Khảo sát thành phần hóa học của loài nấm cordyceps neovolkia
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (724.39 KB, 35 trang )
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA HÓA HỌC
BỘ MÔN HÓA HỌC HỮU CƠ
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA
LOÀI NẤM CORDYCEPS NEOVOLKIANA
GVHD: Th.S Lê Thị Thu Hương
Th.S Dương Thúc Huy
SVTH : Huỳnh Thị Thuận Vy
MSSV : K38.106.161
Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2016
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA HÓA HỌC
BỘ MÔN HÓA HỌC HỮU CƠ
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA
LOÀI NẤM CORDYCEPS NEOVOLKIANA
GVHD: Th.S Lê Thị Thu Hương
Th.S Dương Thúc Huy
SVTH: Huỳnh Thị Thuận Vy
MSSV: K38.106.161
Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2016
NHẬN XÉT CỦA HỘI ĐỒNG
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
LỜI CẢM ƠN
Với tất cả sự trân trọng và lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thành
nhất đến với:
• Cô Lê Thị Thu Hương và Thầy Dương Thúc Huy đã theo sát, nhiệt tình giảng
dạy, hướng dẫn, quan tâm, giúp đỡ và động viên tôi trong quá trình làm khóa
luận tốt nghiệp.
• Tất cả quý thầy cô Khoa Hóa, đặc biệt quý thầy cô Bộ môn Hóa Hữu cơ đã tận
tình truyền đạt những kiến thức quý báu trong suốt thời gian qua và hoàn thành
khóa luận.
• Các anh chị học viên cao học và các bạn sinh viên bộ môn Hóa hữu cơ, khoa
Hóa học Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh đã động viên, giúp
đỡ trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
• Và cuối cùng, con xin chân thành cảm ơn gia đình, đặc biệt là ba mẹ đã tạo
điều kiện tốt nhất trong suốt thời gian con theo học và thực hiện đề tài ở
Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh.
i
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
.i
MỤC LỤC
.ii
DANH MỤC CÁC CHỮ KÍ HIỆU VÀ VIẾT TẮT
.iii
DANH MỤC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, BẢNG BIỂU
.iv
DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC
.v
LỜI MỞ ĐẦU
.vi
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .......................................................................................... 1
1.1.KHÁI QUÁT VỀ CHI CORDYCEPS ..................................................................... 1
1.2. HOẠT TÍNH CÁC HỢP CHẤT CÓ TRONG CHI CORDYCEPS ....................... 2
1.3. NGHIÊN CỨU HÓA HỌC CỦA CHI CORDYCEPS ........................................... 2
CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM ..................................................................................... 8
2.1. HÓA CHẤT, THIẾT BỊ ......................................................................................... 8
2.1.1. Hóa chất ............................................................................................................ 8
2.1.2. Thiết bị .............................................................................................................. 8
2.2. NGUYÊN LIỆU ..................................................................................................... 8
2.3. QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM ............................................................................. 9
2.3.1. Cô lập các hợp chất trên phân đoạn A3 .......................................................... 10
2.4.2. Cô lập các hợp chất trên phân đoạn A6 .......................................................... 10
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................... 12
3.1. KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT SO1 ........................................................ 12
3.2. KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT L1........................................................... 14
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .................................................................. 17
4.1. KẾT LUẬN........................................................................................................... 17
4.2. ĐỀ XUẤT ............................................................................................................. 17
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................................ 18
PHỤ LỤC
ii
DANH MỤC CÁC CHỮ KÍ HIỆU VÀ VIẾT TẮT
AcOH
Acetic acid
Ac
Acetone
C
Chloroform
13
C-NMR Carbon Nuclear Magnetic Resonance
d
Doublet (mũi đôi)
dd
Doublet of doublet (mũi đôi đôi)
DMSO
Dimethyl sulfoxide
EA
Ethyl acetate
Et
Ethanol
J
Coupling constant (hằng số ghép spin)
g
gam
H
Hexane
1
H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance
Hz
Hertz
kg
kilogam
ppm
Part per million
Me
Methanol
mg
miligam
s
Singlet (mũi đơn)
SKC
Sắc ký cột
SKLM
Sắc ký lớp mỏng
