NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VI KHUẨN NỘI SINH ĐỂ PHÒNG TRỪ BỆNH ĐỐM LÁ, KHÔ CÀNH NGỌN KEO LAI (Acacia auriculiformis x Acacia mangium) DO NẤM Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc.
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.61 MB, 43 trang )
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
---------- ----------
---------- ----------
VŨ VĂN ĐỊNH
VŨ VĂN ĐỊNH
NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VI KHUẨN NỘI SINH ĐỂ PHÒNG TRỪ
NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VI KHUẨN NỘI SINH ĐỂ PHÒNG TRỪ BỆNH
BỆNH ĐỐM LÁ, KHÔ CÀNH NGỌN KEO LAI (Acacia auriculiformis x Acacia
ĐỐM LÁ, KHÔ CÀNH NGỌN KEO LAI (Acacia auriculiformis x
mangium) DO NẤM Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc. G ÂY HẠI TẠI
Acacia mangium) DO NẤM COLLETOTRICHUM GLOEOSPORIOIDES
LÂM TRƢỜNG TAM THẮNG, HUYỆN THANH SƠN TỈNH PHÚ THỌ
(PENZ.) SACC. G ÂY HẠI TẠI LÂM TRƢỜNG TAM THẮNG , HUYỆN
THANH SƠN TỈNH PHÚ THỌ
Chuyên ngành: Lâm học
Mã số: 60. 62. 60
LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC LÂM NGHIỆP
LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC LÂM NGHIỆP
NGƢỜI HƢỚNG DẪN: PGS. TS. PHẠM QUANG THU
Thái Nguyên, 2008
Thái Nguyên, 2008
MỤC LỤC
3.3. Nội dung nghiên cứu………………………………………………………15
Lời cảm ơn
3.3.1. Xác định nấm gây bệnh đốm lá, khô cành ngọn keo lai và đánh giá ảnh
Mục lục
hưởng của bệnh đối với keo lai tại khu vực nghiên cứu.....................................15
Danh mục các bảng ...................................................................................i
3.3.2. Phân lập các chủng vi khuẩn nội sinh ở cây keo lai theo các cấp bệnh....15
Danh mục các hình ...................................................................................ii
3.3.3. Thử hiệu lực khả năng kháng nấm bệnh của các chủng vi khuẩn phân lập
Kí hiệu, chữ viết tắt .................................................................................iii
được. ............................................................................................................. ......15
Đặt vấn đề .................................................................................................1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU ..................................3
1.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới...............................................................3
1.2. Tình hình nghiên cứu ở trong nước………………………………………..6
Chƣơng 2. ĐIỀU KIỆN TỰ NHIÊN - KINH TẾ - XÃ HỘI KHU VỰC
NGHIÊN CỨU………………………………………………………………..10
2.1. Điều kiện tự nhiên khu vực nghiên cứu…………………………………...10
2.2. Địa hình, thổ nhưỡng....................................................................................10
2.3. Khí hậu thuỷ văn..........................................................................................10
2.4. Điều kiện kinh tế - xã hội.............................................................................11
2.4.1. Điều kiện kinh tế.......................................................................................11
2.4.2. Điều kiện xã hội........................................................................................13
Chƣơng 3. MỤC TIÊU - ĐỐI TƢỢNG - THỜI GIAN - ĐỊA ĐIỂM - NỘI
DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................................................14
3.3.4. Đánh giá mối quan hệ giữa vi khuẩn nội sinh với cây chủ ở các cấp bị
bệnh khác nhau để tìm hiểu về cơ chế.................................................................15
3.3.5. Ứng dụng vi khuẩn nội sinh trong phòng chống bệnh đốm lá, khô cành
ngọn keo lai.........................................................................................................15
3.4. Phương pháp nghiên cứu.............................................................................16
3.4.1. Xác định nấm gây bệnh đốm lá, khô cành ngọn keo lai và đánh giá ảnh
hưởng của bệnh đối với keo lai tại khu vực nghiên cứu.....................................16
3.4.2. Phân lập các chủng vi khuẩn nội sinh ở cây keo lai theo các cấp
bệnh…………………………………………………………………………….23
3.4.3. Thử hiệu lực khả năng kháng nấm bệnh của các chủng vi khuẩn phân lập
được............................................................................................................... ...25
3.4.4. Đánh giá mối quan hệ giữa vi khuẩn nội sinh với cây chủ ở các cấp bị
bệnh khác nhau để tìm hiểu về cơ chế.................................................................26
3.3.5. Ứng dụng vi khuẩn nội sinh trong phòng chống bệnh đốm lá, khô cành
ngọn keo lai.........................................................................................................27
3.1. Mục tiêu nghiên cứu………………………………………………………14
3.2. Địa điểm nghiên cứu………………………………………………………14
3.2.2. Thời gian nghiên cứu……………………………………………………14
3.2.3. Đối tượng nghiên cứu……………………………………………………14
Chương 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU...............................................................31
4.1. Xác định nấm gây bệnh khô cành ngọn keo lai và đánh giá ảnh hưởng của
bệnh đối với keo lai tại khu vực nghiên cứu.......................................................31
4.1.1. Triệu chứng bệnh đốm lá, khô cành ngọn keo lai.....................................31
4.1.2. Kết quả phân lập nấm bệnh……………………………………………...32
4.5.4. Ảnh hưởng của vi khuẩn nội sinh đến cây keo lai ở giai đoạn rừng non (1
4.1.3. Kết quả thí nghiệm gây bệnh nhân tạo…………………………………..33
tuổi).......................................................................................................... ...........56
4.1.4. Giám định nguyên nhân gây bệnh.............................................................34
Chương 5. KẾT LUẬN - TỒN TẠI VÀ KIẾN NGHỊ………………………60
4.1.5. Sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Colletotrichum gloeosporioides trên môi
5.1. Kết luận……………………………………………………………………60
trường dinh dưỡng PDA......................................................................................36
5.2. Tồn tại và kiến nghị………………………………………………………..62
4.1.6. Đánh giá ảnh hưởng của bệnh đối với keo lai tại khu vực nghiên
TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................................63
cứu.......................................................................................................................36
4.2. Phân lập các chủng vi khuẩn nội sinh ở cây keo lai theo các cấp
hại………………………………………………………………………………38
4.3. Thử hiệu lực khả năng kháng nấm bệnh của các chủng vi khuẩn phân lập
được…………………………………………………………………………….40
4.3.1. Xác định cơ chế kháng bệnh thông qua chủng loại và mật độ vi khuẩn nội
sinh…………………………………………………………………………......40
4.3.2. Mật độ tế bào của các chủng vi khuẩn có hiệu lực cao………………….42
4.3.3. Một số đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn có hiệu lực
cao…………………………………………………………………………........42
4.4. Đánh giá mối quan hệ giữa vi khuẩn nội sinh với cây chủ ở các cấp bị bệnh
khác nhau để tìm hiểu về cơ chế ………………………………………………47
4.5. Ứng dụng vi khuẩn nội sinh trong phòng chống bệnh đốm lá, khô cành ngọn
keo lai…………………………………………………………………………..48
4.5.1. Nhân sinh khối sản xuất chế phẩm ………………………………….......48
4.5.2. Hiệu lực kháng nấm bệnh của khuẩn nội sinh trong phòng thí
nghiệm………………………………………………………………………….49
4.5.3. Thử nghiệm hiệu lực của vi khuẩn nội sinh trong giai đoạn vườn
ươm……………………………………………………………………………..52
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
Bảng
Tên bảng
Trang
4.01
Kết quả gây bệnh nhân tạo keo lai
33
4.02
Sinh trưởng của hệ sợi nấm trên môi trường PDA.
36
4.03
4.04
4.05
4.06
4.07
4.08
4.09
Ảnh hưởng của bệnh đối với keo lai ở Lâm trường Tam
Thắng huyện Thanh Sơn, tỉnh Phú Thọ
Số lượng chủng khuẩn ở các mức độ bị bệnh
Khả năng kháng nấm Colletotrichum gloeosporioides của
các chủng khuẩn nội sinh
Kết quả gây bệnh nhân tạo của các chủng khuẩn nội sinh
đối kháng nấm bệnh
Ảnh hưởng của khuẩn nội sinh đến tỷ lệ bị bệnh và mức
độ bị bệnh của keo lai ở giai đoạn vườn ươm
Ảnh hưởng của khuẩn nội sinh đến sinh trưởng của keo
lai trong giai đoạn vườn ươm
Ảnh hưởng của vi khuẩn nội sinh đến keo lai 1 tuổi
37
38
41
49
Hình
Tên hình
Trang
3.01
Cây bị bệnh cấp 0
20
3.02
Cây bị bệnh cấp 1
21
3.03
Cây bị bệnh cấp 2
21
3.04
Cây bị bệnh cấp 3
21
3.05
Cây bị bệnh cấp 4
21
4.01
Thân cành keo lai bị bệnh
31
4.02
Rừng trồng keo lai bị bệnh đốm lá, khô cành ngọn
32
4.03
Thể quả nấm gây bệnh
32
4.04
Sự sinh trưởng của sợi nấm trên môi trường PDA
33
4.05
Thí nghiệm gây bệnh nhân tạo
34
4.06
Bào tử vô tính của nấm gây bệnh
35
4.07
Tỷ lệ các chủng khuẩn phân lập được trên các vị trí khác
49
nhau của cây chủ
4.08(a,b)
Khuẩn và bào tử B01 đối kháng với nấm Colletotrichum
42
gloeosporioides
50
4.09(a,b)
Khuẩn và bào tử B02 đối kháng với nấm Colletotrichum
43
gloeosporioides
54
57
4.10(a,b) Khuẩn và bào tử B03 đối kháng với nấm Colletotrichum
gloeosporioides
4.11(a,b)
Khuẩn và bào tử P01 đối kháng với nấm Colletotrichum
44
45
gloeosporioides
4.12(a,b)
Khuẩn và bào tử X01 đối kháng với nấm Colletotrichum
gloeosporioides
45
4.13(a,b)
Khuẩn và bào tử X02 đối kháng với nấm Colletotrichum
KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
46
gloeosporioides
4.14
Khuẩn và bào tử X1.1 đối kháng với nấm Colletotrichum
gloeosporioides
4.15
Mức độ bị kháng bệnh của các chủng khuẩn
4.16
Khả năng kháng nấm của các chủng khuẩn B01, B02,
51
4.18
4.19
4.20
4.21
Khả năng kháng nấm của các chủng khuẩn P01 và X1.1
Khả năng ứcc chế nấm của các chủng khuẩn X01 và X02
Ảnh hưởng của khuẩn nội sinh đến tỷ lệ bị bệnh và mức
độ bị bệnh của keo lai ở giai đoạn vườn ươm
Ảnh hưởng của khuẩn nội sinh đến đường kính gốc của
keo lai trong giai đoạn vườn ươm
Ảnh hưởng của khuẩn nội sinh đến keo lai ở giai đoạn
4.23
Ảnh hưởng của khuẩn nội sinh đến tỷ lệ bị bệnh và mức
độ bị bệnh của keo lai ở giai đoạn rừng tuổi 1
52
52
54
D1.3
Đường kính ngang ngực
Đường kính cổ rễ
CT1
Công thức 1
CT2
Công thức 2
CT3
Công thức 3
CT4
Công thức 4
CT5
Công thức 5
ĐC
Công thức đối chứng
M
Trọng lượng của cây
B
Bark
P
Phloem
X
Xylem
54
56
58
Ảnh hưởng của thể tích dịch khuẩn B03 khi tiêm vào cây
keo lai trong giai đoạn rừng non 1 tuổi
bị bệnh của keo lai ở giai đoạn rừng tuổi 1 độ
Chiều cao vút ngọn
Dg
vườn ươm
4.22
HVN
51
(a,b,c,d) B03
4.17(a,b)
Chữ đầy đủ
Kí hiệu, chữ viết tắt
47
58
LỜI CẢM ƠN
ĐẶT VẤN ĐỀ
Được sự đồng ý của trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, khoa Sau
Trong dự án trồng mới 5 triệu hecta rừng, có 2 triệu hecta rừng phòng hộ,
Đại học, thầy giáo hướng dẫn Phạm Quang Thu tác giả đã tiến hành thực hiện đề
3 triệu hecta rừng sản xuất (trong đó có gần 2 triệu hecta rừng nguyên liệu). Loài
tài: “Nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn nội sinh để phòng trừ bệnh đốm lá, khô
cây dùng để trồng rừng nguyên liệu là loài cây có giá trị kinh tế, sinh trưởng
cành ngọn keo lai (Acacia auriculiformis x Acacia mangium) do nấm
nhanh, năng xuất cao, chu kỳ kinh doanh ngắn mau cho thu hoạch sản phẩm.
Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc. gây hại tại lâm trƣờng Tam
Những loài cây này cần có khả năng thích ứng cao với hoàn cảnh có thể trồng
Thắng, huyện Thanh Sơn, Phú Thọ”.
trên đất trống đồi núi trọc, dễ gây trồng, sản phẩm phong phú và đa dạng, thích
Để hoàn thành được luận văn tốt nghiệp này, tác giả đã nhận được sự
hướng dẫn tận tình của thầy giáo Phạm Quang Thu và sự giúp đỡ của các cơ
quan, ban ngành và sự góp ý chân tình của các bạn bè đồng nghiệp.
Nhân dịp này, tác giả xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS. TS. Phạm
Quang Thu thầy giáo trực tiếp hướng dẫn khoa học cùng toàn thể các cán bộ,
công nhân viên của Viện nghiên cứu khoa học Lâm Nghiệp Việt Nam, các thầy,
cô giáo trong khoa Sau đại học, khoa Lâm nghiệp trường Đại học Nông Lâm
Thái Nguyên, Ban giám hiệu trường Trung cấp Kinh tế - Kỹ thuật tỉnh Lào Cai
nơi tôi công tác.
hợp với quy trình công nghệ chế biến và thị trường tiêu thụ. Mặt khác cũng cần
phải đề cập đến khía cạnh vừa phải đáp ứng về mặt kinh tế nhưng vẫn đảm bảo
tác dụng phòng hộ, cải tạo cảnh quan môi trường và có khả năng chống chịu
được các loài sâu bệnh hại [1].
Các loài keo sinh trưởng nhanh, chu kỳ kinh doanh ngắn có thể dùng làm
gỗ củi, làm giấy, làm đồ xây dựng, đồ gỗ và đồ mỹ nghệ. Điều đó chứng tỏ gỗ
keo đang được dùng rộng rãi và được người dân chấp nhận khi gỗ của một số
loài như Đinh, Lim, Lát … ngày càng hiếm và đắt [3]. Ngoài ra keo là loài cây
có khả năng tổng hợp nitơ tự do trong khi quyển rất cao (Dart, và C.S, 1991), có
khả năng thích ứng với điều kiện khí hậu đất đai ở nước ta từ vùng cát ven biển
Tác giả xin chân thành cảm ơn các cán bộ phòng nghiên cứu bảo vệ rừng
Viện Khoa học Lâm Nghiệp Việt Nam, các bạn sinh viên trường Đại học Lâm
tương đối khô hạn đến vùng núi thấp dưới 400m, đây là loài cây cải tạo đất, tăng
độ phì, độ xốp và các tính chất lý, hóa khác của đất.
Nghiệp, Xuân Mai, Hà Nội và các cán bộ, công nhân viên lâm trường Tam
Do nhu cầu sử dụng vào các mục đích khác nhau của gỗ keo như làm bột
Thắng (huyện Thanh Sơn - Phú Thọ), các bạn bè đồng nghiệp và những người
giấy, dăm xuất khẩu, gỗ xây dựng, gỗ củi và cả chế biến đồ mộc xuất khẩu mà
thân trong gia đình đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tác giả hoàn thành
nhiều năm nay, một số loài keo Acacia đã được gây trồng rộng rãi trên khắp cả
luận văn.
nước ở quy mô rừng trồng tập trung và trồng cây phân tán. Theo thống kê đến
tháng 12 năm 2005, diện tích rừng trồng cả nước ta là 2.333.000 ha, trong đó
Thái Nguyên, ngày 10 tháng10 năm 2008
diện tích rừng trồng các loài keo chiếm tỷ lệ lớn nhất [2]
Trước sự gia tăng nhanh về mặt diện tích, các rừng trồng keo đã xuất hiện
nhiều bệnh gây khó khăn không nhỏ cho một số địa phương trong cả nước. Tại
Vũ Văn Định
Bầu Bàng, Bình Dương một số dòng keo lai đã bị mắc bệnh phấn hồng (pink
disease) với tỷ lệ và mức độ bị bệnh khá cao, gây nhiều thiệt hại cho sản xuất.
1
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Tại Đạ Tẻh, tỉnh Lâm Đồng, Keo tai tượng trồng thuần loài với tổng diện tích
Chương 1
hơn 400 ha đã có 118,5 ha bị bệnh với tỷ lệ từ 7 đến 59 % trong đó có một số
TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU
diện tích bị hại rất nặng. Tại Kon Tum, năm 2001 có khoảng 1000 ha rừng keo
lai 2 tuổi bị nhiễm bệnh loét thân, thối vỏ và dẫn đến khô ngọn, với tỷ lệ bị bệnh
khác nhau ở các địa phương. Tỷ lệ bị bệnh nặng nhất ở Ngọc Tụ, Ngọc Hồi, Kon
Tum lên đến 90% cây bị chết ngọn. Trong đó, nấm Colletotrichum
gloeosporioides (Penz.) Sacc là một loài nấm gây bệnh khá phổ biến ở các vùng
trồng keo lai của cả nước, với triệu chứng đốm lá, khô cành ngọn đã ảnh hưởng
rất lớn đến sinh trưởng và năng suất của rừng trồng [18], [21].
Áp dụng biện pháp hóa học để phòng trừ bệnh cho rừng trồng là không
khả thi khi diện tích rừng trồng lớn và gây ảnh hưởng đến môi trường sinh thái.
Nghiên cứu giảm thiểu ảnh hưởng của bệnh bằng biện pháp chọn giống và sinh
học đã được các nhà khoa học quan tâm.
Vi khuẩn nội sinh là vi khuẩn tiền nhân, sống trong mô của thực vật mà
không gây bệnh cho cây chủ (Willson 1995) Một số vi sinh vật nội sinh có hoạt
tính sinh học tạo ra các chất kháng sinh đối kháng với các sinh vật gây bệnh cho
cây chủ cũng đã được nghiên cứu (Phạm Quang Thu và Trần Thanh Trăng năm
2002) [20]. Để góp phần quản lý dịch bệnh hại keo Acacia có hiệu quả, trong
khuôn khổ của một luận văn tốt nghiệp tôi đã tiến hành nghiên cứu, điều tra về
chủng loại và mật độ của các vi khuẩn nội sinh có hoạt tính đối kháng với nấm
gây bệnh trên các cây chủ ở các cấp bệnh hại khác nhau từ đó làm sáng tỏ vai trò
của vi khuẩn nội sinh trong việc bảo vệ cây chủ từ sự xâm nhiễm của sinh vật gây
bệnh và ứng dụng chúng trong phòng trừ bệnh đốm lá, khô cành ngọn keo lai do
nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc. gây hại. Trên cơ sở đó tôi đã
1.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Bệnh cây rừng đã được bắt đầu nghiên cứu trên 150 năm nay, là một môn
khoa học có nhiều cống hiến cho công tác nghiên cứu, phục vụ cho đời sống sản
xuất thực tiễn.
Những năm ở thập kỷ 50 của thế kỷ XX, nhiều nhà bệnh cây đã tập trung
vào việc xác định loài, mô tả nguyên nhân gây bệnh và điều kiện phát sinh, phát
triển của bệnh. Đặc biệt ở các nước nhiệt đới, Roger L. (1953) [36] đã nghiên
cứu các loại bệnh hại cây rừng được mô tả trong cuốn sách bệnh cây rừng các
nước nhiệt đới (Phytopathologie des pays chauds). Trong đó có một số bệnh hại
lá của thông, keo, bạch đàn ….
John Boyce (1961) [30] xuất bản sách Bệnh cây rừng (Forest pathology) đã
mô tả một số bệnh hại cây rừng. Cuốn sách này được xuất bản ở nhiều nước
như: Anh, Mỹ, Canada.
1.1.1. Nghiên cứu về bệnh hại keo
Roger L. (1954) [36] đã nghiên cứu một số bệnh hại trên cây keo. Cây
keo khô héo làm lá rụng và tàn lụi từ trên xuống dưới (chết ngược) do loài nấm
hại lá Glomerella cingulata (giai đoạn vô tính là Collectotrichum
gloeosporioides) đó là nguyên nhân chủ yếu của sự thiệt hại với loài Keo tai
tượng Acacia mangium trong vườn giống ở Papua New Guinea (FAO, 1981).
Tại Malaysia, theo nghiên cứu của Lee (1993) [33] loài nấm này còn gây hại
tiến hành thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn nội sinh để phòng trừ bệnh đốm lá,
với các loài keo khác.
khô cành ngọn keo lai (Acacia auriculiformis x Acacia mangium) do nấm
Nhiều nhà nghiên cứu của Ấn Độ, Malaysia, Philipin, Trung Quốc cũng
Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc. gây hại tại Lâm trƣờng Tam
công bố nhiều loại nấm bệnh hại keo. Roger L. (1953) [36] Tại hội nghị lần thứ
Thắng, huyện Thanh Sơn, Phú Thọ”
III nhóm tư vấn nghiên cứu và phát triển của các loài Acacia, họp tại Đài Loan
2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
3
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
cuối tháng 6 năm 1964 nhiều đại biểu kể cả các tổ chức Quốc tế như CIFOR
cũng như đã đề cập đến các vấn đề sâu bệnh hại các loài keo Acacia.
Các nghiên cứu về các loại bệnh ở keo Acacia cũng đã được tập hợp khá
Chanway (1996) [31] tiến hành phân lập và định danh các loài vi khuẩn
sống ở trong mô của thực vật của 2 loài thông: thông (Pinus radiata) và thông
đỏ (Thuija plicata).
