC, góc quay cực ở 15oC là 2,67o.
Loại D-axit lactic là dạng tinh thể, tan trong nước, tan trong cồn. Nhiệt ñộ
nóng chảy là 28oC, nhiệt ñộ sôi 103oC, góc quay ở 15o là -2,26o.
Nếu D-axit lactic và L-axit lactic có trong hỗn hợp theo tỉ lệ 50:50, người ta
gọi là hỗn hợp raxemic. Hỗn hợp này ñược kí hiệu là DL-axit lactic. Trong quá

Ngày nay, việc sản xuất và tiêu thụ axit lactic trên thế giới khá nhiều. Vì axit

trình lên men không có một hỗn hợp lý tưởng này mà chỉ có ñược hỗn hợp này khi

lactic ñược lên men từ nhiều nguyên liệu khác nhau, chủ yếu là những nguyên liệu

tiến hành tổng hợp hữu cơ. DL-axit lactic là dịch lỏng dạng sino, có khả năng tan

có chứa tinh bột, ñường và nguyên liệu có khả năng chuyển hóa thành ñường. Hơn

trong nước, trong cồn, không tan trong CHCl3, nhiệt ñộ nóng chảy của chúng là

nữa, ña số các loại nguyên liệu này thường là phế phẩm trong nhiều ngành công

16,8oC, nhiệt ñộ sôi là 122oC [1], [3].

nghiệp như rỉ ñường, rơm rạ… [16], [25], [28], [36].

1.1.3. Cơ sở của qúa trình lên men axit lactic

1.1.2. Cấu tạo của axit lactic

Các phản ứng sinh hóa xảy ra trong quá trình lên men lactic là những phản

Công thức phân tử: C3H6O3, khối lượng phân tử là 90,08; tỉ trọng 1,21;

ứng chuyển hydro và ñiện tử. Các enzyme xúc tác quá trình tách nguyên tử hydro

nhiệt ñộ sôi 122oC; ñiểm tan 18oC [1]. Axit lactic là hỗn hợp của 2 dạng ñồng phân

khỏi cơ chất là các enzyme oxy hóa – khử (dehydrogenase, oxydase…) chủ yếu từ

D-axit lactic và L-axit lactic:

vi sinh vật. Như vậy, lên men là quá trình oxy hóa - khử sinh học ñể thu năng lượng

D-axit lactic

L-axit lactic

và các hợp chất trung gian. Tùy thuộc vào các sản phẩm tạo thành mà quá trình lên
men lactic ñược chia thành 2 loại: lên men lactic ñồng hình và lên men lactic dị
hình [8], [11].
Lên men lactic ñồng hình, thực tế chỉ xuất hiện axit lactic, còn trong lên men
dị hình các sản phẩm cuối cùng khá ña dạng: axit lactic, etanol, axit axetic và CO2.
Chỉ có lên men lactic ñồng hình là có ý nghĩa về mặt công nghiệp.

Hình 1.1. Hai dạng ñồng phân của axit lactic [52].


-7-

-8-

Các vi khuẩn lactic ñồng hình phân giải glucose theo con ñường EMP [3].

Glucose

Tùy thuộc vào tính chuyển hóa không gian của men xúc tác cho phản ứng tạo axit

Gluco-6- photphat

lactic, lactac dehdrogenase, và tùy vào sự tồn tại của men lactate-racemase mà có
Fructo-1,6-diphotphat

thể xuất hiện các dạng decacboxyl hóa và chuyển thành axit axetic, etanol và CO2

Glyceraldehyt-3-photphat
Dihydroaxeton photphat
NAD

cũng như tạo thành axeton. Mức ñộ tạo thành sản phẩm này phụ thuộc vào sự có
mặt của oxi.
Sự hình thành nên axit lactic trải qua hàng loạt giai ñoạn trung gian với sự

NADH2

tham gia của các enzyme tương ứng. Các phản ứng chuyển hóa glucose theo con

1,3-Diphotphoglyxerat

ñường EMP ñược chia làm 2 giai ñoạn:
- Giai ñoạn ñầu ñược gọi là giai ñoạn ñầu tư năng lượng, gồm 5 phản ứng

3-Photphoglyxerat

ñầu tiên. Ở giai ñoạn này, ñường ñược hoạt hóa bởi sự photphoril hóa. Phản ứng

2-Photphoglyxerat

này tạo ra 1 mol ñường 6 cacbon ñã ñược photphoril hóa, fructozo – 1,6 –
Photphoenol pyruvat

diphotphat. Đường này sau ñó ñược cắt thành 2 mol trizophotphat. Hai mol

Pyruvat

trizophotphat ñược hình thành từ 1 mol glucose sau 2 lần photphoril hóa mức ñộ
cơ chất tạo thành 4 mol ATP.

NADH2

- Giai ñoạn thứ hai, là giai ñoạn phát sinh năng lượng. Giai ñoạn này gồm

NAD

những phản ứng còn lại. Ở giai ñoạn này, các trizophotphat sẽ ñược hoạt hóa tiếp

Lactat

ñể tạo thành hai hợp chất chứa các liên kết photphat cao năng 1,3diphotphoglycerat và photpho enolpiruvat. Cả hai hợp chất này ñược coi như hợp
chất siêu cao năng lượng. Hai chất này sẽ chuyển photpho cao năng cho ADP ñể
tạo thành ATP. Quá trình này ñược gọi là photphoril hóa ở mức cơ chất.
Lượng axit lactic tạo thành chiếm hơn 90%. Chỉ một lượng nhỏ pyruvat bị
khử cacbon ñể chuyển thành axit lactic, etanol, CO2 và axeton [1], [3].
Phương trình phản ứng tạo axit lactic: C6H12O6 = 2CH3CHOHCOOH
+225cal. Sự lên men lactic ñồng hình ñược biểu diễn theo sơ ñồ sau:

Hình 1.2. Lên men axit lactic ñồng hình nhờ các phản ứng theo con ñường EMP [3].
Các vi khuẩn lactic dị hình thiếu các enzyme chủ yếu của con ñường EMP,
do bị ñột biến một hoặc nhiều hơn một enzyme của con ñường này, ñó là aldolase
và trizophotphatizomerase.


-9-

- 10 -

Sự lên men lactic dị hình xảy ra khi vi khuẩn gây lên men thiếu enzyme cơ bản
của sự ñường phân là aldolase và trioso isomerase. Khi ñó, glucose ñược chuyển hoá

theo con ñường pentosophosphat từ glucoso 6 phosphat ñến xiluloso 5 phosphat. Sau ñó,
dưới tác dụng của enzyme pentosophosphat cetolase mà xiluloso 5 phosphat bị phân ly
tạo thành glyceraldehyd 3 phosphat và acetyl phosphat. Acetyl phosphat có thể ñược
chuyển hoá tiếp tục thành ethanol hoặc axit axetic tuỳ theo hệ enzyme của từng vi sinh
vật. Còn glyceraldehyd 3 phosphat thì bị khử H2 ñể chuyển thành axit lactic giống như
trường hợp lên men lactic ñồng hình.
Sự lên men lactic dị hình ñược ứng dụng trong lên men thức ăn gia súc và muối
chua rau quả. Các vi khuẩn có khả năng gây lên men các ñường mono và disaccharid
(sau khi ñã thuỷ phân thành monosaccharid nhờ enzyme tƣơng ứng của vi khuẩn).
1.2. Tác nhân tổng hợp axit lactic
Vi sinh vật là tác nhân chủ yếu gây nên sự lên men. Trong tế bào vi sinh vật
có một hệ enzyme rất phức tạp. Tuy nhiên, không phải tất cả vi sinh vật ñều có khả
năng tổng hợp một phức hệ enzyme như nhau. Nhiều thí nghiệm nghiên cứu các
enzyme riêng biệt có nguồn gốc từ vi sinh vật chứng tỏ rằng ngay cả cùng một loài,
khác nhau về lượng enzyme tổng hợp ñược. Vì vậy, việc tuyển chọn chủng có hệ
enzyme ñặc trưng cho một sản xuất nào ñó luôn luôn liên quan tới việc khảo
nghiệm hàng chục, hàng trăm loài vi sinh vật khác nhau. Để có ñược chủng ứng
dụng cho từng sản xuất riêng là vấn ñề khó khăn, phức tạp và lâu dài [1].
1.2.1. Phân loại vi khuẩn lactic
Theo khóa phân loại Bergey, nhóm vi khuẩn lactic thuộc:
Giới: Bateria
Ngành: Firmicutes
Lớp: Bacilli
Bộ: Lactobacillates
Hình 1.3. Lên men axit lactic dị hình theo các phản ứng của con ñường PP [4].

