NGHIÊN CỨU TẠO VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU PHỤC VỤ CHỌN TẠO GIỐNG BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY BAO PHẤN Ở CÂY LÚA

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

-----------------------------------------------------

-------------------------------------------------

ĐÀO XUÂN THANH
ĐÀO XUÂN THANH

NGHIÊN CỨU TẠO VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU
PHỤC VỤ CHỌN TẠO GIỐNG BẰNG KỸ THUẬT
NUÔI CẤY BAO PHẤN Ở CÂY LÚA

NGHIÊN CỨU TẠO VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU
PHỤC VỤ CHỌN TẠO GIỐNG BẰNG KỸ THUẬT
NUÔI CẤY BAO PHẤN Ở CÂY LÚA
CHUYÊN NGÀNH: TRỒNG TRỌT
MÃ SỐ: 60.62.01

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP
LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:
PGS.TS.TRẦN NGỌC NGOẠN
PGS.TS.NGÔ XUÂN BÌNH

THÁI NGUYÊN, NĂM 2009

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

THÁI NGUYÊN, NĂM 2009



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Lêi c¶m ¬n

MỞ ĐẦU

Để hoàn thành khóa học và thực hiện đề tài, ngoài sự nỗ lực của bản
thân, tôi còn nhận đƣợc sự giúp đỡ, chỉ dẫn của các thầy cô giáo Khoa Nông
học, tập thể cán bộ công nhân Trung tâm Thực hành Thực nghiệm - Trƣờng
Đại học Nông lâm Thái Nguyên, bạn bè cùng gia đình.
Nhân dịp này tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn tới tập thể thầy, cô giáo
và cán bộ nhân viên:
Bộ môn công nghệ sinh học - Khoa Nông học - Trƣờng Đại học Nông
lâm Thái Nguyên
Bộ môn Giống cây trồng - Khoa Nông học - Trƣờng Đại học Nông lâm
Thái Nguyên
Đặc biệt cho phép tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới:
PGS.TS.Trần Ngọc Ngoạn – Phó Hiệu Trƣởng - Trƣờng Đại học Nông
lâm Thái Nguyên
PGS.TS. Ngô Xuân Bình - Phó trƣởng khoa Nông học - Trƣờng Đại học
Nông lâm Thái Nguyên

ThS. Phạm Văn Ngọc - Bộ môn cây trồng - Khoa Nông học - Trƣờng
Đại học Nông lâm Thái Nguyên.
Đã tận tình hƣớng dẫn và giúp đỡ tôi trong thời gian vừa qua
Xin kính chúc thầy cô, các anh chị cán bộ cùng bạn bè và gia đình luôn
mạnh khỏe, hạnh phúc và công tác tốt.

1. Đặt vấn đề
Cây lúa (Oryza sativa L) là cây lƣơng thực giữ vai trò quan trọng hàng
đầu. Mỗi năm, khoảng 1/2 dân số thế giới sử dụng lúa gạo làm lƣơng thực
chính. Lúa đƣợc trồng phổ biến ở các nƣớc Châu á, Châu Phi, Châu Mĩ La
Tinh. Đối với các nƣớc Châu nhƣ: Ấn Độ, Trung Quốc, Inđônêxia, Băngladesh,
Miến Điện, Thái Lan và Việt Nam thì lúa gạo là cây lƣơng thực đặc biệt quan
trọng trong đời sống con ngƣời.
Trong những năm gần đây, cùng với đà tăng dân số, sự phát triển mạnh
mẽ của nền công nghiệp và đô thị hoá nông thôn làm cho diện tích đất trồng
trọt ngày càng thu hẹp lại. Nếu mở rộng diện tích sẽ gặp rất nhiều khó khăn
và tốn kém. Để đáp ứng đủ nhu cầu lúa gạo của ngƣời tiêu dùng và an ninh
lƣơng thực quốc gia, các nhà tạo giống phải tìm cách làm tăng năng suất, sản
lƣợng lúa trên diện tích đất trồng không thể mở rộng. Phƣơng án sử dụng các
biện pháp kỹ thuật thâm canh trên những giống lúa cao sản, chịu thâm canh là
thích hợp nhất.
Bằng các phƣơng pháp lai hữu tính, phƣơng pháp chuyển gen bất dục
đực mẫn cảm nhiệt độ vào các giống lúa thuần, phƣơng pháp xử lý đột biến
v.v…các nhà tạo giống đã có nhiều thành công với những giống mới có năng

Thái Nguyên, ngày 16 tháng 10 năm 2009
Học viên

suất và sản lƣợng cao. Song việc sử dụng các phƣơng pháp tạo giống nhƣ đã
nói ở trên tuy có tạo ra những tổ hợp lai năng suất cao nhƣng độ thuần chƣa

ổn định. Mặt khác, nếu áp dụng phƣơng pháp chuyển gen bất dục đực mẫn
cảm nhiệt độ vào các giống lúa thuần rồi chọn thuần nhƣ các giống lúa thuần

Đào Xuân Thanh

thì phải mất khoảng 10 vụ bởi vì giống bất dục đực mẫn cảm với nhiệt độ chỉ
kết hạt trong điều kiện nhiệt độ < 240C. Nhƣ vậy, thời gian từ tạo đƣợc giống
đến khi phổ biến sản xuất thực tiễn đại trà phải mất 10 năm. Trong những
năm gần đây, việc ứng dụng biện pháp nuôi cấy bao phấn tạo các dòng nhị

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

3



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

1




bội, nhanh chóng tạo các giống lúa thuần có năng suất cao, chống chịu tốt,
đã thu đƣợc nhiều kết quả. Đó là phƣơng pháp tạo dòng thuần nhanh và hiệu
quả nhất.

- Xác định đƣợc nồng độ các chất 2,4 D; NAA thích hợp nhất cho quá
trình tạo mô sẹo của mẫu cấy.
- Xác định đƣợc nồng độ các chất Kinetin và BAP thích hợp nhất cho

Tuy nhiên, mỗi dòng lúa với những tính trạng di truyền khác nhau, sẽ
có hàm lƣợng Auxin trong cây khác nhau do đó sẽ có những phản ứng khác
nhau với điều kiện nuôi cấy. Để thành công trong việc tạo các dòng thuần
bằng kỹ thuật nuôi cấy đó thì phải xác định đƣợc những yêu cầu về vật liệu
cấy, môi trƣờng dinh dƣỡng, các tác nhân vật lý, hoá học…của các dòng lúa
và đánh giá đƣợc khả năng thích ứng của chúng trên đồng ruộng.
Xuất phát từ những vấn đề trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên

tái sinh chồi từ mô sẹo.
- Xác định đƣợc nồng độ chất NAA thích hợp nhất cho quá trình ra rễ từ
chồi xanh.
- Xác định ảnh hƣởng của các loại môi trƣờng thuần dƣỡng đến quá
trình sinh trƣởng của cây lúa.
- Đánh giá sơ bộ năng suất, các yếu tố cấu thành năng suất và một số
đặc điểm sinh trƣởng phát triển, khả năng kháng bệnh của 20 dòng lúa đƣợc

cứu tạo vật liệu khởi đầu phục vụ chọn tạo giống bằng kỹ thuật nuôi cấy

tạo ra bằng phƣơng pháp nuôi cấy bao phấn.

bao phấn ở cây lúa”

4. Ý nghĩa của đề tài
* Ý nghĩa trong nghiên cứu khoa học:

2. Mục đích của đề tài
- Xác định đƣợc mức ảnh hƣởng của các nhân tố: vật lý, môi trƣờng

- Kết quả nghiên cứu sẽ góp phần bổ sung quy trình kỹ thuật tạo cây lúa

nuôi cấy, nồng độ hormon kích thích sinh trƣởng đến khả năng tạo mô sẹo, tái

thuần đồng hợp tử bằng phƣơng pháp nuôi cấy bao phấn. Từ đó làm cơ sở cho

sinh chồi và ra rễ trong quá trình tạo cây lúa hoàn chỉnh bằng phƣơng pháp

việc chọn các dòng tế bào nhƣ:

nuôi cấy bao phấn.

+ Chọn dòng kháng sâu bệnh.

- Tạo đƣợc dòng thuần trong quá trình nuôi cấy

+ Chọn dòng chịu thâm canh…

- Bƣớc đầu đánh giá đƣợc dòng có triển vọng cho năng suất cao, thích

- Lựa chọn sơ bộ đƣợc một số dòng thuần, làm vật liệu khởi đầu cho

nghi với điều kiện sinh thái đồng ruộng ở Thái Nguyên, có khả năng làm vật
liệu khởi đầu trong công tác tạo giống lúa ƣu thế lai.

công tác tạo giống ƣu thế lai.
- Kết quả nghiên cứu sẽ góp phần định hƣớng, làm tăng tính khả thi cho
những đề tài nghiên cứu về bao phấn lúa tiếp theo.

3. Yêu cầu của đề tài
- Xác định đƣợc thời gian xử lý lạnh thích hợp nhất đối với nuôi cấy

bao phấn lúa

* Ý nghĩa trong thực tiễn sản xuất:
Rút ngắn thời gian tạo giống, do đó giảm giá thành sản xuất giống lúa

- Xác định đƣợc nồng độ chất khử trùng hypocloratnatri thích hợp nhất

mới đồng thời nhanh chóng đƣa đƣợc nhiều giống lúa mới vào sản xuất.

cho xử lý mẫu cấy.
- Xác định đƣợc ảnh hƣởng của môi trƣờng MS và môi trƣờng N6 đến
khả năng tạo mô sẹo

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

2



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

3




Năm 1935 Went và Thisnamn đã khám phá ra auxin IAA có khả năng

CHƢƠNG I

kích thích sự hình thành mô sẹo.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Năm 1941, hai nhà khoa học ngƣời Mỹ Overbeek và Steward với thí
1.1. Tình hình nghiên cứu mô tế bào thực vật

nghiệm nuôi cấy họ cà Datura, đã chỉ ra rằng auxin kích thích sinh trƣởng có

1.1.1. Lịch sử phát triển

trong nƣớc dừa. Cũng trong thời gian này hai ông đã phát hiện ra tác dụng

Nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã đƣợc các nhà khoa học tiến hành vào
cuối thế kỷ XIX.

chất kích thích sinh trƣởng nhân tạo thuộc nhóm auxin, đã đƣợc nghiên cứu
và tổng hợp thành công nhƣ NAA, 2,4 D có ảnh hƣởng tích cực trong việc tạo

Quá trình phát triển đó có thể tạm chia thành 4 giai đoạn. [12]
1.1.1.1. Giai đoạn khởi xƣớng (1898-1930)

mô sẹo và gây phân chia tế bào. Nhiều nhà khoa học đã bổ sung các Auxin và
các Vitamin vào môi trƣờng nuôi cấy và đã khẳng định vai trò của chúng

Phƣơng pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã đƣợc nhà Bác học
ngƣời Đức Grottied Haberlandt đề xƣớng năm 1898. Ông đã tìm cách nuôi
cấy các tế bào thực vật phân lập nhƣng không thành công. Các công trình về
nuôi cấy mô tế bào của các nhà khoa học khác nhƣ Winker (1902), Thielman
(1924), Kuster (1929), cũng không đạt đƣợc mục tiêu nghiên cứu.

Năm 1929 Schmacker đã bƣớc đầu thành công trong lĩnh vực này. Sau
đó có Schitterer (1931), Pfeiffer (1931), Lanrue (1933) cũng đã có những
thành công bƣớc đầu trong nuôi cấy đầu rễ phân lập trong môi trƣờng nhân
tạo. Điều đó giúp cho các nhà khoa học tiếp tục nghiên cứu trên nhiều đối
tƣợng khác nhau.

trong môi trƣờng nuôi cấy mô.
Năm 1955 Miller và Skoog trong khi nuôi cấy mô lõi cây thuốc lá đã
xác định đƣợc vai trò của Kinetin tới việc kích thích sự phát triển của mô.
Những phát hiện mới mẻ về vai trò của các chất kích thích sinh trƣởng 2,4D,
IAA, NAA, kinetin, các vitamin trong giai đoạn này là bƣớc tiến quan trọng
trong lịch sử của phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật.
1.1.1.3. Giai đoạn phát sinh hình thái (1950 - 1960)
Năm 1956 Miller và Skoog đã thành công trong thí nghiệm tạo chồi từ
mô thuốc lá nuôi cấy. Chính Skoog đã phát hiện ra vai trò của kinetin trong sự
phân hoá các cơ quan của cây thuốc lá.

1.1.1.2. Giai đoạn nghiên cứu sinh lý (1930 -1950)

Những năm 1958-1959 Reinert (Đức) và Steward (Mỹ) đã nuôi cấy tế

Giai đoạn này đƣợc bắt đầu bằng công trình nuôi cấy đầu rễ cây cà
chua trong môi trƣờng nhân tạo, đƣợc thực hiện bởi nhà bác học White
(1934). Bằng thí nghiệm này ông là ngƣời đầu tiên đã chứng minh đƣợc rằng
mô phân sinh có thể duy trì thời gian sinh trƣởng hơn nữa nếu chúng tiếp tục
đƣợc nuôi cấy bằng môi trƣờng dinh dƣỡng mới. Cũng trong thời gian này,

bào cây cà rôt và thu đƣợc phôi soma từ mô của chúng.
Năm 1956 Nickell đã nuôi cấy thành công tế bào đơn Phaseolus vulgais
trong dung dịch lỏng.

Năm 1960, bằng kỹ thuật gieo tế bào, Bergman đã tái sinh thành công
tế bào đơn của cây thuốc lá.