t
Triplet (mũi ba)
UV
Ultra violet (Tia cực tím)
W
Water
δ
Chemical shift (độ dịch chuyển hóa học)
iii
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, BẢNG BIỂU
HÌNH ẢNH
Trang
Hình 1.1 Đông trùng hạ thảo ..................................................................................... 1
Hình 1.2 Polysaccharide được xác định bởi Yu và cộng sự 2009 .............................. 3
Hình 1.3 Các hợp chất cô lập được từ Cordyceps sinensis .................................. 5,6,7
Hình 3.1 Công thức cộng hưởng của SO1................................................................ 12
Hình 3.2 Công thức cấu tạo của SO1 ....................................................................... 13
Hình 3.3 Cấu trúc đường vòng năm của L1 ............................................................. 15
Hình 3.4 Công thức cấu tạo của L1 .......................................................................... 15
Hình 4.1 Hai hợp chất cô lập được từ cao ethanol của mẫu nấm Cordyceps ........... 17
SƠ ĐỒ
Sơ đồ 2.1 Quá trình ly trích và cô lập từ cao ethanol của mẫu nấm Cordyceps
sinensis ...................................................................................................................... 11
BẢNG BIỂU
Bảng 2.2 Các phân đoạn của cao methanol thô .......................................................... 9
Bảng 3.1 Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất SO1 và Uracil ............ 13
Bảng 3.2 Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất L1 và Adenosine ........ 16
iv
DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC PHỔ
Phụ lục 1: Phổ 1H-NMR của SO1 trong dung môi DMSO-d 6
Phụ lục 2: Phổ 13C-NMR của SO1 trong dung môi DMSO-d 6
Phụ lục 3: Phổ 1H-NMR của L1 trong dung môi DMSO-d 6
Phụ lục 4: Phổ 13C-NMR của L1 trong dung môi DMSO-d 6
v
LỜI MỞ ĐẦU
Từ xa xưa, con người đã biết sử dụng cây cỏ để làm thuốc chữa bệnh, từ đó tìm
ra được nhiều phương thuốc có thể chữa được một số bệnh nan y như ung thư, sốt
rét,.... Ngày nay, ngành hóa học các hợp chất tự nhiên kết hợp với ngành y dược học,
sinh học không ngừng nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các
dược thảo có trong các phương thuốc cổ truyền để ứng dụng vào việc chữa bệnh.
Thành phần hóa học của chi Cordyceps được tìm thấy gồm có cordycepin (30deoxyadenosin) và dẫn xuất, ergosterol, polysaccharide, glycoprotein và peptide có
chứa thành phần aminoisobutyric acid. Các hợp chất này có các hoạt tính sinh học như
kháng
ung
thư,
kháng
đột
biến
(anti-metastatic),
ức
chế
miễn
dịch
(immunomodulatory), kháng oxy hóa, kháng viêm, diệt sâu bọ (insecticidal), kháng
khuẩn, hạ lipit trong máu, hạ đường huyết, chống lão hóa, bảo vệ hệ thần kinh và thận.
Những nghiên cứu gần đây cho biết các polysaccharide hiện diện trong Cordyceps thể
hiện đa dạng các hoạt tính sinh học như : chống oxy hóa, miễn dịch, chống xơ vữa
động mạch, các nucleoside mang đa tác dụng trên macrophage và cordycepin có hoạt
tính ức chế sự phát triển khối u và miễn dịch. Vì thế, loài nấm này thu hút rất nhiều
nhà nghiên cứu những năm gần đây dựa trên giá trị dinh dưỡng và dược học của nó.
Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành khảo sát thành phần hóa học của
Cordyceps neovolkiana với mong muốn đóng góp vào việc nghiên cứu các hợp chất tự
nhiên, tìm ra những hợp chất có hoạt tính sinh học góp phần nâng cao giá trị của các
dược thảo Việt Nam.
vi
Huỳnh Thị Thuận Vy
Khóa luận tốt nghiệp
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1
KHÁI QUÁT VỀ CHI CORDYCEPS
Các loài nấm thuộc chi Cordyceps gồm có C. sinensis, C. militaris, C. pruinosa
và C. ophioglossoides là
nguồn nguyên liệu quý trong
dược học. Thành phần dược
liệu là loài nấm khô thuộc
chi Cordyceps phát triển
trên ấu trùng. Trong đó, phổ
biến
nhất
là
loài
nấm
Cordyceps sinensis, được
gọi với tên Đông trùng hạ
thảo (Tiếng Trung Quốc,
Dong-Chong-Xia-Cao
Tochukaso,
tiếng
Hình 1.1 Đông trùng hạ thảo
hay
Nhật).
Đông trùng hạ thảo là một dạng cộng sinh giữa một loài nấm túi có tên khoa học là
“Cordyceps sinensis” (Berk.) Sacc. với sâu non (ấu trùng) của một loài côn trùng
thuộc chi Hepialus. Thường gặp nhất là sâu non của loài Hepialus armoricanus.
Ngoài ra còn 40 loài khác thuộc chi Hepialus cũng có thể bị Cordyceps sinensis ký
sinh. Tên gọi trên bắt nguồn từ sự thay đổi theo mùa của nó. Vào mùa đông nấm bắt
đầu ký sinh vào sâu non và làm chết sâu non vì ăn hết chất dinh dưỡng của chúng nên
được gọi là đông trùng. Mùa hè vươn lên khỏi mặt đất. Đầu của ngọn nấm là một thể
đệm (stroma) hình trụ thuôn nhọn nên được gọi là hạ thảo. Chỉ phát hiện được Đông
trùng hạ thảo vào mùa hè ở một số cao nguyên cao hơn mặt biển từ 3500 đến 5000 m.