Họ: Lactobacillaceae & Streptococcaceae…

Trong sự lên men lactic dị hình, nhiều sản phẩm khác nhau ñược tạo thành. Các

Vi khuẩn lactac có chung các ñiểm như: bắt màu gram (+), không di ñộng,

tác nhân gây lên men lactic dị hình là Lactobacillus brevis, Leuconostoc mensenteroides.

không tạo bào tử (dù vậy, ngày nay người ta tìm thấy một số vi khuẩn sinh axit


- 11 -

- 12 -

lactic có khả năng tạo bào tử), nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, kị khí tùy ý, tế bào

Nhóm vi khuẩn lactic bao gồm nhiều loài khác nhau về hình dạng, song về

không chứa cytochobrom và enzyme catalase, lên men tổng hợp axit lactic [1], [5].

mặt sinh lý và khả năng lên men chúng tương ñối ñồng nhất. Môi trường sinh

Bảng 1.1. Hình thái và kiểu lên men lactic của một số vi khuẩn lactic [1], [3].

trưởng của chúng ngoài gluxit, khoáng, muối amon, photphat còn cần vitamin

Giống vi sinh vật

Kiểu

Sản phẩm chính Cấu hình

lên men

(tỉ lệ phân tử)

axit lactic

ñồng hình

lactat

D(-)

L. helveticus

ñồng hình

lactat

DL

L. acidophilus

ñồng hình

lactat

D(-)

L. bulgaricus

ñồng hình

lactat

D(-)

L. delbrueckii

ñồng hình

latcat

D(-)

L.casei

ñồng hình

latcat

- Thuộc loại trực khuẩn nhỏ, có kích thước rất ngắn.
Chúng có thể tạo chuỗi, không di ñộng, gram (+).
- Có khả năng lên men một số loại ñường như
glucose, fructose, galactose, maltose, mannose, lactose.
- Trong quá trình lên men chúng tạo ra L-axit lactic
Hình 1.4. Lactobacillus casei [52]

L(-)

L. plantarum

ñồng hình

lactat

DL

L. brevis

dị hình

-

DL

L. fermentum

dị hình

-

DL

L. viridescens

dị hình

-

DL

Bifidobacterium bifidum

dị hình

lactat: acetat(2:3)

L(+)

- Lactobacillus casei thuộc nhóm các vi khuẩn lên men lactic ñồng hình.
Cấu trúc tế bào của lactobacillus casei thường thẳng, hình que và sắp xếp
theo dây chuyền. Kích thước tế bào khoảng 0,7-1,1 x 2,0-4,0 micrometer. Nó thuộc
dạng yếm khí tùy tiện. Điều này có nghĩa nó là một sinh vật có khả năng phát triển
trong cả hai môi trường hiếu khí và kỵ khí, nhưng phát triển tốt hơn và nhanh hơn
trong sự hiện diện của oxygen.

Cầu khuẩn
Stretoccus

ñồng hình

lactat

L(+)

S. faeclis

ñồng hình

lactat

L(+)

S. salivarius

ñồng hình

lactat

L(+)

S. pyogenes

ñồng hình

lactat

L(+)

S. cremoris

ñồng hình

lactat

L(+)

S. thermophilus

ñồng hình

lactat

L(+)

S. diacetilactics

ñồng hình

lactat

L(+)

Pediococcus cerevisiae

ñồng hình

lactat

DL

Leuconostoc cremoris

dị hình

Leuconostoc mesenteroides

1.2.2. Một số vi khuẩn lactic ñiển hình
Lactobacillus casei:

Trực khuẩn

Lactobacillus lactic

nhóm B, vitamin H, axit folic, axit nicotinic và axit amin khác [1], [11].

dị hình

lactat : acetat : CO2 (1:1:1)

D(-)

lactat : acetat : CO2 (1:1:1)

D(-)

Điều ñặc biệt của vi khuẩn này là có khả năng hoạt ñộng trong một khoảng
nhiệt ñộ và pH tương ñối rộng, nhiệt ñộ hoạt ñộng nằm trong khoảng: 30-40oC, pH
tối thích vào khoảng 5.5.
Các nhà khoa học ñã tìm thấy lactobacillus casei có nhiều ñặc tính có lợi hỗ
trợ sức khỏe con người. Nó có thể cải thiện và tăng cường tiêu hóa. Một số chủng
vi khuẩn giúp kiểm soát tiêu chảy, có tác dụng chống viêm ruột, giảm dung nạp
ñường lactose, giảm táo bón,... Ngoài ra, nó còn là vi sinh vật sử dụng ñể sản xuất
axit lactic, một sản phẩm ứng dụng rộng rãi trong công nghệ sinh học và trong
ngành công nghiệp thực phẩm. Lactobacillus casei ñược sử dụng rộng rãi trong
công nghiệp, nhất là trong sản xuất sữa.


- 13 -

- 14 -

Lactobacillus bulgaricus:

Ứng dụng vi khuẩn lactic ñể len men sữa chua: nhiều loại vi khuẩn lactic

- Thuộc loại trực khuẩn có kích thước rất dài, liên kết với nhau tạo thành
chuỗi, gram (+).

ñược ñưa vào quá trình sản xuất sữa chua. Sự lên men lactic trong quá trình sản
xuất vừa tăng giá trị dinh dưỡng vừa có tính chất chữa bệnh ñường ruột giúp ăn

- Chúng không có khả năng di ñộng

ngon miệng, dễ tiêu hóa vừa có tác dụng bảo quản lâu hơn sản phẩm sữa khỏi bị hư hỏng.

- Chúng có khả năng lên men ñược các loại ñường
như glucose, lactose, galactose, fructose

Ứng dụng ñể sản xuất dưa chua: muối chua rau quả là một quá trình hoạt
ñộng của vi khuẩn lactic và vi khuẩn axetic. Trong rau quả, vi khuẩn sẽ phát triển

- Chúng không có khả năng tạo ra nitrit từ nitrate.
Hình 1.5. L.bulgaricus [52]

tạo axit lactic và axit axetic cùng với một số chất hữu cơ khác. Các axit hữu cơ này
làm giảm pH của dịch, chống lại sự phát triển của các vi sinh vật gây thối làm hư

Lactobaciilus acidophilus:

thối rau quả. Bên cạnh ñó, nhờ có lượng axit hữu cơ tạo thành sẽ làm tăng hương vị

- Thuộc loại trực khuẩn gram (+) di ñộng

của khối ủ chua rau quả, ñồng thời giữ ñược màu tự nhiên và bảo ñảm ñược chất

- Kích thước: rộng 0,6µ – 0,9µ

lượng của sản phẩm ủ chua. Vì vậy, cũng như sản xuất sữa chua, muối chua rau quả

- Trong thiên nhiên chúng tồn tại riêng lẽ. Đôi

là quá trình vừa mang ý nghĩa chế biến vừa mang ý nghĩa bảo quản.

khi cũng tạo thành chuỗi ngắn.

Ứng dụng trong sản xuất tương: sản xuất tương theo phương pháp của người

- Có khả năng lên men một số loại ñường như

miền Bắc (Việt Nam) có giai ñoạn ngả nước ñậu sau khi rang. Quá trình ngả nước

glucose, fructose, galactose, maltose, mannose, lactose,

ñậu này có nhiều phản ứng sinh hóa khác nhau xảy ra, trong ñó có quá trình lên

Hình 1.6. L.acidophilus [52]

saccharose ñể tạo thành axit lactic.

- Chúng không có khả năng lên men một số loại ñường như xylose,
arabinose, rhamnose, glycerol, mantitol, sorbitol, dulcitol, inositol.

- Nhiệt ñộ phát triển tối ưu là 45 – 50oC.

men lactic tạo pH thích hợp cho sản phẩm và làm tăng hương vị cho sản phẩm.
Ứng dụng sản xuất ñậu phụ: giai ñoạn kết tủa protein của ñậu trong quá trình
sản xuất ñậu phụ theo phương pháp truyền thống thường dùng nước dưa chua (có vi
khuẩn lactic) ñể tạo kết tủa nhờ pH giảm ñến ñiểm ñẳng ñiện của protein ñậu nành.

Streptococcus lactic:

Ứng dụng ñể sản xuất các sản phẩm lên men từ sữa: các sản phẩm sữa có sử

- Có dạng hình cầu, dạng chuỗi

dụng lên men lactic thông thường là: sữa chua uống, sữa chua ăn, phomat, bơ…Các

- Nhiệt ñộ thích hợp phát triển: 30oC

qúa trình biến ñổi và chuyển hóa trong sản xuất ñều làm cho sản phẩm thêm giàu

- Chúng lên men ñược các loại ñường như:
glucose, maltose, rhamnose, lactose.

Hình 1.7. Streptococcus lactic[52]

dinh dưỡng và tạo cho sản phẩm có hương vị ñặc trưng.
Ứng dụng ñể ủ thức ăn cho gia súc: về nguyên tắc trên các loại cỏ, lá cây có

1.3. Ứng dụng của axit lactic

chứa các chất dinh dưỡng phù hợp với vi khuẩn lactic nên khi tiến hành ủ các loại

1.3.1. Trong công nghệ thực phẩm

cỏ, lá cây thì khối ủ này trở nên chua và giữ ñược màu sắc hương vị của cây, lá.

Vi khuẩn lactic có nhiều trong thiên nhiên, do ñó chúng rất gần gũi với
những hoạt ñộng sống của con người, trong ñó phần lớn là trong ngành chế biến
thực phẩm.

Quá trình ủ chua này cũng góp phần bảo quản thức ăn cho gia súc [5], [8], [15].