Gautherets đã thành công trong nuôi cấy mô tƣợng tầng và tìm đƣợc môi
trƣờng dinh dƣỡng thích hợp cho nhiều loại cây.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

4



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

5




Các giống lúa có nguồn gốc họ phụ Indica là những giống lúa khó tính

1.1.1.4. Giai đoạn nghiên cứu di truyền (1960 đến nay)
Các thành tựu của giai đoạn này đã chính thức ứng dụng kỹ thuật nuôi
cấy mô và tế bào thực vật invitro vào công tác giống và nghiên cứu di truyền.

trong việc nuôi cấy bao phấn. Để tiến tới thành công, các nhà khoa học đã và
đang tìm cách xác định sự ảnh hƣởng của các yếu tố có tác động trực tiếp

Năm 1960 Cooking (Anh) đã dùng men Cellulose để phân hủy vỏ

hoặc gián tiếp đến quá trình nuôi cấy. Các yếu tố đó là: Kiểu gen của cây cho

cellulose của tế bào thực vật và thu đƣợc các tế bào không có vỏ, còn gọi là

phấn, giai đoạn phát triển của cây trong thời điểm lấy mẫu, thành phần môi

các tế bào trần (protoplast).

trƣờng nuôi cấy, các yếu tố vật lý nhƣ nhiệt độ, ánh sáng...

Nitsch (1967), Nakata và Tanaka (1968) là những ngƣời thành công
đầu tiên trong việc tạo cây thuốc lá đơn bội bằng kỹ thuật nuôi cấy bao phấn.

* Ảnh hưởng của kiểu gen cây cho bao phấn:
Sự thay đổi của tần số tạo mô sẹo và khả năng tái sinh của mô sẹo ở

Takabe (1971) tái sinh đƣợc cây thuốc lá hoàn chỉnh từ protoplast.

phấn hoa phụ thuộc phần lớn vào kiểu gen của cây. Kết quả quan sát của

Melchers(1977) dung hợp protoplast thành công giữa khoai tây và cà

Oono (1968), Chu (1982), Hu (1985), Zapata (1990) cho thấy sự khác biệt của

chua tạo cây “Pomate”

các kiểu gen kéo theo sự khác biệt trong khả năng nuôi cấy lúa. Kiểu gen loài

Năm 1985, cây thuốc lá mang gen biến nạp đầu tiên đƣợc công bố.
Khái niệm chuyển gen trở thành phổ cập trong thuật ngữ công nghệ sinh học

thực vật. Ledoux cho rằng có thể gây ra biến dị di truyền ở biến dị tế bào,
thậm chí ở hạt giống bằng cách cho chúng hấp thụ ADN ngoại lai.[20]

phụ Indica phát triển và tạo mô sẹo kém so với loài phụ Japonica.
Theo Mathias và Fukki (1986) khả năng tái sinh của cây lúa trong nuôi
cấy tế bào bị chi phối bởi sự tƣơng tác tế bào chất, nhân của chính nó.
* Ảnh hưởng của giai đoạn phát triển của cây trong thời điểm lấy mẫu

Từ năm 1980 đến nay, hàng loạt thành công mới trong lĩnh vực công

Các tác giả Oono (1975), Lin (1976), Chen (1977) cho thấy: mẫu bao

nghệ đƣợc công bố. Nuôi cấy mô tế bào đã trở thành một công cụ không thể

phấn đƣợc lấy vào thời điểm các tiểu bào tử trong bao phấn đang ở giai đoạn

thiếu trong công nghệ tạo giống và nhân giống hiện đại.

đơn bào muộn là tốt nhất. Bao phấn ở giai đoạn tứ thể không có khả năng

Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào đã mang lại những cơ sở lý luận mới mẻ cho

phát triển trong môi trƣờng nuôi cấy invitro, Bao phấn ở giai đoạn đơn bào
sớm phát triển kém.

sinh học hiện đại.

Hạt phấn chỉ có thể phát triển tốt khi đã tách ra khỏi tứ tử (giai đoạn

1.1.2. Tình hình nuôi cấy bao phấn lúa trên thế giới

Năm 1968 Nishi và cộng sự là những tác giả đầu tiên thành công trong

đơn bào giữa đến đơn bào muộn).

lĩnh vực nuôi cấy bao phấn trên những cây một lá mầm sau khi công bố kết

*Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian xử lý đòng

quả tái sinh cây lúa hoàn chỉnh từ mô sẹo. Sau đó, hàng loạt các tác giả cũng

Kêt quả nghiên cứu của Zhou và Cs (1983) đã cho thấy rằng: Xử lý

công bố những kết quả khả quan nhƣ: Chu et. al (1975), Chen (1977), Chalyf
anh Stalanrl (1981), Wang et.al (1982), Mich et.al (1985). Kết quả tạo cây
đơn bội và lƣỡng bội thuần thu đƣợc chủ yếu ở loài phụ Japonica, đối với loài

đòng ở nhiệt độ thấp rất có hiệu quả trong nuôi cấy bao phấn lúa. Điều kiện
lạnh làm tăng khả năng tạo cây xanh.
+ Chaleff và Cs (1975) xử lý đòng ở 60C trong 5 ngày

phụ Indica thì kết quả chƣa cao.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

6



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

7




+ Hu và Cs (1978) đã xử lý đòng lúa ở nhiệt độ 100C trong thời gian 4 -

Trong kỹ thuật nuôi cấy bao phấn lúa, các chất điều hoà sinh trƣỏng có
thể sử dụng ở dạng đơn hay kết hợp theo những tỷ lệ khác nhau

8 ngày.
+ Matitin và Drimo Millo (1981) đã tiến hành xử lý đòng lúa ở nhiệt độ
0

Năm 1980, Khi nuôi cấy bao phấn lúa Japonica, Yang và cộng sự đã
sử dụng kết hợp NAA 4mg/l + 2,4D 1mg/l + IAA 2mg/l + Kinetin 3mg/l .

2 - 4 C trong thời gian 48h.
0

+ Gupta và Borthakeu (1987) đã xử lý đòng lúa ở nhiệt độ 10 C trong
thời gian 11 ngày.

Kết quả cho thấy rằng nếu môi trƣờng tạo mô sẹo có chứa 2,4D nồng độ
1mg/l thì mô sẹo dễ dàng tái sinh thành cây.

+ Guapta, Quimio và Zapata (1990) xử lý đòng ở 6-80C trong thời gian
8 ngày.

Theo Wasakd (1982): IAA xúc tiến quá trình hình thành rễ, Sự kết hợp

các auxin: IAA, NAA, Kinetin một cách hợp lý sẽ xúc tiến mạnh mẽ quá

+ Rush và cộng sự (1982) đã tiến hành xử lý đòng lúa ở nhiệt độ 400C
trong thời gian 15 phút.

trình phân hoá tế bào và tái sinh cây xanh.
Nhìn chung, các chất tham gia vào môi trƣờng nuôi cấy bao phấn lúa

+ Năm 1886, Torrizo xử lý đòng ở 350C trong 15 phút cũng cho kết quả
khả quan.
Nói chung, đã có nhiều thí nghiệm nghiên cứu về sự ảnh hƣởng của
nhiệt độ và thởi gian xử lý đòng đến kết quả nuôi cấy bao phấn lúa. Kết quả
nghiên cứu của các tác giả cho thấy rằng xử lý đòng ở nhiệt độ khác nhau sẽ
cho những kết quả nuôi cấy khác nhau
* Ảnh hưởng của nồng độ Cacbon đến quá trình tạo mô sẹo và tái
sinh cây.
Nồng độ cacbon có thể làm thay đổi tỷ lệ hình thành mô sẹo và khả
năng tái sinh cây trong nuôi cấy bao phấn lúa.
Chen (1978) cho biết đƣờng có tác dụng làm thay đổi áp suất thẩm thấu
của môi trƣờng nuôi cấy. Nồng độ đƣờng trong môi trƣờng nuôi cấy từ 6 - 8%
sẽ làm tăng cả hai quá trình hình thành mô sẹo và tái sinh tiếp theo.
Năm 1988 Kim và Paghavan thông báo rằng: Tỷ lệ hình thành mô sẹo từ
bao phấn sẽ giảm đi khi nồng độ đƣờng trong môi trƣờng nuôi cấy cao (8 -12%)
* Ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng đến quá trình tạo mô sẹo
và tái sinh cây.

nhƣ chất điều hoà sinh trƣởng, muối, đƣờng, sắt, Vitamin..... đều có sự ảnh
hƣởng lẫn nhau và ảnh hƣởng chung đến kết quả của quá trình nuôi cấy.
* Ảnh hưởng của các yếu tố vật lý trong môi trường
Các yếu tố vật lý của môi trƣờng bao gồm:

+ Trạng thái vật lý của môi trƣờng ở dạng rắn hay lỏng
+ Độ pH môi trƣờng
+ Độ ẩm không khí
+ Ánh sáng và nhiệt độ của phòng nuôi cấy
Các yếu tố trên tác dụng trực tiếp đến sự hình thành mô sẹo và khả
năng tái sinh chồi.
Kết quả nghiên cứu lúa mỳ của Bjarmsta (1989) cho thấy rằng xử lý
ánh sáng cƣờng độ cao sẽ kìm hãm quá trình tạo mô sẹo nhƣng lại kích thích
quá trình tạo cây xanh, ánh sáng yếu hoặc ánh sáng khuyếch tán không ảnh
hƣởng gì đến khả năng tạo mô sẹo của mẫu cấy.
* Ảnh hưởng của các môi trường khác nhau đến quá trình nuôi cấy bao phấn.
Các môi trƣờng khác nhau sẽ cho những kết quả nuôi cấy bao phấn là
khác nhau. Năm 1962 Dono thông báo môi trƣờng Murashige and skoog là
môi trƣờng thích hợp nhất cho nuôi cấy bao phấn. Đến năm 1975 thì Chu và

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

8



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

9




Cs lại thông báo rằng môi trƣờng N6 là môi trƣờng tốt nhất cho nuôi cấy bao
phấn lúa.

- Giữa phôi dinh dƣỡng và hạt phấn hoặc là giữa các phôi với nhau
luôn luôn có sự cạnh tranh làm ức chế quá trình tái sinh cây.

Năm 1974, hai nhóm nghiên cứu của Chen và Wang đã thành công lớn
khi sử dụng môi trƣờng Miller trong nuôi cấy bao phấn lúa.
Rất nhiều tác giả có chung một kết luận rằng: môi trƣờng có nồng độ
muối vô cơ cao sẽ rất thích hợp cho phân hoá mô sẹo.

- Trong môi trƣờng nuôi cấy, phôi dinh dƣỡng nhị bội phát triển mạnh
hơn hạt phấn tách rời dẫn đến kết quả là mô sẹo nhị bội chiếm ƣu thế so với
mô sẹo đơn bội.
Để loại bỏ các nhân tố cạnh tranh đối với sự phát triển của hạt phấn,
các nhà nghiên cứu đã tiến hành nuôi phấn hạt phấn sau khi đã tách rời khỏi

1.1.3. Tình hình nuôi cấy bao phấn ở Việt Nam
Ở nƣớc ta, nghiên cứu nuôi cấy mô thực vật mới bắt đầu từ năm 1975.
[16]. Kỹ thuật nhân giống invitro đã đƣợc tiến hành trên nhiều đối tƣợng thực
vật khác nhau nhƣ: chuối, khoai tây, cà chua, ngô, lúa, phong lan…và cũng đã
đạt đƣợc những kết quả nhất định, làm tăng hệ số nhân giống và tạo đƣợc
giống mới sạch bệnh ở các loại cây này.

mô túi phấn. Song kết quả đạt đƣợc vẫn còn rát khiêm tốn. Thực tế cho thấy
tỷ lệ mô sẹo hình thành thấp, sức tái sinh cây từ mô sẹo cũng không cao.
Cũng trong thời gian này, các tác giả đã thử nghiệm nuôi cấy bao phấn
lúa trong môi trƣờng lỏng và rút ra kết luân:
+ Môi trƣờng lỏng thuận lợi cho sự hấp thu dinh dƣỡng hơn môi trƣờng rắn.

Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn lúa đƣợc ứng dụng rất sớm vào công tác
chọn tạo giống và đã đƣợc tiến hành ở những cơ quan nghiên cứu khoa học,

+ Các chất độc do hạt phấn chết tạo ra không có tác động xấu tới các
hạt phấn khác bởi vì nó đã bị khuyếch tán vào môi trƣờng lỏng.

các trƣờng đại học. Phƣơng pháp này đƣợc thực hiện có sự trợ giúp của công

Năm 1994, Viện di truyền nông nghiệp công bố quá trình nuôi cấy bao

nghệ sinh học nhằm chuyển lạp gen, gây áp lực bằng điều kiện ngoại cảnh bất

phấn, nâng cao tỉ lệ tạo mô sẹo và khả năng tái sinh của cây đơn bội (Nguyễn

lợi ở mức độ tế bào (rét, nóng, bệnh hai…), nuôi cấy bao phấn, dung hợp tế

Văn Đồng, Vũ Đức Quang, Phạm Ngọc Lƣơng, Trần Duy Quý 1994).

bào trần, nuôi cấy phôi lúa. Bằng công nghệ sinh học ngƣời ta có thể chủ

Từ năm 1994 – 2001, đã có công trình nghiên cứu nuôi cấy bao phấn

động chuyển thêm một số gen mới có lợi đã đƣợc nghiên cứu kỹ vào cây lúa

lúa mới để chọn tạo nguồn vật liệu khởi đầu phục vụ phát triển lúa lai đựơc

nhƣ gen kháng bạc lá, gen chịu phèn, gen chịu rét, gen chịu mặn…Tuy nhiên

công bố (Viện di truyền nồng nghiệp 1997 - 2000).

số lƣợng những giống lúa đạt năng suất, chất lƣợng đƣợc tạo ra chƣa nhiều.