Đó là các vùng Tây Tạng, Tứ Xuyên, Thanh Hi, Cam Túc, Vân Nam... Ở Trung Quốc,
đây là vị thuốc có nguồn gốc hàng ngàn năm.[23]
Trong y học cổ truyền Trung Hoa và Tây Tạng, Đông trùng hạ thảo được xem
là có sự cân bằng tuyệt vời giữa âm và dương, bởi nó vừa là thực vật vừa là động vật,
được hình thành vào mùa đông và trưởng thành vào mùa hạ. Cho nên Đông trùng hạ
thảo được xem là một vị thuốc quý, có thể chữa được “bách hư bách tổn”.
1
Huỳnh Thị Thuận Vy
1.2
Khóa luận tốt nghiệp
HOẠT TÍNH CÁC HỢP CHẤT CÓ TRONG CHI CORDYCEPS
Thành phần hóa học của chi Cordyceps được tìm thấy gồm có cordycepin (30deoxyadenosin) và dẫn xuất, ergosterol, polysaccharide, glycoprotein và peptide có
chứa thành phần aminoisobutyric acid. Các hợp chất này có các hoạt tính sinh học như
kháng
ung
thư,
kháng
đột
biến
(anti-metastatic),
ức
chế
miễn
dịch
(immunomodulatory), kháng oxy hóa, kháng viêm, diệt sâu bọ (insecticidal), kháng
khuẩn, hạ lipit trong máu, hạ đường huyết, chống lão hóa, bảo vệ hệ thần kinh và thận.
Những nghiên cứu gần đây cho biết các polysaccharide hiện diện trong C. sinensis thể
hiện đa dạng các hoạt tính sinh học như: Chống oxy hóa, điều hòa miễn dịch, chống
xơ vữa động mạch, các nucleoside mang đa tác dụng trên macrophage và cordycepin
có hoạt tính ức chế sự phát triển khối u và điều hòa miễn dịch. Vì thế, loài nấm này
thu hút rất nhiều nhà nghiên cứu những năm gần đây dựa trên giá trị dinh dưỡng và
dược học của nó. Tuy nhiên, nguồn cung cấp tự nhiên của các loài nấm này giảm dần
bởi vì môi trường sống khắc nghiệt và sự khai thác quá mức nguồn nguyên liệu. Gần
đây, một vài loài nấm thuộc chi Cordyceps được chiết tách và nuôi cấy trong phòng
thí nghiệm.[27]
1.3
NGHIÊN CỨU HÓA HỌC CỦA CHI CORDYCEPS
Các
hợp
chất
như
cordycepin
(3’-deoxyadenosine),
3’-amino-3’-
deoxyadenosine, homocitrullyl aminoadenosine, adenine, cordycepic acid và
D-
mannitol đã được cô lập từ các loài nấm thuộc chi Cordyceps từ những năm 1950
[Cunningham và cộng sự (1950);[5] Chatterjee và cộng sự (1957);[2] Kredich và
Guarino (1961);[16] Guarino và Kredich (1963);[7] Kaczka và cộng sự (1964);[10] Liu và
cộng sự (1989).[21]].
Một nguyên cứu gần đây chứng tỏ có sự khác nhau về thành phần và hàm
lượng các hợp chất hóa học giữa nấm tự nhiên và nấm nuôi cấy. Nấm nuôi cấy chứa
hàm lượng của polysaccharide, adenine và adenosine cao hơn so với các loài nấm tự
nhiên. Li và cộng sự[18,19] cũng tìm thấy nấm C. sinensis nuôi cấy có hàm lượng
nucleoside cao hơn loài tự nhiên.
Ergosterol hiện diện trong C. sinensis được xác định bởi sắc kí lớp mỏng điều
chế [Li và Li (1991); Li và cộng sự (2004)].[20] Boros và cộng sự (1994)[1] công bố
ophiocordin (54), một hợp chất kháng nấm và kháng khuẩn được cô lập từ C.
2
Huỳnh Thị Thuận Vy
Khóa luận tốt nghiệp
ophioglossoides [Kneifel và cộng sự (1977)][15] có cấu trúc của balanol từ Verticillium
balanoides.
Bioxanthracenes (55-67) được cô lập từ C. pseudomilitaris [Isaka và cộng sự
(2001)].[8] Ngoài ra, các hợp chất cordypyridones A-D (68-71) cũng được cô lập từ
loài nấm trên bởi cùng nhóm tác giả [Isaka và cộng sự (2001)].[9]
Các hợp chất chứa vòng mười carbon cepharosporolides C, E và F (71-73),
cùng với cordycepin, pyridine-2, 6-dicarboxylic acid và 2-carboxymethyl-4-(30hydroxybutyl) furan (73-74) được cô lập từ C. militaris bởi Rukachaisirikul và cộng
sự (2004).[26] Krasnoff và cộng sự (2005)[16] công bố cicadapeptins I và II (các peptide
chứa thành phần aminoisobutyric acid) và myriocin (kháng nấm) (51-53) từ C.
heteropoda.