- 15 -

- 16 -

Ứng dụng trong sản xuất các loại sữa bột giàu canxi: Bổ sung lactac canxi

1.3.2. Trong y học
Ứng dụng vi khuẩn lactic ñể chữa bệnh

vào thành phần sữa bột dinh dưỡng, bánh ngọt, bánh nướng ñể tăng lượng canxi

ñường ruột: nước Pháp ñã sản xuất và ñưa ra thị

cho cơ thể. [8], [15].

trường hàng chục năm nay một sản phẩm mang tên

1.3.3. Ứng dụng trong công nghệ vật liệu

biolactyl. Sản phẩm này chuyên trị tiêu chảy bằng
một nhóm nhiều vi khuẩn lactic.

Chất dẻo trong tương lai: người ta ñã nghiên cứu những chất dẻo mới thay
thế cho chất dẻo cũ khó bị phân hủy. Chất dẻo mới này là một loại polymer có tên

Hình 1.8. Thuốc Biolactyl [50]

gọi là axit polylactic (PLA). Đó là sản phẩm ñược tạo ra nhiều loại vật liệu ứng

Ứng dụng axit lactic theo phương pháp vi lượng ñồng cân (homeopathy):

dụng trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau như: công nghiệp dệt, công nghiệp

trong quá trình vận ñộng của cơ thể, mô cơ hoạt ñộng mạnh và trong một thời gian

thuộc da, công nghiệp bao bì…Những vật liệu này sau khi vứt bỏ chúng sẽ bị phân

dài sẽ gây ra hiện tượng mệt mỏi. Hiện tượng mệt mỏi này do các phản ứng sinh

hủy bởi vi sinh vật, không gây ô nhiễm môi trường [13], [16], [17].

hóa xảy ra trong mô cơ, tạo axit lactic. Các thầy thuốc ñã tạo ra một vị thuốc bao

1.3.4. Ứng dụng trong mỹ phẩm

gồm axit lactic kết hợp với cây kim sa có khả năng giúp cơ thể không còn mệt mỏi
và có khả năng làm việc trong thời gian dài.
Ứng dụng axit lactic trong phẩu thuật chỉnh hình, người ta thường sử dụng

loại vật liệu có tên là purasorb.
- Purasorb là một hợp chất cao phân tử ñược sản xuất từ axit lactic.
- Purasorb ñược sử dụng như những ñinh gim, gắn phần xương lại với nhau;
khi xương ñịnh hình, purasorb sẽ tự tiêu hủy.

Các loại lactate kim loại ñược sử dụng trong thành phần của một số mỹ
phẩm chăm sóc da như punosal của hãng mỹ phẩm Punac. Mỹ phẩm này có tác
dụng chống lại các vi sinh vật có trên bề mặt da, làm ẩm và sang da [8], [18].
1.4. Tình hình nghiên cứu axit lactic trên thế giới
Axit lactic ñược các nhà nghiên cứu nước ngoài quan tâm khá nhiều, nhưng
chủ yếu tập trung ứng dụng của axit này trong công nghiệp thực phẩm, trong nông
nghiệp và lâm nghiệp, trong y tế và y học.

Ứng dụng axit lactic trong nha khoa: Trong nha khoa có hai chế phẩm ñược

- Năm 1780 nhà bác học Thụy Điển Scheele lần ñầu tiên ñã tách ñược axit

sử dụng nhiều ñó là puramex và puracal. Puramex gồm các thành phần như

lactic từ sữa bò lên men chua. Năm 1857 Pasteur ñã chứng minh ñược lên men sữa là

amulinium lactac, Fe-lactac, Mg-lactac, Mn-lactac, Zn-lactac; puracal chỉ có canxi

do nhóm vi khuẩn lactic [1]. Năm 1878 , Joseph Lister (1827 – 1912) ñã phân lập thành

lactac. Các chế phẩm này thường làm răng khỏe hơn.

công vi khuẩn lactic ñặt tên là Bacterium lactic nay gọi là Streptococcus lactic [13].

Ứng dụng trong sản xuất vật liệu sinh học (biomaterials): các nhà khoa học

Sau ñó có nhiều nhà nghiên cứu trên thế giới ñã nghiên cứu và khảo sát lên men

ñang nghiên cứu tạo ra những vật liệu sinh học dùng trong y học bằng các

sản xuất axit lactic từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau. Vi khuẩn lên men chủ yếu

copolymer của axit lactic. Các copolymer này có tính năng rất giống những bộ

từ nguồn cacbon chính là dịch ñường, từ một số nguyên liệu có khả năng chuyển biến

khung xương ñộng vật. Hướng này ñang ñược nghiên cứu và trong tương lai nó sẽ

thành ñường. Năm 2001, Hassan K. Sreenath, AnaB.Moldes, RichardG. Koegel

ñược ứng dụng nhiều.

& Richard J. Straub, Sản xuất axit lactic từ chất thải nông nghiệp [36]. Năm
2003, Takashi Ueno, Yasuhiro Ozawa, Masaki Ishikawa, Kotoyoshi Nakanishi &
Toshinori Kimura, Sản xuất axit lactic từ chất thải thực phẩm như bã dứa (từ dứa


- 17 -

- 18 -

ñóng hộp) và bã nho (từ sản xuất vang nho) [39]. Năm 2006, Walaiporn

liệu khác nhau ñể có thể lên men axit lactic thì khá phong phú như rỉ ñường, ñường

Timbuntam Klanarong Sriroth, Yutaka Tokiwa, nghiên cứu sản xuất axit lactic

củ cải, nước mía, các phế phẩm công nghiệp khác…Nhưng nghiên cứu lên men thu

từ nước mía bởi lactobacillus sp. Năm 2007, Buenaventurada P. Calabia

nhận axit lactic từ tinh bột hạt mít thì chưa ñược các nhà khoa học quan tâm, hạt

Yutaka Tokiwa, Sản xuất D- axit lactic từ rỉ ñường, nước mía và nước ép

mít lại là một nguồn phế phẩm trong công nghệ sản xuất các sản phẩm thực phẩm

củ cải ñường của Lactobacillus delbrueckii [16].

từ quả mít, chính vì vậy mà chúng tôi ñã mạnh dạn ñề cập ñến việc nghiên cứu lên

- Năm 2007, Sarote Sirisansaneeyakul

Tiyaporn Luangpipat

Wirat

men axit lactic từ tinh bột hạt mít.

Vanichsriratana Thongchai Srinophakun Henry Ho-Hsien Chen Yusuf Chisti,

1.6. Các yếu tố ảnh hưởng ñến tổng hợp axit lactic từ vi sinh vật

Tối ưu hóa sản xuất axit lactic bằng cách cố ñịnh lacbacillus lactic IO-1 [33].

1.6.1. Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng

- Năm 2007, Se´ bastien Givry Vincent Prevot Francis Duchiron, sản

1.6.1.1. Nguồn cacbon

xuất axit lactic từ thủy phân hemicenllulo bởi các tế bào của Lactobacillus

Nguồn cacbon có ý nghĩa hàng ñầu trong sự sống sinh vật, thức ăn chủ yếu

bifermentans cố ñịnh trong Alginat- Ca bằng cách sử dụng phương pháp phản

cùa vi sinh vật hyñrocacbon. Trao ñổi, chuyển hóa hyñrocacbon ñáp ứng ba nhu

ứng bề mặt [22].

cầu của tế bào: sản sinh ra năng lượng, tạo ra những tiền chất, tạo ra các quá trình

Hầu hết các ñề tài nghiên cứu ñều tập trung sản xuất axit lactic từ nhiều

oxy hóa-khử ñể biến ñổi những tiền chất thành các sản phẩm trung gian hoặc sản

nguồn nguyên liệu khác nhau. Nhưng chưa có ñề tài nào dùng tinh bột từ hạt mít ñể

phẩm cuối cùng dùng ñể xây dựng tế bào, ñồng thời tích tụ trong môi trường một

lên men lactic.

hoặc một vài sản phẩm sinh tổng hợp thừa [1], [3].

1.5. Tình hình nghiên cứu axit lactic trong nước

1.6.1.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Tại Việt Nam, việc sử dụng axit lactic vào nhiều ngành công nghiệp khác

Nitơ là nguyên tố quan trọng trong tế bào. Vi sinh vật cũng như các cơ thể

nhau và nguồn axit lactic chủ yếu thu nhập từ nước ngoài với giá thành khá cao. Sự

sống khác ñều cần nitơ trong quá trình sống ñể xây dựng tế bào. Chúng góp phần

quan tâm của các nhà khoa học trong nước về lên men sản xuất axit lactic chủ yếu

tạo nên nhóm amin (_NH2) và nhóm imin (_NH_) trong các phân tử axit amin cấu

từ nguồn nguyên liệu chính là rỉ ñường. Tháng 1 năm 2010, PGS.TS. Lê Thanh

tạo nên protein, các vòng purine và pyrimidine, trong nhiều vitamin và trong một số

Mai, nghiệm thu ñề tài cấp bộ “sản xuất axit lactic từ rỉ ñường”, trường Đại Học

hợp chất khác có trong nguyên sinh chất của tế bào. Việc chọn nguồn nitơ là rất cần

Bách Khoa Hà Nội [49]. Tuy nhiên, việc sử dụng hạt mít làm nguyên liệu cho quá

thiết ñể ñảm bảo ñược hiệu suất sinh tổng hợp cao và có lợi về mặt kinh tế [1], [3].

trình lên men lactic thì chưa ñược nghiên cứu. Tuy vậy, hạt mít ñược quan tâm và

1.6.1.3. Ảnh hưởng của photphat vô cơ

nghiên cứu ở một số Trường Đại Học tuy không nhiều. Năm 2009, tại trường Đại

Tất cả các hoạt ñộng của tế bào ñều cần năng lượng, nguồn năng lượng ñược

Học Bách Khoa Thành Phố Hồ Chí Minh, Nguyễn Minh Hiền, Nguyễn Thúy

tích trữ chủ yếu ở các liên kết cao năng với gốc phosphat. Vì thế các gốc này có vai

Hương, Nghiên cứu quá trình thủy phân tinh bột hạt mít bằng enzyme Termamyl

trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa năng lượng của hệ thống sinh học ở tế

120L và AMG 300L ñể lên men rượu chưng cất [42].

bào [1], [3].