Các nhà khoa học Việt Nam đã đạt đƣợc một số thành tựu có ý nghĩa to

Đỗ Năng Vịnh và Lê Thị Diệu Muội [15] đã nghiên cứu một số yếu tố

lớn trong sản suất. Tại viện Di Truyền Nông nghiệp, phƣơng pháp nuôi cấy

ảnh hƣởng đến khả năng tạo thành mô sẹo và tạo thành cây lúa từ hạt phấn

bao phấn kết hợp với chọn dòng biến dị đã tạo ra 50 dòng bất dục phản ứng

bằng phƣơng pháp nuôi cấy invitro.

với nhiệt độ (TGMS) mới , trong đó 5 dòng đƣợc xác định là có tính bất dục

Sau nhiều năm tiến hành nghiên cứu về nuôi cấy bao phấn, năm 1993
Nguyễn Hữu Hổ và Nguyễn Văn Uyển đã có những kết luận sau:
- Trong mô túi phấn có chất ức chế ảnh hƣởng tới sự phát triển hạt phấn

ổn định, có ƣu thế lai cao khi lai tạo và đang đƣợc sử dụng trong chọn giống
lúa lai 2 dòng.
Bằng phƣơng pháp nuôi cấy bao phấn đã tạo ra 12 dòng, giống thuần
có ƣu thế lai gần tƣơng đƣơng với con lai F1 các dòng giống có triển vọng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

10



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

11




gồm DT26, DT29, DT32, AC22, AC23, AC24, AC25,....đang đƣợc khảo

điều kiện thuận lợi nhất định, những tế bào đó có thể sẽ phát triển thành một

nghiệm. Nhờ nuôi cấy bao phấn lúa có thể rút ngắn thời gian chọn giống mới

cơ thể hoàn chỉnh. [11]

xuống từ 4-6 thế hệ. Kỹ thuật đơn bội invitro cũng đang đƣợc triển khai mạnh

Miller và Skoog (1956) đã tạo chồi thành công từ mô thuốc lá nuôi cấy,

trong chọn giống ở Viện lúa Đồng bằng sông Cửu Long, Viện công nghệ sinh

chứng minh đƣợc tính toàn năng của tế bào. Thành công trên đã tạo ra công

học...[9].

nghệ mới: Công nghệ sinh học ứng dụng trong nhân giống vô tính, tạo giống

Những năm gần đây, Vũ Đức Quang và cộng sự đã tiến hành nghiên

cây trồng và dòng chống chịu.

cứu và cải tiến môi trƣờng N6 thành môi trƣờng HD. Ông cho rằng môi

Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở lý luận

trƣờng HD có ƣu điểm vƣợt trội so với môi trƣờng N6 và là môi trƣờng tốt

của phƣơng pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Cho đến nay, con ngƣời đã

nhất cho sự phát triển của bao phấn lúa.

hoàn toàn chứng minh đƣợc khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh

Viện Di truyền nông nghiệp Hà Nội đã tạo ra 3 giống lúa quốc gia
DT10, A20, DT11 bằng phƣơng pháp gây đột biến.

từ một tế bào riêng rẽ.
1.3.2. Sự phân hoá và phản phân hoá tế bào
Cơ thể thực vật trƣởng thành là một chỉnh thể thống nhất bao gồm

1.2. Khái niệm nhân giống Invitro
Nhân giông vô tính invitro là phƣơng pháp sản xuất hàng loạt cây con
từ các bộ phận của cây (các cơ quan, mô, tế bào) bằng cách nuôi cấy chúng
trong ống nghiệm ở điều kiện vô trùng tuyệt đối có môi trƣờng nuôi cấy thích
hợp và đƣợc kiểm soát [1]

nhiều cơ quan chức năng khác nhau, trong đó có nhiều loại tế bào khác nhau.
Mỗi tế bào khác nhau sẽ thực hiện một chức năng cụ thể khác nhau
Song, mọi tế bào đều đƣợc tạo thành từ tế bào phôi sinh.[12]
Sự phân hoá tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào

Mọi cơ thể sinh vật phức tạp đều gồm nhiều đơn vị nhỏ là các tế bào
hợp thành. Các tế bào đã phân hóa đều mang các thông tin có trong các tế bào
đầu tiên và là những tế bào độc lập, từ đó để xây dựng lại toàn bộ cơ thể.
1.3. Cơ sở khoa học của nuôi cấy Invitro

của mô chuyển hoá, đảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể. Quá
trình phân hoá của tế bào có thể biểu thị nhƣ sau:
Tế bào phôi sinh

Tế bào chuyên hoá
chức năng riêng

Tế bào giãn

1.3.1. Tính toàn năng của tế bào
Haberlandt (1902) là ngƣời đầu tiên đề xuất phƣơng pháp nuôi cấy mô
và tế bào thực vật để chứng minh tính toàn năng của tế bào.

Mặc dù các tế bào đã chuyển hoá thành các mô chức năng nhƣng chúng
vẫn giữ nguyên khả năng phân chia. Trong điều kiện thích hợp, các tế bào lại

Haberlandt cho rằng mỗi tế bào của bất kỳ sinh vật nào cũng đều có khả

có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ. Quá trình đó đƣợc

năng tiềm tàng để phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Ông nhận thấy rằng,

gọi là phản phân hoá tế bào, (ngƣợc lại với quá trình phân hoá tế bào). Tuy

mỗi tế bào của cơ thể đa bào đều phát sinh từ hợp bào thông qua quá trình

nhiên, khi tế bào đã phân hoá thành các tế bào có chức năng chuyên biệt,

phân bào nguyên nhiễm. Điều đó có nghĩa là mỗi tế bào của một sinh vật sẽ

chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình. Trong điều kiện cần

chứa toàn bộ thông tin di truyền cần thiết của một cơ thể hoàn chỉnh. Khi gặp

thiết ở điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

12



13




phân chia mạnh mẽ. Quá trình đó gọi là phản phân hoá tế bào, ngƣợc lại với

thể đảm bảo hoàn toàn chắc chắn. Đây là một trở ngại lớn trong sinh sản hữu

quá trình phân hoá tế bào.

tính. Ngày nay bằng phƣơng pháp sinh sản vô tính, ngƣời ta đã khắc phục

Quá trình phát sinh hình thái trong quá trình nuôi cấy mô, tế bào thực

đƣợc nhƣợc điểm này. Đặc biệt là nhân giống vô tính in vitro.

vật thực chất là kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào. Kỹ

Dựa trên cơ chế nguyên phân, trong nhân giống invitro khi lấy các bộ

thuật nuôi cấy mô, tế bào xét cho cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh

phận sinh dƣỡng trong một cây đem nhân giống thì các bộ phận đó có thông

hình thái của tế bào thực vật một cách định hƣớng dựa vào sự phân hóa và

tin di truyền giống nhau và tạo nên các cơ thể mới có thông tin di truyền

phản phân hóa của tế bào trên cơ sở tính toàn năng của tế bào thực vật. Để

giống nhau và giống cơ thể mẹ. Nhƣ vậy nếu cơ thể mẹ có các tính trạng di

điều khiển sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy, ngƣời ta thƣờng bổ sung

truyền tốt thì các tính trạng đó sẽ đƣợc thể hiện ở mọi cơ thể con cái. [9]

vào môi trƣờng nuôi cấy 2 nhóm chất điều tiết sinh trƣởng thực vật là auxin

1.3.4. Môi trƣờng nuôi cấy (môi trƣờng dinh dƣỡng)

và cytokinin. Nếu tỷ lệ auxin/cytokinin thấp thì sự phát sinh hình thái theo

1.3.4.1. Khái niệm

hƣớng tạo chồi; nếu tỷ lệ này cao thì tạo thành rễ, còn khi tỷ lệ này cân bằng
thì sẽ phát sinh theo hƣớng tạo mô sẹo. [3].

Môi trƣờng nuôi cấy là điều kiện vô cùng quan trọng, có tính chất
quyết định sự phân hoá tế bào và cơ quan trong nuôi cấy.
Theo Street [23] thì môi trƣờng nuôi cấy và môi trƣờng xung quanh là

1.3.3. Cơ chế di truyền thông qua các hệ tế bào
Cơ chế di truyền thông qua các thế hệ tế bào bao gồm các công đoạn:

những nhân tố quyết định sự thành công hoặc thất bại của quá trình nuôi cấy

Trong quá trình nguyên phân, từ một tế bào mẹ sẽ nhân đôi, tạo ra 2 tế bào

invitro. Môi trƣờng nuôi cấy là nguồn cung cấp các chất cần thiết cho sự phân

con giống nhau và giống tế bào mẹ ban đầu. Nhƣ vậy qua nguyên phân bộ

chia và phân hoá của mô tế bào trong suốt quá trình nuôi cấy. Vì vậy, môi

NST trong nội bộ từng cơ thể đƣợc diễn ra theo cơ chế nguyên phân, đây là

trƣờng dinh dƣỡng phải đầy đủ chất dinh dƣỡng, các chất cần thiết.

cơ chế phân bào mà từ một tế bào ban đầu sẽ phân chia thành hai tế bào con

Đối với hầu hết các loài thực vật, Môi trƣờng nuôi cấy bao gồm các

có bộ NST giống bộ NST của tế bào mẹ đã truyền nguyên vẹn sang tế bào

nguyên tố đa lƣợng, vi lƣợng, nguồn các bon, các axitamin, các chất điều hoà

con. Sở dĩ có hiện tƣợng này là do trƣớc mỗi lần giảm phân, mỗi phân tử

sinh trƣởng và một số chất phụ gia. Thành phần dinh dƣỡng, hàm lƣợng các

ADN đã thực hiện quá trình tái sinh để từ mỗi phân tử ADN hình thành 2

chất cần thiết cho tế bào sinh trƣởng tốt nhất thay đổi tuỳ theo từng loài,

phân tử ADN giống nhau và giống ADN ban đầu. Quá trình này đƣợc thực

giống, nguồn gốc mẫu cấy hay từng cơ quan khác nhau trên cùng một cơ thể.

hiện ở kỳ trung gian và thông qua cơ chế phân ly đều của NST ở kỳ sau, là cơ

1.3.4.2. Một số môi trƣờng cơ bản

sở cho sự truyền nguyên vẹn thông tin di truyền trong nội bộ cơ thể.

Đã có rất nhiều môi trƣờng dinh dƣỡng lần lƣợt đƣợc tìm ra trên cơ sở

Giữa 2 thế hệ cơ thể đƣợc hình thành thông qua cơ chế giảm phân đã

cải tiến môi trƣờng của Kotte và Robbin (1902) nhƣ: Môi trƣờng White

làm cho ở thế hệ đời sau có hiện tƣợng phân ly tính trạng, do bộ NST của thế

(1934), Knudson (1946), Vacin và Went (1949), Heller(1953), Murasnige -

hệ sau không giống nhau và không giống bố mẹ. Vì vậy việc duy trì các tính

Skoog (1962), Gammborg (B5) (1968), Knop (1974), WMR (1982), Aderson

trạng mong muốn ở bố mẹ sang thế hệ sau bằng sinh sản hữu tính sẽ không

(1984),… Tuy nhiên, mỗi môi trƣờng chỉ thích hợp với một loài cây nhất định

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

14



15




nhƣ: Môi trƣờng Knudson (1946), Vacin và Went (1949), chỉ thích hợp cho

đƣờng đƣợc sử dụng chủ yếu là sacarose và glucose với nồng độ thay đổi từ 20

các loài Lan, môi trƣờng Murasnige - Skoog (1962) thích hợp cho cácloài cây

– 40g/l tuỳ theo từng loài thực vật và mục đích nuôi cấy.

thân thảo và một số loài cây thân gỗ sinh trƣởng nhanh nhƣ Keo, Bạch

- Các vitamin

đàn…Môi trƣờng WMP chỉ thích hợp cho các loài cây thân gỗ.[9]

Trong quá trình nuôi cấy, cây invitro có thể tự tổng hợp đƣợc một số

Tuỳ thuộc vào từng đối tƣợng cụ thể, trong mỗi giai đoạn nuôi cấy, mà

vitamin cần thiết nhƣng chƣa đáp ứng đƣợc nhu cầu sinh trƣởng. Do đó ngƣời

lựa chọn loại môi trƣờng thích hợp thì mới có kết quả khả quan. Thông

ta thƣờng bổ sung một số vitamin nhóm B nhƣ: B1, B2, B3, B5, B6...ở nồng

thƣờng, ngƣời ta hay sử dụng môi trƣờng MS và môi trƣờng N6 cho nhân

độ 1mg/l; Dung dịch vitamin dễ bị hỏng do nấm, khuẩn nhiễm tạp và bị phân

giống Invitro.

huỷ ở nhiệt độ cao. Vì vậy cần bảo quản trong điều kiện lạnh dƣới 0 0C hoặc

* Môi trƣờng MS:

chỉ pha chế trƣớc khi sử dụng. Ngoài ra, bổ sung một lƣợng tƣơng đối lớn

Các thành phần cơ bản của môi trƣờng MS (Murashige- skoog) [1]:

myo-inositol : 50 - 500mg/l, để thúc đẩy sự phân chia mô tế bào.

bao gồm:

- Các chất phụ gia hữu cơ khác

- Các nguyên tố đa lượng:

Nƣớc dừa, thanh hoạt tính, dịch chiết nấm men...có tác dụng kích thích

Bao gồm: N, P, K, S, Mg, Ca,… thƣờng đƣợc sử dụng ở nồng độ

sự sinh trƣởng của mô sẹo nên thƣờng đƣợc dùng lam chất phụ gia.