Một glycoprotein với thành phần N-acetylgalactosamine [Gal-β(1→3)-Gal-NAcol galactosyl-β(1→3)-N-acetyl-galactosaminitol] được cô lập từ C. ophioglossoides
[Kawaguchi và cộng sự (1986)].[11] Các polysaccharide cũng được cô lập bởi nhiều
nhóm tác giả. Bốn exopolysaccharides có khối lượng phân tử từ 50 kDa đến 2260 kDa
được cô lập từ C. militaris bởi Kim và cộng sự (2003b, c).[12-14] Yu và cộng sự (2004a,
b) cũng công bố bốn polysaccharides từ C. militaris.[31-32] Ngoài ra còn nhiều công bố
khác nghiên cứu về polysaccharide từ nấm Cordyceps như Chun và cộng sự (2003),
Methacanon và cộng sự (2005),[22] Wu, Sun, và Pan (2006),[27] Xiao và cộng sự
(2006),[29] Yu và cộng sự (2007),[33] Cheung và cộng sự (2009).[3] Các nghiên cứu chỉ
dừng ở xác định thành phần các monosaccharide và khối lượng phân tử cũng như hoạt
tính sinh học. Một nghiên cứu gần đây được thực hiện bởi Yu và cộng sự (2009)[25] sử
dụng nhiều phương pháp xác định cấu trúc của polysaccharide từ Cordyceps militaris.
-(1→3)-
→[ 4-α-D-Man-(1→4)-α-D-Man-(1→4)-α-D-Man-(1→
]n
→
β-D-Gal-(1→
[ 6)-β-D-Gal-(1 ]3 4)-α-D-Glc
Hình 1.2 Polysaccharide được xác định bởi Yu và cộng sự (2009)
3
Huỳnh Thị Thuận Vy
Khóa luận tốt nghiệp
Gần đây, Yang và cộng sự[29] đã cô lập năm cordysinin A-E (1-5) cùng với bốn
mươi sáu hợp chất đã biết khác từ nấm Cordyceps sinensis nuôi cấy: ergosterol (6),
(17R)-17-methylincisterol (7), ergosterol peroxide (8), ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3one (9), fungisterol (10), hỗn hợp của β-sitosterol (11) và stigmasterol (12), hỗn hợp
của β-sitosterol 3-O-acetate (13) và stigmasterol 3-O-acetate (14), 4,4-dimethyl-5αergosta-8,24(28)-dien-3β-ol (15), 3-O-ferulylcycloartenol (16), daidzein (17), phydroxybenzoic acid (18), vanillic acid (19), orobol (20), uracil (21), genistein (22),
D-mannitol
(23), p-methoxybenzoic acid (24), 3-hydroxy-2-methyl-4-pyrone (25),
acetovanillone (26), p-hydroxyphenylacetic acid (27), cyclo(L-Pro-L-Val) (28),
syringic
acid
(29),
cyclo(L-Phe-L-Pro)
(30),
cyclo(L-Pro-L-Tyr)
(31),
2-
furancarboxylic acid (32), p-methoxyphenol (33), glycitein (34), salicylic acid (35),
methyl p-hydroxyphenylacetate (36), thymine (37), nicotinic acid (38), ergosteryl-3O-β-D-glucopyranoside (39), flazin (40), 3′,4′,7-trihydroxyisoflavone (41), succinic
acid (42), perlolyrine (43), 1-methylpyrimidine-2,4-dione (44), protocatechuic acid
(45), 3,4-dihydroxyacetophenone (46), 4-hydroxyacetophenone (47), 2-deoxy-Dribono-1,4-lactone (48), 1-acetyl-β-carboline (49), và adenosine (50).