Như vậy, việc sử dụng axit lactic hiện nay ở nước ta rất nhiều, trong khi ñó
quá trình lên men sản xuất axit lactic thì còn hạn chế. Hơn nữa, các nguồn nguyên


- 19 -

1.6.1.4. Ảnh hưởng của nguồn muối khoáng
Môi trường tổng hợp ñòi hỏi phải bổ sung các nguyên tố khoáng cần thiết.

- 20 các dung dịch thường xuyên có ion H+ tự do. Nồng ñộ H+ trong môi trường dinh
dưỡng có ảnh hưởng lớn ñến sự trao ñổi chất và phát triển của vi sinh vật.

Nhu cầu của các nhóm vi sinh vật khác nhau thì khác nhau về nguyên tố khoáng

pH của môi trường có ảnh hưởng rất lớn ñến sự phát triển và khả năng sinh

hoặc nguyên tố vi lượng. Nguyên tố vi lượng ñóng vai trò rất quan trọng vì chúng

tổng hợp của vi sinh vật. Sự ảnh hưởng của pH ñến vi sinh vật một cách không

có chức năng giúp cho một số enzyme hoạt ñộng trong quá trình trao ñổi chất của tế bào.

giống nhau. Có những pH mà ở ñó vi sinh vật vẫn phát triển bình thường, nhưng

Nếu trong môi trường thiếu một số nguyên tố vi lượng vi sinh vật sẽ không

các sản phẩm tạo thành ít hoặc hoàn toàn không tạo thành [1], [3], [4].

phát triển bình thường, dễ dẫn ñến chết tế bào hoặc có sự phát triển bất thường [1],

1.7. Hạt mít

[3], [4].

1.7.1. Đặc ñiểm và thành phần của hạt mít
Cây mít có tên khoa học là: Artocarpus heterophyllus Lam.

1.6.2. Ảnh hưởng của ñiều kiện nuôi cấy
Sinh trưởng và trao ñổi chất của chúng nghiên cứu liên quan chặt chẽ ñến

Họ khoa học: Moraceae.

hàng loạt các yếu tố khác nhau, tác ñộng qua lại với nhau và với môi trường bên
ngoài. Ảnh hưởng của các yếu tố bên ngoài thường thể hiện dưới dạng thích hợp

Đây là một loại cây ăn quả ñược trồng ở vùng
nhiệt ñới hoặc cận nhiệt ñới.

hay không thích hợp cho hoạt ñộng của tế bào và các enzyme trong chuỗi trao ñổi
chất [1], [3].

Cây mít không thể phát triển ở vùng có
khí hậu lạnh

1.6.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt ñộ
Hoạt ñộng trao ñổi chất của vi sinh vật có thể coi là kết quả của các phản

Một số ñiều kiện về khí hậu thổ nhưỡng
của cây mít:
Hình 1.9. Cây mít [51].

ứng hóa học. Vì các phản ứng này phụ thuộc chặt chẽ vào nhiệt ñộ nên yếu tố nhiệt

-

Độ cao: từ mực nước biển – 1600m

ñộ rõ ràng ảnh hưởng sâu sắc ñến các quá trình sống của tế bào. Tế bào thu ñược

-

Lượng mưa: 1000 – 2400mm

nhiệt chủ yếu từ môi trường bên ngoài, một phần cũng do cơ thể thải ra, do kết quả

-

Nhiệt ñộ: 24 – 28oC

của hoạt ñộng trao ñổi chất. Vấn ñề ñáng lưu ý là cùng một loài vi sinh vật, tùy

-

Đất ñai: ñộ sâu của tầng canh tác 25cm, bán kính 2.25m, ñộ pH 5÷7.5.

theo quá trình sinh lý khác nhau mà ñòi hỏi những nhiệt tối thích khác nhau.

Một cây mít trưởng thành mỗi vụ có thể

Hầu hết tế bào sinh dưỡng bị ức chế ở nhiệt ñộ cao do protein bị biến tính,

cho từ 200 – 300 quả, khối lượng mỗi quả trung

một hoặc hàng loạt enzyme bị mất bất hoạt, ngược lại ở nhiệt ñộ thấp có thể làm

bình khoảng 2–5 kg (các giá trị trên khác nhau

bất hoạt quá trình vận chuyển các chất qua màng tế bào do ảnh hưởng ñến cấu hình của

tùy theo giống loài và từng khu vực).

enzyme [1], [3].

1.6.2.2. Ảnh hưởng của pH
Vi sinh vật sống và phát triển trong các môi trường lỏng chịu ảnh hưởng trực
tiếp hoặc gián tiếp của các ion H+ và OH- do các phân tử nước phân ly ra. Trong

Hạt mít ñược coi là phế phụ phẩm trong
quả mít, hạt mít chiếm khoảng 10 – 15% tổng
khối lượng của trái mít.

Hình 1.10. Hạt mít [45].


- 21 -

- 22 -

Hạt mít ñược chứa bên trong múi mít và ñược bao bọc trong một lớp vỏ mỏng
màu trắng. Hạt mít tươi thường có màu nâu sáng cho ñến nâu, có hình bầu dục hoặc
hình tròn.

1.7.2. Tinh bột hạt mít
Từ bảng 1.2, tôi thấy hàm lượng tinh bột trong hạt mít ñạt tới 77.76 ±0.96%
so với tổng số hàm lượng chất khô có trong hạt. Dưới kính hiển vi ñiện tử quét

Chiều dài hạt khoảng 2 – 3 cm (0.8 – 1.2 inch), ñường kính khoảng 1.0 –
1.5cm (0.4 – 0.6 inch). Trung bình trong một quả mít có 100 – 500 hạt. Hạt mít có

(SEM), và kính hiển vi quang dưới ánh sáng bình thường cho thấy các hạt tinh bột
có hình tròn và hình vuông là chiếm ưu thế (hình 1.11). [19].

thể bảo quản trong thời gian một tháng nếu ñược bảo quản trong ñiều kiện lạnh và

ẩm [19].
Bảng 1.2. Thành phần hóa học của hạt mít [38].
% (tính theo vật chất khô)
Chỉ tiêu
Chưa loại lớp vỏ nâu

Đã loại lớp vỏ nâu

Singh et al (1991)

Độ ẩm

7.70 ± 0.20

8.57 ± 0.25

5.1

Protein thô (%N*5.7)

11.02 ± 0.46

11.17 ± 0.21

17.2

Lipid thô

1.01 ± 0.12

0.99 ± 0.08

2.2

Xơ thô

2.36 ± 0.04

1.67 ± 0.11

3.06

3.97 ± 0.04

3.92 ± 0.03

3.6

81.64

82.25

74

Hàm lượng tinh bột

77.76 ± 0.96

-

Amylose của tinh bột

32.05 ± 1.20

-

Protein của tinh bột

1.84

-

pH

5.68

-

Khả năng hấp thụ nước

205

141

Khả năng hấp thụ dầu

92.6

90.2

Tro
Carbonhydrat tổng số

(a)

Hình 1.11. Hình chụp cấu hình phân tử tinh bột hạt mít [19]


- 23 -

- 24 -

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Một số thiết bị thông dụng khác như: Tủ cấy Laminar; Nồi hấp thanh trùng
Hirayama HVE-50; Cân ñiện tử Excell; Tủ ấm Memmert; Máy lắc Edmund Buhler
Gmbtt… (phụ lục 2.1)

2.1. Đối tượng nghiên cứu

- Dụng cụ, vật liệu dùng trong thực nghiệm (phụ lục 2.2)
Hóa chất: Sử dụng các hóa chất trong phòng thí nghiệm Trường Đại học

2.1.1. Hạt mít
Hạt mít ñược thu mua tại một số cơ sở bóc múi mít cung cấp cho Công ty
Vianamit - tại thị xã Buôn Hồ, huyện Krôngbuk, tỉnh Daklak.
2.1.2. Enzyme thủy phân

Bách Khoa Đà Nẵng và một số hóa chất liên quan mua tại Đà Nẵng và TP. Hồ Chí
Minh (phụ luc 1.1 và 1.2)

2.2. Phương pháp nghiên cứu

Tinh bột hạt mít ñược thủy phân bởi 2 loại chế phẩm enzyme: α-amylaza và
γ-amylaza .Chế phẩm enzyme α-amylaza do hãng Novozymes - Đan Mạch sản xuất.