30ppm. Thành phần, tỷ lệ của từng chất ở mỗi nuôi trƣờng nuôi cấy cụ thể là

Trong nƣớc dừa có chứa đƣờng, các axitamin, axit hữu cơ, đặc biệt

khác nhau, môi trƣờng giàu nitro thích hợp cho việc hình thành chồi, môi

trong nƣớc dừa có chứa các hợp chất quan trọng cho nuôi cấy mô. đó là myo-

trƣờng giàu kali có tác dụng xúc tiến mạnh quá trình trao đổi chất

inositol, các hợp chất có hoạt tính auxin, các gluxit của xytokinin. Nƣớc dừa

- Các nguyên tố vi lượng:

tỏ ra có tác dụng vƣợt trội trong các môi trƣờng nhân nhanh chồi.

Fe, Cu, Zn, Mn, Mo, Bo, Co, I …là các nguyên tố vi lƣợng thƣờng
đƣợc dùng trong môi trƣờng nuôi cấy invitro. Các nguyên tố này đóng vai trò
rất quan trọng trong các hoạt động của Enzim.

- Các chất điều tiết sinh trưởng
Các chất điều tiết sinh trƣởng đóng vai trò quan trọng nhất trong quá
trình nuôi cấy invitro, là yếu tố quyết định sự thành bại của quá trình nuôi

Các nguyên tố vi lƣợng thƣờng đƣợc dùng ở nồng độ thấp hơn so với
các nguyên tốa đa lƣợng

cấy. Các hoormon tự nhiên có tác dụng đến sự biến đổi sinh lý, sinh hoá trong
cây, đặc biệt ở các cơ quan chồi và rễ.

- Nguồn cacbon

Hoormon thực vật là những hợp chất hữu cơ do thực vật sinh sản ở

Mặc dù dƣới ánh sáng nhân tạo, cây Invitro có khả năng hình thành

nồng độ thấp làm nhiệm vụ điều tiết các quá trình sinh trƣởng của cây. Có 5

diệp lục và quang hợp. Song, khả năng tổng hợp cacbon của chúng rất kém do

nhóm chất điều tiết sinh trƣởng của thực vật đã đƣợc phát hiện, đó là: auxin,

đó các mô thực vật sống theo phƣơng thức dị dƣỡng là chính. Các mô tế bào

xytokinin, gibberellin, absixic axit và ethylen. Trong đó, auxin và xytokinin là

sống nhờ nguồn cacbon lấy từ đƣờng trong môi trƣờng dinh dƣỡng. Có hai loại

hai nhóm chất đƣợc sử dụng nhiều hơn cả.
- Auxin:

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

16



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

17




Auxin là hoormon sinh trƣởng. Tác dụng chủ yếu của Auxin là kích
thích sự giãn tế bào, làm tăng phân bào, sự hình thành mô sẹo và sự xuất hiện
rễ bất định.

+ Nhóm xytokinin : Các chất thuộc nhóm xytokinin đang đƣợc sử dụng
chủ yếu là :
Kinetin (K), benzyl adenin purin (BAP), zeatin trong đó BAP và K

Các Auxin thƣờng đƣợc sử dụng trong nuôi cấy mô là:

đƣợc sử dụng rộng rãi nhất vì giá không đắt lại có hoạt tính cao.

+ 2,4 Dicloro phenoxy axetic axit (2,4 D);

- Chất làm đông cứng môi trường – agar

+ α – Naphtylaxetic axit(α –NAA);

Mỗi loài thực vật thích hợp với môi trƣờng giá thể khác nhau ngƣời ta

+ Indolaxit axetic ( IAA).

thƣờng sử dụng thạch Aga – một loại polysacarrit làm từ rong biển, có khả

+ Indol butyric acid (IBA).

năng ngậm nƣớc cao, để làm đông cứng môi trƣờng nuôi cấy. Aga tan ở

Riêng IAA là auxin tự nhiên còn NAA, IBA và 2.4D là các auxin nhân

1000C, đông đặc ở 450 Trong môi trƣờng axit, aga không có khả năng đông

tạo, auxin nhân tạo có hoạt tính mạnh hơn auxin tự nhiên, do cấu trúc phân tử

đặc. Nồng độ thƣờng dùng từ 0,4% - 0,8% (tức 4 - 8 g/l) tuỳ thuộc vào độ tinh

khá bền vững nên auxin nhân tạo khó bị oxy hóa bởi các enzyme. Kinh

khiết và từng loại môi trƣờng.

nghiệm sử dụng auxin trong nuôi cấy cho kết quả cao là sử dụng auxin với

Ví dụ : Đối với cây lúa, hàm luợng aga thích hợp từ 5,5 – 6,5 g/l.

nồng độ cao tại thời điểm ban đầu sau đó giảm dần để tránh tình trạng mô bị

- pH môi trường : pH môi trƣờng là yếu tố rất quan trọng, có tác động

“say” và nhiễm độc. Nồng độ auxin thƣờng dùng từ 0,001 – 10mg/l môi

rất lớn đến quá trình trao đổi chất của tế bào. Độ pH môi trƣờng ảnh hƣởng

trƣờng nuôi cấy.

trực tiếp tới quá trình thu nhận các chất dinh dƣỡng từ môi trƣờng vào trong

- Cytokinin (hoormon phân bào):

tế bào. Các hợp chất đặc biệt mẫn cảm với pH môi trƣờng là NAA, GA3, và

Các hợp chất cytokinin kích thích sự phân bào và sự phân hoá chồi bất

cỏc vitamin. Ngoài ra, hàng loạt các hợp chất sắt cũng phụ thuộc vào độ pH.

định. Việc điều chỉnh tỷ lệ auxin/cytokinin trong môi trƣờng nuôi cấy quyết

Khoảng pH thích hợp nhất cho nuôi cấy invitro là 5,5 – 5,8. Độ pH nhỏ hơn

định sự phân hóa tế bào theo hƣớng tạo mô sẹo, tạo chồi, tạo rễ hay tạo phôi

4.5 hoặc lớn hơn 7 đều gây ức chế quá trình sinh trƣởng của cây

soma. Có 3 loại cytokinin chính đƣợc sử dụng trong nuôi cấy mô là:
+ Kinetin: Kinetin đƣợc hình thành từ chế phẩm AND ở điều kiện nhiệt

Có thể dùng dung dịch KOH 1N, NaOH 1N hay HCl 1N với nồng độ
10% để điều chỉnh độ pH môi trƣờng.

độ cao. Trong cơ thể sống có thể không có kinetin tồn tại, sản phẩm này kích

* Môi trường Chu (N6)

thích sự tạo thành chồi mô nuôi cấy.

Đây là môi trƣờng rất hiệu quả trong nuôi cấy bao phấn lúa và các loài

+ Zeatin: Tác dụng tƣơng tự kinetin nhƣng giá thành của zeatin khá
cao nên chỉ dùng trong những trƣờng hợp thật đặc biệt.

cây hoà thảo khác.
1.3.5. Điều kiện vô trùng

+ 6-Benzylaminopurine (BAP): Tác dụng của BAP giống kinetin

Nuôi cấy Invitro là nuôi cấy trong điều kiện vô trùng. Nếu không đảm

nhƣng hoạt tính của BAP cao hơn nhiều so với kinetin và bền vững hơn zeatin

bảo tốt điều kiện vô trùng mẫu nuôi cấy hoặc môi trƣờng sẽ bị nhiễm, mô

ở nhiệt độ cao.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

18



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

19




nuôi cấy sẽ bị chết. Điều kiện vô trùng có ý nghĩa quyết đến sự thành bại của
của nuôi cấy mô invitro [12].

Hiện nay trong các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô để cung cấp nguồn
ánh sáng có cƣờng độ 2000 - 2500 lux ngƣời ta sử dụng các dàn đèn huỳnh

Phƣơng pháp vô trùng vật liệu thông dụng nhất hiện nay là dùng các
chất hóa học, tia cực tím có khả năng diệt nấm và vi khuẩn.

quang đặt cách bình nuôi cấy từ 35- 40cm.
1.3.6.2. Nhiệt độ

Vô trùng ban đầu là một thao tác khó và là khâu đầu tiên có ý nghĩa

Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, nhiệt độ là nhân tố quan trọng ảnh

quyết định. Tuy vậy, nếu tìm đƣợc nồng độ và thời gian xử lý thích hợp sẽ

hƣởng tới sự phân chia tế bào và các quá trình sinh hóa trong cây. Tùy thuộc

cho tỷ lệ sống cao, thông thƣờng hay sử dụng một số hóa chất nhƣ HgCl2

vào xuất xứ của mẫu nuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độ cho phù hợp. Nhìn

0.1%, NaHCl 10%, nƣớc javen, cồn 760, clorox,…để khử trùng.

chung nhiệt độ thích hợp nhất cho sự sinh trƣởng tốt ở nhiều loài cây là 25 0C

Phƣơng tiện khử trùng: Nồi hấp vô trùng, tủ sấy, buồng và bàn cấy vô

(white, 1973).
1.3.7. Vật liệu nuôi cấy

trùng, phòng nuôi cây.

Để bắt đầu quá trình nhân giống vô tính cho 1 loài hoặc 1 dòng ngƣời

1.3.6. Điều kiện ánh sáng và nhiệt độ
Ánh sáng và nhịêt độ là hai yếu tố chính có ảnh hƣởng cơ bản đến quá

ta phải chú trọng trƣớc nhất là vật liệu nuôi cấy. Đây là bƣớc đầu tiên và là

trình sinh trƣởng của mô nuôi cấy [5]

khâu quan trọng quyết định đến sự thành bại và tốc độ sinh trƣởng của quá

1.3.6.1. Ánh sáng:

trình nhân giống. Theo nguyên tắc, bất kỳ một tế bào trong cơ thể đều có khả

Sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy chịu ảnh hƣởng từ các yếu tố

năng tái sinh thành một cây hoàn chỉnh trong điều kiện thích hợp. Tuy vậy để

nhƣ: thời gian chiếu sáng, cƣờng độ ánh sáng và chất lƣợng ánh sáng.Thời

có tốc độ tái sinh, sức sống, sức chống chịu của cây con cao thì khả năng đó

gian chiếu sáng tác động đến quá trình phát triển của mô nuôi cấy. Thời gian

còn tùy thuộc vào tuổi sinh lý của vật liệu nuôi cấy [11].

chiếu sáng thích hợp với đa số các loài cây là 12 – 18 h/ngày.
Cƣờng độ ánh sáng tác động đến sự phát sinh hình thái của mô nuôi

Trong nuôi cấy mô ngƣời ta thƣờng sử dụng vật liệu nuôi cấy nhƣ đỉnh
sinh trƣởng, chồi, bao phấn, gieo qua hạt, thân mầm….

cấy. Theo Ammirato (1986): cƣờng độ ánh sáng cao kích thích sự sinh trƣởng

1.3.8. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình nuôi cấy mô, tế bào

của mô sẹo. ngƣợc lại, cƣờng độ ánh sáng thấp kích thích sự tạo chồi. Nhìn

1.3.8.1. Kiểu gen của cây cho bao phấn

chung cƣờng độ ánh sáng thích hợp cho mô nuôi cấy là 1000 - 7000 lux

Kiểu gen của cây cho bao phấn nuôi cấy có ảnh hƣởng rất lớn đến kết

(Morein, 1974), ngoài ra chất lƣợng ánh sáng cũng ảnh hƣởng tới sự phát sinh

quả nuôi cấy. Nuôi cấy bao phấn của các giống lúa thuộc loài phụ Japonica

hình thái của mô thực vật invitro: ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao của thân

(kể cả trƣờng hợp không xử lý lạnh trƣớc) đều đạt tỷ lệ thành cây thƣờng cao

chồi hơn so với ánh sáng trắng. Nếu mô nuôi cấy trong ánh sáng xanh thì sẽ

hơn nuôi cấy bao phấn của các giống lúa thuộc loài phụ Indica. Chen và Lin

ức chế vƣơn cao nhƣng lại có ảnh hƣởng tốt tới sự sinh trƣởng của mô sẹo.

(1981) còn thấy rằng tỷ lệ bao phấn tạo callus, khả năng callus tái sinh thành
cây, tỷ lệ cây xanh/cây bạch tạng và số lƣợng nhiễm sắc thể của cây tái sinh
đều liên quan đến kiểu gen của cây cho bao phấn. Điều này chứng tỏ khả

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

20

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

21




năng nuôi cấy bao phấn lúa cũng do gen điều khiển, đối với những giống
phản ứng tốt có thể chứa nhiều gen tác động lên quá trình này.
Để tăng hiệu quả nuôi cấy có thể bằng cách lai tạo nhằm cải tiến giống.
Ví dụ : ở khoai tây kiểu gen phản ứng tốt có thể thu đƣợc bằng cách lai giữa
kiểu gen phản ứng kém với kiểu gen phản ứng tốt.