đầy đủ vào cuốn sách “Cẩm nang bệnh keo nhiệt đới ở Ôxtrâylia, Đông Nam Á
L. Araujo và cộng sự (2002) đã tiến hành biện pháp phòng trừ sinh học
và Ấn Độ” bản tiếng Anh có tên là A Manual of Diseases of Tropical Acacias
bằng việc sử dụng sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn Bacillus sp., được phân
in Australia, South-east Asia and India (Old, K.M. et al, 2000) [35]. Cuốn sách
lập từ mô thực vật. Ông và cộng sự đã đi sâu vào nghiên cứu các loài vi khuẩn
đã đề cập đến các bệnh khá quen thuộc đã từng gặp ở nước ta như bệnh phấn
sống trong mô của thực vật để tìm ra các chất kháng sinh có khả năng kiềm chế
trắng (powdery mildew), bệnh đốm lá, bệnh phấn hồng (pink disease) và rỗng
các nguồn gây bệnh ở cây trồng bằng phương pháp sinh học nhằm làm giảm bớt
ruột (heart rot).
tác động đến môi trường, bởi hiện nay con người đang sử dụng rất nhiều chất
hoá học để phòng trừ bệnh cây và côn trùng gây hại trên các cánh đồng. Với
1.1.2. Nghiên cứu về vi khuẩn nội sinh
phương pháp này nhóm của ông đã phân lập và tuyển chọn một số chủng vi
Đã có rất nhiều nhà khoa học đi sâu nghiên cứu về vi khuẩn và đặc biệt là
vi khuẩn sống nội sinh trong mô của thực vật. Phần lớn các loài vi khuẩn nội
khuẩn nội sinh được lựa chọn trong các giống cam, quýt nghiên cứu để tìm ra
các chất kháng sinh mới có hiệu lực cao trong việc phòng trừ nấm bệnh.
sinh có hoạt tính sinh học, tạo ra chất kháng sinh quan trọng để ngăn chặn sự
Jinwi Kim (2000) [32] tách chất ức chế B-lactamase từ vi khuẩn sống
xâm nhập của sinh vật gây bệnh gây ra đối với cây chủ, trong đó có cây lâm
trong mô thực vật. Tác giả đã phân lập và tuyển chọn vi khuẩn sống trong mô
nghiệp và nông nghiệp. Vì vậy, việc nghiên cứu sử dụng các chủng vi khuẩn nội
của 25 loài thực vật khác nhau và phân lập được 600 chủng vi khuẩn. Trong đó
sinh để bảo vệ cây trồng là vấn đề rất quan trọng và đã được nhiều nước trên thế
đã tìm ra được 10 chủng có hiệu lực cao, đó là KJ3, Z3, PQ, RV2, HL2, CL21,
giới quan tâm.
PG5, GB5, GB18, AS3, S21 có khả năng chống lại hoạt động của nấm Candida
Năm 1955 trên thế giới chỉ tìm ra được 500 chất kháng sinh thì 20 năm sau,
albicans, trong đó lựa chọn được 2 chủng vi khuẩn Z3, RV2 có khả năng sinh ra
năm 1975 đã tìm ra được 5.000 chất kháng sinh. Hiện nay nói chung trên thế
chất kháng sinh -lactamase. Chủng vi khuẩn Z3 được lựa chọn để sản xuất với
giới đã biết được hơn 13.000 chất kháng sinh được sản xuất từ thiên nhiên
quy mô lớn. Chủng Z3 được phân lập từ rễ của cây gừng chống lại nấm C.
(Berdy 1984). Sau đây là một số công trình nghiên cứu tiêu biểu về vi khuẩn nội
albicans, nhưng không chống lại được nấm Aspergillus và nấm Fusarium.
sinh có khả năng sản sinh ra chất kháng sinh trong quá trình trao đổi chất được
dùng để phòng trừ bệnh hại cây trồng.
Miss Yuparet Puangmali (1999) [34] đã phân lập và tuyển chọn một số
loài vi khuẩn sống trong mô của cây cỏ có khả năng sản xuất ra chất kháng sinh
Theo Willson (1995) vi khuẩn nội sinh là vi khuẩn tiền nhân sống trong mô
L- sparaginase. Tác giả đã phân lập được 657 loài vi khuẩn từ những cây thân
của thực vật mà không gây bệnh cho cây chủ. Vi khuẩn nội sinh tìm thấy ở
thảo để sản xuất ra L-sparaginase. Trong đó ông tìm ra được 220 loài vi khuẩn
nhiều loài cây và cũng giống như các loài vi khuẩn sống trong đất, nước như:
có hiệu lực mạnh để thử nghiệm. Nhóm vi khuẩn CMU - HB - 63, tạo ra chất
Pseudomonas, Bacillus và Azospirillum.
kháng sinh lớn nhất trong môi trường; CMC 0.6% (w/v), KH2PO4 0.3% (w/v),
4
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
5
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
NaCl 0.05% (w/v), 1M MgSO4.7 H2O 0.2% (w/v), 0.1M CaCl2.2 H2O 0.1% với
o
pH = 7. Sử dụng 0.2% số lượng vi khuẩn để trong tủ lắc ở nhiệt độ 45 C với tốc
đều cảnh báo nguy cơ gây hại lớn của bệnh đối với các rừng trồng tập trung và
đề xuất các định hướng nghiên cứu.
độ 175 vòng/phút trong vòng 48 giờ. Vi khuẩn này hoạt động để sinh ra chất
Dự án mang tên “Giảm thiểu tác động của bệnh bạch đàn ở vùng Đông
kháng sinh L - Asparaginase ở 50.24 mU/ml và hoạt động có hiệu quả ở 202.58
Nam Á” ACIAR PN 9441 do Trung tâm Nghiên cứu Nông nghiệp Quốc tế của
mU/ml. Đã ứng dụng bằng cách tiêm chủng vi khuẩn vào cây để cây xúc tiến
Ôxtrâylia (ACIAR) tài trợ đã bắt đầu được triển khai tại Việt Nam, Thái Lan và
sinh trưởng và kiểm soát bệnh. Các thí nghiệm của ông với 2 cây là cà chua và
Ôxtrâylia. Dự án được Viện Khoa học Lâm nghiệp triển khai tại Việt Nam. Cho
cây dưa chuột đã đem lại hiệu quả ức chế một số loại mầm bệnh và giảm mức độ
tới khi kết thúc dự án vào cuối năm 2000, dự án đã đặt nền móng cho định
bị bệnh. Mầm bệnh ông sử dụng trong nghiên cứu bao gồm: Pythium ultimum,
hướng nghiên cứu về bệnh và mở đầu các nghiên cứu về chọn giống bạch đàn
Rhizoctonia, Fusarium oxysporum, Pseuodomonas syringe, Colletotrichum
kháng bệnh ở nước ta. Bước đầu dự án đã tìm hiểu được các loài nấm hại, điều
orbiculore, Erwinia teracheiphila và thể khảm do virus ở cây dưa chuột.
tra đánh giá mức độ nhiễm bệnh và ảnh hưởng của loài, xuất xứ cũng như các
Nhận xét:
gia đình đối với nấm hại. Tuy nhiên việc xác định, tuyển chọn được các loài,
Việc sử dụng vi sinh vật để phòng trừ bệnh cây ở trên thế giới đã nghiên
xuất xứ kháng bệnh mới chỉ là bước đi đầu tiên trong khi tuyển chọn các gia
cứu và áp dụng trong sản xuất đạt hiệu quả cao. Đã có rất nhiều nhà khoa học đi
đình và các dòng kháng bệnh mới là mục tiêu lâu dài cần được đầu tư. Các kết
sâu nghiên cứu về vi khuẩn và đặc biệt là vi khuẩn sống nội sinh trong mô của
quả bước đầu của dự án đã được thông báo tại Hội thảo dự án bệnh bạch đàn
thực vật. Các nhà khoa học đã tìm thấy một số loài vi khuẩn nội sinh có hoạt
được tổ chức vào tháng 11 năm 2000 tại TP Hồ Chí Minh (Nguyễn Hoàng
tính sinh học cao, tạo ra chất kháng sinh quan trọng để ngăn chặn sự xâm nhập
Nghĩa (2000); Phạm Quang Thu (2000).
của sinh vật gây bệnh gây ra đối với cây chủ, trong đó có cây lâm nghiệp, nông
Cho tới giữa những năm 1980, Keo lá tràm là loài keo được trồng rộng rãi
nghiệp và cây ăn quả. Bằng phương pháp sinh học này đã làm giảm bớt tác động
nhất ở các tỉnh phía Nam. Hiện nay trong Vườn thực vật của Trung tâm Khoa
xấu đến môi trường, bởi hiện nay con người đang sử dụng rất nhiều chất hoá học
học Sản xuất Lâm nghiệp Đông Nam Bộ nằm trên địa phận thị trấn Trảng Bom,
để phòng trừ bệnh cây và côn trùng gây hại.
huyện Thống Nhất, tỉnh Đồng Nai còn tồn tại hai hàng Keo lá tràm được trồng
1.2. Tình hình nghiên cứu ở trong nƣớc
từ đầu những năm 1960, thuộc loại lớn tuổi nhất của nước ta (Nguyễn Hoàng
1.2.1. Nghiên cứu về bệnh hại cây rừng
Nghĩa, 1992). Cây có chiều cao khoảng trên dưới 20 m và đường kính 40 - 60
Vào cuối những năm 1980 đầu những năm 1990, bệnh dịch cháy lá, chết
cm. Cây to nhất có đường kính đạt tới 80 cm, thậm chí có cây hai thân, mỗi thân
ngọn bạch đàn (die - back) đã xuất hiện trên diện rộng và là mối đe dọa lớn cho
có đường kính 50 cm. Sau này, loài keo này cũng đã trở nên quen thuộc trong
các nhà trồng rừng trên khắp cả nước, đặc biệt là vùng Đông Nam Bộ và miền
các chương trình trồng rừng ở các tỉnh phía Bắc.
Trung (Quảng Nam, Đà Nẵng và Huế).
Từ đầu những năm 1980 trở lại đây, nhiều loài keo đã được nhập về thử
Nguyễn Hoàng Nghĩa (1997) [12] cho thấy diện tích rừng bạch đàn bị
nghiệm ở nước ta như Keo tai tượng (A. mangium), Keo lá liềm (A.
nấm lá tấn công đã lên tới 50% tổng diện tích, với các mức độ hại khác nhau và
crassicarpa), Keo đa thân (A. aulacocarpa), Keo bụi (A. cincinnata), Keo lá sim
6
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
7
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
(A. holosericea) và sau này là keo lai tự nhiên được phát hiện và chủ động lai
Phạm Quang Thu (2002) [19], [20] sử dụng vi sinh vật nội sinh thực vật có
khả năng ức chế sự phát triển của nấm gây bệnh cây rừng đã được nghiên cứu ở
tạo (Sedgley et al., 1992)
Mùa xuân năm 1990, các xuất xứ Keo tai tượng và Keo lá tràm gieo tại
Việt Nam từ năm 2002, tác giả đã đi sâu vào nghiên cứu khả năng tương tác của
vườn ươm Chèm, Từ Liêm, Hà Nội đã bị bệnh phấn trắng lá với các mức độ khác
các vi sinh vật có khả năng ức chế sinh vật gây bệnh với các loài sinh vật đặc
nhau. Nhìn bề ngoài, lá keo như bị rắc một lớp phấn trắng hay vôi bột. Mức độ
thù khác nhau như vi sinh vật phân giải lân, vi sinh vật kích thích sinh trưởng, vi
bệnh đã được đánh giá qua quan sát bằng mắt thường và được xếp theo thứ tự
sinh vật cố định đạm hội sinh và cộng sinh, vi sinh vật đối kháng với nấm gây
nặng hay nhẹ. Nhìn chung bệnh đã chưa gây nên ảnh hưởng lớn tới sinh trưởng
bệnh...để tạo ra chế phẩm hỗn hợp được gọi là “phân vi sinh chức năng”. Phân
của cây con tại vườm ươm và khi đó cũng không có điều kiện để tìm hiểu sâu hơn
vi sinh chức năng này đã được nghiên cứu và sản xuất thử cho từng đối tượng
về nguồn gốc bệnh và các vấn đề có liên quan (Nguyễn Hoàng Nghĩa, 1997) [12].
cây trồng như: cây Bông, cây Đậu, cây Cà chua, cây Điều và một số cây khác
Một vài năm gần đây khi diện tích gây trồng keo đã tăng lên đáng kể (gần
như cây keo, cây Thông nhựa, Thông mã vĩ.