2.2.1. Phương pháp hóa học
2.2.1.1. Xác ñịnh hàm lượng tinh bột theo phương pháp thủy phân nhờ axit [6]

Còn chế phẩm γ-amylaza do Genencor Bio-products Co.Ltd, China sản xuất. Chế

Nguyên tắc: Thủy phân tinh bột thành ñường bởi dung dịch HCl 2% ở ñiều

phẩm α-amylaza có dạng lỏng màu nâu ñậm, không có mùi, nhiệt ñộ tối thích từ 90

kiện ñun sôi trong bình cách thủy với thời gian là 2 giờ. Dịch ñã thủy phân ñược

÷105oC, pH tối thích từ 4,5÷5. Chế phẩm enzyme γ-amylaza cũng có dạng lỏng, màu

làm nguội và trung hòa bằng NaOH với chỉ thị metyl da cam. Hàm lượng ñường

nâu ñen, có mùi hắt khó chịu, pHopt=3,5 – 5, topt= 50 – 60oC.

trong dung dịch ñược xác ñịnh theo các phương pháp Graxianop (ñược trình bày ở

2.1.3. Vi khuẩn lactic

mục 2.2.1.2 bên dưới). Từ hàm lượng ñường ñịnh lượng ñược, áp dụng công thức

Vi khuẩn lactobacillus casei ñược lấy từ công ty Nanogen Biopharma, thành
phố Hồ Chí Minh. Chủng ở dạng ñông khô nên cần phải hoạt hoá lại trước khi sử

ñể xác ñịnh hàm lượng tinh bột của hạt mít, xem phụ lục 3.1 và 3.2
2.2.1.2. Xác ñịnh hàm lượng ñường khử bằng phương pháp Graxianop [6]

dụng. Chúng tôi bảo quản chủng vi khuẩn này ở ñiều kiện 0-5oC trong suốt thời gian nghiên cứu.

Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng

2.1.4. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất trong quá trình nghiên cứu

2K3Fe(CN)6 + 2KOH

2K4Fe(CN)6 +H2O + O

Thiết bị:

Tiếp theo oxi hóa ñường ñể tạo thành axit ñường

- Tủ sấy: dùng ñể sấy nguyên liệu và dụng cụ

CH2CH(CHOH)4 + O

- Máy so màu

Phản ứng tổng quát là:

COOH(CHOH)4COOH

4K3Fe(CN)6 + 4KOH + CH2CH(CHOH)6CHO

4K4Fe(CN)6+

COOH(CHOH)4COOH + 2H2O
2.2.1.3. Xác ñịnh hàm lượng axit lactic bằng phương pháp hóa học [12]
Nguyên lý
Oxy hóa axit lactic bằng ñồng sunfat, ở môi truờng axit sunfuric thành
acetaldehyd. Acetaldehyd kết hợp với para-oxydiphenyl với sự có mặt của ion
Hình 2.1. Máy so màu hiệu JENWAY 6305

Hình 2.2. Tủ sấy nguyên liệu

Cu2+, cho màu tím có thể ñịnh lượng bằng phương pháp so màu trên máy so màu.


- 25 -

- 26 -

Dụng cụ, vật liệu và thuốc thử:

Đơn vị hoạt ñộ enzyme α- amilaza là lượng enzyme chuyển hóa ñược một

- Máy so màu

gam tinh bột tan thành các dextrin có phân tử lượng khác nhau ở 30oC trong thời

- Dung dịch CuSO4 4%

gian một giờ (pH cho amilaza của malt là 4.8 – 4.9, của nấm mốc là 4.7, của vi

- Axit sunfuric ñậm ñặc

khuẩn là 6.0…).

- Axit sunfuric 10%

Cách tiến hành xem phụ lục 3.3

- Dung dịch chì axetat basic: + Chì axetat Pb(CH3COO)2 300gam
+ Chì oxyt (bột)

100gam

+ Nước cất

700gam

Nghiền nát chì axetat, cho vào chậu sứ với chì oxyt và nước cất, khuấy cho
ñến khi tan hoàn toàn. Lọc và bảo quản trong chai nút kín.
- Dung dịch para oxydiphenyl 0,75%
+ Para oxydiphenyl 0,75gam
+ NaOH 2% vừa ñủ 100ml
Cách tiến hành và tính toán theo phụ lục 3.5.
2.2.1.4. Xác ñịnh hàm lượng ñường khử bằng phương pháp so màu sử dụng acid
dinitro salicylic (DNS) [6].
Mục ñích: Nhằm kiểm tra và ñiều chỉnh nồng ñộ dịch ñường sau thủy phân
ñể thuận lợi cho quá trình lên men.

2.2.1.6. Xác ñịnh hoạt lực của γ-amilaza theo phương pháp vi lượng của
V.Y.Rodzevich, O.P.Korenbiakina [6]

Nguyên tắc: Phương pháp dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột bởi enzyme γamilaza có trong chế phẩm nghiên cứu. Xác ñịnh lượng glucoza tạo thành sẽ tính
ñược hoạt ñộ enzyme.
Đơn vị hoạt ñộ γ-amilaza là lượng enzyme tác dụng lên dung dịch tinh bột
tan pH= 4,7 ở nhiệt ñộ 30oC trong thời gian một giờ giải phóng ñược 1mg glucoza.
Cách tiến hành xem phụ lục 3.4
2.2.2. Phương pháp công nghệ
2.2.2.1. Xử lí hạt mít và sản xuất bột hạt mít
Hạt mít ñược thu nhận từ nhiều cơ sở sản xuất nhỏ lẻ. Quá trình xử lý và thu
nhận bột hạt mít ñược trình bày như quy trình bên dưới.
Hạt mít thu nhận về ñược tách các hợp chất hữu cơ như xơ, vỏ, cồi mít và

Nguyên tắc: Dựa trên phản ứng tạo màu giữa ñường khử với thuốc thử axit

rửa sạch, phơi ráo ñể thuận lợi cho quá trình tách lớp vỏ cứng bên ngoài. Dùng dao

dinitrosalicylic DNS. Cường ñộ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng ñộ

ñể tách sạch lớp vỏ cứng. Sau ñó bóc lớp vỏ màu nâu mỏng bao quanh hạt, vì chính

dịch ñường khử trong phạm vi nhất ñịnh. Dựa trên ñồ thị ñường chuẩn ñối với

lớp vỏ này ảnh hưởng ñến màu sắc của bột hạt mít. Trong quá trình nghiên cứu,

glucoza tinh khiết tính ñược hàm lượng ñường khử trong mẫu phân tích.

chúng tôi sử dụng NaOH với các nồng ñộ nghiên cứu khác nhau ñể tách lớp vỏ màu

Phương pháp tiến hành ñược thể hiện ở phụ lục 3.6
2.2.1.5. Xác ñịnh hoạt lực của α- amilaza theo Rukhliadeva [6]
Nguyên tắc: Phương pháp dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột bởi enzyme có

trong dịch chế phẩm nghiên cứu tới các dextrin có phân tử lượng khác nhau. Đo
cường ñộ màu tạo thành giữa tinh bột và các sản phẩm thủy phân của nó với iot
bằng máy so màu quang ñiện sẽ tính ñược hoạt ñộ enzyme.

nâu ñồng thời không lưu lại mùi xút (mùi ñặc trưng của NaOH) trong bột hạt mít
thành phẩm. Tiếp ñến là thái mỏng hạt mít ñể rút ngắn thời gian sấy khô. Những
miếng hat mít tươi này sấy liên tục ở nhiệt ñộ 55 -60oC từ 60 ñến 72giờ. Cuối cùng
là xay bột ñáp ứng cho quá trình nghiên cứu sau này.


- 27 -

- 28 -

Hạt mít

Bột hạt mít ñem hòa nước

Làm sạch và làm ráo

Hồ hóa ở to = 95oC, T = 45 phút, ñiều chỉnh về pH=5,5-6

Tách lớp vỏ cứng bên ngoài
Bổ sung chế phẩm α-amylaza, tỉ lệ 0,1%
Tách vỏ nâu
Nâng nhiệt ñộ lên 95oC và giữ 120 phút
Rửa sạch và làm nhỏ
Hạ to = 60oC và ñiều chỉnh pH = 4,25
Sấy khô
Xay bột

2.2.2.2. Phương pháp thủy phân tinh bột hạt mít bằng chế phẩm enzyme α-amylaza

Bổ sung chế phẩm γ – amylaza, tỉ lệ từ 0,12 - 0,2 %
Giữ ở 60oC, T = 175-180 phút

và γ-amylaza
Quá trình thủy phân tinh bột hạt mít ñược thực hiện nhờ hai loại chế phẩm

Ở ñây chúng tôi sẽ cố ñịnh các ñiều kiện dịch hóa bởi chế phẩm α-amylaza

enzyme α-amylaza và γ – amylaza [42]. Bột hạt mít trước lúc dịch hóa ñược hồ hóa

và chỉ khảo sát hàm lượng chế phẩm γ – amylaza bổ sung trong quá trình ñường

ở pH = 5- 5.5, nhiệt ñộ 95oC trong bể ổn nhiệt. Trong quá trình dịch hóa bằng chế

hóa sao cho hiệu suất thủy phân là cao nhất.

phẩm enzyme α-amylaza, tinh bột hạt mít ñược chuyển hóa thành maltoza, một ít

2.2.2.3. Môi trường lên men lactic [34]

ñường glucoza và chủ yếu là các dextrin. Sau ñó chúng tôi tiến hành ñường hóa bởi

Bảng 2.1. Thành phần môi trường lên men axit lactic (Fer) [34].

chế phẩm enzyme γ – amylaza ñể cuối cùng thu nhận sản phẩm là dịch ñường ñáp

Thành phần

ứng cho quá trình lên men lactic.