1.3.8.4. Nhiệt độ và thời gian xử lý đòng
Kết quả nghiên cứu của Zhou và c.s (1983) đã cho thấy rằng: Xử lý
đòng ở nhiệt độ thấp rất có hiệu quả trong nuôi cấy bao phấn. Điều kiện lạnh
làm tăng khả năng tạo cây xanh.
Hiệu quả của xử lý trƣớc nhiệt độ thấp đến việc hình thành callus và

Phải thay đổi điều kiện và môi trƣờng nuôi cấy cho từng loại cây trồng

cây con đã đƣợc nghiên cứu bởi một số tác giả về một số phƣơng pháp xử lý

thậm chí cho từng giống cây trong cùng một loài.

nhƣ: Xử lý bông đã tách bẹ, xử lý bông chƣa tách bẹ hoặc xử lý bao phấn đã

1.3.8.2. Giai đoạn phát triển của bao phấn

đƣợc nuôi cấy. Tất cả các phƣơng pháp đó đều cho kết quả tốt, Tuy nhiên tốt

Giai đoạn phát triển của bao phấn tại thời điểm tách rời ra và nuôi cấy
cũng có ảnh hƣởng rất quan trọng đến kết quả nuôi cấy. Đối với lúa giai đoạn
phản ứng tốt nhất là trƣớc và giữa giai đoạn hạt phấn một nhân trong điều kiện
nồng độ đƣờng trong môi trƣờng nuôi cấy tăng từ 6% đến 9% (Chen, 1978).
Các tác giả Oono (1975), Lin (1976) và Chen (1977) cho thấy: Mẫu
bao phấn đƣợc lấy vào thời điểm các tiểu bào tử trong bao phấn đang ở giai

hơn cả là theo phƣơng pháp của Genovest và Magill (1979), xử lý bông còn
nằm trong bẹ lá đòng ở nhiệt độ 10- 130C trong 10-14 ngày [11]
Tsay và Chen (1984), Lin và Tsay (1984) phát hiện ra rằng những hạt
phấn đƣợc xử lý lạnh đột ngột ở 8-100C trong 7 ngày tạo ra nhiều callus hơn
gấp 2 lần so với không xử lý. Tuy nhiên kết quả không khác biệt khi xử lý
lạnh bao phấn đã cấy trên môi trƣờng.

đoạn đơn bào muộn là tốt nhất. Bao phấn ở giai đoạn tứ thể không có khả

Theo Chen và Cs (1982), thời gian xử lý lạnh dài 8-10 ngày tốt hơn 2-4

năng phát triển trong môi trƣờng nuôi cấy invitro. Bao phấn ở giai đoạn đơn

ngày. Tuy nhiên nếu kéo dài thời gian này quá 15 ngày lại ức chế quá trình

bào sớm phát triển kém. Hạt phấn chỉ có thể phát triển tốt khi đã tách ra khỏi

hình thành callus.

tứ tử (giai đoạn đơn bào giữa đến đơn bào muộn).

Lin và Tsay (1984), Tsay và c.s (1988) cho biết callus hình thành từ

1.3.8.3. Điều kiện sinh lý của cây cho bao phấn

bao phấn đƣợc xử lý lạnh sẽ tạo ra nhiều cây đơn bội và ít cây lƣỡng bội hơn

Chen và Lin (1976), Chen và Tsay (1984) cho rằng bao phấn nào đƣợc
lấy ở những bông trỗ sớm thì cho kết quả nuôi cấy tốt hơn bao phấn lấy ở

là từ bao phấn không xử lý, điều kiện lạnh đã kích thích việc tạo callus sớm
và khả năng tái sinh thành cây cao.

những bông trỗ muộn. Tỷ lệ tạo callus ở bao phấn lấy từ nhánh cấp 3 thấp hơn

Các giống khác nhau đòi hỏi điều kiện xử lý khác nhau, trạng thái sinh

bao phấn từ nhánh cấp 1, cấp 2 và từ cây mẹ. Lý do bao phấn từ nhánh cấp 3

lý và giai đoạn phát triển của hạt phấn cũng ảnh hƣởng đến hiệu quả của xử

cho hiệu quả nuôi cấy kém hơn có thể những nhánh này thiếu dinh dƣỡng.Tuy

lý. Tsay và c.s (1988) thấy rằng khả năng hình thành callus tăng gấp 2 lần khi

nhiên không có sự sai khác giữa những hoa ở các vị trí khác nhau trên cùng

xử lý bao phấn chứa bào tử ở giai đoạn giữa và cuối một nhân trong 7-14

một nhánh. Nhìn chung cây nào sinh trƣởng khoẻ, trong điều kiên môi trƣờng

ngày, quá 14 ngày thì tỷ lệ cây xanh giảm.

dinh dƣỡng tối ƣu, có cƣờng độ ánh sáng mạnh thƣờng cho bao phấn có tỷ lệ
thành cây cao.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

22



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

23




Nói chung đã có nhiều nghiên cứu về ảnh hƣởng của nhiệt độ và thời
gian xử lý đòng đến kết quả nuôi cấy bao phấn. Kết quả của các tác giả cho
thấy rằng xử lý đòng ở nhiệt độ khác nhau sẽ cho kết quả nuôi cấy khác nhau.

1.4.2. Các giai đoạn chính
1.4.2.1. Giai đoạn 1: Chuẩn bị
Đây là giai đoạn lựa chọn đối tƣợng nuôi cấy (cây trồng, giống) từ đó

1.4. Các giai đoạn chính trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

xác định bộ phận thích hợp của cây để làm vật liệu nuôi cấy. (Ví dụ: thân, lá,

1.4.1. Khái niệm nuôi cấy bao phấn

chồi, nụ, cuống hoa, đế hoa, hạt phấn...).. Song song với việc chuẩn bị mẫu

Nuôi cấy bao phấn chứa các bào tử hoặc hạt phấn chƣa chín trong môi

cấy là tiến hành vệ sinh và khử trùng phòng nuôi cấy, các dụng cụ nuôi cấy,

trƣờng nhân tạo nhằm tạo cây đơn bội và đƣợc sử dụng rộng rãi trong cải tiến

mẫu cấy. Yêu cầu đối với mẫu cấy trƣớc khi đƣa vào nuôi cấy là phải đƣợc vô

giống cây trồng. Thông qua phƣơng pháp này rút ngắn thời gian chọn tạo,

trùng, tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, tốc độ sinh trƣởng nhanh.

tăng tính biến dị cho chọn lọc và giải quyết vấn đề lai xa. Từ đó tạo dòng thần

Kết quả giai đoạn này đƣợc quyết định bởi kỹ năng lấy mẫu, nồng độ

từ nuôi cấy bao phấn F1 hoăc F2 trong thời gian ngắn. Kỹ thuật nuôi cấy

chất khử trùng và thời gian xử lý khử trùng mẫu cấy.

invitro kích thích tiểu bào tử phát triển thành cây trong môi trƣờng nuôi cấy

1.4.2.2. Giai đoạn 2: Cấy mẫu tạo mô sẹo

bao phấn và hạt phấn. Cho phép nhân nhanh chóng, tạo ra hàng loạt cây đơn
bội đó là một lối thoát kì diệu đối với ứng dụng cây đơn bội, di truyền giống
cây trồng [10].

Sau khi vật liệu cấy đã đƣợc khử trùng trong thời gian nhất định thì tiến
hành cấy mẫu vào môi trƣờng invitro. (vào mẫu) để tạo mô sẹo.
Yêu cầu của giai đoạn này là phải hạn chế tối đa tỷ lệ nhiễm nấm và

Bình thƣờng sự phát triển của tế bào sinh dục đực trong bao phấn đi
theo các giai đoạn sau: Từ bào tử tế bào mẹ thông qua tính phân bào giảm

khuẩn trong phòng nuôi cấy.
1.4.2.3. Giai đoạn 3: Tái sinh chồi

nhiễm hình thành tiểu bào tử (đơn bội). Sau đó các tiểu bào tử hình thành các

Khi mẫu cấy trong ống nghiệm đã tạo đƣợc nhiều mô sẹo thì tiến hành

giao tử đực (hạt phấn cũng đơn bội). Nhƣng khi ta đƣa bao phấn và nuôi cấy

cấy tái sinh. Yêu cầu của giai đoạn này là tái sinh một cách định hƣớng sự

trong môi trƣờng nhân tạo, sự phát triển của tiểu bào tử sẽ khác đi. Dƣới sự

phát triển của mô nuôi cấy.

tác động của hàng loạt các yếu tố trong môi trƣờng nhân tạo, đặc biệt là các

Quá trình đƣợc điều khiển chủ yếu dựa vào tỷ lệ của các hợp chất

chất kích thích sinh trƣởng, trong tế bào sẽ diễn ra quá trình phản phân hoá, từ

auxin/xytokinin đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy. Để tái sinh mẫu nuôi cấy trong

đó các bào tử sẽ phân chia thành mô sẹo, các mô sẹo này lúc đầu là đơn bội.

ống nghiệm thƣờng sử dụng chồi đỉnh, chồi nách, mô sẹo…

Sau đó tuỳ theo từng điều kiện nuôi cấy chúng có thể là đơn bội hay lƣỡng

1.4.2.4. Giai đoạn 4: Nhân nhanh chồi

bội hoá, khi chuyển vào trong môi trƣờng tái sinh cây, ta sẽ thu đƣợc cây đơn
bội hay lƣỡng bội. Khi cần thiết cây đơn bội thu đựơc ta có thể xử lý bằng
colchicine để lƣỡng bội hoá dòng đơn bội thu đƣợc (Theo Phan Khải, Vũ Đức
Quang và cộng sự, 1990).

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Để tạo hệ số nhân chồi cao nhất, tiến hành cấy chuyển các chồi đƣợc tái
sinh ở mẫu tái sinh sang môi trƣờng dinh dƣỡng mới.
Ngƣời ta thƣờng đƣa vào môi trƣờng dinh dƣỡng nhân tạo các chất điều
hòa sinh trƣởng:auxin, xytokinin…các chất bổ sung khác nhƣ: nƣớc dừa, dịch

24



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

25

chiết nấm men…đồng thời điều khiển nhiệt độ ánh sáng thích hợp…tạo điều
kiện tốt nhất cho chồi sinh trƣởng tốt, tăng hệ số nhân chồi tái sinh.
Tùy thuộc vào đối tƣợng nuôi cấy ngƣời ta có thể nhân nhanh bằng

Nếu cây đa bội thể mang những cặp gen dị hợp tử thì biểu hiện kiểu
hình là do các tính trạng trội hoặc lặn quyết định. Đối với những cây có nhiễm
sắc thể đơn bội thì kiểu hình sẽ phản ánh trung thực kiểu gen. Dựa vào đặc

kích thích sự hình thành cụm chồi hoặc kích thích sự phát triển chồi nách.

điểm này ngƣời ta có thể nhận biết dễ dàng các đột biến lặn của giống đang

1.4.2.5. Giai đoạn 5: Cấy tạo rễ

nghiên cứu. Vì vậy cây đơn bội là vật liệu lý tƣởng trong công tác chọn giống

Khi chồi đạt đƣợc kích thƣớc nhất định ta cấy chuyển các chồi đó sang

cây trồng.

môi trƣờng ra rễ. Thƣờng sau 2-3 tuần từ những chồi riêng lẻ này sẽ xuất hiện

Trong cơ thể thực vật, chỉ có hạt phấn và noãn là những tế bào đơn bội

rễ và phát triển thành cây hoàn chỉnh. ở giai đoạn này ngƣời ta thƣờng bổ

(1n). Từ năm 1924 Blakeslee và cộng sự đã chứng minh đƣợc rằng: Hoàn

sung vào môi trƣờng nuôi cấy các auxin có chức năng tạo rễ phụ từ chồi.

toàn có thể thu đƣợc những dòng đồng hợp tử nhị bội thuần bằng cách nhị bội

Thông thƣờng, các nhóm chất IAA, NAA, 2,4D đƣợc sử dụng nhiều

hoá cơ thể đơn bội.

trong quá trình nghiên cứu và sản xuất, tác dụng xúc tiến hình thành rễ từ chồi

Năm 1968, Mizenkes oono (Nhật Bản) đã thành công trong việc tạo cây

tái sinh. Mỗi một loài cây, loại mô sẽ yêu cầu một nồng độ hoá chất khác

lƣỡng bội đồng hợp tử tuyệt đối từ cây đơn bội bằng phƣơng pháp nuôi cấy

nhau để tạo rễ tốt nhất.

bao phấn lúa. Hiện nay đã có 65 loại cây trồng đƣợc tạo ra bằng con đƣờng

1.4.2.6. Giai đoạn 6: Đƣa cây tái sinh trở về điều kiện sống tự nhiên

đơn bội.

Đây là công đoạn cuối cùng của quá trình nuôi cấy invitro. Cây đã tái

Kỹ thuật tạo cây đơn bội invitro bằng cách kích thích tiểu bào tử phát

sinh hoàn chỉnh (đủ rễ, thân, lá) đƣợc đƣa ra khỏi ống nghiệm, thuần dƣỡng

triển thành cây thông qua nuôi cấy bao phấn đã tạo ra hàng loạt cây đơn bội

trong các môi trƣờng nhƣ đất, môi trƣờng thuần dƣỡng lỏng… kết quả của

một cách nhanh chóng. Đây là thành tựu vô cùng to lớn, mở ra một hƣớng đi

giai đoạn này sẽ quyết định khả năng ứng dụng cây invitro trong các chƣơng

mới trong lĩnh vực ứng dụng đơn bội vào công tác chọn giống cây trồng, có

trình giống hoặc vào các mục đích khác nhau.

thể rút ngắn thời gian tạo giống từ 5 đến 7 năm.