230.000 ha vào cuối năm 1999) thì cũng đã xuất hiện bệnh ở rừng trồng. Tại Đạ
Phạm Quang Thu, Trần Thanh Trăng (2002) [20] đã phân lập và tuyển chọn
Tẻh (Lâm Đồng) Keo tai tượng trồng thuần loài trên diện tích 400 ha đã có
vi khuẩn đối kháng với nấm gây bệnh cây thông con ở vườn ươm, với 12 loài
118,5 ha bị bệnh với tỷ lệ từ 7 - 59% trong đó có một số diện tích bị khá nặng
cây dùng làm mẫu để phân lập vi khuẩn đã phân lập được 70 chủng vi khuẩn
(Phạm Quang Thu, 2002) [21]. Tại Bầu Bàng, Bình Dương một số dòng keo lai
khác nhau và đã tuyển chọn được 11 chủng vi khuẩn có hiệu lực đối kháng với
đã bị mắc bệnh phấn hồng (Pink Disease) với tỷ lệ mắc và mức độ bệnh khá cao
nấm gây bệnh thối cổ rễ Fusarium oxysporum.
gây thiệt hại cho sản xuất. Tại Kon Tum năm 2001 có khoảng 1000 ha rừng keo
Nguyễn Hoàng Nghĩa, Phạm Quang Thu, 2006 [13] Vai trò của vi khuẩn
lai 2 tuổi bị nhiễm bệnh loét thân, thối vỏ và dẫn đến khô ngọn. Tỷ lệ nặng nhất
nội sinh trong cơ chế kháng bệnh loét thân, cành do nấm Colletotrichum
là ở Ngọc Tụ, Ngọc Hồi (Kon Tum) lên đến 90% số cây bị chết ngọn [18]
gloeosporioides (Penz.) Sacc. gây bệnh hại đối với keo lai.
1.2.2. Nghiên cứu biện pháp phòng trừ bằng sinh học
Nhận xét:
Biện pháp phòng trừ các loại nấm bệnh bằng các chế phẩm sinh học có
Việc sử dụng vi sinh vật để phòng trừ bệnh cây trồng ở Việt Nam cũng đã được
nguồn gốc từ nấm và vi khuẩn đã được rất nhiều nhà khoa học trong nước
nghiên cứu và áp dụng trong sản xuất trong hệ thống các biện pháp phòng trừ
nghiên cứu và áp dụng. Nguyễn Lân Dũng, Phạm Văn Ty và Lê Mai Hương
tổng hợp. Việc phân lập, tuyển chọn chủng có hiệu lực cao và sử dụng chúng
(1998) [5] đã sử dụng xạ khuẩn để phòng chống bệnh thối cổ rễ cây thông con ở
trong phòng trừ bệnh cây rừng đã được nghiên cứu và áp dụng vào sản xuất.
vườn ươm do nấm Fusarium oxysporum gây ra. Phạm Văn Mạch (1991) [8]
Nghiên cứu này đi sâu vào việc phân lập và xác định vi khuẩn nội sinh cây keo
trong công trình nghiên cứu của mình đã sử dụng các chủng Tricoderma spp., xạ
lai trồng tại Phú Thọ và thí nghiệm sử dụng vi khuẩn nội sinh trong phòng trừ
khuẩn Streptomyces spp. để phòng chống bệnh thối cổ rễ cây thông con vườn
bệnh đốm lá, khô cành ngọn do nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.)
ươm. Tuy nhiên những nghiên cứu này mới dừng lại ở những thí nghiệm các
Sacc. gây hại.
chủng nấm và xạ khuẩn đều được phân lập từ đất.
8
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
9
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Bảng 2.1: Tài liệu khí tượng thuỷ văn khu vực nghiên cứu
Chương 2
ĐIỀU KIỆN TỰ NHIÊN - KINH TẾ - XÃ HỘI
KHU VỰC NGHIÊN CỨU
2.1. Điều kiện tự nhiên khu vực nghiên cứu
Các tháng
trong năm
Nhiệt độ (oC) Độ ẩm (%)
Lượng mưa (mm) Gió (m/s)
1
15,3
85,3
20,9
6,7
2
18,9
88,0
35,1
7,0
nông nghiệp còn lại là đất lâm nghiệp và rừng phòng hộ.
3
19,4
87,0
42,4
6,7
2.2. Địa hình, thổ nhƣỡng
4
24,1
86,7
139,2
8,3
5
26,8
85,3
243,4
8,3
- Nhóm đất phát triển tại chỗ: Các loại đất feralit phát triển trên một số
6
27,6
88,0
242,5
8,0
loại đá mẹ như đá biến chất, sa thạch, granit, đá vôi phù hợp cho trồng cây lâm
7
28,2
88,3
350,7
8,0
8
28,3
89,7
368,9
8,0
9
27,0
88,7
93,0
7,0
10
21,8
87,3
28,1
6,3
khu vực Thanh Sơn, Phú Thọ thuộc tiểu vùng khí hậu 3 của miền Bắc Việt Nam,
11
22,8
88,0
43,1
6,3
có 2 mùa rõ rệt.
12
18,4
85,7
17,8
6.7
TB
23,44
87,42
135,81
7,28
- Thanh Sơn diện đất tích tự nhiên 62063 ha chiếm tới 37,8% diện tích
của toàn tỉnh, trong đó có 31000 ha đất rừng tự nhiên, gần 6000 ha đất trồng trọt
- Là huyện miền núi có địa hình phức tạp bị chia cắt bởi nhiều sông suối
và những dẫy núi cao.
nghiệp, nông nghiệp.
2.3. Khí hậu thuỷ văn
Khí hậu:
Theo số liệu của trạm khí tượng thuỷ văn tỉnh Phú Thọ từ năm (19952006) bình quân về nhiệt độ, độ ẩm, lượng mưa trong năm (Bảng 2.1) cho biết
(Nguồn phòng nông nghiệp huyện Thanh Sơn năm 2006)
2.4. Điều kiện kinh tế - xã hội
2.4.1. Điều kiện kinh tế
Ngay từ Đại hội Đảng bộ huyện lần thứ 22 đã xác định cơ cấu
kinh tế của Thanh Sơn là Lâm - Nông nghiệp và thương mại, dịch vụ. Đại hội
Đảng bộ huyện lần thứ 23 tiếp tục khẳng định: Phát huy nội lực, lợi thế, tiềm
năng, đẩy nhanh phát triển KT-XH với nhịp độ cao và vững chắc; chuyển dịch
10
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
11
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
cơ cấu kinh tế, cơ cấu lao động theo hướng công nghiệp hóa, hiện đại hóa; Phát
chỉ đạo tích cực với từng xã để chuyển sang trồng rừng kinh tế với các cây bản
triển nông lâm nghiệp toàn diện, tạo vùng kinh tế tập trung, đưa chăn nuôi trở
địa có lợi ích kinh tế lâu dài như trám, chò, lát trên những diện tích có thể.
thành ngành sản xuất chính, coi trọng phát triển công nghiệp, tiểu thủ công
Cây chè - cây công nghiệp dài ngày được xác định là cây xóa đói giảm nghèo và
nghiệp; tạo bước phát triển vượt bậc về dịch vụ, du lịch, xây dựng kết cấu hạ tầng.
làm giầu cho người nông dân được chỉ đạo phát triển cả về diện tích và chất
Bám sát định hướng đúng đắn đó, bằng những nỗ lực trong chỉ đạo thực hiện các
lượng. Diện tích chè hiện có trên 1.400 ha, trong đó gần 1/3 của công ty chè Phú
chương trình kinh tế, kết thúc năm 2007, Huyện Thanh Sơn đã đạt giá trị sản xuất
Đa cho năng suất, chất lượng cao. Người nông dân đã và sẽ tiếp tục được hỗ trợ
gần 550 tỷ đồng. Nông lâm thủy sản chiếm 40%; công nghiệp - xây dựng chiếm
bằng nguồn tiền dự án để trồng cây chè lai cho năng suất, chất lượng tốt hơn
39,5%; dịch vụ chiếm 20,5% trong cơ cấu kinh tế. Đáng chú ý là có cấu kinh tế đã
thay cho giống chè cũ năm 2008, bằng các nguồn.
có bước chuyển hết sức tích cực. So với năm 2006, giá trị sản xuất nông lâm
Thanh Sơn có trên 62000 ha đất tự nhiên thì phần nhiều là diện tích rừng
nghiệp, thủy sản tăng 2,7%; công nghiệp - xây dựng tăng 13,1%. Đặc biệt, dịch
phòng hộ cần giữ bảo vệ. Chính trên diện tích này lại có thế mạnh phát triển
vụ thương mại tăng tới 16%. Tỷ lệ hộ nghèo còn 37,87%, giảm 5,76%/năm.
chăn nuôi đại gia súc. Huyện ủy đã ra nghị quyết chuyên đề về thực hiện đề án
Sản xuất nông - lâm nghiệp
phát triển chăn nuôi đại gia súc, trong đó tăng số lượng và chất lượng đàn bò,
Huyện Thanh Sơn có rất ít diện tích canh tác nông nghiệp lại phân tán, rất
giữ ổn định đồng thời cải tạo đàn trâu. Việc phát triển đàn gia súc được huyện
khó cho tưới tiêu. Toàn huyện có trên 148 công trình thủy lợi với trên hai trăm
chỉ đạo thực hiện bằng cách khoanh vùng chăn nuôi, trâu, bò và dê. Riêng đàn
km kênh mương, song hàng năm luôn bị thiên tai đe dọa. Khâu thủy lợi chưa thể
bò sẽ có những giải pháp tích cực để cải tạo nâng cao chất lượng theo hướng
chủ động tưới tiêu trên toàn bộ diện tích. Hàng năm huyện tập trung chỉ đạo
sinh hóa. Mục tiêu tới năm 2010, toàn huyện sẽ có khoảng 8-10 vạn trâu.
nông dân cố gắng làm mùa hết diện tích và mở rộng trồng ngô vụ đông. Tuy
2.4.2. Điều kiện xã hội
nhiên, do thiên tai nên sản lượng lương thực không ổn định. Như vậy vấn đề an
ninh lương thực, đảm bảo đời sống người dân không thể trông chờ hoàn toàn
vào nông nghiệp mà phải cả từ việc khai thác nguồn lực dồi dào từ đất rừng,
trồng cây đặc dụng phòng hộ kết hợp cây kinh tế, cây công nghiệp dài ngày và
chăn nuôi. Những năm qua, lợi ích từ nghề rừng đối với Thanh Sơn đã quá rõ
ràng. Đất rừng đã được giao cho các hộ công nhân, nông dân, bởi vậy cho dù là
Thanh Sơn là huyện miền núi có rất nhiều khó khăn hiện có 10 dân tộc anh
em cùng sinh sống, trong đó có tới gần 60% số khẩu là dân tộc ít người. Tư
tưởng trông chờ ỉ lại vào Nhà nước còn nặng nề; hạn chế về trình độ, năng lực
của đội ngũ cán bộ khiến cho việc tiếp thu, ứng dụng các tiến bộ kỹ thuật chăn
nuôi, trồng trọt ở cơ sở chưa được phát huy tối đa.
khu vực do các Nông lâm trường, các xã, bản, động vùng sâu vùng xa, đất và
Bên cạnh những khó khăn, Thanh Sơn cũng có những lợi thế nhất định.
rừng đều đã có chủ - đương nhiên chủ rừng được hưởng lợi từ kinh tế rừng. Tuy
Huyện có các tuyến quốc lộ đi qua, nối liền Thủ đô Hà Nội với các tỉnh phía Tây
nhiên làm gì để khai thác tốt nhất hiệu quả tài nguyên đất thì cần phải có những
Bắc tạo lợi thế hơn hẳn nhiều địa phương trong tỉnh về phát triển kinh tế hàng
giải pháp tích cực phù hợp. Trước hết, huyện chỉ đạo chuyển mục đích sử dụng
hóa. Thanh Sơn cũng là địa phương tập trung nhiều mỏ khoáng sản đã được cấp
đất theo hướng xác định các diện tích rừng phòng hộ ít xung yếu, không xung
phép khai thác.
yếu chuyển sang trồng rừng kinh tế. Qua kết quả điều tra khảo sát, huyện có sự
12
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
13
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Chương 3
3.3. Nội dung nghiên cứu
MỤC TIÊU - ĐỐI TƢỢNG - THỜI GIAN - ĐỊA ĐIỂM - NỘI
DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Mục tiêu nghiên cứu
3.3.1. Xác định nấm gây bệnh đốm lá, khô cành ngọn keo lai và đánh giá
ảnh hƣởng của bệnh đối với keo lai tại khu vực nghiên cứu
- Thu thập mẫu bệnh và mô tả triệu chứng bệnh đốm lá, khô cành ngọn keo lai
- Bước đầu tìm hiểu cơ chế chống chịu bệnh đốm lá, khô cành ngọn keo
lai do nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc. thông qua chủng loại
và mật độ vi khuẩn nội sinh có khả năng ức chế, tiêu diệt nấm gây bệnh.
- Ứng dụng vi khuẩn nội sinh trong phòng chống bệnh cho cây keo lai.
- Phân lập mẫu bệnh
- Thí nghiệm gây bệnh nhân tạo trong phòng thí nghiệm
- Giám định nguyên nhân gây bệnh
- Sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc.
trên môi trường dinh dưỡng PDA
3.2. Địa điểm nghiên cứu
- Lấy mẫu bệnh ở rừng trồng keo lai tại Lâm trường Tam Thắng, huyện
- Đánh giá ảnh hưởng của bệnh đối với keo lai tại khu vực nghiên cứu.
3.3.2. Phân lập các chủng vi khuẩn nội sinh ở cây keo lai theo các cấp bệnh
Thanh Sơn, Phú Thọ.
- Phân lập vi khuẩn nội sinh được tiến hành tại phòng Nghiên cứu Bảo vệ
3.3.3. Thử hiệu lực khả năng kháng nấm bệnh của các chủng vi khuẩn phân
lập đƣợc
thực vật rừng Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam.
- Thí nghiệm sử dụng vi khuẩn nội sinh phân lập được để phòng trừ bệnh
- Xác định cơ chế kháng bệnh thông qua chủng loại và mật độ vi khuẩn nội sinh
tại vườn ươm Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam.
- Mô tả đặc điểm của các chủng vi khuẩn nội sinh có hiệu lực.
3.2.2. Thời gian nghiên cứu
3.3.4. Đánh giá mối quan hệ giữa vi khuẩn nội sinh với cây chủ ở các cấp bị
- Luận văn được thực hiện từ 13/3/2007 đến ngày 15/9/2008.
3.2.3. Đối tƣợng nghiên cứu
bệnh khác nhau
3.3.5. Ứng dụng vi khuẩn nội sinh trong phòng chống bệnh đốm lá, khô
cành ngọn keo lai
- Đối tượng nghiên cứu là các loài vi khuẩn nội sinh trong mô thực vật ở
keo lai (Acacia auriculiformis x Acacia mangium)
- Nhân sinh khối sản xuất chế phẩm
- Thử nghiệm hiệu lực của khuẩn nội sinh trong phòng thí nghiệm
- Nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc.
- Thử nghiệm hiệu lực của khuẩn nội sinh trong phòng chống bệnh ngoài vườn
ươm.
- Ứng dụng hiệu lực khuẩn đối với rừng non keo lai 1 tuổi
- Ảnh hưởng của vi khuẩn nội sinh đến sinh trưởng của cây keo lai ở vườn ươm
14
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
15
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
- Ảnh hưởng của vi khuẩn nội sinh đến sinh trưởng của cây keo lai ở giai đoạn
7(cm) rồi cấy trên môi trường PDA được đựng trong hộp lồng. Đặt các hộp lồng
rừng trồng non (1 tuổi).
đã cấy mẫu bệnh này trong tủ định ôn ở nhiệt độ 280 C trong khoảng 2 - 3 ngày
3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
để cho sợi nấm phát triển mọc trên môi trường. Khi nấm đã mọc ra ngoài môi
3.4.1. Xác định nấm gây bệnh đốm lá, khô cành ngọn keo lai và đánh giá
ảnh hƣởng của bệnh đối với keo lai tại khu vực nghiên cứu
3.4.1.1. Thu thập mẫu bệnh và mô tả triệu chứng bệnh đốm lá, khô cành
trường PDA ta tiến hành cấy chuyển nấm này sang các hộp lồng khác có chứa
PDA để thuần khiết nấm bệnh.
Phương pháp 2: Để trong hộp lồng ẩm.
Lấy cành bị bệnh cắt thành các đoạn nhỏ khoảng 5 - 7 cm cho vào hộp
ngọn keo lai
Chọn các cây keo lai có triệu trứng bệnh, thể hiện về mặt hình thái đầu
tiên lá đốm nhỏ sau vết đốm to dần lên, lá bị cháy và chết từ trên ngọn xuống.
Cây vừa mới bị bệnh càng tốt. Lấy 15 mẫu, bọc mẫu bằng giấy báo cho vào túi
ni lông để đem về phòng thí nghiệm.
lồng đã được làm ẩm (dùng hộp lồng đã được khử trùng, sau đó để giấy ẩm vào
trong) hộp lồng cần có độ ẩm thích hợp không được ẩm quá cũng như khô quá
(để tạo môi trường thích hợp cho sự phát triển của nấm bệnh), tiếp theo dùng
băng keo quấn 2 đến 3 vòng, để hộp lồng trong vòng 2 - 3 ngày thấy trên cành
được làm ẩm, xuất hiện các vết bệnh màu đen, để hộp lồng càng lâu ngày thì
Quan sát triệu chứng bằng mắt thường hoặc kính lúp các đặc điểm bên
cành làm ẩm càng đen là do sự phát triển của nấm bệnh (lưu ý cành được làm
ngoài của thân, cành, lá bị bệnh như biến đổi về màu sắc chỗ thân cành bị bệnh,
ẩm phải là cành có vết bệnh, nếu vết bệnh càng mới thì càng tốt, thường ta lấy
bệnh trạng, sự phân bố bệnh trạng trên thân cành. Mô tả và chụp ảnh thân, cành,
cành làm ẩm ở cấp bệnh từ II - IV.
lá bị bệnh.
Khi đã thấy sự phát triển của nấm bệnh thì tiến hành cấy nấm trên môi
Trong trường hợp cơ quan sinh sản của vật gây bệnh chưa xuất hiện thì có
trường PDA, cách cấy như sau: Trước tiên đưa hộp lồng có chứa cành làm ẩm
thể dùng phương pháp giữ ẩm của Naumov, mẫu thân cành bị bệnh để trong hộp
lên kính hiển vi soi để tìm sợi nấm bào tử, dùng kim nhọn bằng sắt đã qua khử
petri có giấy hút ẩm để vật gây bệnh hình thành cơ quan sinh sản.
trùng hớt nhẹ phần sợi bào tử trên cành làm ẩm, cho đầu kim sắt đã dính nấm
Đối với trường hợp trên thân cành, lá xuất hiện cơ quan sinh sản có thể
bệnh đó vào hộp lồng có chứa môi trường PDA và dùng băng keo quấn hộp lồng
lấy trực tiếp vật gây bệnh trên mẫu bệnh.
lại, để hộp lồng vào tủ bảo quản và theo dõi sự phát triển của nấm bệnh. Khi sợi
3.4.1.2. Phân lập mẫu bệnh
nấm bắt đầu mọc, cấy truyền sang môi trường dinh dưỡng mới.
Có 2 phương pháp phân lập:
3.4.1.3. Thí nghiệm gây bệnh nhân tạo
Thí nghiệm gây bệnh nhân tạo là phương pháp kiểm tra và khẳng định được
Phương pháp 1: Phân lập trực tiếp trên môi trường PDA.
Lấy phần thân bị bệnh của cây keo, tiến hành rửa sạch bằng nước cất vô
trùng, sau đó khử trùng bề mặt bằng cồn 700 rồi rửa lại 2 - 3 lần bằng nước cất
vô trùng. Sau khi đã khử trùng mẫu bệnh xong thì cắt thành từng đoạn nhỏ 5 -
loài nấm phân lập từ các tổ chức bị bệnh trên thân, cành có chính xác hay không.
Phương pháp thí nghiệm: Lấy bào tử từ cơ quan sinh sản của nấm bằng
que cấy inox được khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn, cho bào tử nấm vào cốc
nước vô trùng pha loãng tới hạn đến mật độ khoảng 1.106 tế bào/ml. Rồi tiến
16
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
hành nhúng các mẫu lá keo vào cốc nước bào tử đó, sau đó để lá vào trong hộp
lồng petri giữ ẩm, mỗi hộp để 3 lá và băng keo lại xung quanh hộp. Theo dõi
* Điều tra tỷ lệ bị bệnh (P%)
Trong mỗi ô tiêu chuẩn, đếm tổng số cây điều tra và số cây bị bệnh thân,
thời gian bệnh xuất hiện và kiểm tra bào tử nấm trên các lá gây bệnh nhân tạo.
cành hoặc lá trong ô. Tỷ lệ bị bệnh trong ô tiêu chuẩn được tính theo công thức
3.4.1.4. Giám định nguyên nhân gây bệnh
như sau:
Căn cứ vào nhữmg triệu chứng bệnh đã mô tả, đặc điểm hình thái bào
tử quan sát trên kính hiển vi và tham khảo, đối chiếu với các tài liệu phân
loại Zhao Liping (1983), F.G. Brown (1968) và Sutton B. (1980) đ ể xác định
P=
n
x100
N
[3.01]
Trong đó:
P là tỷ lệ bị bệnh (%).
loại nấm gây bệnh.
n là số cây bị bệnh
3.4.1.5. Sự sinh trƣởng của hệ sợi nấm Colletotrichum gloeosporioides
N là tổng số cây điều tra trong ô tiêu chuẩn
(Penz.) Sacc. trên môi trƣờng dinh dƣỡng PDA
Nghiên cứu sự sinh trưởng của sợi nấm được tiến hành trên môi trường
Nếu : 0 < P < 5%
Phân bố cá thể
5% ≤ P < 25%
Phân bố cụm
28 C. Đo đường kính phát triển nấm sau 24 giờ; 48 giờ và 72 giờ theo 2 chiều
25% ≤ P <50%
Phân bố đám
vuông góc.
P ≥ 50%
Phân bố đều
dinh dưỡng PDA. Sau khi cấy nấm, nuôi nấm trong tủ định ôn với nhiệt độ
0
3.4.1.6. Đánh giá ảnh hƣởng mức độ của bệnh đối với keo lai tại khu vực
* Mức độ bị bệnh:
Điều tra toàn bộ số cây trong ô tiêu chuẩn (dung lượng mẫu n 30). Sau
nghiên cứu
Mục đích là để nắm vững tình hình phân bố, mức độ bị hại đồng thời
đó tiến hành điều tra ở toàn bộ thân, cành và tán của cây. Căn cứ vào diện tích bị
hại ở thân, cành và lá để phân cấp bệnh, tiến hành phân cấp mức độ bị hại theo 5
nghiên cứu mối quan hệ giữa vật gây bệnh và cây chủ.
Trong khu vực nghiên cứu tại các vị trí địa hình như chân, sườn, đỉnh,
hướng phơi khác nhau... lập các ô tiêu chuẩn đại diện để điều tra, diện tích mỗi ô
tiêu chuẩn là 1000 m2 (40 m x 25 m), (dung lượng mẫu điều tra n
cấp được đánh số từ 0 đến 4. Chỉ tiêu phân cấp mức độ bị hại theo Nguyễn
Hoàng Nghĩa và Phạm Quang Thu năm 2006 [13].
30). Sau khi
điều tra trên ô tiêu chuẩn tỷ lệ và mức độ bị bệnh được tính toán như sau:
18
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
19
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Mức độ bị hại
Cấp bệnh
Không bị bệnh
0
Hại nhẹ
1
Hại trung bình
2
Hại nặng
3
Hại rất nặng
4
Biểu hiện bên ngoài
Cây khoẻ, tán lá phát triển bình thường
(Hình 3.01)
Dưới 25% tán lá bị bệnh hoặc dưới 10%
cành bị bệnh. (Hình 3.02)
25 - 50% tán lá bị bệnh hoặc 10 - 25% cành
bị bệnh. (Hình 3.03)
> 50 - 75% tán lá bị bệnh hoặc > 25 - 50%
cành bị bệnh. (Hình 3.04)
> 75% tán lá bị bệnh hoặc trên 50% cành bị
bệnh. (Hình 3.05)
Hình 3.02: Cây bị bệnh cấp 1
Hình 3.03: Cây bị bệnh cấp 2
Hình 3.04: Cây bị bệnh cấp 3
Hình 3.05: Cây bị bệnh cấp 4
Hình 3.01: Cây bị bệnh cấp 0
(cây khỏe, không bị bệnh)
20
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
21
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Mức độ bị bệnh được tính bình quân gia quyền theo số cây ở các chỉ số
0,1 ≤ DI < 0,25
bệnh trong ô tiêu chuẩn.
thuốc phòng trừ
Chỉ tiêu phân cấp mức độ bị hại trong phòng thí nghiệm
0,25 ≤ DI < 0,5
Ghi chú: Cấp 0: Không bị bệnh
DI ≥ 0,5
Cấp 2: > 10 - 20% diện tích lá bị bệnh
Trên các khu rừng trồng keo lai tại Lâm trường Tam Thắng, Thanh Sơn,
Cấp 4: > 30% diện tích lá bị bệnh.
Phú Thọ tiến hành phân cấp mức độ bị hại theo 5 cấp được đánh số từ 0 đến 4.
- Tính mức độ bị bệnh chung cho mỗi chủng khuẩn.
Ở mỗi cấp bệnh khác nhau cần phải chọn ra 3 cây đặc trưng và tiêu biểu,
i
ni.vi
x100%
1
N .V
mỗi cây lấy một mẫu (một cành) có đường kính 1 - 1,5 cm. Các cành được chọn
[3.02]
có vị trí cành ít được chiếu sáng và đánh ký hiệu riêng cho từng cành.
R: Là mức độ bị bệnh (Severity of attack)
Phƣơng pháp phân lập
ni: Là số cây bị bệnh theo cấp bệnh i.
Bƣớc 1: Chuẩn bị dụng cụ
vi: Là chỉ số của cấp bệnh i.
n: Là tổng số cây điều tra trong ô tiêu chuẩn.
V = 4.
Rửa hộp lồng cho sạch sau đó để khô bọc kín bằng giấy báo và cho vào nồi
hấp khử trùng ở 1210C tương đương với áp suất 1 atm trong thời gian 30 phút.
- Mức độ bị bệnh của toàn khu vực điều tra được tính theo công thức:
Rtb =
Trong đó:
chặt bỏ cây bệnh
3.4.2. Phân lập các chủng vi khuẩn nội sinh ở cây keo lai theo các cấp bệnh
Cấp 3: > 20 - 30% diện tích lá bị bệnh
R =
cần cắt bỏ lá và thân cành bệnh, loại bỏ
cây bệnh nặng và phun thuốc phòng trừ
Cấp 1: < 10% diện tích lá bị bệnh
Trong đó:
cần loại bỏ lá, thân cành bệnh và phun
Ri
Bƣớc 2: Chuẩn bị môi trƣờng
[3.03]
n
Rtb là mức độ bị hại của toàn khu vực điều tra.
Ri là mức độ bị hại của từng ô tiêu chuẩn.
n là tổng số ô tiêu chuẩn.
- Chỉ số tổn thất được xác định thông qua công thức sau:
DI (%) = R% x P%
[3.04]
Trong đó:
R (%) mức độ bị bệnh
Để phân lập vi khuẩn nội sinh cần chuẩn bị một số loại môi trường sau:
Môi trƣờng PBS:
NaCl
: 8,5 gam
KH2PO4
: 6,8 gam
NaOH
: 1,16 gam
Nước cất
P (%) tỷ lệ bị bệnh
: 1000 ml
Điều chỉnh pH : 7
Căn cứ vào trị số DI xác định được biện pháp phòng trừ:
DI < 0,1
Sau đó cho vào tủ sấy đặt ở nhiệt độ 1100C để qua đêm.
không cần phun thuốc phòng trừ
Sau khi pha được môi trường cho vào các ống nghiệm, các ống nghiệm
22
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
23
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
cần phải nút bông chặt và miệng ống nghiệm được quấn bằng giấy, mỗi ống
0
nghiệm là 9ml: hấp khử trùng ở 121 C trong thời gian 30 phút .
Môi trƣờng PDA:
Bƣớc 4: Phân lập vi khuẩn nội sinh
Phân lập vi khuẩn theo phương pháp pha loãng tới hạn. Dùng pipet lấy
0,1ml cho vào hộp lồng có chứa môi trường PDA, dùng que trang đều trên mặt
thạch và ghi rõ ngày cấy và ký hiệu mẫu bệnh. Để các hộp lồng đã cấy vi khuẩn
Khoai tây
: 200 gam
D-Glucose
: 20 gam
Agar
: 15-18 gam
điểm của mỗi chủng. Nếu mật độ vi khuẩn quá nhiều trên mỗi hộp lồng cần pha
Nước cất
:1000ml
loãng đến 105, 106. Dùng que cấy tách ra từng chủng vi khuẩn khác nhau rồi cho
trong tủ định ôn với nhiệt độ 280C, theo dõi sự xuất hiện của các khuẩn lạc đếm
số lượng vi khuẩn có trong hộp lồng, có bao nhiêu chủng khác nhau, mô tả đặc
Khoai tây rửa sạch cắt thành miếng có kích thước 1x1x1cm cho vào nồi
và đổ nước 1000 ml đun sôi, để 30 phút tính từ lúc sôi, lọc lấy nước trong, sau
đó cho thêm nước cho đủ 1000 ml. Cho D-glucose và agar vào các bình tam giác
500 ml nút bông, quấn giấy đầu cổ bình (3 bình, mỗi bình 330 ml). Hấp khử
0
trùng ở môi trường 121 C trong 30 phút rồi đổ ra hộp lồng để trong tủ cấy.
Môi trƣờng nƣớc cất
ra một hộp lồng khác có chứa môi trường PDA (mỗi hộp một loại vi khuẩn),
mỗi chủng cấy 2 hộp lồng, sau đó dùng băng keo quấn chặt.
Theo dõi sự phát triển của vi khuẩn và đánh giá khả năng sinh trưởng của
vi khuẩn, mô tả đặc điểm của vi khuẩn khi nó được tách ra.
Dựa vào hình thái, màu sắc, kích thước để nhận biết các loại vi khuẩn khác
nhau và được thống kê các chủng phân lập được từ các mẫu thí nghiệm.
Rửa sạch các ống nghệm cho 9 ml nước vào các ống nghiệm nút bông vào
miệng ống nghiệm được quấn bằng giấy. Cho vào nồi hấp khử trùng ở môi
0
3.4.3. Thử hiệu lực khả năng kháng nấm bệnh của các chủng vi khuẩn phân
lập đƣợc
trường 121 C (tương đương với 1atm) trong 30 phút.
3.4.3.1. Xác định cơ chế kháng bệnh thông qua chủng loại và mật độ vi
Bƣớc 3: Cắt mẫu
khuẩn nội sinh
Lấy cành mẫu đã được chọn cắt thành từng đoạn nhỏ khoảng 7- 8 cm, khử
- Xác định các chủng vi khuẩn có khả năng kháng nấm gây bệnh
trùng bằng cồn 75% trong 1 phút. Lấy ra hơ nhanh qua đèn cồn, sau đó cắt thành
Sau phân lập được vi khuẩn thuần khiết chúng ta cấy nấm gây bệnh ở 3
các lát mỏng có kích thước 0,5 - 1,0 (mm) ở 3 vị trí: phần vỏ (Bark) ký hiệu là
góc của hộp lồng và cuốn kín hộp lồng rồi ghi rõ ngày tháng trên nắp hộp lồng
B; phần tượng tầng (Phloem) ký hiệu là P; phần gỗ (Xylem) ký hiệu là X.
giữ mẫu ở tủ định ôn.
Sau khi cắt xong cân mỗi phần 1 gam rồi cho vào ống nghiệm có chứa
môi trường PBS nút bông và b ịt miệng ống nghiệm bằng giấy để qua đêm. Nếu
phần tượng tầng của mẫu bệnh quá ít ta có thể lấy 0,5 gam của phần tượng tầng
cho vào ống nghiệm chứa 4,5 ml môi trường PBS.
Sau 5 - 7 ngày thì tiến hành đánh giá hiệu lực của vi khuẩn đối với nấm
gây bệnh trên môi trường PDA bằng việc đo đường kính vòng ức chế.
Công thức đo đường kính vòng ức chế của vi khuẩn đối với nấm bệnh
được tính bằng công thức:
V (mm) = D (mm) - d (mm)
24
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
25
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Trong đó:
V (mm): đường kính trung bình vòng ức chế.
3.3.5. Ứng dụng vi khuẩn nội sinh trong phòng chống bệnh đốm lá, khô
D (mm): đường kính tính theo hai chiều từ tâm của hộp lồng
cành ngọn keo lai
đến mép trong của khuẩn lạc nấm bệnh.
3.4.5.1. Nhân sinh khối sản xuất chế phẩm
d (mm): đường kính trung bình của khuẩn lạc vi khuẩn tính theo hai
chiều vuông góc.
Chuẩn bị môi trường PD để nhân sinh khối vi khuẩn sản xuất chế phẩm
theo Nguyễn Lân Dũng (2002) [7].
Căn cứ vào trị số V, xác định được chủng vi khuẩn có hiệu lực kháng nấm
gây bệnh loét thân cành keo lai. Trị số V càng lớn, chủng vi khuẩn càng có hiệu
Thành phần gồm:
lực mạnh. Những chủng khuẩn có hiệu lực đường kính trung bình vòng ức chế
Khoai tây: 200 gam
(V ≥ 20 mm).
D- Glucose: 20 gam
- Mật độ tế bào của các chủng vi khuẩn có hiệu lực cao
Nước
Lấy 1ml dung dịch khuẩn của các chủng có hiệu lực kháng nấm cao pha
loãng với 9 ml nước cất đã hấp khử trùng theo phương pháp pha loãng tới hạn.
Lấy 0,1 ml dịch khuẩn đã pha loãng trang trên các hộp lồng chứa môi
0
trường PDA. Đặt các hộp lồng đã cấy trong tủ định ôn ở 28 C trong 48 giờ.
Đếm số lượng khuẩn lạc thu được trên các hộp lồng tính theo CFU/ml. Từ
đó làm cơ sở cho việc xác định mật độ tối ưu để phòng trừ bệnh.
3.4.3.2. Mô tả đặc điểm của các chủng vi khuẩn nội sinh có hiệu lực
: 1000 ml
Khoai tây rửa sạch để cả vỏ, cắt thành khối có kích thước 1x1x1cm, cho
vào đun cùng 1000 ml nước, đun sôi trong 30 phút. Lọc lấy nước trong, cho
thêm nước để đủ 1000 ml. Sau đó cho D-glucose vào khuấy cho tan đều, cho
vào mỗi bình tam giác nút bông và quấn giấy ở miệng bình. Hấp khử trùng ở
121oC trong thời gian 20 phút.
Sau khi hấp khử trùng để các bình môi trường vào trong tủ cấy, khử trùng
các dụng cụ cần thiết và tiến hành trước ngọn lửa đèn cồn.
Lấy từng loại chủng có hiệu lực, dùng que cấy khuẩn khử trùng lấy từng
Mô tả hình dạng, màu sắc, kích thước, các chủng khuẩn (bào tử và các thể
loại khuẩn cho vào mỗi bình môi trường. Với mỗi loại lấy 3 - 5 lần để đảm bảo
quả). Khả năng sinh trưởng, phát triển của từng loại khuẩn trên môi trường
lượng khuẩn đưa vào môi trường không quá ít. Nút bông lại và ghi rõ ký hiệu
PDA, khả năng kháng nấm của các chủng khuẩn có hiệu lực.
của từng loại.
3.4.4. Đánh giá mối quan hệ giữa vi khuẩn nội sinh với cây chủ ở các cấp bị
Cho các bình vào máy lắc, lắc với tốc độ 200 vòng/phút ở 28oC trong 24
giờ, 48 giờ và 72 giờ.
bệnh khác nhau để tìm hiểu về cơ chế
Thu thập mẫu bệnh theo các cấp độ bị bệnh khác nhau.
Xác định cơ chế kháng bệnh thông qua chủng loại và mật độ vi khuẩn nội
sinh.
So sánh và đánh giá hiệu lực các chủng khuẩn, mật độ khuẩn đối với các
cây ở các cấp độ bệnh khác nhau.
Sau khi lấy các bình đã lắc, lấy ở mỗi loại ra một ít làm mẫu đếm số bào
tử hữu hiệu bằng cách: lấy 1ml dịch khuẩn pha loãng với 9 ml nước cất đã hấp
khử trùng theo phương pháp pha loãng tới hạn.
Lấy 1ml dịch khuẩn đã pha loãng trên các hộp lồng chứa môi trường
PDA. Đặt các hộp lồng đã cấy trong tủ định ôn ở 280C trong 48 giờ.
26
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
27
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Đếm số lượng khuẩn lạc thu được trên các hộp lồng tính theo CFU/ ml.
Công thức 2: tiêm 10 ml dịch vi khuẩn mỗi loại, mật độ 105 tế bào/1ml
Từ đó biết được loại khuẩn nào sinh trưởng nhanh trên môi trường nuôi cấy
Công thức 3: tiêm 15 ml dịch vi khuẩn mỗi loại, mật độ 105 tế bào/1ml
thuần khiết.
Công thức 4: tiêm 20 ml dịch vi khuẩn mỗi loại, mật độ 105 tế bào/1ml
3.4.5.2. Thử nghiệm hiệu lực phòng chống bệnh trong phòng thí nghiệm
Công thức 5: tiêm 10 ml nước cất vô trùng
Phương pháp thí nghiệm: Lấy cành, lá non không bị bệnh lần lượt nhúng
Sau 2 tuần phun ướt toàn bộ cây thí nghiệm ở các công thức bằng dung
vào các cốc đựng dung dịch khuẩn trong vòng 30 phút, công thức đối chứng
dịch nấm gây bệnh có mật độ 105 tế bào/1 ml. Theo dõi sau một thời gian đánh
không nhúng mỗi một công thức có 3 hộp lồng.
giá mức độ bị bệnh theo công thức [3.02] và sinh trưởng của cây keo lai như
Lấy bào tử từ cơ quan sinh sản của nấm đã nuôi cấy trên môi trường PDA
bằng que cấy inox được khử trùng trên ngọn đèn cồn, cho bào tử nấm vào cốc
6
chiều cao vút ngọn (Hvn), đường kính cổ rễ (Dg) ...
3.4.5.4. Thử nghiệm hiệu lực phòng chống bệnh ở rừng non keo lai 1 tuổi
nước vô trùng tới khi mật độ đạt khoảng 1.10 tế bào/ml. Rồi tiến hành nhúng
Thí nghiệm được tiến hành tại vườn rừng của Viện khoa học Lâm nghiệp
các mẫu lá keo nhiễm khuẩn vào cốc nước bào tử đó, sau đó để lá vào trong hộp
Việt Nam với 5 công thức, mỗi công thức 30 cây, 3 lần lặp thời gian theo dõi
lồng petri giữ ẩm, mỗi hộp để 3 lá và băng keo lại xung quanh hộp. Theo dõi và
trong vòng 60 ngày.
Công thức 1: tiêm 20 ml dịch vi khuẩn, mật độ 105 tế bào/1ml
đánh giá mức độ bị bệnh ở mỗi công thức.
Chỉ tiêu phân cấp mức độ bị hại trong phòng thí nghiệm
Công thức 2: tiêm 30 ml dịch vi khuẩn, mật độ 105 tế bào/1ml
Công thức 3: tiêm 40 ml dịch vi khuẩn, mật độ 105 tế bào/1ml
Ghi chú: Cấp 0: Không bị bệnh
Cấp 1: < 10% diện tích lá bị bệnh
Công thức 4: tiêm 50 ml dịch vi khuẩn, mật độ 105 tế bào/1ml
Cấp 2: >10 - 20% diện tích lá bị bệnh
Công thức 5: tiêm 20 ml nước cất vô trùng
Cấp 3: >20 - 30% diện tích lá bị bệnh
Sau 4 tuần nhiễm vi khuẩn nội sinh, phun ướt toàn bộ cây thí nghiệm ở
các công thức bằng dung dịch nấm gây bệnh có mật độ 105 tế bào/1ml. Sau 4
Cấp 4: > 30% diện tích lá bị bệnh.
- Tính mức độ bị bệnh trung bình cho mỗi chủng khuẩn theo công thức
Rtb =
Ri
n
tuần đánh giá mức độ bị bệnh ở các công thức thí nghiệm.
Ảnh hưởng của khuẩn nội sinh đến sinh trưởng (chiều cao, khối lượng
[3.05]
tươi, khối lượng khô) của cây keo lai ở các công thức thí nghiệm.
Ri là tổng các cấp hại của một chủng khuẩn
3.4.5.5. Ảnh hƣởng của vi khuẩn nội sinh đến sinh trƣởng của cây keo lai ở
n là số mẫu thí nghiệm
vƣờn ƣơm
3.4.5.3. Thử nghiệm hiệu lực phòng chống bệnh ngoài vƣờn ƣơm
Thử nghiệm với 3 chủng khuẩn có hiệu lực cao trong phòng thí nghiệm,
mỗi chủng khuẩn được tiến hành với 4 công thức ở các nồng độ khác nhau và 1
công thức đối chứng, mỗi công thức 30 cây, 3 lần lặp.
Công thức 1: tiêm 05 ml dịch vi khuẩn mỗi loại, mật độ 105 tế bào/1ml
Tiến hành đo Hvn, Dg ở tất cả các cây có trong công thức sau đó tính
toán và xử lý số liệu trên Excel để lấy các giá trị trung bình của lần lượt từng
công thức và so sánh với công thức đối chứng. Tìm ra những chủng khuẩn có tác
dụng cho sự sinh trưởng của cây keo lai trong giai đoạn vườn ươm.
28
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
29
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
3.4.6.5. Ảnh hƣởng của vi khuẩn nội sinh đến sinh trƣởng của cây keo lai ở
Chương 4
giai đoạn rừng non (1 tuổi)
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Thí nghiệm được tiến hành tại vườn rừng của Viện khoa học Lâm Nghiệp
Việt Nam (Đông Ngạc, Từ Liêm, Hà Nội) với số lượng 30 cây cho mỗi công
4.1. Xác định nấm gây bệnh đốm lá, khô cành ngọn keo lai và đánh giá ảnh
thức.
hƣởng của bệnh đối với keo lai tại khu vực nghiên cứu
- Tiến hành đo Hvn bằng thước chuyên dùng, đường kính D1.3 cây có
trong công thức sau đó tính toán và xử lý số liệu trên Exel 7.0.
- Thu 30 cây keo lai một năm tuổi gồm (rễ, thân, cành, lá) ở lần lượt từng
công thức đem cân các bộ phận ngay tại chỗ được sinh khối tươi.
4.1.1. Kết quả thu thập mẫu bệnh và triệu chứng bệnh đốm lá, khô cành
ngọn keo lai
Bệnh đốm lá, khô cành ngọn keo lai mới đầu trên lá keo thấy xuất hiện những vết
đốm nhỏ màu nâu hoặc đen trên lá sau đó chúng lan dần ra gây khô cành ngọn
Sấy khô bằng tủ sấy ở nhiệt độ 750C trong khoảng thời gian từ 6 - 8 giờ.
những cây bị nặng dẫn đến chết. Trên mặt vỏ xuất hiện các đoạn đen nứt dọc. Chỗ
Trong quá trình sấy, kiểm tra trọng lượng của mẫu sau 2, 4, 6 và 8 giờ sấy. Nếu
vết bệnh thường xuất hiện các sợi nấm dọc tạo ra các vân đen. Cành bị bệnh
sau 3 lần kiểm tra thấy trọng lượng không đổi thì đó chính là trọng lượng khô
thường có màu sắc không tươi như màu của cây khoẻ (Hình 4.01).
của mẫu.
Hình 4.01: Thân cành keo lai bị bệnh
Khi bệnh nặng, vỏ khô dần, co thắt, nhăn nheo, mô vỏ bị bệnh thối mềm
làm lá và cả ngọn cây bị héo (Hình 4.02).
30
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
31
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Hình 4.02: Rừng trồng keo lai bị bệnh đốm lá, khô cành ngọn
Hình 4.04: Sự sinh trưởng của sợi nấm trên môi trường PDA
4.1.2. Kết quả phân lập nấm bệnh
Để ẩm cành bị bệnh từ 3 - 5 ngày và trên kính hiển vi quang học ta thấy
thể quả nấm xuất hiện khối bào tử vô tính hình tròn màu da cam.
4.1.3. Kết quả thí nghiệm gây bệnh nhân tạo
Để xác định chủng nấm phân lập được từ tổ chức bị bệnh có đúng là nấm
gây bệnh hay không tiến hành thí nghiệm gây bệnh nhân tạo bằng cách nhúng lá
non keo lai vào nấm bệnh Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc. Theo dõi
trong vòng 7 ngày sau đó đánh giá mức độ bị bệnh ở các cấp nặng, nhẹ khác
nhau, phân cấp mức độ bị hại theo diện tích của lá bị bệnh. Kết quả thí nghiệm
gây bệnh nhân tạo được ghi ở Bảng 4.01.
Bảng 4.01: Kết quả gây bệnh nhân tạo lá keo lai
Thời gian quan sát
Cấp bệnh (R%)
Đối chứng
Sau 1 ngày
7,50
0
Sau 2 ngày
25,00
0
Dùng kim nhọn bằng sắt đã qua khử trùng hớt nhẹ phần sợi bào tử trên
Sau 3 ngày
45,00
0
cành làm ẩm, cho đầu kim sắt đã dính nấm bệnh đó vào hộp lồng có chứa môi
Sau 4 ngày
50,00
0
trường PDA và dùng băng keo quấn hộp lồng lại, để hộp lồng vào tủ bảo quản ở
Sau 5 ngày
62,50
0
nhiệt độ 280C và theo dõi sự phát triển của nấm bệnh. Khi sợi nấm bắt đầu mọc,
Sau 6 ngày
81,25
0
cấy truyền sang môi trường dinh dưỡng mới.
Sau 7 ngày
93,75
0
Hình 4.03: Thể quả nấm gây bệnh
32
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
33
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Từ Bảng 4.01 cho thấy chủng nấm phân lập được gây bệnh cho lá, cành
mùa sinh trưởng, đĩa bào tử có kích thước chiều dài 121,5 - 182,7 m, và chiều rộng
non keo lai. Sau 7 ngày toàn bộ các lá keo ở công thức gây bệnh có mức độ bị
2 - 53,6 m. Bên trong của đĩa bào tử có cuống bào tử mọc ra trên đó, cuống bào tử
bệnh là 93,75% trong khi đó đối chứng không bị bệnh (Hình 4.05).
không mầu đơn bào, có kích thước chiều dài 101,8 và chiều rộng 4,1 - 6,3 m.
Bào tử
Bào tử nẩy
mầm
Hình 4.05: Thí nghiệm gây bệnh nhân tạo
4.1.4. Giám định nguyên nhân gây bệnh
Hinh 4.06: Bào tử vô tính của nấm gây bệnh
+ Giai đoạn vô tính (Anamorph)
Căn cứ vào nhữmg triệu chứng bệnh đã mô tả, đặc điểm hình thái bào tử
Tên loài : Nấm đĩa gai Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc.
quan sát trên kính hiển vi tham khảo đối chiếu với các tài liệu phân loại nấm của
Thuộc chi nấm bào tử đĩa gai: Colletotrichum
các tác giả Zhao Liping (1983), F.G. Brown (1968) và Sutton B. 1980, Nấm gây
Họ nấm đĩa : Melanconiaceae
bệnh cho keo lai được xác định là loài nấm Colletotrichum gloeosporioides
Bộ nấm đĩa: Melanconiales.
(Penz.) Sacc.
Ngành phụ nấm bất toàn: Deuteromycetes
Nấm gây bệnh đốm lá, khô cành ngọn keo lai có hai giai đoạn sinh sản
trong vòng đời, giai đoạn hữu tính và giai đoạn vô tính.
Ngành nấm thật: Eumycota
+ Giai đoạn hữu tính (Teleomorph)
Giai đoạn vô tính (Anamorph): Bào tử phân sinh hình bầu dục hay hình hạt
Giai đoạn hữu tính (Teleomorph), quan sát trên kính hiển vi cho thấy bào
gạo thuôn dài đơn bào không mầu, sau khi thành thục có mầu nâu. Bào tử không có
tử túi đơn bào hình bầu dục. Vỏ bào tử dạng túi, vỏ túi hình cầu mọc đơn hoặc
vách ngăn nhưng đặc biệt là ở trước giai đoạn nẩy mầm bào tử thường có một vách
cụm dưới vỏ cây. Bên trong vỏ túi có nhiều túi bào tử và sợi bên, túi bào tử
ngăn ngang hình thành hai tế bào có mầu nâu, bào tử có chiều dài từ 11,87 m -
không mầu dạng que có đỉnh tròn. Đối chiếu với chuyên khảo nấm túi của
16,38 m, chiều rộng 3,26 - 4,78 m. Vỏ bào tử dạng đĩa có mầu nâu nhạt, nằm rải
Richard T. Hanlin 1990, nấm túi được xác định là:
rác dưới vỏ cây, sau đó màng lộ ra ngoài mầu nâu đen khi chín nứt ra và bào tử bay
Tên loài : Glomerella cingulata (Stonem.) Spauld.& Schrenk.
ra ngoài gặp điều kiện thuận lợi nẩy mầm thực hiện quá trình xâm nhiễm mới trong
Chi: Glomerella Spald. & H. Schrenk.
34
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
35
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Họ: Phyllachoraceae
năng sinh trưởng phát triển của cây. Ở nước ta bệnh phân bố chủ yếu ở các tỉnh
Bộ: Phyllachorales
Tuyên Quang, Phú Thọ, Hoà Bình, Hà Giang, Vĩnh Phúc, Hà Tây (cũ), Sơn La,
Lớp: Sordariomycetes
Lâm Đồng, Kon Tum, Thừa Thiên Huế,…Bệnh hại đã gây tổn thất rất lớn về giá
Ngành phụ: Pezizomycotina
trị kinh tế và môi trường sinh thái. Dịch bệnh có khả năng bùng phát gây chết
Ngành nấm túi: Ascomycota
hàng loạt rừng trồng trên diện rộng, làm cho ngọn và lá cây bị biến mầu sau đó
4.1.5. Sự sinh trƣởng của hệ sợi nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.)
khô héo, lá rụng, cành khô chết từ trên ngọn xuống, tạo điều kiện cho mối mọt
Sacc. trên môi trƣờng dinh dƣỡng PDA
tấn công phá hại, làm giảm sinh trưởng của cây, gây cho cây có nhiều khuyết tật,
Tốc độ sinh trưởng của hệ sợi nấm bệnh theo thời gian khi nuôi trên môi
Tại Lâm trường Tam Thắng huyện Thanh Sơn tỉnh Phú Thọ, đã điều tra
truờng dinh dưỡng PDA được trình bày ở Bảng 4.02.
Bảng 4.02: Sinh trưởng của hệ sợi nấm trên môi trường PDA.
Thời gian
Sau 48 giờ
đánh giá thực trạng tình hình bệnh tại 4 khu vực nghiên cứu. Kết quả về tỷ lệ bị
bệnh, mức độ bị bệnh và chỉ số tổn thất được trình bày ở Bảng 4.03.
Bảng 4.03: Ảnh hưởng của bệnh đối với keo lai ở Lâm trường Tam Thắng
Chi tiêu
Sau 24 giờ
sản lượng thấp, phẩm chất kém, giá trị thành phẩm giảm.
huyện Thanh Sơn, tỉnh Phú Thọ
Sau 72 giờ
Chỉ tiêu
Đường kính khuẩn lạc
(mm)
8,35
18,30
23,19
Địa điểm
Từ Bảng 4.02 cho thấy loài nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.)
Sacc . mọc khá nhanh trên môi trường dinh dưỡng PDA. Sau 24 giờ đầu nấm
Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc. sinh trưởng bình thường với tốc
độ sinh trưởng bình quân đạt 347,9 µm/giờ đến 48 giờ tiếp theo nấm sinh trưởng
rất nhanh (381,25 µm/giờ) tốc độ sinh trưởng bắt đầu giảm từ giờ 49 trở đi tốc
Mức độ bị hại
(R%)
Tỷ lệ bị hại (P%)
Chỉ số tổn thất
(DI)
Xã Yên Sơn
38,41
55,85
0,215
Xã Tinh Nhuệ
16,70
31,03
0,052
Xã Tinh Nhuệ
47,20
63,71
0,301
Xã Lương Nha
14,10
26,08
0,037
Trung bình
29,10
44,17
0,129
Từ Bảng 4.03 ta thấy mức độ bị hại và tỷ lệ bị hại trung bình của rừng
trồng keo lai tại Lâm trường Tam Thắng là 44,17%, mức độ bị hại trung bình
độ sinh trưởng bình quân của sợi nấm 322 µm/giờ.
4.1.6. Đánh giá ảnh hƣởng của bệnh đối với keo lai tại khu vực nghiên cứu
Bệnh đốm lá, khô cành ngọn keo lai đã dẫn đến vỏ của thân cây bị thối,
mất dần khả năng dẫn truyền dinh dưỡng nuôi cây, làm tán cây bị héo dần và
chết từ ngọn xuống (Die Back). Bệnh gây hại trên nhiều loài keo ở các nước ôn
29,10%, chỉ số tổn thất là DI = 0,129 nằm trong khoảng (0,1 ≤ DI < 0,25) cần
loại bỏ lá, thân cành bị bệnh và phun thuốc phòng trừ.
Chứng tỏ diện tích rừng trồng keo lai của Lâm trường bị bệnh nặng dẫn
đến tổn thất rất lớn về mặt kinh tế.
đới và nhiệt đới. Bệnh hại, gây cho cây bị đốm lá, khô cành ngọn làm giảm khả
36
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
37
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
4.2. Phân lập các chủng vi khuẩn nội sinh ở cây keo lai theo các cấp hại
Với 15 mẫu keo lai ở các cấp bị hại từ 0 đến 4, mỗi cấp 3 mẫu đã tiến
Cấp bị bệnh 1 (cây bị hại nhẹ): phân lập được 9 chủng khuẩn trong đó ở phần vỏ phân
lập được 4 chủng là B01, B03, B1.2, B1.3, phần tượng tầng 3 chủng P1.1, P1.3, P2.2 và
hành phân lập được 30 chủng vi khuẩn nội sinh khác nhau. Các chủng vi
phần gỗ phân lập được 2 chủng X1.1, X02 vi khuẩn.
khuẩn này được thống kê theo cấp bị hại và ở các vị trí phân lập, được trình
Cấp bị bệnh 2 (cây bị hại trung bình): phân lập được 5 chủng vi khuẩn trong đó ở
bày ở Bảng 4.04.
phần vỏ phân lập được 2 chủng B1.3, B3.1
Bảng 4.04: Số lượng chủng khuẩn ở các mức độ bị bệnh
STT
1
Mức độ bị bệnh
Cây khoẻ, không
bị bệnh
Số lượng
Chủng vi khuẩn
B01, B02, B03, B1.3
10
P01, P1.3, P2.2
X01, X02, X2.2
phần tượng tầng phân lập được 1 chủng P2.1 và phần gỗ phân lập được 2 chủng vi
khuẩn X1.1, X02
Cấp bị bệnh 3 (cây bị hại nặng): phân lập được 4 chủng vi khuẩn trong đó ở phần vỏ
phân lập được 2 chủng B1.3, B3.1,
phần tượng tầng phân lập được 1 chủng và phần gỗ phân lập được 1 chủng vi
khuẩn.
- Cấp bị bệnh 4 (cây bị hại rất nặng): phân lập được 1 chủng vi khuẩn ở phần vỏ
B01, B03, B1.2, B1.3
2
Hại nhẹ
9
P1.1, P1.3, P2.2
X1.1, X02
B1.3, B3.1
3
Hại trung bình
5
5
Hại nặng
và phần tượng tầng nhiều hơn so với phần gỗ cụ thể như sau: Ở vị trí vỏ phân lập được
P2.1
Hại rất nặng
4
Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy: Vi khuẩn phân bố trong cây chủ ở các bộ
phận của cây khác nhau: Các chủng vi khuẩn ở cây keo lai thường tập trung ở phần vỏ
13 chủng khuẩn chiếm 43,33%; ở phần tượng tầng phân lập được 9 chủng khuẩn chiếm
X1.1, X02
B1.3, B3.1
4
và 1 chủng khuẩn ở phần tượng tầng.
30%; ở phần gỗ phân lập được 8 chủng chiếm 26,67%. Số lượng các chủng vi khuẩn
phân lập được trên các vị trí khác nhau của cây chủ được thể hiện ở Hình 4.07:
P3.1
X3.1
B4.1
2
26.67%
P4.1
43.33%
Qua Bảng 4.04 ta thấy 15 mẫu cành keo lai được lấy ở các cây có các cấp bệnh
từ 0 đến 4 đã phân lập được tất cả 30 chủng khuẩn trong đó có 20 chủng vi khuẩn khác
nhau. Ký hiệu của các chủng vi khuẩn là: B01, B02, B03, B1.3, B4.1, B3.1, B1.2,
30%
Vỏ
Tượng tầng
Gỗ
P01, P1.3, P2.2, P1.1, P3.1, P4.1, P2.1, X01, X02, X2.2, X1.1, X3.1, X1.3.
Cấp bị bệnh 0 (cây khoẻ): phân lập được 10 chủng vi khuẩn trong đó ở phần
Hình 4.07: Tỷ lệ các chủng khuẩn phân lập được
vỏ phân lập được 4 chủng B01, B02, B03, B1.3. phần tượng tầng 3 chủng P01,
trên các vị trí khác nhau của cây chủ
P1.3, P2.2 và phần gỗ phân lập được 3 chủng vi khuẩn X01, X02, X2.2
38
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
39
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