Cao nấm men

8,0

Merck, Đức

K2HPO4

0,5

Merck, Đức

Trên cơ sở nghiên cứu lý thuyết và thừa kế kết quả nghiên cứu của Nguyễn

Gam/lít

Nguồn cung cấp

Minh Hiền, Nguyễn Thúy Hương (Trường ĐH Bách khoa TP.HCM) [42], tác giả ñã

KH2PO4

0,5

Merck, Đức

1,0

Merck, Đức

sử dụng chế phẩm enzyme α-amylaza của hãng Novozymes - Đan Mạch sản xuất

CH3COONa.3H2O

với tỷ lệ 0,1% ñể dịch hóa tinh bột và 0,12% chế phẩm enzyme γ – amylaza cũng

MgSO4.7H2O

0,6

Merck, Đức

do hãng này sản xuất cho quá trình ñường hóa. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử

MnSO4.4H2O

0,03

Merck, Đức

dụng chế phẩm γ-amylaza do Genencor Bio-products Co.Ltd, China sản xuất nên tỷ
lệ chế phẩm enzyme sử dụng cần phải ñược nghiên cứu thêm. Chính vì thế mà
chúng tôi ñã ñề xuất quy trình thủy phân như sau:

Dịch ñường vừa ñủ 1000ml
Môi trường lên men lactic trong nghiên cứu này là dịch ñường của quá trình
thủy phân từ tinh bột hạt mít với nồng ñộ khảo sát phối trộn với môi trường riêng lẻ
thích hợp với nhau.

- 29 -

- 30 -

Sau khi phối trộn tất cả các thành phần, tiến hành hiệu chỉnh pH môi trường
bằng H2SO4 20% và NaOH 5N [34] ñể ñưa pH về giá trị cần cho quá trình lên men.

Chủng vi khuẩn lactobacillus casei ở dạng ñông khô, hoạt hóa ở môi trường
trên theo các bước sau:

Hấp tiệt trùng dịch lên men ở nhiệt ñộ 121oC trong thời gian 20 phút.
2.2.2.4. Phương pháp lên men lactic

- Dùng que cấy lấy một lượng vừa phải chủng ñông khô cho vào lọ ñựng
10ml nước muối sinh lý ñã qua hấp tiệt trùng, khuấy tan ñều.

- Giống vi khuẩn sau khi nuôi cấy ñạt yêu cầu, kiểm tra và khảo sát theo các ñiều

- Chuẩn bị môi trường MRS ñã hấp tiệt trùng, ñổ ñều trên 5 ñĩa petri, làm nguội.

kiện thích hợp.

- Dùng pipet vô trùng hút 1ml dịch khuẩn trên cho vào ñĩa petri, sau ñó dùng

- Dịch ñường sau khi xác ñịnh nồng ñộ và bổ sung một số thành phần khác.

que trang trang ñều trên bề mặt thạch.

Tiến hành hấp thanh trùng ở nhiệt ñộ 121oC trong 20 phút.

- Nuôi cấy trong thời gian 48h, ổn ñịnh ở nhiệt ñộ 30oC trong tủ bảo ôn.

- Chuyển giống từ môi trường nuôi cấy sang môi trường lên men theo tỉ lệ
xác ñịnh trong quá trình khảo sát.

2.2.3.2. Phương pháp xác ñịnh gián tiếp số lượng tế bào bằng cách ñếm các khuẩn
lạc phát triển trên môi trường thạch [5]
Nguyên tắc: Một tế bào có thể phân chia theo cấp số nhân cho ñến khi hình

2.2.3. Phương pháp vi sinh vật
2.2.3.1. Phương pháp hoạt hóa vi khuẩn

thành một khuẩn lạc có thể trông thấy ñược. Đây là cơ sở của việc ñịnh lượng tế

Môi trường ñể nuôi cấy vi khuẩn lactobacillus casei là môi trường MRS agar
của Merck, Đức. Đây là môi trường có pha chế sẵn và có thành phần như sau: [14], [29].
Bảng 2.2. Thành phần môi trường MRS Agar

bào trên ñĩa thạch, bởi số lượng khuẩn lạc sinh ra từ một thể tích giống vi sinh vật
nhất ñịnh chỉ số lượng tế bào sống có trong thể tích giống ñó. Thông thường, tất cả
các tế bào ở phase tăng trưởng hay ở phase ổn ñịnh ñều có khả năng hình thành khuẩn lạc.

Thành phần

Gam/lít

Peptone

10,0

Để ñịnh lượng chính xác, cần phải thực hiện sao cho mỗi một khuẩn lạc chỉ

Cao thịt

8,0

ñược hình thành từ một tế bào. Do dịch tế bào sử dụng trong phòng thí nghiệm

Cao nấm men

4,0

thường có nồng ñộ cao, thường nhiều hơn 106 tế bào/ml, nên cần thiết phải ñược

Glucose

20,0

pha loãng trước khi cấy. Phương pháp chuẩn là thực hiện các bước pha loãng ñể

K2HPO4

2,0

giảm nồng ñộ tế bào từ 10 ñến 100 lần cho ñến khi ñạt vài nghìn tế bào/ml.

Vì vậy, số lượng khuẩn lạc ñếm ñược gần như tương ñương với số lượng tế bào sống.

Cách tiến hành ñược thể hiện ở phụ lục 3.8.

CH3COONa.3H2O

5,0

Triamonium citrate

2,0

MgSO4.7H2O

0,2

Giống phải ñược hoạt hóa trước khi lên men ñể ổn ñịnh trạng thái sinh lý,

MnSO4.4H2O

0,05

tiến hành nhân giống theo các cấp, thể tích cấp sau lớn hơn cấp trước khoảng 10 lần

Agar

10,0

[1], [10]. Trong lên men công nghiệp việc rút ngắn thời gian lên men là cần thiết,

Sorbitan mono-oleate (C24H44O6)

1ml

do ñó môi trường nhân giống ñược thiết kế có thành phần giống môi trường lên

pH = 6,2 ±0,2

2.2.3.3. Phương pháp chuyển giống sang môi trường lên men

men nhằm tạo ñiều kiện thích nghi cho chủng nghiên cứu và giảm thời gian lên
men.


- 31 -

- 32 -

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Mật ñộ giống cấy phải ñược xác ñịnh trước khi thực hiện việc lên men thông
qua phương pháp xác ñịnh gián tiếp mật ñộ tế tào bằng cách ño OD620nm [39].
Trong qúa trình nhân giống và lên men phải theo dõi tính thuần khiết của

3.1. Khảo sát ñặc ñiểm của các nguyên liệu trong nghiên cứu

giống cấy, tránh tình trạng bị tạp nhiễm vi sinh vật lạ gây ảnh hưởng ñến hiệu suất

3.1.1. Bột hạt mít

lên men và làm sai lệch kết quả khảo sát.

3.1.1.1. Xử lí và thu nhận bột hạt mít
Theo quy trình ñã trình bày ở mục 2.2.2.1, chúng tôi ñã tiến hành xử lý và

2.2.4. Phương pháp toán học
Áp dụng quy hoạch thực nghiệm ñể khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố ảnh
hưởng ñến quá trình lên men và tối ưu hóa hàm một mục tiêu hai yếu tố [2].

thu nhận bột hạt mít. Theo quy trình này, vỏ cứng ñược tách bằng phương pháp cơ
học, còn vỏ nâu thì sử dụng NaOH. Để tìm ra nồng ñộ xút thích hợp cho việc tách
vỏ nâu, chúng tôi ñã tiến hành ngâm hạt mít trong dung dịch NaOH có nồng ñộ:
1%, 2%, 3% và 4% trong khoảng thời gian từ 3 - 5 phút. Kết quả khảo sát ñược
trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của nồng ñộ xút ñến quá trình tách lớp vỏ nâu ở hạt mít
STT