1.5. Kỹ thuật đơn bội Invitro và công tác giống cây trồng

1.5.2. Kỹ thuật đơn bội trong công tác chọn tạo giống cây trồng

1.5.1. Cây đơn bội

1.5.2.1. Tạo cây từ hạt phấn của các dòng lai F1

Cây trồng trong tự nhiên da dạng về loài và mỗi loài có mức bội thể

Giá trị của cây đơn bội trong công tác chọn tạo giống đã đƣợc phát hiện

khác nhau. Song, hầu hết cây trồng có nhiễm sắc thể lớn hơn 1 dạng nhị bội

từ lâu. Tuy nhiên, các cây đơn bội xuất hiện ngẫu nhiên với tần số rất thấp

thể 2n là phổ biến. Cũng có những loài cây có bộ nhiễm sắc thể tam bội, tứ

không thể đáp ứng nhu cầu của nghiên cứu và chọn tạo giống. [16].

bội, lục bội....ví dụ nhƣ: Cây mía, cây khoai lang có bội nhiễm sắc thể hỗn

Năm 1964, lần đầu tiên trên Thế giới, 2 nhà khoa học ấn Độ Guha và

loạn 2n, 4n và 6n. Nhƣ vậy, mỗi đặc điểm di truyền của chúng đều bị hai hay

Maheshwari thành công trong việc tạo cây đơn bội từ nuôi cấy bao phấn

nhiều gen chi phối, một số gen sẽ có trên 2alen và có hiện tƣợng trội hoặc lặn

invitro cây cà Datura innoxia. Ngay sau đó, cây đơn bội đã đƣợc tạo ra bằng

của một gen.

nuôi cấy bao phấn ở hàng loạt cây trồng khác nhau. Ngoài nuôi cấy bao phấn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

26



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

27

các nhà khoa học còn thành công rất lớn trong nuôi cấy noãn chƣa thụ tinh,
nuôi cấy hạt phấn tách rời. Kỹ thuật này tạo ra nhanh chóng hàng loạt cây đơn

Cây mẹ AAbb

x

aaBB Cây bố

bội, phục vụ đắc lực cho công tác chọn tạo giống cây trồng.
Hai phƣơng pháp nghiên cứu cây đơn bội hiện nay là :

Kiểu gen của cây F1 :

- Nuôi cấy bao phấn hay tiểu bào tử tách rời, còn gọi là phƣơng pháp

Kiểu gen của hạt phấn :

trinh sinh đực trong ống nghiệm.

AB

- Nuôi cấy tế bào trứng chƣa thụ tinh, còn gọi là phƣơng pháp trinh

Ab

aB

ab

Kiểu gen của cây đơn bội tái sinh từ hạt phấn:

sinh cái trong ống nghiệm.

AB

Tại Trung Quốc, công nghệ đơn bội đã đƣợc triển khai trên quy mô

AaBb

Ab

aB

ab

Kiểu gen của cây nhị bội hoá có nguồn gốc hạt phấn:

rộng lớn và có định hƣớng chiến lƣợc rõ ràng trong tạo giống mới. Hơn một

AABB

AAbb

aaBB

aabb

nghìn cơ sở nuôi cấy bao phấn đã hoạt động trên toàn quốc từ những năm
1970. kết quả đã tạo đƣợc trên 100 giống lúa mới trong một thời gian ngắn.
Tại Triều Tiên, kỹ thuật nuôi cấy bao phấn đã tạo ra 42 giống lúa mới
(Sasson, 1993; Jain, 1997).

Theo sơ đồ trên bằng phƣơng pháp nuôi cấy hạt phấn sẽ nhận đƣợc 4
kiểu gen đồng hợp khác nhau, trong đó xác suất xuất hiện kiểu gen AABB là
1/4. Trong khi đó xác suất xuất hiện kiểu gen AABB bằng phƣơng pháp chọn

Ƣu thế của các phƣơng pháp này là tất cả các cây tạo thành đều có

lọc thông thƣờng là 1/16. Mặt khác nhà chọn tạo giống sẽ rất khó khăn để

nguồn gốc từ tiểu bào tử hoặc đại bào tử, vì vậy con nhân đƣợc sẽ là cây đơn

phân biệt đƣợc các cây đồng hợp (AABB ) với các cây dị hợp (AABb, AaBb)

bội hoặc nhị bội đồng hợp tử tuyệt đối với các cặp nhiễm sắc thể hoàn toàn

vì chúng đều giống nhau về kiểu hình. Do đó bắt buộc phải chọn ở các thế hệ

giống nhau (trừ trƣờng hợp đột biến) [16].

tiếp theo. Ngƣợc lại, bằng phƣơng pháp tạo cây từ hạt phấn có thể dễ dàng

Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn và hạt phấn tách rời trên môi trƣờng tổng

phân biệt đƣợc các kiểu gen khác nhau vì chúng ở trạng thái đồng hợp, khi đó

hợp đã đƣợc sử dụng vào nhiều mục đích khác nhau. Phƣơng pháp tạo cây từ

các kiểu hình đƣợc biểu hiện rõ rệt. Nhƣ vậy bằng phƣơng pháp này có thể rút

hạt phấn của các dòng lai F1 không những rút ngắn thời gian trong tạo giống

ngắn thời gian và đơn giản hóa qua trình chọn tạo giống [16].

mà còn đơn giản hoá quá trình chọn giống.

1.5.2.2. Ứng dụng kỹ thuật đơn bội trong chọn tạo giống mới và dòng

* Ta có sơ đồ tạo cây từ hạt phấn con lai F1 nhƣ sau:

thuần ở cây lúa
Nhờ kỹ thuật nuôi cấy bao phấn có thể rút ngắn thời gian chọn giống
mới xuống từ 4 đến 6 thế hệ và tạo ra hàng loạt các dòng thuần mới. Thành
tựu nuôi cấy mô hứa hẹn nhiều triển vọng đối với chọn tạo giống lúa là tái
sinh cây lúa từ nuôi cấy hạt phấn tách rời ở cả 2 dạng lúa nƣớc Japonica và
Indica do Raina và Irfan công bố năm 1998. Trên 500 phôi đã đƣợc tái sinh từ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

28



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

29

80.000 hạt phấn nuôi cấy trong đĩa petri đƣơng kính 3.5 cm. Rất nhiều cây đã

Để tạo các dòng bất dục đực nhân với các nền di truyền khác nhau,

đƣợc tái sinh từ hạt phấn. Theo lý thuyết, một cặp lúa lai F1 có thể tạo ra

nuôi cấy bao phấn con lai F1 mang gen bất dục đực nhân sẽ cho phép tạo ra

4.096 kiểu gen đồng hợp khác nhau tái sinh từ hạt phấn invitro (Đỗ Năng

các dòng thuần bất dục đực nhân chỉ sau một lần nuôi cấy bao phấn (Nin Jin

Vịnh và Phan Khải, 1996).

c.s,1997; Q.R.Chu c.s, 1998).

Kỹ thuật nuôi cấy hạt phấn tách rời hứa hẹn có thể tạo ra vô số những
nguồn gen quý giá cho chọn giống [16].

- Lai xa kết hợp với nuôi cấy mô tế bào trong chọn tạo các dòng kháng
sâu bệnh và các điều kiện bất thuận của môi trƣờng.

Ở nƣớc ta, công nghệ đơn bội đƣợc áp dụng với 2 mục tiêu chính sau:
- Cố định ƣu thế lai thông qua việc rút ngắn thời gian tạo giống thuần
chủng bằng nuôi cấy bao phấn của con lai F1.

Ngƣời ta đã tạo ra các con lai khác loài để chuyển các gen kháng từ lúa
dại vào lúa trồng. Tuy nhiên, khi lai gặp phải khó khăn là tính không tƣơng
hợp và để khắc phục hiện tƣợng này ngƣời ta đã áp dụng phƣơng pháp cứu

-Tạo dòng thuần có những đặc tính thích nghi với thụ phấn chéo và
mang gen kết hợp rộng.

phôi và nuôi cấy bao phấn. Phƣơng pháp này cho phép ta có thể chuyển những
gen kháng từ cây dại vào cây trồng để cải thiện nguồn gen của cây trồng.

Hiện nay công nghệ nuôi cấy bao phấn và hạt phấn tách rời đƣợc sử
dụng phổ biến với các mục đích sau:

- Tối ƣu hoá môi trƣờng nuôi cấy để chọn tạo ra các giống lúa hạt dài
chất lƣợng cao.

- Cố định ƣu thế lai và các gen hữu ích.

Tại trƣờng Đại học tổng hợp Lossiana (Mỹ), ngƣời ta đã xây dựng

Thông qua kỹ thuật nuôi cấy bao phấn ngƣời ta có thể cố định ƣu thế

chiến lƣợc chọn giống lúa hạt dài cho miền Nam nƣớc Mỹ bằng nuôi cấy bao

lai và các gen hữu ích từ con lai F1 có ƣu thế lai cao, làm tăng năng suất lúa

phấn lúa. Các giống lúa hạt dài có khả năng tái sinh yếu, tỷ lệ 0.5%. Bằng tối

(M.S, Swaminathan, 1995; Chen và c.s, 1978; Narayanan và c.s, 1996). Nuôi

ƣu hóa môi trƣờng nuôi cấy, hàng năm họ đã tạo ra đựoc hơn 8.000 dòng

cấy bao phấn lúa lai Indica/Indica đã thu đƣợc các dòng có năng suất cao hơn

thuần đơn bội kép bằng nuôi cấy bao phấn của con lai F1 hạt dài. Mục tiêu là

bố mẹ và bằng 93.2% so với con lai F1 (Batachandran và c.s, 1994).

chọn ra các giống lúa hạt dài có giá trị thƣơng mại cao [16]

- Tạo các dòng bất dục đực mới và các dòng mang gen kết hợp rộng
cho tạo giống lúa lai.

Các bƣớc chọn giống có thể tiến hành theo trình tự nhƣ sau:
- Lai giống có đặc tính nông học và chất lƣợng ƣu việt với giống mang

Để tạo các dòng bất dục đực mới và các dòng có tiềm năng và rút ngắn
quá trình tạo giống, ngƣời ta kết hợp lai, lai xa với nuôi cấy bao phấn. Kết quả
của quá trình này cho thấy kỹ thuật nuôi cấy bao phấn của con lai
Japonica/Indica là con đƣờng nhanh và có hiệu quả để phát triển các dòng
phục hồi mang gen kết hợp rộng trong chọn tạo giống lúa lai (Yan J.Q, c.s,

gen kháng để tạo ra con lai F1.
- Nuôi cấy bao phấn con lai F1 tạo ra dòng thuần với những đặc tính
khác nhau.
- Sử dụng kỹ thuật chỉ thị phân tử để chọn những dòng thuần mang gen
kháng bệnh.
- Khảo nghiệm những dòng thuần chọn lọc trong những điều kiện sản

1996; Virmani, 1996).

xuất khác nhau để chọn giống tốt, kháng bệnh.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

30



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

31




2.1.2.2. Địa điểm và thời gian tiến hành

CHƢƠNG II

1/ Địa điểm

VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Các thí nghiệm nghiên cứu đƣợc bố trí tại hai điểm:
- Phần nuôi cấy bao phấn đƣợc tiến hành tại phòng thí nghiệm «Công
nghệ tế bào thực vật » Bộ môn Công nghệ sinh học, Khoa Nông học, Trƣờng

2.1. Vật liệu và phạm vi nghiên cứu

Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.

2.1.1 Vật liệu
- Vật liệu nuôi cấy invitro là bao phấn của một số dòng lúa lai F1 thuộc

- Phần đánh giá ở đồng ruộng đƣợc tiến hành tại Trung tâm thực hành
thực nghiệm của Trƣờng ĐH Nông Lâm Thái Nguyên.

các tổ hợp lai: KimA/R278, KimA/ R17
- Vật liệu thí nghiệm ở vụ mùa 2008 tại đồng ruộng gồm 20 dòng lúa,
Đó là các dòng: TN49, TN50, TN53, TN57, TN64, TN65, TN68, TN70,
TN71, TN72, TN73, TN76, TN81, TN83, TN84, TN85, TN87, TN91, TN93,

2/ Thời gian
Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 4 năm 2007 đến tháng 10 năm 2008
3/ Giới hạn nội dung nghiên cứu
- Các nghiên cứu tạo dòng thuần đƣợc tiến hành trong phòng thí

TN97.
Để tiện trong việc so sánh, thí nghiệm bố trí thêm giống Khang Dân
(giống số 21). Trong đó, Khang Dân đƣợc sử dụng làm vật liệu thí nghiệm
nhƣ một dòng lúa để có thể tiến hành so sánh Duncan (so sánh cặp nhóm

nghiệm ở các giai đoạn : Vệ sinh đòng lúa và xử lý lạnh, khử trùng hoa lúa,
tạo callus, tái sinh chồi, ra rễ tạo cây hoàn chỉnh.
- Giai đoạn ở nhà lƣới : tiến hành nghiên cứu ảnh hƣởng của một số
loại môi trƣờng thuần dƣỡng đến sinh trƣởng của cây lúa.

không có đối chứng).

- Giai đoạn ngoài đồng ruộng : Tiến hành đánh giá sơ bộ khả năng sinh

2.1.2. Phạm vi nghiên cứu

trƣởng của các dòng lúa thông qua các chỉ tiêu : Năng suất, các yếu tố cấu

2.1.2.1. Điều kiện nghiên cứu
Phòng thí nghiệm nuôi cấy bao phấn lúa đƣợc duy trì trong điều kiện :

thành năng suất, thời gian sinh trƣởng, thời gian đẻ nhánh, khả năng chống

- Số giờ chiếu sáng trong ngày: 8 - 10 h/ngày

đổ, khả năng kháng sâu bệnh.