4
Huỳnh Thị Thuận Vy
Khóa luận tốt nghiệp
H 2N
O
H
N
NH
N
O
HO
N
H
H
O
N
N
H
H
H
HO
Cordisinin A (1)
N
N
N
N
HO
HO H
OCH3
N
H
CH3
Cordisinin C (3)
Cordisinin B (2)
N
H
OH
CH3
H OH
OH
Cordisinin D (4)
Cordisinin E (5)
H
O
H
O
H
H
H
O
HO
H
O
O
HO
(17R)-17-methyl incisterol (7)
Ergosterol peroxide (8)
Ergosterol (6)
H
H
H
H
H
HO
H
ß-sitosterol (11)
HO
H
Fungisterol (10)
O
Ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one (9)
H
H
H
O
O
H
H
HO
O
O
Stigmasterol 3-O-acetate (14)
ß-sitosterol 3-O-acetate (13)
Stigmasterol (12)
H
H
H
H
CH2
H
O
H
O
O
O
H
HO
O
4,4-dimethyl-5a-ergosta-8,24(28)-dien-3ß-ol (15)
HO
O
3-O-ferulylcycloartenol (16)
O
O
OH
O
HO
O
OH
OH
O
OH
Daidzein (17)
H
N
HO
OH
p-hydroxybenzoic acid (18)
HO
O
HO
Vanillic acid (19)
OH
OH
O
Uracil (21)
OH
O
Genistein (22)
OH
OH
OH
OH
OH
O
O
O
HO
HN
O
Orobol (20)
OH
O
O
OH
D-mannitol(23)
p-methoxybenzoic acid (24) 3-hydroxy-2-methyl-4-pyrone (25)
Hình 1.3 Các hợp chất cô lập từ loài nấm thuộc chi Cordyceps
5
Huỳnh Thị Thuận Vy
Khóa luận tốt nghiệp
O
CH3
O
O
O
H 3C
HO
HO
O
Cyclo-(L-Pro-L-Val) (28)
O
HO
H3CO
OH
N
H
O
O
O
HO
p-methoxyphenol (33)
2-furancarboxylic acid (32)
Cyclo(L-Pro-L-Tyr) (31)
O
Cyclo(L-Phe-L-Pro) (30)
Syringic acid (29)
OH
O
N
O
O
H
p-hydroxyphenylacetic acid (27)
N
HN
HO
HN
OH
Acetovanillone (26)
OH
N
O
HO
O
O
O
Glycitein (34)
O
HO
H
O
OH
OH
HO
O
OH
H
Methyl p-hydroxyphenylacetate (36)
Salicylic acid (35)
OH
O
O
OH
HN
O
N
H
H
N
O
O
OH
N
Thymine (37)
Flazin (39)
N
O
O
O
N
CH3
Perlolyrine (43) OH
O
OH
NH2
O
O
O
H
N
N
H
O
O
H
N
N
H
O
Aib-1
Hyp-1
CH3
N
N
N
N
O
HO
OH
adenosine (50)
HO
R2
adenosine (50)
H
N
N
H
Aib-2
NH2
O
1-Acetyl-beta-carboline (49)
Leu/Ile R
1
Gln
Protocatechuic acid (45)
N
2-deoxy-D-ribono1,4-lactone (48)
OH
4-hydroxyacetophenone (47)
O
Val
H
N
OH
O
N
OH
O
1-methylpyrimidine-2,4-dione
(44)
O
Hyp-2
N
H
HO
Succinic acid (42)
3,4dihydroxyacet
ophenone (46)
O
N
HO
O
CH3
OH
OH
H
N
OH
OH
O
3',4',7-trihydroxyisoflavone (41)
O
HO
OH
Nicotinic acid (40)
OH
HO
HO
O
O
O
Ergosterol 3-O-ß-D-glucoside (38)
H
HO
OH
O
OH
O
NH2
(51) R1 = CH3, R2 = H
(52) R1 = H, R2 = CH3
N
HO
O
CO2H OH
O
Cicadapeptin I (51) and cicadapeptin II (52)
HOH2C
HN
NH
O
NH2 OH
HOOC
OH
O
(53) Myriocin
O
HO
Ophiocordi (54)
Hình 1.4 Các hợp chất cô lập từ loài nấm thuộc chi Cordyceps
6
Huỳnh Thị Thuận Vy
H3CO
8
8a
7
6
H3CO
OH
9 9a
10a 10 4a
5
Khóa luận tốt nghiệp
H3CO
H3CO
OH
3
4 3
H3CO
CH3
11
R1
5
5'
10'
4' 3'
1' O
10
5
OH
5'
H3CO
CH3
H3CO
CH3
OH
R2
R2
H3CO
1 O
4 3
1 O
1 O
4
OH
4'
3'
1' O
OCH3 OH
OCH3 OH
(63)
2
(61) R = OH
2
(62) R = H
1
2
(55) R = OH, R = OH
1
2
(56) R = OAc, R = OH
1
2
(57) R = OAc, R = OAc
1
2
(58) R = OH, R = H
1
2
=
(59) R OAc, R = H4
1=
2=H
R
R
H,
(60)
H3CO
H3CO
OH
OH
O
O
H3CO
H3CO
CH3
CH3
R1
(66) R1 = OH
(67) R1 = H
OH
H3CO
R1
CH3
O
OCH3 OH
(64) R1 = OH
(65) R1 = H
OH
17 O
2
H
11 12
10
7
8
N
1
3
9
15
H
2
O
N
1
H
N
OH
13
OH
9
7
8
3
2
13 O
OH
15
14
(69)
OCH3
N
OCH3
H
H
(72)
13 O
N
13 14
O
8
13 O
OH
H
1
(74) R = H
1
(75) R = CH3
14 R2
R2 =
HgX
(76)
2 = OH
R
(77)
2
(78) R = p-bromobezoyloxy
14
OH
(80)
(79)
Hình 1.5 Các hợp chất cô lập từ loài nấm thuộc chi Cordyceps
7
N
H
H
O
OH
OH
O
N
H
OR1
(73)
OCH3
O
N
1 OCH3
14
14
(70) X = OH
(71) X = H
N
O
6
4
H
H
4
13 O
5
O
X
5
(68)
O
O
N
O
H
4
OCH3
OH
6
CH3
4'
3'
1' O
OCH3 OH
OH
10'
5'
H3CO
CH3
CH3
(81)
Huỳnh Thị Thuận Vy
Khóa luận tốt nghiệp
CHƯƠNG 2: THỰC NGHIÊM
2.1
-
HOÁ CHẤT VÀ THIẾT BỊ
2.1.1
Hóa chất
Dung môi dùng trong sắc ký cột và sắc ký điều chế, sắc ký lớp mỏng gồm: hexane,
ether dầu hỏa, ethyl acetate, acetic acid, chloroform, acetone, methanol đều là hóa
chất của hãng Chemsol-Việt Nam và được làm khan bằng Na 2 SO 4 nếu sử dụng lại
và nước cất.
-
Thuốc thử: để hiện hình các vết hữu cơ bằng sắc ký lớp mỏng, phun xịt bằng dung
dịch sulfuric acid 30%, vanillin/H 2 SO 4 .
-
Sắc ký cột thường dùng silica gel sắc ký cột 70- 30, cỡ hạt: 0.04-0.06 mm, Ấn Độ.
-
Sắc ký lớp mỏng 25DC-Alufolien 20 x 20 cm Kiesel gel F 254 Merck.
2.1.2
Thiết bị
-
Các thiết bị dùng để trích ly (lọ thủy tinh, becher, bình lóng).
-
Đèn UV: bước sóng 254nm – 365nm.
-
Cân điện tử.
-
Máy cô quay chân không Buchi-111 kèm bếp cách thủy Buchi 461 Water Bath.
-
Các cột sắc ký: cột cổ điển.
-
Các thiết bị ghi phổ: Phổ 1H-NMR,
C-NMR: Ghi trên máy cộng hưởng từ hạt
13
nhân Bruker ở tần số 500 MHz cho phổ 1H-NMR và 125 MHz cho phổ 13C-NMR.
Tất cả phổ được ghi tại phòng Phân Tích Trung Tâm trường Đại học Khoa Học Tự
Nhiên thành phố Hồ Chí Minh, số 227, Nguyễn Văn Cừ, Quận 5, Thành phố Hồ
Chí Minh.
2.2
NGUYÊN LIỆU
Mẫu nấm Cordyceps neovolkiana được cung cấp từ TS. Đinh Minh Hiệp – Ban
quản lý khu Nông nghiệp công nghệ cao Thành phố Hồ Chí Minh.
8
Huỳnh Thị Thuận Vy
2.3
Khóa luận tốt nghiệp
QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM
Từ sinh khối nấm tươi 3.5 kg được làm sạch, để khô, nghiền nhỏ thu được bột
khô. Sau đó, bột khô được ngâm dầm trong ethanol ở nhiệt độ phòng. Lấy dịch cô
quay thu hồi dung môi dưới áp suất thấp thu được 200.0 g cao ethanol thô.
Cao ethanol thô sẽ được hòa tan nhiều lần trong methanol nóng, trong quá trình
hòa tan thấy xuất hiện kết tủa, lọc riêng phân tủa (70.0 g). Phần dịch đem cô quay thu
hồi dung môi, thu được cao methanol thô (130.0 g). Sau đó, tiến hành sắc ký cột cao
methanol thô với hệ dung môi với độ phân cực tăng dần thu được tám phân đoạn
tương ứng như bảng 2.1:
Bảng 2.1 Các phân đoạn của cao methanol thô
2.3.1
Hệ dung môi
Cao (g)
H:EA 9:1
A1 (1.56)
H:EA 8:2
A2 (5.0)
H:EA 7:3
A3 (3.1)
H:EA 5:5
A4 (10.0)
H:EA 7:3
A5 (3.0)
H:EA 9:1
A6 (10.0)
EA:Me 5:5
A7 (30.0)
Me 100%
M (56.0)
Cô lập các hợp chất trên phân đoạn A3
Thực hiện sắc kí cột cao A3 (3.1 g) bằng hệ dung môi H:EA:AcOH
(4.0:1.0:0.2) thu được sáu phân đoạn kí hiệu từ A3.1 đến phân đoạn A3.6. Tiếp tục
sắc kí lớp mỏng điều chế trên phân đoạn A3.5 (210.0 mg) với hệ dung môi
H:EA:Ac:AcOH (7.5:2.5:1.0:0.1) thu được hợp chất SO1 (5.0 mg).
9
Huỳnh Thị Thuận Vy
2.3.2
Khóa luận tốt nghiệp
Cô lập các hợp chất trên phân đoạn A6
Cao A6 (10.0 g) được tiến hành sắc kí cột với hệ dung môi
H:EA:Ac:AcOH:Me (6.0:3.0:0.4:0.2:0.1) thu được bốn phân đoạn kí hiệu từ A6.1 đến
phân đoạn A6.4.
Phân đoạn A6.4 (20.0 mg) tiếp tục được sắc kí cột với hệ dung môi Q:AcOH
với tỷ lệ thể tích v/v 5.0:0.1 với hệ Q là C:Me:W (82.0:11.8:0.2) thu được hợp chất L1
(7.0 mg).
10
Huỳnh Thị Thuận Vy
Khóa luận tốt nghiệp
Sinh khối nấm
3.5 kg
-
Ngâm dầm trong ethanol
Cô quay thu hồi dung môi
Cao ethanol thô
200.0 g
- Hòa tan trong methanol
- Cô quay thu hồi dung môi
Cao methanol thô
130.0 g
Tủa methanol thô
70.0 g
- SKC (sắc ký cột)
H:EA
EA:Me
[9:1 – 0:10]
[5:5]
A1
1.56 g
A2
5.0 g
A3
3.1 g
A4
10.0 g
Me
100%
A5
3.0 g
A6
10.0 g
SKC H:EA:AcOH
4.0:1.0:0.2
A3.1
150.0
mg
A3.2
70.0
mg
A3.3
256.0
mg
A3.4
360.0
mg
A3.5
210.0
mg
A3.6
300.0
mg
M
56.0 g
SKC H:EA:Ac:AcOH:Me
6.0:3.0:0.4:0.2:0.1
A6.1
1.87
g
SKC H:EA:Ac:AcOH
7.5:2.5:1.0:0.1
SO1
5 mg
A7
30.0 g
A6.2
2.16
g
A6.3
2.30
g
A6.4
3.15
g
SKC Q:AcOH
5.0:0.1
L1
7 mg
Với hệ Q là C:Me:W 82.0:11.8:0.2
Sơ đồ 2.1 Quá trình ly trích và cô lập từ cao ethanol của mẫu nấm Cordyceps sinensis
11
Huỳnh Thị Thuận Vy
Khóa luận tốt nghiệp
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1
KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT SO1
Hợp chất SO1 thu được từ phân đoạn A3.5 của cao ethanol với các đặc điểm
như sau:
Trạng thái: Chất lỏng không màu.
Bắt UV, vết không màu khi hiện hình bằng vanillin/H 2 SO 4 .
Phổ 1H-NMR (DMSO-d 6 ): Phụ lục 1.
Phổ 13C-NMR (DMSO-d 6 ): Phụ lục 2.
Biện luận cấu trúc SO1
Phổ 1H-NMR cho thấy sự hiện diện của bốn tín hiệu δ H 10.93 (1H, s), δ H 10.78
(1H, s), δ H 7.36 (2H, dd, J 1 = 9.0 Hz, J 2 = 6.0 Hz), δ H 5.43 (2H, d, J = 7.5 Hz). Hai tín
hiệu proton nhân thơm cộng hưởng δ H 7.36, δ H 5.43 ghép cặp với nhau. Proton H-6
(δ H 7.36) chuyển dịch về vùng từ trường thấp nên chịu ảnh hưởng của một nhóm thế
âm điện hay liên kết trực tiếp với nitrogen.
Mặc khác, trên phổ 13C-NMR cho thấy xuất hiện bốn tín hiệu carbon sp2, trong
đó có hai tín hiệu của carbon tứ cấp là C-2 (δ C 152.0), C-4 (δ C 164.8) và hai tín hiệu
carbon methine là C-5 (δ C 100.7), C-6 (δ C 142.7). Tín hiệu C-6 (δ C 142.7) dịch về
vùng từ trường thấp giúp xác định vị trí của nó trong cấu trúc của SO1.
Từ những dữ liệu phổ trên và so sánh với dữ liệu liệu phổ của Uracil.[6] Hợp
chất SO1 dự đoán là Uracil và có hai công thức cộng hưởng như sau:
O
H
O
N3 4 5
2 6
1
N
OH
4
H
N3
2
H
HO
H
5
1
N 6 H
H
(B)
(A)
Hình 3.1 Hai công thức cộng hưởng của SO1
12
Huỳnh Thị Thuận Vy
Khóa luận tốt nghiệp
Theo Hurd R. E., Reid B. R.,[24] hai proton cộng hưởng: NH-1A (δ H 10.78),
NH-3A (δ H 10.93) sẽ ứng với hai proton của nhóm –NH trong cấu trúc A.
Mặc khác, phân tích sự chẻ mũi của H-5 và H-6, chứng tỏ hợp chất SO1 tồn tại
ở hai cấu trúc A và B với tỷ lệ 1:1.
Dựa vào sự phân tích các dữ kiện phổ trên, so sánh các dữ kiện phổ của hợp
chất SO1 với các dữ kiện phổ của hợp chất Uracil đã được công bố thấy có sự tương
đồng, do đó SO1 đề nghị có công thức như sau:
O
H
OH
H
H
N
N
N
O
H
HO
N
H
H
B
A
Hình 3.2 Công thức cấu tạo của SO1
Bảng 3.1 Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất SO1 và Uracil
Vị trí
1
δ H (ppm)
δ C (ppm)
10.78
2
3
Uracil (DMSO-d 6 )[6]
SO1 (DMSO-d 6 )
δ H (ppm)
10.82
152.0
10.93
4
δ C (ppm)
152.3
10.02
164.8
165.1
5
5.43 (d, 7.5)
100.7
5.47
101.0
6
7.36 (dd, 9.0, 6.0)
142.7
7.41
142.9
13
Huỳnh Thị Thuận Vy
3.2
Khóa luận tốt nghiệp
KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT L1
Hợp chất L1 thu được từ phân đoạn A6.3 của cao ethanol với các đặc điểm như
sau:
Trạng thái: Chất lỏng không màu.
Bắt UV, hiện hình màu vàng nâu.
Phổ 1H-NMR (DMSO): Phụ lục 3.
Phổ 13C-NMR (DMSO): Phụ lục 4.
Biện luận cấu trúc:
Trên phổ 1H-NMR cho thấy sự hiện diện của hai proton thơm mũi đơn tại δ H
8.33 (1H, s) H-2, δ H 8.11 (1H, s) H-8. Hai proton của nhóm –NH 2 tại δ H 7.32 (2H, s).
Dựa vào độ dịch chuyển hóa học của các nhóm methine H-2, H-8 chứng tỏ chúng phải
liên kết trực tiếp với dị tố nitrogen. Phổ 1H-NMR còn cho thấy các tín hiệu ở vùng từ
trường từ δ H 3.53 đến 5.85 tương ứng với một phân tử đường.
Mặc khác, trên phổ 13C-NMR có năm tín hiệu của carbon sp2, trong đó có ba
tín hiệu carbon tứ cấp là δ C 156.6, δ C 149.6, δ C 119.8, và hai tín hiệu carbon methine
δ C 152.8, δ C 140.4. Ngoài ra, phổ 13C-NMR còn cho thấy các carbon sp3 liên kết với dị
tố oxygen hoặc nitrogen tại δ C 88.4, δ C 86.4, δ C 74.0, δ C 70.3, δ C 63.3 tương ứng với
một phân tử đường năm carbon.
Ngoài ra, trên phổ 1H-NMR còn có bảy tín hiệu H-1' δ H 5.85 (1H, d, J = 6.5
Hz), H-2' δ H 4.56 (1H, t, J = 5.5 Hz), H-3' δ H 4.13 (1H, dd, J 1 = 5.0 Hz, J 2 = 3.5 Hz),
H-4' δ H 3.93 (1H, q, J = 3.5 Hz), H-5 a ' δ H 3.64 (1H, dd, J 1 = 12.0 Hz, J 2 = 3.5 Hz), H5 b ' δ H 3.53 (1H, dd, J 1 = 14.0 Hz, J 2 = 3.5 Hz). Vì H-2' và H-3' ghép cặp với nhau với
hằng số ghép J = 5.0 Hz, theo Ernö Pretsch, Philippe Bühlmann, và Martin
Badertscher[6] nên H-2' và H-3' sẽ ghép cis với nhau.
14
Huỳnh Thị Thuận Vy
Khóa luận tốt nghiệp
H
HO
H
5'
H
H
O
H
4'
1'
2'
3'
H
OH
HO
Hình 3.3 Cấu trúc đường vòng năm của L1
Dựa vào sự phân tích các dữ kiện phổ trên và so sánh các dữ kiện phổ của chất
L1 với adenosine đã được công bố thấy có sự tương đồng, do đó hợp chất L1 đề nghị
có công thức như sau:
NH2
6
5
N1
2 3 4
N
7
N
9
N
8
1'
HO
2'
HO
O
3' 4'
OH
5'
Hình 3.4 Công thức cấu tạo của L1
15
Huỳnh Thị Thuận Vy
Khóa luận tốt nghiệp
Bảng 3.2. Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất L1 và adenosine
Vị trí
Adenosine (DMSO-d 6 )[6]
L1 (DMSO-d 6 )
δ H (ppm)
δ C (ppm)
δ H (ppm)
δ C (ppm)
8.33
152.8
8.38
153.2
1
2
3
4
149.6
149.8
5
119.8
120.1
6
156.6
156.9
7
8
8.11
140.4
8.17
140.7
1'
5.85 (d, 6.5)
88.4
5.91
88.8
2'
4.56 (t, 5.5)
74.0
4.64
74.3
3'
4.13 (dd, 5.0, 3.5)
71.1
4.17
71.4
4'
3.93 (q, 3.5)
86.4
3.99
86.6
9
5'
3.64 (dd, 12.0, 3.5)
3.53 (dd, 14.0, 3.5)
62.3
3.70
3.58
2'-OH
5.51
3'-OH
5.24
4'-OH
5.48
-OH
5.43 (br)
6-NH
7.31
7.41
16
62.4