NaOH, %

Kết quả

1

1

Lớp vỏ nâu tách không hết, màu của hạt ñậm tối

2

2

Lớp vỏ nâu chưa tách hết triệt ñể, màu của hạt không

3

3

Đã tách sạch lớp vỏ nâu của hạt, màu của hạt ñẹp, trắng

4

4

Đã tách sạch lớp vỏ nâu của hạt, màu của hạt ñẹp, trắng

ñẹp, hơi vàng nâu

Như vậy, bắt ñầu ở nồng ñộ NaOH 3% là ñã tách hết lớp vỏ nâu, ngâm lại
bằng nước lạnh và rửa sạch ñể không còn lưu lại mùi của xút. Ở nồng ñộ xút càng
cao thì lớp vỏ nâu cũng ñược tách sạch, tuy nhiên về mặt kinh tế sẽ không ñạt yêu
cầu và mùi của xút còn lưu lại trên hạt mít ảnh hưởng ñến chất lượng của bột hạt
mít. Vì vậy chúng tôi chọn nồng ñộ NaOH 3% ñể tách sạch lớp vỏ nâu của hạt mít.
Sau khi tách xong vỏ nâu, hạt mít ñược thái nhỏ, ñể ráo, sấy khô, xay thành bột ñể
thuận lợi cho quá trình nghiên cứu.
Nguyên liệu sau khi sấy khô, ñể kiểm tra dư lượng của NaOH còn trong hạt
mít vì mùi của NaOH ảnh hưởng ñến chất lượng của bột hạt mít, chúng tôi tiến
hành kiểm nghiệm bằng cách ngâm nước cất trở lại ñến khi lát hạt mít trương nở,


- 33 -

- 34 -

sau ñó dùng quỳ tím và áp sát vào lát hạt mít ñồng thời nhúng vào nước ngâm. Kết

Dựa vào kết quả thu ñược từ thực nghiệm chúng tôi thấy rằng, hàm lượng

quả cho thấy, giấy quỳ tím không ñổi màu. Như vậy, qua thời gian ngâm rửa và

tinh bột của hạt mít trung bình ñạt 65,62%. Trong khi ñó, theo tài liệu [13] thì hàm

sấy, NaOH không còn lưu lại trong mẫu hạt mít.

lượng tinh bột trong hạt mít 77.76 ± 0.96%. Như vậy nguyên liệu khảo sát có hàm
lượng tinh bột thấp hơn so với tài liệu nghiên cứu. Theo chúng tôi do nguyên liệu
thu mua tại một số nơi xử lí mít, thông thường do mít thu mua về ñang ở giai ñoạn
già chín và có thể còn non hoặc mít chỉ ñạt ñến ñộ chín thu hái, ñây cũng chính là
nguyên nhân làm cho hàm lượng tinh bột trong hạt mít hình thành chưa nhiều.
3.1.2. Chế phẩm enzyme
Trong quá trình thủy phân tinh bột hạt mít, chúng tôi sử dụng 2 loại chế
phẩm enzyme như ñã trình bày ở mục 2.2.2.2. Để khảo sát hiệu quả của quá trình
thủy phân cũng như ñịnh lượng ñược hàm lượng enzyme bổ sung, trước khi thủy

Hình 3.1. Bột hạt mít thu nhận

phân tinh bột, chúng tôi xác ñịnh lại hoạt lực của chế phẩm enzyme tại thời ñiểm

Bột hạt mít thu nhận ñược có màu trắng ñục, gần giống như màu của bột ngủ
cốc, có hương thơm ñặc trưng.

nghiên cứu.
3.1.2.1. Xác ñịnh hoạt lực của chế phẩm enzyme α-amylaza

3.1.1.2. Xác ñịnh hàm lượng tinh bột của hạt mít

Chúng tôi tiến hành thực nghiệm với chế phẩm enzyme ñưa về bằng cách

Chúng tôi tiến hành xác ñịnh hàm lượng tinh bột của hạt mít theo phương

pha loãng 10 lần. Dựa vào nguyên tắc ñã trình bày ở mục 2.2.1.5 và phụ lục 3.3.

pháp thủy phân bằng axit như ñã trình bày ở 2.2.1.1. Từ ñó tôi ñịnh lượng hàm

Chúng tôi tiến hành thực nghiệm và nhận thấy: ống chứa dung dịch kiểm chứng có

lượng ñường khử tạo thành theo phương pháp Graxianop như ñã trình bày ở mục

màu xanh, ống chứa dung dịch thí nghiệm có màu tím.

2.2.1.2, phụ lục 3.1 và 3.2.

Đo cường ñộ màu của các dụng dịch ở bước sóng λ = 656nm so với nước

Với hạt mít thu mua từ các nguồn nhỏ lẻ khác nhau thì kết quả tinh bột xác
ñịnh ñược trình bày ở bảng 3.2

cất, kết quả ñược trình bày ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Kết quả ño OD của dịch kiểm chứng và mẫu thí nghiệm

Bảng 3.2. Hàm lượng tinh bột của hạt mít
Số lần ño
KQ ño

Kết quả ño OD

Lần 1
(ml)

Lần 2
(ml)

Lần 3
(ml)

Lần 4
(ml)

Trung bình
(ml)

Glucoza 0,5%

2,7

2,8

2,8

2,9

2,8

Dịch ñường

2,5

2,4

2,3

2,4

2,4

a (gam)

0,014

Mbột, %

65,62

Mật ñộ quang

Lần 1

Lần 2

Lần 3

Trung bình

D1

0,145

0,145

0,145

0,145

D2

0,071

0,072

0,071

0,071

Từ công thức tính: C =
Suy ra: C = 0,051

D1 − D2
* 0,1
D1


- 35 -

Trong ñó:

- 36 -

D1 là mật ñộ quang ño ñược của dung dịch kiểm chứng

thể bị giảm, nếu vậy chúng tôi thay chế phẩm mới sản xuất khác hoặc tăng hàm

D2 là mật ñộ quang ño ñược của dung dịch thí nghiệm

lượng chế phẩm enzyme bổ sung khi thủy phân.

0,1 là lượng tinh bột ñem phân tích, gam.

3.1.3. Vi khuẩn lên men lactic

C: là lượng tinh bột ñược thủy phân

Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng vi khuẩn lactobacillus casei.

Vậy hoạt lực của chế phẩm enzyme α-amylaza ñược tính như sau:

Chủng này ñang ở dạng ñông khô nên chúng tôi tiến hành hoạt hóa chủng. Sau khi

Cứ 5ml enzyme

hoạt hóa, vi khuẩn có dạng như hình 3.2, sau ñó chúng tôi chọn những ñốm khuẩn

thủy phân ñược 0,051g bột trong 10phút

X1 ml enzyme

1g bột

có màu trắng sữa, tròn ñều và nhân giống các cấp theo thời gian, bảo quản ở nhiệt

X1 = (5 x 1)/0,051 = 98,039 (ml enzyme)

ñộ thấp ñể phục vụ cho nghiên cứu.

Trong 60 phút thì: X2 = 98,039 x 6 = 588,235 ml enzyme
Dịch enzyme ñưa về ñược pha loãng 10 lần ñể xác ñịnh hoạt lực, do ñó:
HdA = 588,235 x 10 = 5882,35 ñơn vị/ml
Kết luận: Từ kết quả trên, trong suốt quá trình nghiên cứu, cứ theo ñịnh kỳ
chúng tôi kiểm tra lại hoạt lực của chế phẩm enzyme này ñể thuận lợi cho việc
khảo sát hàm lượng enzyme bổ sung khi thủy phân.
3.1.2.2. Xác ñịnh hoạt lực của chế phẩm enzyme γ – amylaza
Hoạt lực của chế phẩm enzyme γ – amylaza ñược xác ñịnh theo phương
pháp ñã trình bày ở mục 2.2.1.6 và phụ lục 3.4. Chúng tôi tiến hành thực nghiệm và

Hoạt lực của enzyme tính bằng “ñơn vị/ml” ñược xác ñịnh như sau:

nhằm hồ hóa hoàn toàn lượng bột có trong dịch bột. Để dịch hóa, chúng tôi ñiều
chỉnh pH về 5,5 – 6, ñồng thời bổ sung chế phẩm α-amylaza với tỷ lệ 0,1% so với

a × K × 3,3 × 60
m × 10
a = a2 – a1
* Ở mức pha loãng 10 lần:
HdG =

( 4,3 − 0,6) × 1 × 3,3 × 60
= 146,52
0,5 × 10

Theo quy trình ñề xuất ở mục 2.2.2.2, chúng tôi cân 30 gam bột hạt mít hòa
trong 100ml nước, khuấy ñều và ñun cách thủy ở nhiệt ñộ sôi, thời gian 45 phút

sau thực nghiệm, chúng tôi có ñược kết quả như sau:

HdG =

Hình 3.2. Vi khuẩn L.casei sau khi hoạt hóa
3.2. Nghiên cứu quá trình thủy phân tinh bột

lượng bột có trong dịch bột, hạ nhiệt ñộ xuống ñến 95oC và giữ trong bể ổn nhiệt
120 phút. Sau khi kết thúc quá trình dịch hóa, ñưa nhiệt ñộ xuống 60oC và ñiều
chỉnh pH = 4,25, bổ sung chế phẩm γ – amylaza với các tỷ lệ khác nhau: 0,12%;
(ñơn vị/ml)

Vậy, hoạt lực của chế phẩm enzyme γ – amylaza ñược tính là:
HñG = 146,52 *10 = 1465 ñơn vị/ml.
Kết luận: Cũng tương tự như chế phẩm enzyme α-amylaza, chúng tôi xác
ñịnh ñược hoạt lực của chế phẩm γ – amylaza với mục ñích thuận lợi cho suốt quá
trình nghiên cứu. Vì trong thời gian nghiên cứu, hoạt lực của chế phẩm enzyme có