- Nhiệt độ phòng nuôi cấy: 18 - 250C

2.2. Nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu

- Cƣờng độ ánh sáng: 2000-3000 lux

2.2.1. Nội dung nghiên cứu

- Ẩm độ: 80 - 90%

2.2.1.1. Nội dung nghiên cứu trong phòng thí nghiệm

Thí nghiệm thuần dƣỡng cây tái sinh đƣợc bố trí trong nhà lƣới có mái

1/ Nghiên cứu ảnh hƣởng của thời gian xử lý lạnh đến tỷ lệ sống của

bao phấn lúa.

che, nhiệt độ, ẩm độ, ánh sáng phụ thuộc vào môi trƣờng.
Thí nghiệm đánh giá các đặc điểm nông sinh học của các dòng thuần đồng

2/ Nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ chất khử trùng đến tỷ lệ sống

hợp tử đƣợc bố trí ngoài đồng ruộng, chịu ảnh hƣởng của môi trƣờng tự nhiên.

của mẫu cấy.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

32



33




3/ Nghiên cứu ảnh hƣởng của môi trƣờng MS và môi trƣờng N6 đến
khả năng tạo callus của mẫu cấy.

* Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian xử lý lạnh đến
khả năng tạo mô sẹo (callus) của mẫu cấy.

4/ Nghiên cứu ảnh hƣởng của các chất 2,4 D ; NAA đến khả năng tạo
callus của mẫu cấy.

Thí nghiệm gồm 6 công thức, mỗi công thức thí nghiệm làm với 3 lần
nhắc lại, mỗi lần nhắc lại theo dõi 10 lọ, mỗi lọ 50 mẫu. Mẫu cấy là những

5/ Nghiên cứu ảnh hƣởng của các chất Kinetin, BAP đến khả năng tái

bao phấn không bị nhiễm.

sinh chồi từ mô sẹo.

Môi trƣờng nuôi cấy:

6/ Nghiên cứu ảnh hƣởng của chất NAA đến khả năng ra rễ từ chồi xanh.

N6 + (1,5 mg 2,4D + 60g đƣờng + 100mg inostol/lit môi trƣờng).

7/ Nghiên cứu ảnh hƣởng của các loại môi trƣờng thuần dƣỡng đến khả

Tiến hành vệ sinh đòng sạch sẽ bằng nƣớc sạch rồi khử trùng bằng cồn

năng sinh trƣởng của cây.

75 sau đó gói lại bằng giấy thấm và giấy bạc và bảo quản trong tủ lạnh ở

2.2.1.2. Nội dung nghiên cứu ở đồng ruộng

nhiệt độ 8 – 100C trong những khoảng thời gian khác nhau.

0

Sơ bộ đánh giá một số đặc điểm sinh trƣởng, chống chịu, năng suất và
các yếu tố cấu thành năng suất của 20 dòng lúa đƣợc tạo từ nuôi cấy bao phấn
ở vụ mùa 2008 thông qua các chỉ tiêu:
- Thời gian đẻ nhánh, thời gian trỗ, thời gian chín sinh lý, Tổng thời
gian sinh trƣởng.
- Khả năng chống chịu sâu đục thân, sâu cuốn lá, bệnh khô vằn, bệnh
bạc lá.

- CT1: không xử lý lạnh
- CT2: xử lý lạnh 1 ngày
- CT3: xử lý lạnh 3 ngày
- CT4: xử lý lạnh 5 ngày
- CT5: xử lý lạnh 7 ngày
- CT6: xử lý lạnh 10 ngày
Sau 5 ngày cấy mẫu vào môi trƣờng, bắt đầu theo dõi mẫu cấy

- Khả năng chống đổ.
- Số bông/m2 , Số hạt chắc/ bông, P1000 hạt, Năng suất thực thu.
2.2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.2.1. Phƣơng pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm

Các chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mẫu tạo callus (mô sẹo) và tỷ lệ mẫu chết.
* Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất khử trùng
hypocloratnatri đến tỷ lệ sống của mẫu cấy.
Thí nghiệm gồm 4 công thức, mỗi công thức thí nghiệm làm với 3 lần

1/ Quy trình kỹ thuật nuôi cấy bao phấn lúa:
Các nghiên cứu trong phòng thí nghiệm đƣợc thực hiện theo Quy trình kỹ

thuật nuôi cấy bao phấn lúa của Viện nghiên cứu cây lƣơng thực và thực phẩm

nhắc lại, mỗi lần nhắc lại theo dõi 10 lọ, mỗi lọ cấy 50 mẫu (bao phấn).
Tiến hành bóc bao lá đòng, ngâm hoa lúa trong chất khử trùng
hypocloratnatri ở nồng độ khác nhau với thời gian 20 phút. Sau đó tráng lại

(Hải Dƣơng).

bằng nƣớc cất vô trùng 5 lần.

2/ Các thí nghiệm nghiên cứu
Các thí nghiệm nghiên cứu trong phòng thí nghiệm đƣợc bố trí theo

- CT1 : Xử lý mẫu bằng hypocloratnatri nồng độ 0,5 % nguyên chất
- CT 2: Xử lý mẫu bằng hypocloratnatri nồng độ 1,0 % nguyên chất

kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn

- CT 3 : Xử lý mẫu bằng hypocloratnatri nồng độ 1,5 % nguyên chất
- CT 4 : Xử lý mẫu bằng hypocloratnatri nồng độ 2,0 % nguyên chất

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

34



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

35

Sau 5 ngày cấy mẫu vào môi trƣờng bắt đầu theo dõi mẫu.
Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mẫu sống.

Thí nghiệm gồm 6 công thức, với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại theo
dõi 10 lọ, mỗi lọ 50 mẫu . Mẫu cấy là những bao phấn không bị nhiễm.

* Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường MS và môi
trường N6 đến khả năng tạo mô sẹo (callus)

- CT1: Nền + 0 mg NAA /lít môi trƣờng
- CT2: Nền + 0,5 mg NAA /lít môi trƣờng

Thí nghiệm gồm 2 công thức, mỗi công thức làm với 3 lần nhắc lại,

- CT3: Nền + 1,0 mg NAA/lít môi trƣờng

mỗi lần nhắc lại theo dõi 20 lọ, mỗi lọ cấy 100 mẫu. Mẫu cấy là những bao

- CT4: Nền + 1,5 mg NAA/lít môi trƣờng

phấn không bị nhiễm.

- CT5: Nền + 2,0 mg NAA/lít môi trƣờng

- CT1: MS + (1,5 mg 2,4D + 30 g đƣờng + 100mg inostol/lit môi trƣờng)
- CT2: N6 + (1,5 mg 2,4D + 30 g đƣờng + 100mg inostol/lit môi trƣờng)

Sau 30 ngày cấy mẫu vào môi trƣờng, tiến hành theo dõi mẫu.
Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ mẫu hình thành mô sẹo và tỷ lệ mẫu chết.
* Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất 2,4 D đến khả năng

- CT6: Nền + 2,5 mg NAA /lít môi trƣờng
(Môi trƣờng nền: N6 + 60g Đƣờng + 100g Inostol + 6,5 gam Agar/lit
môi trƣờng)
Sau 5 ngày cấy mẫu vào môi trƣờng, bắt đầu theo dõi mẫu
Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mẫu ra mô sẹo, tỷ lệ mẫu chết.

tạo mô sẹo (callus) của mẫu cấy.
Thí nghiệm gồm 6 công thức, mỗi công thức thí nghiệm làm với
3 nhắc lại, mỗi lần nhắc lại theo dõi 10 lọ, mỗi lọ cấy 50 mẫu. Mẫu cấy là
những bao phấn không bị nhiễm.

* Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất Kinetin đến khả năng
tái sinh chồi từ mô sẹo (callus).
Thí nghiệm gồm 8 công thức, mỗi công thức thí nghiệm làm với 3 lần

- CT1: Nền + 0 mg 2,4D/lit môi trƣờng

nhắc lại, mỗi lần nhắc lại theo dõi 5 lọ, mỗi lọ 10 mẫu cấy. Mẫu cấy là những

- CT2: Nền + 0,5 mg 2,4D/lit môi trƣờng

callus đạt tiêu chuẩn.

- CT3: Nền + 1,0 mg 2,4D/lit môi trƣờng

- CT1: Nền +

- CT4: Nền + 1,5 mg 2,4D/lit môi trƣờng

0 mg kinetin/lit môi trƣờng

- CT2: Nền + 1,0 mg kinetin/lit môi trƣờng

- CT5: Nền + 2,0 mg 2,4D/lit môi trƣờng

- CT3: Nền + 1,5 mg kinetin/lit môi trƣờng

- CT6: Nền + 2,5 mg 2,4D/lit môi trƣờng
Môi trƣờng nền: N6 + (60g đƣờng + 100g inostol + 6,5 g agar/lit

- CT4: Nền + 2,0 mg kinetin/lit môi trƣờng
- CT5: Nền + 2,5 mg kinetin/lit môi trƣờng

môi trƣờng)
Sau 5 ngày cấy mẫu vào môi trƣờng bắt đầu theo dõi mẫu.

- CT6: Nền + 3,0 mg kinetin/lit môi trƣờng

Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (callus), tỷ lệ mẫu chết.

- CT7: Nền + 3,5 mg kinetin/lit môi trƣờng

* Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo mô

- CT8: Nền + 4,0 mg kinetin/lit môi trƣờng

sẹo (callus)của mẫu cấy

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

(Môi trƣờng nền: N6 + 60g đƣờng + 100mg inostol + 6,5 g agar/lit )

36



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

37




Sau 5 ngày cấy mẫu vào môi trƣờng. bắt đầu theo dõi mẫu tái sinh chồi.

- CT1: Nền + 0. mg NAA /lit môi trƣờng

Các chỉ tiêu theo dõi:

- CT2: Nền + 0,1 mg NAA /lit môi trƣờng

+ Tỷ lệ callus hình thành chồi xanh.

- CT3: Nền + 0,2 mg NAA /lit môi trƣờng
- CT4: Nền + 0,3 mg NAA /lit môi trƣờng

+ Tỷ lệ callus hình thành chồi bạch tạng.

- CT5: Nền + 0,4 mg NAA /lit môi trƣờng

+ Tỷ lệ callus chết
* Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất BAP đến quá trình tái
sinh chồi từ mô sẹo.

(Nền: N6 + 60g đƣờng + 100mg inostol + 6,5g Agar/lit môi trƣờng)
Sau 20 ngày cấy mẫu vào môi trƣờng tiến hành theo dõi mẫu.

Thí nghiệm gồm 8 công thức, mỗi công thức thí nghiệm làm với 3 lần nhắc
lại, mỗi lần nhắc lại theo dõi 5 lọ, mỗi lọ cấy10 mẫu. Mẫu cấy là những callus
đạt tiêu chuẩn.
- CT1: Nền +

- CT6: Nền + 0,5 mg NAA /lit môi trƣờng

Chỉ tiêu theo dõi: số lƣợng rễ hình thành, chiều dài rễ.
*Thí nghiệm 9 : Nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại môi trường
thuần dưỡng đến khả năng sinh trưởng của cây

0 mg BAP/lit môi trƣờng

Thí nghiệm gồm 4 công thức, mỗi công thức thí nghiệm làm với 3 lần

- CT2: Nền + 1,0 mg BAP/lit môi trƣờng

nhắc lại, mỗi lần nhắc lại thì theo dõi 4 mẫu cấy. Mẫu cấy là những cây lúa có

- CT3: Nền + 1,5 mg BAP/lit môi trƣờng

kích thƣớc đồng đều.

- CT4: Nền + 2,0 mg BAP/lit môi trƣờng

- CT1: môi trƣờng Yoshida,

- CT5: Nền + 2,5 mg BAP /lit môi trƣờng

- CT2: môi trƣờng MS

- CT6: Nền + 3,0 mg BAP/lit môi trƣờng

- CT3: môi trƣờng Nƣớc cất

- CT7: Nền + 3,5 mg BAP/lit môi trƣờng

- CT4: môi trƣờng đất.

- CT8: Nền + 4,0 mg BAP/lit môi trƣờng

Sau 20 ngày cấy bắt đầu theo dõi mẫu.

(Môi trƣờng nền: N6 + 60g đƣờng +100mg inostol + 6,5 g agar/lit

Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ sống, chết, chiều dài rễ, chiều cao cây, số lá, số

môi trƣờng)

nhánh.

Sau 20 ngày cấy mẫu vào môi trƣờng thì theo dõi mẫu tái sinh chồi.

4/ Đánh giá kết quả nuôi cấy trong phòng thí nghiệm

Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mẫu tái sinh chồi và mẫu chết

a) Đánh giá kết quả khử trùng

* Thí nghiệm 8 : Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ
từ chồi của mẫu cấy

+ Tû lÖ mÉu sèng (%) =

Sè mÉu sèng
x 100
Sè mÉu cÊy

+ Tû lÖ mÉu chÕt (%) =

Sè mÉu chÕt
x 100
Sè mÉu cÊy

Thí nghiệm gồm 6 công thức, mỗi công thức thí nghiệm làm với 3 nhắc
lại, mỗi lần nhắc lại theo dõi 8 mẫu cấy. Mẫu cấy là những chồi có kích thƣớc
đồng đều.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

38



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

39




b) Đánh giá khả năng ra mô sẹo

+ Tû lÖ mÉu t¹o m« sÑo (%) =

Dải bảo vệ

Sè mÉu t¹o m« sÑo
x 100
Sè mÉu cÊy

c) Đánh giá khả năng tạo chồi

+ Tû lÖ mÉu t¹o chåi (%) =

Sè mÉu t¹o chåi
x 100
Sè mÉu cÊy

2.2.2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ngoài đồng ruộng
* Thí nghiệm 10: Đánh giá sơ bộ khả năng sinh trưởng phát triển trên
đồng ruộng của cây lúa nuôi cấy từ bao phấn thông qua theo dõi một số tiêu
Dải
bảo
vệ

chí nông sinh học trong quá trình thí nghiệm.
1/ Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm

Khèi 1

Khèi 2

Khèi3

TN84

TN73

TN93

TN53

TN71

TN97

TN64

TN49

TN72

TN68

TN84

KD18

TN50

TN65

TN 49

KD18

TN57

TN 87

TN73

TN91

TN76

TN71

TN70

TN81

TN93

TN87

TN68

TN70

TN72

TN84

Nghiên cứu ngoài đồng ruộng đƣợc tiến hành ở vụ Mùa 2008. Thí

TN76

TN50

TN73

nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu Khối ngẫu nhiên hoàn toàn RCBD (Randomized

TN81

KD18

TN65

Complete Block Design) gồm 21 công thức với 3 lần nhắc lại.

TN85

TN53

TN70

TN97

TN93

TN83

TN57

TN76

TN71

Khoảng cách giữa các ô là 30cm.

TN49

TN83

TN50

Khoảng cách giữa các khối là 40cm.

TN72

TN85

TN64

Diện tích mỗi ô thí nghiệm là 3m2. (1,5m x 2m)

TN 65

TN68

TN91

TN87

TN97

TN57

TN91

TN64

TN85

Tổng diện tích thí nghiệm gồm 189m2, đƣợc chia làm 3 khối, mỗi khối
21ô (tổng số ô thí nghiệm là 63 ô).

- Các dòng/giống lúa đƣợc bố trí ngẫu nhiên ở mỗi khối.
Xung quanh có dải bảo vệ.
Thí nghiệm bố trí trên ruộng tƣơng đối bằng phẳng, chủ động tƣới
tiêu.

TN83
TN 81
1/ Phƣơng pháp nghiên cứu ở vụ Xuân 2008
Dải bảo vệ
2/ Quy trình kỹ thuật trồng lúa

Dải
bảo
vệ

TN53

Sơ đồ 2: Khu vực thí nghiệm

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

40



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

41

2/ Quy trình kỹ thuật

dõi. Các cây mẫu đƣợc lấy ngẫu nhiên, thƣờng lấy tại 5 điểm trên 2 đƣờng

* Phương pháp làm mạ

chéo góc, trừ cây ở rìa ô. Trên mỗi ô thí nghiệm dùng 5 que cắm tại 5 điểm
theo 2 đƣờng chéo góc, mỗi điểm là một cây theo dõi. (theo dõi 5 cây/ô).

- Ngày gieo: 30/6/2008
- Phƣơng pháp gieo: Gieo mạ dƣợc

1/ Chỉ tiêu về thời gian sinh trƣởng

* Phương pháp cấy

Thời gian sinh trƣởng của cây lúa đƣợc tính từ ngày bắt đầu gieo hạt đến

- Ngày cấy: 11/7/2008

ngày thu hoạch. Thời gian sinh trƣởng của cây lúa đƣợc chia làm các thời kỳ:

- Kỹ thuật cấy: cấy 1 dảnh/khóm. Cấy nông tay, thẳng hàng

+ Thời gian cấy: Tính từ khi gieo đến khi cấy

- Khoảng cách cấy: Hàng cách hàng 20cm, cây cách cây 20cm

+ Thời gian bắt đầu đẻ nhánh: Tính từ khi gieo đến khi ruộng lúa có

- Mật độ cấy 25 cây/m2

50% số cây bắt đầu xuất hiện nhánh đầu tiên

* Phương pháp bón phân

+ Thời gian kết thúc đẻ nhánh: Tính từ khi gieo đến khi có 50% số cây

Quy trình bón (cho 1 ha): 60kgN + 60kg P2O5 + 60kg K2O
- Cách bón chia làm 3 lần:
+ Lần 1: (Bón lót): 100% P2O5 + 1/3 N + 1/3 K20 (bón lót).
+ Lần 2: (Bón thúc đẻ nhánh): 1/3 N + 1/3 K20.

đạt nhánh tối đa
+ Thời gian bắt đầu trỗ: Tính từ khi gieo đến khi có 10% số khóm có
bông vƣơn ra khỏi bẹ lá đòng khoảng 5cm
+ Thời gian kết thúc trỗ: Tính từ khi gieo đến khi có 80% số khóm có

+ Lần 3: (Bón thúc đòng): 1/3 N + 1/3 K20.
- Bón lót: toàn bộ phân vi sinh và phân lân + 50% đạm + 30% kali

bông thoát khỏi bẹ lá đòng.

- Bón thúc làm 2 lần:

+ Thời gian chín: tính từ khi gieo đến khi có 85% số hạt chín trên bông.

+ Lần 1: Khi lúa hồi xanh (sau cấy 6 ngày), bón 30% đạm + 40% kali

2/ Chỉ tiêu về khả năng chống chịu

+ Lần 2: Bón thúc đòng (trƣớc trỗ 25 ngày), bón 20% đạm + 30% kali

* Khả năng chống chịu sâu, bệnh hại

* Dặm tỉa: Tiến hành sau cấy 5 ngày, đảm bảo mật độ.

Phƣơng pháp theo dõi và đánh giá theo Quy phạm khảo nghiệm giống

* Điều tiết nước: Giữ nƣớc trên ruộng hợp lý ở từng giai đoạn

lúa Quốc gia (2004). Theo dõi tình hình phát sinh, phát triển của sâu bệnh hại

* Phòng trừ sâu bệnh: Thƣờng xuyên theo dõi tình hình phát sinh, phát triển

trên đồng ruộng ở các giai đoạn sinh trƣởng của lúa và đánh giá ở thời kỳ lúa bị hại

của sâu bệnh hại để có biện pháp phòng trừ kịp thời.

nặng nhất.

2.2.2.3. Các chỉ tiêu và phƣơng pháp theo dõi đánh giá

a. Sâu đục thân (Chilo suppressalis Walker):

Đánh giá so sánh các dòng lúa theo quy phạm khảo nghiệm giống Quốc
gia 10TCN 558 - 2002[10] và viện nghiên cứu lúa quốc tế IRRI (1996)[25]

Đánh giá từ giai đoạn đẻ nhánh đến làm đòng, vào chắc và chín theo
thang điểm 6 cấp (10TCN 558 – 2002). Tính tỷ lệ nhánh bị chết và bông bạc

Phƣơng pháp theo dõi và đánh giá các chỉ tiêu sẽ đƣợc tiến hành trên

do sâu hại trên diện tích 1m2.

toàn ô thí nghiệm hoặc trên từng cây, bộ phận của cây đã đƣợc định ra để theo

+ Cấp 0: Không bị hại

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

42



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

43




+ Cấp 1: 1 - 10% số dảnh bị chết hoặc bông bạc

+ Điểm 3: 6 - 12% diện tích vết bệnh/lá

+ Cấp 3: 11 - 20% số dảnh bị chết hoặc bông bạc

+ Điểm 5: 13 - 25% diện tích vết bệnh/lá

+ Cấp 5: 21- 30% số dảnh bị chết hoặc bông bạc

+ Điểm 7: 26 - 50% diện tích vết bệnh/lá

+ Cấp 7: 31 - 51% số dảnh bị chết hoặc bông bạc

+ Điểm 9: 51 - 100% diện tích vết bệnh/lá.

+ Cấp 9: > 51% số dảnh bị chết hoặc bông bạc.
b. Sâu cuốn lá nhỏ (Cnaphalocrocis medinalis Guene):
Đánh giá từ giai đoạn đẻ nhánh đến chín. Tính tỷ lệ cây bị ăn phần
xanh của lá hoặc lá bị cuốn thành ống trên diện tích 1m2.

* Khả năng chống đổ: Theo dõi bằng phƣơng pháp đánh giá trực quan ở
giai đoạn sinh trƣởng của cây lúa từ giai đoạn vào chắc – chín sau đó đánh giá
theo các thang điểm của IRRI. Quan sát tƣ thế của cây
+ Điểm 1: Tốt (cây không nghiêng)

+ Cấp 0: Không bị hại
+ Cấp 1: 1 - 10% cây bị hại

+ Điểm 3: Khá (hầu hết cây bị nghiêng nhẹ)

+ Cấp 3: 11 - 20% cây bị hại

+ Điểm 5: Trung bình (hầu hết cây bị nghiêng)

+ Cấp 5: 21- 30% cây bị hại

+ Điểm 7: Yếu (hầu hết cây bị đổ rạp)

+ Cấp 7: 31 - 51% cây bị hại

+ Điểm 9: Kém (tất cả các cây bị đổ rạp).

+ Cấp 9: > 51% cây bị hại.

3/ Chỉ tiêu về các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất

c. Bệnh khô vằn (Rhizoctonia Solani):
Quan sát diện tích vết bệnh trên lá từ giai đoạn chín sữa đến vào chắc.

a. Số bông/m2:

+ Điểm 0: Không bị hại

- Đếm toàn bộ số bông hữu hiệu (có 10 hạt chắc trở lên) của từng cây

+ Điểm 1: Vết bệnh thấp hơn 20% chiều cao cây

theo dõi sau đó lấy giá trị trung bình rồi suy ra số bông/m2

+ Điểm 3: Vết bệnh từ 21 - 30% chiều cao cây

- Bông bị sâu đục thân không đƣợc tính là bông hữu hiệu.

+ Điểm 5: Vết bệnh từ 31 - 45% chiều cao cây

Số bông/m2 = Bông/khóm x khóm/m2

+ Điểm 7: Vết bệnh từ 46 - 65% chiều cao cây

b. Số hạt chắc/bông:

+ Điểm 9: Vết bệnh trên 95% chiều cao cây

- Chỉ đếm số hạt chắc trên bông lúa

d. Bệnh bạc lá (Xanthomonas Oryzae):

- Tỷ lệ hạt chắc(TLHC): Từ số hạt chắc và tổng số hạt ta suy ra tỷ lệ hạt

Quan sát diện tích vết bệnh trên lá từ giai đoạn làm đòng – vào chắc.
+ Điểm 0: Không bị hại

chắc theo công thức sau:

TLHC (%) =

+ Điểm 1: 1 - 5% diện tích vết bệnh/lá

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Theo dõi và đánh giá theo phƣơng pháp của IRRI:

44

Sè h¹t ch¾c/b«ng
x 100
Tæng sè h¹t/b«ng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

45




c. Khối lượng nghìn hạt (P1000 hạt):

CHƢƠNG III

Cân thóc khô ở ẩm độ 13 - 14%. Đếm 3 lần, mỗi lần 500 hạt rồi cân

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

đƣợc khối lƣợng lần lƣợt là P1, P2, P3 (bảo đảm sự sai khác giữa các lần nhắc
lại nhỏ hơn 3% so với giá trị trung bình).

3.1. Kết quả nghiên cứu trong phòng thí nghiệm

P1 + P2 + P3
P1000 h¹t (g) =
x2
3

3.1.1. Ảnh hƣởng của thời gian xử lý lạnh đến khả năng tạo mô sẹo
(callus) của mẫu cấy

d. Năng suất thực thu (NSTT): Đƣợc tính nhƣ sau:
Gặt toàn bộ ô thí nghiệm, tuốt hạt phơi khô tới độ ẩm 14% thì quạt sạch
và cân khối lƣợng rồi quy ra tạ/ha. Làm tròn 2 chữ số ở sau dấu phẩy.
2.3. Xử lý số liệu:
+ Sử dụng phƣơng pháp tính toán trên phần mềm Excel
+ Xử lý số liệu trên phần mềm IRRISTAT

Xử lý bao phấn lúa ở nhiệt độ thấp trong khoảng thời gian phù hợp sẽ
có tác dụng nâng cao tỷ lệ hình thành mô sẹo của bao phấn lúa trong môi
trƣờng nuôi cấy. Các thí nghiệm xử lý bao phấn ở nhiệt độ thấp 8 – 100C đã
đƣợc bố trí trong các khoảng thời gian khác nhau và đánh giá kết quả nghiên
cứu theo từng tổ hợp lai riêng biệt. Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng : Trong
các khoảng thời gian khác nhau, tỷ lệ hình thành mô sẹo của bao phấn có khác
nhau. Sự sai khác có ý nghĩa ở mức tin cậy 95%. Kết quả đƣợc tổng hợp ở
bảng 3.1:
Bảng 3.1: Ảnh hƣởng của thời gian xử lý lạnh đến khả năng tạo mô sẹo
của các tổ hợp nghiên cứu (Sau 30 ngày)

Tổ hợp

Công thức

nghiên cứu

thí nghiệm
CT1

CT2
CT3

KimA/R278

CT4
CT5
CT6

Thời gian

Tỷ lệ mẫu

Tỷ lệ

xử lý

tạo mô sẹo

mẫu chết

(ngày)

(%)

(%)

0

46

1

91,0

9,0

3

d

90,0

c

87,0

21,0

a

79,0

16,0

b

84,0

10,0

5

13,0

7
10

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

95,0

d

5,0

CV%

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

e

6,8

47