0,14%; 0,16%; 0,18% và 0,20%. Giữ ở bể ổn nhiệt trong thời gian 175 -180 phút.
Sau quá trình thủy phân thì lọc lấy dịch ñường và ñịnh lượng hàm lượng ñường khử
tạo thành. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng hai loại chế phẩm enzyme αamylaza và γ – amylaza ñể thủy phân tinh bột hạt mít. Nhưng chế phẩm enzyme
α-amylaza tại thời ñiểm nghiên cứu có nguồn gốc sản xuất từ hãng Novozyme,

hoàn toàn giống với chế phẩm enzyme của tác giả Nguyễn Minh Hiền, Nguyễn


- 37 -

- 38 -

Thúy Hương (Trường ĐH Bách khoa TP.HCM) [42] mà chúng tôi tham khảo và

Tương tự như vậy, trong các lần lên men sau này, chúng tôi thực hiện xây

thừa hưởng nên chúng tôi không khảo sát tỷ lệ chế phẩm enzyme này bổ sung vào

dựng ñường chuẩn và từ ñó ñiều chỉnh nồng ñộ dịch ñường sau thủy phân ñể thích

ñể dịch hóa là bao nhiêu. Hơn nữa, chế phẩm γ – amylaza chúng tôi sử dụng do

hợp cho từng mẻ lên men khác nhau.

Genencor Bio-products Co.Ltd, China sản xuất, không cùng nguồn gốc xuất xứ của

3.2.2. Khảo sát hàm lượng chế phẩm γ – amylaza cần dùng

chế phẩm enzyme γ – amylaza như trong tài liệu [42] nên chúng tôi tiến hành khảo
sát lượng chế phẩm enzyme γ – amylaza bổ sung ñể ñường hóa tinh bột hạt mít.
Sản phẩm của quá trình thủy phân tinh bột hạt mít là dịch ñường khử. Để

Dịch ñường sau thủy phân, chúng tôi tiến hành pha loãng 100 lần và ño OD.
Dựa vào ñồ thị ñường chuẩn ở mục 3.3, kết quả ñược thể hiện ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Hàm lượng ñường khử tạo thành sau quá trình thủy phân

Lượng enzyme γ –

Lượng ñường khử tạo

Hiệu suất

amylaza bổ sung, %

thành, gam/100ml

thủy phân,%

1

0,12

10,769

49,233

2

0,14

11,667

53,339

OD ở các mức nồng ñộ dịch ñường chuẩn (ñường glucose chuẩn) khác nhau nhằm

3

0, 16

14,000

64,005

xây dựng ñược ñường chuẩn và thể hiện ở hình 3.3.

4

0,18

20,000

91,436

5

0,20

15,556

71,119

ñịnh lượng hàm lượng ñường khử tạo thành chúng tôi sử dụng phương pháp DNS

STT

như ñã trình bày ở mục 2.2.1.4 và phụ lục 3.6. Trong phương pháp này, chúng tôi
tiến hành xây dựng ñường chuẩn ñường glucose.
3.2.1. Xây dựng ñường chuẩn ñường glucose
Với nguyên tắc cơ bản ñã trình bày ở mục 2.2.1.4, chúng tôi tiến hành ño

Chú ý: cách tính hiệu suất thủy phân xem ở phụ lục 5.2
Qua bảng kết quả trên ta thấy, tại thời ñiểm khảo sát, lượng chế phẩm
enzyme γ – amylaza bổ sung càng tăng thì lượng dịch ñường tạo thành càng cao.
Khi hàm lượng enzyme là 0,18% dịch bột thì lượng ñường tạo thành là cao nhất,
ñồng thời hiệu suất thủy phân ñạt ñược cũng cao nhất (ñồ thị ở phụ lục 5.1). Nếu
tiếp tục tăng hàm lượng enzyme bổ sung, vì có sự cạnh tranh giữa enzyme và cơ
chất nên lúc này hàm lượng ñường tạo thành giảm dần. Chính vì vậy, những nghiên
Hình 3.3. Đường chuẩn glucoza
Từ ñồ thị ñường chuẩn, chúng tôi xác ñịnh hàm lượng ñường khử tạo thành
ở các mức bổ sung chế phẩm enzyme γ – amylaza khác nhau như trình bày ở trên.
Mục ñích là ñể tìm ra hàm lượng chế phẩm γ – amylaza thích hợp cho quá trình
ñường hoá sao cho sau khi kết thúc quá trình thủy phân thì lượng ñường khử tạo
thành là cao nhất.

cứu tiếp theo tôi thủy phân tinh bột bởi 0,1% chế phẩm enzyme α-amylaza và
0,18% chế phẩm enzyme γ – amylaza ñể tạo dịch ñường cho quá trình lên men lactic.
Nhận xét: Từ kết quả thực nghiệm thu ñược, chúng tôi thấy dưới sự xúc tác
của hai loại chế phẩm enzyme trên, tinh bột của hạt mít ñược thủy phân khá triệt ñể.


- 39 -

Hình 3.4. Dịch ñường sau thủy phân
Dịch sau thủy phân tiến hành lọc trên giấy lọc nhiều lần. Hàm lượng ñường
thu ñược sau thủy phân ñủ ñiều kiện cho quá trình lên men lactic.

Từ kết quả thu ñược, chúng tôi ñiều chỉnh nồng ñộ dịch ñường theo các mức

- 40 -

Hình 3.5. Dịch ñường ñã khảo sát nồng ñộ trước lúc lên men
3.3.1. Khảo sát khả năng sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactobacillus casei
Dựa vào nguyên tắc ñã trình bày ở mục 2.2.3.2. và phụ lục 3.8, chúng tôi
tiến hành thực nghiệm như sau:

khác nhau ñể lên men.

- Cho 100ml dịch ñường có nồng ñộ 5% vào bình tam giác có dung tích 250ml

3.3. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng ñến qúa trình lên men lactic

- Bổ sung thành phần môi trường lên men vào dịch ñường trên như ñã trình

Trong quá trình lên men lactic, dưới sự hoạt ñộng của vi khuẩn lactobacillus
casei, chịu sự ảnh hưởng của nhiều yếu tố như nhiệt ñộ, nồng ñộ dịch ñường, hàm
lượng vi khuẩn bổ sung, thời gian lên men…dịch ñường bị chuyển hóa và sản phẩm
tạo thành cuối cùng chủ yếu là axit lactic, ngoài ra có một số sản phẩm phụ khác
như ethanol, axit acetic, CO2, aceton.

bày ở mục 2.2.2.3.
- Hấp thanh trùng môi trường ở nhiệt ñộ 121oC trong thời gian 20 phút.
- Làm nguội môi trường và tiến hành cấy vi khuẩn lactibacillus casei trong
ñiều kiện vô trùng.
- Nuôi ở nhiệt ñộ 37oC trong 24 giờ.

Chúng tôi tiến hành thực hiện quá trình lên men với các ñiều kiện và yếu tố

- Pha loãng môi trường trên trong nước cất ñã hấp vô trùng bằng cách sử

khảo sát khác nhau. Trước khi khảo sát quá trình lên men, chúng tôi chọn phương

dụng 7 ống nghiệm, mỗi ống chứa 9ml nước cất vô khuẩn và một số ống hút 1ml ñã

pháp so màu sử dụng axit dinitrosalycilic (DNS), ñược trình bày ở mục 2.2.1.4 và

hấp tiệt khuẩn. Mức ñộ pha loãng khác nhau như sau:

mục 3.2 ñể xác ñịnh và ñiều chỉnh nồng ñộ của dịch ñường chuẩn bị lên men. Đồng
thời với quá trình trên, chúng tôi chuẩn bị trước dịch vi khuẩn ñể khảo sát ñộng thái
sinh trưởng và phát triển của loại vi khuẩn này nhằm thuận lợi cho quá trình lên
men và rút ngắn thời gian lên men.
Dịch ñường sau khi ñã ñiều chỉnh về nồng ñộ khảo sát, chúng tôi tíến hành
bổ sung thành phần dinh dưỡng như ñã trình bày ở mục 2.2.2.3. Tiếp ñến là hấp
thanh trùng môi trường và lên men.

+ Hút 1ml mẫu dịch vi khuẩn trên cho vào ống nghiệm thứ nhất chứa 9ml
nước cất, khuấy ñều. Ta có mức ñộ pha loãng lúc này là 10-1 lần
+ Tiếp tục hút 1ml ở ống nghiệm thứ nhất cho vào ống nghiệm thứ hai chứa
9ml nước cất vô khuẩn. Trộn ñều và ta ñược ñộ pha loãng là 10-2
+ Tiếp tục chúng tôi làm tương tự và có các mức ñộ pha loãng khác nhau
như sau: 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7
Ở mỗi ñộ pha loãng phải khuấy ñều và lắc kỹ. Tương ứng với mỗi ñộ pha
loãng, tiến hành gieo cấy vào hộp petri theo trình tự như sau: