Hoàn thiện qui trình sản xuất thuốc tiêm aslem điều hoà miễn dịch

BYT-BKHCN
ĐHDHN

BYT-BKHCN
ĐHDHN

BYT-BKHCN
ĐHDHN

Bộ khoa học và công nghệ

Bộ y tế

trờng đại học dợc hà nội
13-15 lê thánh tông, hà nội

Báo cáo tổng kết khoa học và kỹ thuật của Dự án:

hoàn thiện qui trình sản xuất thuốc
tiêm aslem điều hoà miễn dịch

pgs.ts.đào kim chi

5889
21/6/2006

Bản quyền thuộc Trờng Đại học Dợc Hà nội
Đơn xin sao chép toàn bộ hoặc từng phần tài liệu này phải gửi tới Hiệu trởng
Trờng Đại học Dợc Hà nội trừ trờng hợp sử dụng với mục đích nghiên cứu

Hà Nội, 12 - 2005

Bộ khoa học và công nghệ

Bộ y tế

trờng đại học dợc hà nội
13-15 lê thánh tông, hà nội

Báo cáo tổng kết khoa học và kỹ thuật của Dự án:

hoàn thiện qui trình sản xuất thuốc
tiêm aslem điều hoà miễn dịch

pgs.ts.đào kim chi

Hà Nội, 12 - 2005
báo cáo đợc chuẩn bị trên cơ sở kết quả thực hiện dự án
Kc.10- da13


Dự án KC10-DA13

Lời cảm ơn
Chúng tôi xin trân trọng gửi lời cám ơn tới:
- Bộ Khoa học và Công nghệ
- Ban lãnh đạo và Văn phòng Chơng trình KC10
- Ban Giám hiệu trờng Đại học Dợc Hà nội
- Trung tâm Khoa học và Công nghệ Dợc
- Phòng Quản lý Khoa học trờng Đại học Dợc Hà nội

đã quan tâm chỉ đạo, giúp đỡ chúng tôi trong suốt quá trình thực hiện
dự án.
Chúng tôi cũng xin chân thành cảm ơn:
- Bộ môn Hoá sinh, Bộ môn Bào chế, Phòng TN GMP, Bộ môn Phân tích
- Độc chất, Công ty Dợc khoa, Phòng Tài chính Kế toán, Phòng Giáo
tài của trờng Đại học Dợc Hà nội
- Viện Kiểm nghiệm Quốc gia

- Viện Hoá học, Trung tâm KHCN Quốc gia
- Công ty cổ phần Dợc phẩm Vĩnh phúc (VINPHACO)
đã phối hợp thực hiện và giúp đỡ hết sức nhiệt tình để chúng tôi có thể
hoàn thành đợc dự án.

Hà nội, ngày 31 tháng 12

năm 2005

Chủ nhiệm dự án

PGS.TS. Đào Kim Chi


Báo cáo tóm tắt tổng kết khoa học và kỹ thuật

Dự án KC10-DA13

danh sách những ngời thực hiện
Chủ nhiệm dự án:

PGS.TS Đào Kim Chi

Các cán bộ tham gia:
TS. Nguyễn Quốc Bình, ĐH Dợc Hà Nội
Ths. Đỗ Hồng Quảng, ĐH Dợc Hà Nội
Ths. Đào Mai Anh, ĐH Dợc Hà Nội
CN. Nguyễn Thuý Minh, ĐH Dợc Hà Nội
DS. Nguyễn Duy Thiệp, ĐH Dợc Hà Nội
PGS.TS. Đỗ Hữu Nghị, ĐH Dợc Hà Nội
ThS. Nguyễn Kiều Anh, ĐH Dợc Hà Nội
PGS.TS Nguyễn Văn Long, ĐH Dợc Hà Nội
Ths.Nguyễn Thanh Hơng, Công ty Dợc phẩm Đông Đô
PGS.TS. Chu Đình Kính, Viện Hoá học
Trung tâm KHCN Quốc gia
Ths. Nguyễn Thị Kim Thanh, Viện Kiểm nghiệm Quốc gia
DS. Đỗ Văn Doanh, Công ty cổ phần Dợc phẩm Vĩnh phúc

Cơ quan tham gia:
1. Trờng Đại học Dợc Hà nội
2. Viện Kiểm nghiệm Quốc gia
3. Viện Hoá học, Trung tâm KHCN Quốc gia
4. Công ty cổ phần Dợc phẩm Vĩnh phúc
(VINPHACO)


Mục lục
Trang
Mở đầu

1

Phần I. Tổng Quan

3

1.1. Những hiểu biết hiện nay về điều hoà miễn dịch và KTMD

3

1.2. Tổng quan về các chất KTMD

4

1.2.1.Phân loại, nguồn gốc chất KTMD

4

1.2.2. Vị trí tác động và cơ chế tác dụng của chất KTMD

10

1.2.3. Phơng thức sử dụng thuốc KTMD

12

1.2.4. Tác dụng phụ của thuốc KTMD

14

1.2.5. ứng dụng của thuốc KTMD trên lâm sàng

15

1.3. Tình hình nghiên cứu và thuốc KTMD trên thị trờng Việt Nam 18
1.4. Thuốc KTMD Aslem

20

1.4.1. Xuất xứ

21

1.4.2. Tác dụng dợc lý và cơ chế tác dụng

22

1.4.3. Các nghiên cứu thử nghiệm

22

1.4.4. Chỉ định và chống chỉ định

25

1.4.5. Tác dụng phụ-Độc tính

26

1.4.6. Tơng tác thuốc

26

1.4.7. Liều lợng và cách dùng

26

1.4.8. Đóng gói, bảo quản và hạn dùng

27

1.4.9. Tiêu chuẩn

27

Phần II. Vật liệu, thiết bị và phơng pháp

2.1. Cho hoàn thiện qui trình tổng hợp GF

28
28

2.1.1. Hoá chất và dung môi

28

2.1.2. Các thiết bị và phơng pháp

28

2.2. Cho hoàn thiện qui trình bào chế thuốc

31


2.2.1. ở qui mô bán công nghiệp

31

2.2.2. ở qui mô công nghiệp

35

2.3. Cho hoàn thiện tiêu chuẩn nguyên liệu GF

41

2.3.1. Tinh chế GF

41

2.3.2. Xác định cấu trúc của GF

41

2.3.3. Định lợng GF bằng HPLC

41

2.3.4. Định lợng GF theo tiêu chuẩn cơ sở

45

2.3.5. Xác định tạp chất trong GF

45

2.3.6. Phân tích số liệu thực nghiệm

45

Phần III. Kết quả và bàn luận

47

3.1. Kết quả hoàn thiện qui trình tổng hợp GF

47

3..2. Kết quả hoàn thiện qui trình bào chế thuốc tiêm Aslem

55

3.2.1. Kết quả về sản lợng thuốc

55

3.2.2. Đánh giá 2 quy trình sản xuất Aslem

56

3.3. Kết quả hoàn thiện tiêu chuẩn nguyên liệu GF

62

3.3.1. Chế tạo chất chuẩn GF

62

3.3.2. Kết quả phân tích GF

62

3.3.3. Kết quả nghiên cứu định lợng GF bằng HPLC

78

Phần IV. Kết luận và đề xuất
Lời cảm ơn
Tài liệu tham khảo
Phụ lục

93


Các chữ viết tắt
ADCC
CDC
COSY
CSF
DEA
DEAD

DEPT
DIPAD
ĐTB
ĐMD
G-CSF
GF
GM-CSF
GMP
HMBC
HMQC
HSQC
HTMD
IBCF
IFN
IL
KN
KT
KTCL
KTMD
LAF
LAK
LC-MS
LIF
LPS
Lym
MA
MAb
M-CSF
MD
MDP

NK
NMM
PDGF
Ph3P (3P)

Antibody dependent cellular cytotoxicity
Complement dependent cytotoxicity
Correlated spectroscopy
Colony Stimulating Factor
Diethyl amin
Diethyl azodicarboxylate
Distortion Enhancement by Polarization Transfer
Diisopropyl azodicarboxylate
Đại thực bào
Đáp ứng miễn dịch
Granulo Colony Stimulating Factor
Glycyl Funtumin
Granulo-Macrophage Colony Stimulating Factor
Good Manufactureing Practice
Heteronuclear Multiple Bond Correlation
Heteronuclear Multiple Quantum Coherence
Heteronuclear Single Quantum Coherence
Hệ thống miễn dịch
Isobutyl chloroformiat
Interferon
Interleukin
Kháng nguyên
Kháng thể
Kỹ thuật chất lợng
Kích thích miễn dịch

Laminer Air Flow
Lymphokine Activated Killer cell
Liquid Chrormatography-Mass Spectroscopy
Leukemia Inhibiting Factor
LIpopolysaccharid
Lympho bào
Mixed Anhydrid
Monoclonal Antibody
Macrophage Colony Stimulating Factor
Miễn dịch
Muramyl DiPeptid
Natural Killer Cell
N-methylmorpholin
Platelet Derivative Growth Factor
Triphenyl phosphine


SCF
SGMD
SKLM
SOP
t-BOC-Gly
Tc
TCCS
TF
TIL
TGF
Th
TNF
Ts

VINPHACO

Stem Cell Factor
Suy giảm miễn dịch
Sắc ký lớp mỏng
Standard operating practice
Tert butyl oxycarbonyl Glyclyl
T cytotoxic
Tiêu chuẩn cơ sở
Transfer Factor
Transformation Growth Factor
T helper
Tumor Necrosis Factor
T suppressor
Công ty cổ phần Dợc phẩm Vĩnh phúc


Danh Mục Bảng
TT

Tên bảng

Trang

1

Bảng 2.1. Thiết bị sử dụng cho sản xuất Aslem ở quy mô bán công

31

nghiệp
2

Bảng 2. 2.Thiết bị sử dụng cho sản xuất Aslem ở quy mô công

35

nghiệp
3

Bảng 2.3. Nguyên vật liệu Nguồn gốc Tiêu chuẩn

42

4

Bảng 3. 1. So sánh quy trình tổng hợp GF đã đợc hoàn thiện với

47

quy trình tổng hợp ở quy mô phòng thí nghiệm
5

Bảng 3.2. Kết quả tổng hợp GF.HCl theo qui trình đã hoàn thiện

52

6

Bảng 3.3. Kết quả sản xuất thuốc Aslem trong 2 năm làm dự án

55

7

Bảng 3.4. So sánh tóm tắt qui trình sản xuất Aslem ở quy mô bán

56

công nghiệp với qui trình công nghiệp theo tiêu chuẩn GMP
8

Bảng3.5. So sánh phổ giữa 2 phơng pháp tinh chế GF

76

9

Bảng 3.6. Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống HPLC

80

10

Bảng 3.7. Kết quả xác định LOQ (n = 3)

82

11

Bảng 3.8. Kết quả biểu thị sự phụ thuộc giữa diện tích pic và nồng

82

độ GF
12

Bảng 3.9. Kết quả xác định độ tìm lại

83

13

Bảng 3.10. Kết quả xác định độ chính xác của phơng pháp

84

14

Bảng 3.11. Kết quả xác định hàm lợng GF theo hai phơng pháp

85

phân tích
15

Bảng 3.12. Kết quả xác định khả năng tách GF khỏi các tạp

87

16

Bảng 3.13. Kết quả so sánh hai phơng pháp phân tích

91


Danh Mục Hình
STT

Tên hình

Trang

1

Hình1.1. Công thức cấu tạo của Aslem

20

2

Hình2.1. Sơ đồ qui trình tổng hợp Glycyl Funtumin. HCl

29

(Nguyên liệu sản xuất thuốc tiêm Aslem)
3

Hình 2.2. Sơ đồ quy trình bào chế Aslem ở quy mô bán công

34

nghiệp
4

Hình 2.3. Sơ đồ quy trình bào chế Aslem ở quy mô công nghiệp

40

5

Hình3.1. Biểu đồ sản xuất Aslem

61

6

Hình3..2. Phổ IR của GF -KT

64

7

Hình3. 3. Phổ IR của GF -CC

65

8

Hình3.4. Phổ IR của GF chuẩn -1999

66

9

Hình3.5. Phổ MS của GF -KT

67

10

Hình3.6. Phổ MS của GF -CC

68

11

Hình3.7. Phổ 13C của GF -KT

72

12

Hình3.8. Phổ 13C của GF -CC

73

13

Hình3.9. Phổ 1H của GF -KT

74

14

Hình3.10. Phổ 1H của GF -CC

75

15

Hình 3.11. Sắc ký đồ của GF (A) và phổ hấp thụ UV của pic GF

79

trên sắc đồ (B)
16

Hình 3.12. Sắc ký đồ của dung dịch xác định độ phân giải

80

17

Hình 3.13..Sắc ký đồ A) Glycin Funtumin hydroclorid chuẩn;

81

B) Mẫu trắng

18

Hình 3.14

Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích pic và

83


nång ®é GF
19

H×nh 3.15. A) S¾c ký ®å 8 t¹p chÊt cã thÓ cã trong GF

87

B) S¾c ký ®å 8 t¹p chÊt vµ GF.

20

H×nh 3.16. S¾c ký ®å cña GF t¸ch b»ng s¾c ký líp máng

89

21

H×nh 3.17. S¾c ký ®å cña GF t¸ch b»ng HPLC

89

Dự án KC10-DA13

Bài tóm tắt
Sau 2 năm thực hiện dự án (2004-2005), chúng tôi đã hoàn thành đầy đủ
mọi khối lợng công việc theo đúng kế hoạch và chỉ tiêu các sản phẩm KHCN đã
đăng ký trong "Thuyết minh Dự án" và Hợp đồng số 13/2004/HĐ-DA.CTKC10 ký
với Bộ KH&CN và Ban Chủ nhiệm Chơng trình KC-10, với những nội dung sau:
1. Hoàn thiện hệ thống thiết bị và quy trình tổng hợp nguyên liệu GF:
1.1. Bổ xung thiết bị cho tổng hợp GF (300g/năm)
1.2. Mở rộng và hoàn thiện quy mô tổng hợp GF từ Pregnenolon: tối u hoá
những thông số kỹ thuật trong từng giai đoạn phản ứng, lựa chọn phơng pháp tinh
chế thích hợp để nâng cao chất lợng nguyên liệu cũng nh hiệu xuất tổng hợp. Cụ
thể là:

TT

Hiệu xuất
Tên giai đoạn phản ứng và sản phẩm

Giai đoạn
1

Giai đoạn hydrogen hoá (Pregnanolon)

2

Giai đoạn gắn nhóm phtalimid (Phtalimido-

68-82%

đã
hoàn
thiện
80-90%

87%

99%

cũ

funtumin)
3

Giai đoạn thuỷ phân nhóm phtaloyl (Funtumin)

68%

75%

4

Giai đoạn ngng tụ t-BOC-Gly-funtumin (BOC-

90%

95%

65%

75%

Hiệu xuất từ Funtumin

58,50%

71,25%

Hiệu xuất toàn bộ từ Pregnenolon

17,11%

36,94%

Gly-F)
5

Giai đoạn khử nhóm bảo vệ (Glycyl-Funtumin)

2.3. áp dụng quy trình đã hòan thiện, đã tổng hợp đợc 311,7g GF đạt TCCS,
đủ dùng để pha 800L thuốc tiêm (tơng ứng với 800.000 ống Aslem) theo kế hoạch
của dự án.


Dự án KC10-DA13

2. Hoàn thiện công nghệ sản xuất thuốc tiêm Aslem:
2.1. Bổ xung thiết bị cho sản xuất (200.000-300.000 ống /lô mẻ)
2.2. Mở rộng và hoàn thiện công nghệ sản xuất thuốc tiêm Aslem: sản xuất

đạt TCCS 547.704 ống Aslem (từ 625L dung dịch) trong đó có 44.500 ống (từ 50L)
đợc sản xuất thử nghiệm thành công tại xởng thuốc tiêm GMP của VINPHACO.
Số còn lại (175L) với nguyên liệu có sẵn sẽ đợc tiếp tục sản xuất tuỳ theo nhu cầu
tiêu thụ của thuốc. Kết quả này là cơ sở đảm bảo cho khả năng sản xuất 400.000
ống Aslem /năm tại cơ sở đạt tiêu chuẩn GMP.
3. Hoàn thiện tiêu chuẩn chất lợng cho nguyên liệu GF:
3.1. Đã chế tạo đợc 13g chất chuẩn GF trong đó có 6,34g GF-KT (tinh chế
bằng phơng pháp kết tinh nhiều lần) và 6,68 g GF-CC (tinh chế bằng sắc ký cột).
3.2. Kết quả phân tích cấu trúc trên các phổ IR, MS, NMR cũng nh các
tơng quan COSY, HSQC, HMBC và mô phỏng:
- Đã chứng minh cấu trúc phân tử đúng nh mong muốn của GF-KT là C23H38N2O2
(phù hợp với pic M+m/z = 374 amu), còn GF-CC là C24H38N2O2 do có thêm nhóm CHCl2 liên kết trong cấu trúc phân tử ở N thế cho H của -NH- tại vị trí C3) ;
- Đã khảng định GF-KT là mẫu chuẩn có độ tinh sạch cao hơn so với mẫu GF-CC.
Dự đoán này hoàn toàn phù hợp với kết quả định lợng GF bằng quang phổ hấp thụ
UV (GF-KT có hàm lợng 99,86% trong khi hàm lợng của GF-CC chỉ đạt
95,64%).
3.3. Xây dựng đợc phơng pháp phân tích GF bằng HPLC. Kết quả kiểm
nghiệm GF-KT nằm trong giới hạn cho phép của TCCS là cơ sở cho phép bổ xung
phơng pháp HPLC vào TCCS để định tính, định lợng GF và thử tạp chất có liên
quan trong GF.
3.4. Mẫu chuẩn GF-KT đạt tất cả các tiêu chí trong TCCS, đợc chọn làm
chất chuẩn chính và đợc Viện Kiểm nghiệm Quốc gia cấp chứng chỉ phân tích,
đóng thuốc chuẩn và lu giữ tại Viện.


Dự án KC10-DA13

Mở đầu
Miễn dịch trị liệu là phơng pháp nhằm khôi phục lại hệ thống MD đã bị suy
giảm do hậu quả của nhiều yếu tố gây bệnh cũng nh do các phơng pháp điều trị

kinh điển (phẫu thuật, xạ trị , hoá trị liệu) gây ra. Đây là một hớng điều trị bổ trợ
quan trọng đem lại nhiều hiệu quả có triển vọng trong tơng lai.
Tại nhiều nớc trên thế giới hiện nay, phơng pháp kết hợp "Phẫu thuật - Hoá
- Miễn dịch" (Immmuno - Chemo - Surgery) đang trở thành một xu thế đợc áp
dụng rộng rãi trong điều trị ung th, nó không chỉ giúp cải thiện tiên lợng của
bệnh, tăng thời gian sống thêm sau mổ mà còn cải thiện đợc chất lợng cuộc sống
cho bệnh nhân.
Việc sử dụng các chất điều biến miễn dịch (Immunomodulator) trong đó có
các chất KTMD không đặc hiệu đã thực sự mở ra một hớng nghiên cứu mới trong
vấn đề phòng và chữa các bệnh có liên quan đến SGMD đặc biệt là đối với ung th
và đang thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học trên thế giới. Danh sách các chất
KTMD đã và mới đợc tìm thấy ngày một gia tăng từ các nguồn nguyên liệu khác
nhau nh: các chế phẩm vi sinh (BCG, Corynebacterim parvum, MDP...), nấm
(Lentinan...), sinh học (các vaccin, các lympho T nuôi cấy, các kháng thể đơn dòng,
cytokin), tổng hợp hoá học (Levamisol, Azymexon, Isoprinosine, LH1...), thảo mộc
(Lectin, Taxol...). Những chất này đang đợc thử nghiệm và áp dụng trên lâm sàng
chủ yếu cho các bệnh lý suy giảm miễn dịch thứ phát. ở Việt nam đã có một số
công trình nghiên cứu tìm kiếm các chất KTMD có nguồn gốc từ thực vật nh chế
phẩm Phylamin từ bèo hoa dâu, dịch chiết toàn phần rễ cây Nhàu, dịch chiết toàn
phần cây Lấu, dịch chiết từ vỏ đỗ xanh...), gần đây còn có chế phẩm Naturen chế từ
con tằm, Cadef... nhng vẫn cha có chế phẩm nào đợc nghiên cứu hoàn chỉnh
dới dạng tinh khiết.
Căn cứ vào kết quả của Đề tài cấp Bộ KH-YD-02-11B (2002): "Nghiên cứu
sản xuất thuốc điều hoà miễn dịch Aslem ứng dụng trong lâm sàng", chế phẩm
thuốc tiêm Aslem do Trung tâm khoa học công nghệ Dợc và Công ty Dợc khoa
trờng ĐH Dợc Hà nội sản xuất đã đợc Cục Quản lý Dợc VN cấp phép lu

1

Dự án KC10-DA13

hành trên thị trờng ở VN nhằm đáp ứng nhu cầu sử dụng thuốc ngày càng gia tăng
trong điều trị bổ trợ ung th. Việc bổ xung trang thiết bị để mở rộng qui mô sản
xuất, đạt tiêu chuẩn GMP về thuốc tiêm, hoàn thiện qui trình tổng hợp và tiêu
chuẩn nguyên liệu, đào tạo cán bộ kỹ thuật cho tổng hợp, sản xuất và tổ chức quản
lý sản xuất là hết sức cần thiết. Do đó, dự án KC10DA13: " Hoàn thiện qui trình
sản xuất thuốc tiêm Aslem điều hoà miễn dịch" đã đợc xét duyệt.
Dự án thuộc chơng trình " Khoa học và Công nghệ phục vụ bảo vệ và chăm sóc
sức khoẻ cộng đồng", đợc thực hiện trong 2 năm (từ 01/01/2004 đến 31/12/2005)
với kinh phí 3.424.940.000 đồng, trong đó có 1.000.000.000 đồng đợc hỗ trợ từ
ngân sách Sự nghiệp khoa học. Dự án phải hoàn trả cho NN 595.000.000 đồng
(60% từ NSSNKH) vào 2 đợt: đợt 1 (06/2006) và đợt 2 (12/2006).
Mục tiêu của Dự án:
- Hoàn thiện qui trình tổng hợp Glycyl funtumin hydrochlorid (GF) với số
slợng 300g/năm.
- Hoàn thiện qui trình bào chế thuốc tiêm Aslem 0,3 mg/ml ở qui mô công
nghiệp
- Hoàn thiện tiêu chuẩn nguyên liệu GF.
Nội dung chính của DA:
1/ Hoàn thiện hệ thống thiết bị và qui trình tổng hợp nguyên liệu GF :
- Lựa chọn và lắp đặt thiết bị cho tổng hợp khoảng 300g/năm
- Nghiên cứu biện pháp tối u hoá những thông số kỹ thuật của các giai đoạn
phản ứng, lựa chọn phơng pháp tinh chế thích hợp để nâng cao hiệu xuất
tổng hợp và đạt chất lợng tinh khiết hoá học theo TCCS.
2/ Hoàn thiện công nghệ bào chế thuốc tiêm Aslem đạt tiêu chuẩn GMP :
- Lựa chọn trang thiết bị máy móc cho công nghệ sản xuất thuốc.
- Nghiên cứu biện pháp tối u hoá qui trình sản xuất Aslem ở qui mô 400.000
ống/năm đạt TCCS đã đợc VKN Quốc gia thẩm định.
3/ Hoàn thiện tiêu chuẩn chất lợng cho nguyên liệu pha tiêm:

- Chế tạo chất chuẩn GF.
- Xây dựng và hoàn thiện tiêu chuẩn cho nguyên liệu GF.

2


Dự án KC10-DA13

Phần I

Tổng quan
1.1. Những hiểu biết hiện nay về điều hoà MD và KTMD

Hệ thống MD ở ngời đảm nhiệm một chức phận sinh lý quan trọng có tính
sống còn, đó là đáp ứng của cơ thể với mọi chất lạ (kháng nguyên) xâm nhập để
bảo vệ tính đặc thù, toàn vẹn và hằng định của nó.
Trong trờng hợp bệnh lý, đáp ứng của hệ thống MD có thể tăng hay giảm
dẫn đến những biểu hiện rối loạn gây nên tình trạng mất cân bằng tự nhiên trong cơ
thể. Mục đích của liệu pháp MD chính là điều hoà hệ thống MD để giúp cho cơ thể
điều chỉnh các trạng thái rối loạn MD đó trở về trạng thái cân bằng bình thờng.
Có 2 xu hớng điều hoà chính:
- Xu hớng làm tăng cờng đáp ứng MD (immunostimulating) khi có hiện tợng
suy giảm hay cha đủ MD
- Xu hớng làm ức chế MD (immunosupressing) khi có đáp ứng quá mức gây rối
loạn.
Tuy nhiên, do cơ chế điều hoà và tơng tác giữa các tế bào của hệ thống MD
có rất nhiều giai đoạn khác nhau khiến cho tác dụng của thuốc khi sử dụng khó có
thể đợc xác định rõ đâu là ranh giới của chất KTMD (Immunostimulant) và chất
ức chế MD (Immunosupressor). Vì thế nhiều chất đợc gọi là chất điều hoà MD
(Immunoregulator) hay còn gọi chung là chất điều biến MD (Immunomodulator)

[40] [56]. Trên thực tế, một chất khi đa vào cơ thể có thể tác động vào một hay
nhiều khâu của hệ thống MD và có tác dụng làm thay đổi nhiều chỉ tiêu MD khác
nhau, thậm chí còn chồng chéo và trái ngợc nhau. Mặc dù vậy, nó sẽ đợc xếp
vào nhóm chất nào là tuỳ thuộc chủ yếu vào tác dụng của nó trên đại đa số chỉ tiêu
MD nghiên cứu mà vẫn cho tác dụng theo cùng một hớng (hoặc kích thích, hoặc
ức chế MD). Cho đến nay phần lớn các chất điều biến MD có tác dụng tăng cờng
nhiều hơn là ức chế MD.

3


Dự án KC10-DA13

1.2. Tổng quan về Các chất KTMD [33] [35] [37] [38] [42 ] [43] [45] [48] [62] [71]

Đã từ lâu ngời ta coi việc tiêm phòng vaccin để phòng chống các bệnh
nhiễm khuẩn là một biện pháp KTMD vì trong thành phần của vaccin không chỉ có
các KN vi khuẩn hay virus gây bệnh mà thờng có kèm thêm các trợ chất
(Adjuvant) có tác dụng kích thích cơ thể sản xuất ra KT mạnh hơn là nếu chỉ đa
vào cơ thể KN đơn độc. Adjuvant chính là những chất KTMD đầu tiên đợc phát
hiện và từ đó nhiều công trình nghiên cứu đợc triển khai mạnh mẽ cùng với việc
phát hiện ra các bệnh lý MD (quá mẫn, suy giảm MD, bệnh tự miễn...) vào cuối
thế kỷ XIX và đầu thế kỷ XX . Từ chỗ chỉ có một số trung tâm nghiên cứu MD tại
các nớc phát triển, tới nay đã có hầu hết các trung tâm nghiên cứu MD trên thế
giới công bố những kết quả nghiên cứu về lĩnh vực này. Các chất KTMD mới tìm
ra ngày càng nhiều và việc tiếp tục tìm kiếm các chất KTMD mới vẫn đang là một
hớng nghiên cứu thời sự do tính đa dạng vô cùng phức tạp của những tình trạng
bệnh lý MD nói trên, đòi hỏi một thuốc mới phải có nhiều đặc tính khác nhau để
vừa có khả năng điều biến các rối loạn MD, lại vừa có thể áp dụng điều trị một
cách hợp lý cho từng cá thể.

Tính đa dạng về cấu trúc, bản chất và tác dụng sinh học của chất KTMD phần
nào đợc phản ánh ở nguồn gốc khác nhau của chúng: nguồn các chất sinh học,
hoá học, vi sinh và thực vật. Ngoài ra, những con đờng tổng hợp mới hay bán tổng
hợp áp dụng công nghệ gen cũng đang đợc chú ý một cách thích đáng. Trên thực
tế một số thuốc thờng dùng trong điều trị với mục đích khác cũng đợc phát hiện
thấy có đặc tính KTMD, điển hình là Levamisol.
1.2.1. Phân loại nguồn gốc chất KTMD
1.2.1.1. Các chế phẩm KTMD sinh học:
Đó là các chất KTMD tự nhiên đợc chế tiết từ các tế bào MD và viêm.
Chúng đợc sản xuất từ huyết thanh, dịch nghiền tổ chức ở ngời hoặc động vật
(chủ yếu là cơ quan lympho) hay môi trờng nuôi cấy tế bào MD với KN bằng

4


Dự án KC10-DA13

phơng pháp bán tổng hợp, tổng hợp dựa vào cấu trúc hoá học của các hợp chất tự
nhiên hoặc bằng công nghệ gen (tái tổ hợp):
- Các hormon tuyến ức: đợc chiết xuất từ tổ chức tuyến ức và một phần từ huyết
thanh, bao gồm: các sản phẩm tinh khiết một phần (thymosine, thymostimulin);
các sản phẩm tinh khiết hơn (thymosin 1, thymulin, thymopoietin). Nhiều nghiên
cứu đánh giá tác dụng của hormon tuyến ức invitro và invivo trên súc vật thí
nghiệm và đã đợc sử dụng trên lâm sàng trong các bệnh ung th, tự miễn, viêm
gan virus mạn tính tiến triển, ở ngời già.
- Các Interleukin (IL): là các sản phẩm chế tiết của các tế bào MD và viêm đã hoạt
hoá, có bản chất thờng là những peptid có trọng lợng phân tử thấp:
+ IL-1 chủ yếu do ĐTB tiết ra, đợc sản xuất từ môi trờng nuôi cấy tế bào
monocyte ở ngời kích thích bởi BCG bò sống, đã đợc thử nghiệm trong điều trị
suy tuỷ, ung th lympho bào T dới da.

+ Các IL-2,3,5,6 chủ yếu do lympho T hoạt hoá tiết ra, đợc sản xuất bằng
công nghệ gen. IL-2 có tác dụng điều hoà ĐƯMD dịch thể và tế bào, hiện đang
đợc dùng để điều trị các bệnh ung th (da, phổi, đại trực tràng, tạng đặc). IL-3 và
6 là yếu tố kích thích sự trởng thành của tế bào gốc ở tuỷ xơng, đã đợc dùng
trên lâm sàng trong suy tuỷ. IL-12 là yếu tố kích thích tế bào Th1, Tc và NK; hiện
đang đợc thử nghiệm trên súc vật bị nhiễm virus, ung th và ở bệnh nhân AIDS.
- Các Interferon (IFN): là các peptid gồm 3 loại: IFN- do tế bào bạch cầu sản
xuất, IFN- do các tế bào xơ non và IFN- do các tế bào lym T hoạt hoá tiết ra. Các
chế phẩm IFN đợc sản xuất ở dạng thô từ các bạch cầu và bằng công nghệ gen, có
tác dụng tăng cờng hoạt tính chống virus của các tế bào một cách không đặc hiệu,
ức chế sự tăng sinh tế bào và điều hoà ĐƯMD. IFN- chủ yếu có tác dụng ức chế
phân bào, đã đợc dùng trên lâm sàng trong viêm gan B mạn tính và ung th
(melanoma, carcinoma, lymphoma). IFN- có tác dụng điều hoà ĐƯMD dịch thể
và tế bào (tăng cờng hay ức chế ĐƯMD) tuỳ thuộc vào liều lợng và thời điểm

5


Dự án KC10-DA13

tiêm thuốc vào cơ thể; đợc sử dụng trong điều trị một số bệnh nhiễm virus cha có
vaccin và bệnh tự miễn nh vẩy nến, viêm khớp dạng thấp.
- Các yếu tố kích thích tạo cụm (CSF): là những cytokin đợc xác định dựa vào đặc
tính kích thích sự tạo thành các cụm tế bào khi đa các yếu tố này vào môi trờng
gel thạch nuôi cấy tế bào tuỷ xơng. Một số CSF đã đợc xác định: multi-CSF (IL3) là yếu tố kích thích tạo cụm hồng cầu và bạch cầu hạt; GM-CSF là yếu tố kích
thích tạo cụm bạch cầu hạt và ĐTB; M-CSF là yếu tố kích thích phát triển dòng
monocyte, ĐTB; G-CSF là yếu tố kích thích phát triển dòng bạch cầu hạt; LIF là
yếu tố ức chế leukemia, duy trì tế bào nguồn; SCF (stem cell factor) là yếu tố hợp
đồng với các CSF khác để phát triển và biệt hoá các dòng tế bào máu. Các CSF đã
đợc dùng trên lâm sàng trong điều trị suy tuỷ, suy thận mạn tính, ghép tuỷ xơng,

bệnh bạch cầu và sau hoá trị liệu ung th.
- Các cytokin tái tạo và sửa chữa vết thơng: do những tế bào viêm (tiểu cầu,
mastocyte, lym T) tiết ra có tác dụng điều hoà phản ứng viêm. Việc hàn gắn và sửa
chữa vết thơng trong viêm liên quan đến quá trình ĐƯMD và có sự tham gia của
một số cytokin quan trọng:
. Yếu tố tăng cờng gây chuyển dạng tế bào (TGF-) là yếu tố đa chức năng
do các tiểu cầu đợc hoạt hoá tiết ra; có tác dụng thu hút, tập trung nhiều loại tế
bào viêm (ĐTB, bạch cầu hạt trung tính, lym T, tế bào xơ non, tế bào cơ trơn), cảm
ứng tổng hợp các chất trung gian. Hiện nay các đồng phân TGF- 1,2,3 đã đợc
sản xuất bằng phơng pháp tái tổ hợp và đợc dùng trên súc vật thử nghiệm để kích
thích quá trình làm lành và sửa chữa vết thơng.
. Yếu tố tăng trởng từ tiểu cầu (PDGF), IL-4, IFN-, IL-6 cũng là những
cytokin giúp hàn gắn và sửa chữa vết thơng.
- Yếu tố chuyển (TF): thu đợc từ dịch phá vỡ bạch cầu qua thẩm tích, có tác dụng
tăng cờng ĐƯMD không đặc hiệu. Tiêm TH có khả năng chuyển thụ động trạng
thái quá mẫn muộn sang cơ thể khác.
- Các kháng thể đơn clone (MAb) [39]: là chất điều biến MD thụ động, có hiệu giá
cao chống vi khuẩn và virus gây bệnh. Các chế phẩm MAb đặc hiệu để chống lại

6


Dự án KC10-DA13

những KN trên tế bào ung th giúp cho cơ thể tăng cờng cơ chế bảo vệ và tăng
độc tính để tiêu diệt tế bào u (qua hiệu ứng ADCC, và CDC). Hiện nay ngời ta
đang nghiên cứu dạng thuốc tác dụng tại đích bằng cách gắn MAb với các hoá chất
chống ung th hay chất phóng xạ nh một viên đạn để diệt các tế bào ung th một
cách chọn lọc. Một số MAb đã đợc FDA chấp thuận sử dụng trên lâm sàng:
Bevacizumab (Avastin) là KT kháng VEGF (vascular endothelial growth factor)

dùng kết hợp với hoá trị liệu có tác dụng kéo dài rõ rệt thời gian sống thêm ở bệnh
nhân ung th đại trực tràng có di căn, ung th vú và ung th phổi. Cetuximab
(Erbitux) là KT kháng EGF (epidermal growth factor) dùng đơn độc hoặc kết hợp
với hoá trị liệu có tác dụng gây đáp ứng kháng u mạnh trên lâm sàng ở những bệnh
nhân ung th đại trực tràng nặng phải dùng hoá chất. Trastuzumab (Herceptin) là
KT kháng HER2/neu dùng trong phác đồ chuẩn Hoá-MD trị liệu làm giảm tái phát,
kéo dài thời gian sống thêm không bệnh (disease free survival) và thời gian sống
thêm toàn bộ ở những bệnh nhân ung th vú tiên lợng xấu.
1.2.1.2. Các chế phẩm KTMD có nguồn gốc hoá học:
Đa số các chất này đợc bán tổng hợp hay tổng hợp toàn phần dựa vào cấu
trúc hoá học của một số chất KTMD tự nhiên, do đó đã tạo ra một số chế phẩm tinh
khiết có thành phần, công thức hoá học và cấu trúc phân tử xác định, không chỉ có
tác dụng KTMD mà còn có u điểm là ít độc tính hơn.
- SDZ MRL 953 là chất đồng phân mới của monosaccarid lipid A có tác dụng
KTMD tơng tự nh endotoxin nhng ít độc hơn.
- Bốn đồng phân mới của Tuftsin đợc tổng hợp cũng có tác dụng hoạt hoá các tế
bào thực bào giống nh Tuftsin tự nhiên.
- NPT 16416, ADA 202-718, thiazolobenzimidazole là những dẫn xuất của
Levamisol đợc tổng hợp nhằm nâng cao hiệu quả tác dụng KTMD đồng thời hạn
chế tác dụng phụ của thuốc.
- Cycloferon là muối của acid acridone acetic với N-methyl glucamin có tác dụng
cảm ứng sinh tổng hợp IFN kháng virus trực tiếp.

7


Dự án KC10-DA13

Một trong những đặc tính chung nhất của các chất KTMD tự nhiên hay tổng
hợp là có tác dụng hoạt hoá các tế bào thực bào, một số chất còn có tác dụng kích

thích các tế bào Tc và NK. Vì vậy các chất KTMD có nguồn gốc hoá học đợc coi
là những chất KTMD không đặc hiệu.
1.2.1.3. Các chế phẩm KTMD có nguồn gốc vi sinh:
Ngay từ đầu thế kỷ XVIII, ngời ta đã phát hiện thấy ung th có thể tự động
thoái triển ở một số bệnh nhân sau một nhiễm trùng nặng. William B. Coley (1891)
là một trong những ngời đầu tiên đã sử dụng các chế phẩm từ một số vi khuẩn
hoặc độc tố của chúng để điều trị cho các bệnh nhân ung th tổ chức mềm. Các chế
phẩm nhóm này đợc điều chế từ vi khuẩn, virus, nấm, ký sinh trùng:
- Các chế phẩm KTMD có nguồn gốc vi khuẩn: đợc điều chế từ một hay một số
loại vi khuẩn nguyên vẹn bị bất hoạt hay giảm độc lực, hoặc đợc chiết từ các
thành phần khác nhau của vi khuẩn (thành tế bào vi khuẩn, chất chuyển hoá tiết ra
ở môi trờng nuôi cấy vi khuẩn...):
. BCG là vi khuẩn lao bò giảm độc lực, là chất KTMD không đặc hiệu, đã
đợc dùng trên lâm sàng trong các bệnh: phong, ung th. Các mycobacteria khác
(Klebsiella, Brucella) cũng đang đợc thử nghiệm trên lâm sàng.
. Protein A là chế phẩm đợc tinh chế từ S. aureus Cowwan I có tác dụng
hoạt hoá tế bào NK; RU 41.740 là glycoprotein chiết xuất từ Klebsiella
pneumoniae, có tác dụng điều biến MD trên nhiều loại tế bào MD (thực bào, NK,
lym T, B) và đã đợc dùng trên những bệnh nhân nhiễm trùng mạn tính, ung th,
ngời già.
. Lipid A là lipopolysaccarid điều chế từ E. Coli; polysaccarid điều chế từ
Streptococcus, brucella, E.Coli cũng đã đợc thử nghiệm trên lâm sàng.
. OK 432 chế tạo từ Streptococcus đợc dùng cho bệnh nhân ung th
(melanoma) và phòng nhiễm virus.
. Broncho-vaxom có bản chất nucleoprotein đợc chế từ 8 loại vi khuẩn gây
bệnh đờng hô hấp và đã đợc dùng trong điều trị viêm phế quản mạn tính.

8

Dự án KC10-DA13

. MDP đợc chiết từ thành tế bào vi khuẩn (mycobacteria, corinebacteria,
nocardia, listeria) dới tên các biệt dợc Murabutide, MTP-pe dùng để chống tái
phát trong ung th, nhiễm trùng, tiêm cùng với vaccin để tăng hiệu lực của vaccin
- Các chế phẩm KTMD có nguồn gốc virus, ký sinh trùng: Phức hợp KTMD
(ISCOM) đợc sản xuất từ các thành phần của ký sinh trùng (plasmodium
falciparum , virus (HIV) dới dạng kết hợp giữa KN đặc hiệu với chất KTMD và
đợc coi là "vaccin kiểu mới" dùng để phòng chống các bệnh nhiễm trùng, đang
đợc thử nghiệm trên lâm sàng.
- Các chế phẩm KTMD có nguồn gốc từ nấm: Lentinan, Krestin, Glucan,
Pchizophyllan có thành phần chính là polyglycol, có tác dụng kích thích hệ thống
thực bào đơn nhân, hiện đang đợc dùng trong điều trị một số loại ung th.
1.2.1.4. Các chế phẩm KTMD có nguồn gốc thực vật:
Các chế phẩm này đợc nghiên cứu tập trung ở một số nớc nh Nhật bản,
Mexico, Ucraina, úc.
- Dịch chiết toàn phần của cây Tầm gửi (Viscum album) chứa chất có hoạt tính là
các lectin và peptid, có tác dụng gây độc đối với tế bào ung th và tăng cờng MD
theo cơ chế hoạt hoá các tế bào NK.
- Chế phẩm Isorel (Australia) đang đợc thử nghiệm trên lâm sàng.
- Các lectin từ vỏ hạt đậu có tác dụng tơng tự Concavalin A (kích thích phân bào
và sản xuất IFN- từ bạch cầu đơn nhân).
- Các saponin từ một số loài Mimoza ở Mexico có tác dụng hoạt hoá các tế bào
lympho và ĐTB, ức chế sự phát triển của các tế bào ung th.
- Taxol đợc chiết từ cây thông đỏ có tác dụng chống ung th do hoạt hoá ĐTB,
tăng tiết IL-1và IL-2.

9

Dự án KC10-DA13

- Bài thuốc sắc Juzan-Taihoto của Nhật bản đợc chế từ 10 loại thảo mộc địa
phơng có tác dụng kích thích phân bào và tăng hoạt hoá bổ thể.
1.2.2. Vị trí tác động và cơ chế tác dụng của chất KTMD
Các chất KTMD khi đợc đa vào cơ thể sẽ phát huy tác dụng trên toàn cơ
thể, đặc biệt là trên hệ thống MD, làm cho hệ MD từ trạng thái bình thờng hay bị
suy giảm trở nên hoạt động tốt hơn, đáp ứng với KN ở mức độ cao hơn để có thể
loại trừ một cách hữu hiệu mọi tác nhân gây bệnh xâm nhập vào cơ thể.
1.2.2.1. Vị trí tác động của chất KTMD
- Tác động vào khâu ĐƯMD tự nhiên
Để làm nhiệm vụ tăng cờng hệ thống MD, các chất KTMD có thể tác động
vào một hay nhiều khâu trong "hàng rào MD không đặc hiệu" của cơ thể nh:
. hàng rào vật lý (da, niêm mạc) : Acridin và dẫn xuất của nó có tác dụng kích
thích sinh trởng các tế bào biểu mô, tăng tiết chất nhầy, do đó làm tăng cơ chế bảo
vệ tự nhiên.
. hàng rào hoá học bao gồm các thành phần bổ thể, các yếu tố đông máu, các
protein pha cấp... có vai trò ngăn chặn KN xâm nhập theo cơ chế không đặc hiệu:
IL-6 làm tăng số lợng và hoạt hoá tiểu cầu, tăng hàm lợng protein pha cấp; IL-1,
Jusan-Taihoto làm tăng hàm lợng bổ thể, ceruloplasmin, haptoglobin; Bronchovaxom cảm ứng sinh tổng hợp IFN.
. hàng rào tế bào là các tế bào tham gia trực tiếp hay gián tiếp loại trừ vi
khuẩn, virus, ký sinh trùng, tế bào ung th. Đây cũng chính là bộ phận quan trọng
nhất trong cơ chế bảo vệ tự nhiên của cơ thể bao gồm các tế bào thực bào (bạch cầu
hạt trung tính và ĐTB), bạch cầu ái toan, ái kiềm, bạch cầu NK, tế bào mast, tế bào
nội mô... Hormon tuyến ức, một số IL, IFN-, hầu hết các chất KTMD tổng hợp,
một số chất KTMD có nguồn gốc vi sinh có tác dụng kích thích các tế bào thực
bào; Tuftsin, Linomide, hormon tuyến ức, IL-2, RU 41.740, Krestin, protein A,
Isorel tác động vào tế bào NK; IL-1, IL-6 kích thích hoạt động của các tế bào viêm.

10

Dự án KC10-DA13

- Tác động vào khâu ĐƯMD đặc hiệu
Phơng thức đáp ứng này là do các tế bào lympho đảm nhiệm việc sản xuất
ra các phân tử tiếp nhận đặc hiệu (các KT dịch thể và tế bào) để liên kết với KN và
rồi thông qua đó loại trừ chúng một cách trực tiếp hay gián tiếp. Tế bào lym B đảm
nhiệm chức năng ĐƯMD dịch thể bằng cách sản xuất ra các KT dịch thể (Ig) và tế
bào lym T chịu trách nhiệm trên ĐƯMD qua trung gian tế bào.
Có rất nhiều chất KTMD tác động vào các tế bào lympho và ĐTB để tăng
cờng ĐƯMD đặc hiệu:
. Những chất làm tăng cờng ĐƯMD dịch thể: levamizol, forphenicinol; RU
41740; IL-15, TNF, IFN; Isorel, Lectin của một số họ đậu.
. Những chất làm tăng cờng ĐƯMD tế

bào: azimexon, linomide,

isoprinosine, levamisol, imuthiol; IL-2, hormon tuyến ức; protein A, RU 41740;
lectin một số họ đậu.
. Một số chất làm tăng cờng cả ĐƯMD dịch thể và tế bào: bestatin, isorel,
forphenicinol, RU 41740, IL-2, TNF.
Nh vậy, nhìn chung các chất KTMD có thể tác động đến hầu hết các khâu
của quá trình ĐƯMD và trong từng khâu đó đều thấy có mặt của của các chất
KTMD có nguồn gốc và bản chất khác nhau.
1.2.2.2. Cơ chế tác dụng của chất KTMD:
Mỗi chất KTMD có cơ chế hoạt động riêng, tuy nhiên có thể liệt kê những
đặc tính cơ bản sau:
- Chất KTMD có thể kích thích làm tăng sinh tế bào bằng cách đẩy nhanh quá trình
phân bào ở tế bào gốc (stem cells), tác động vào quá trình biệt hoá và trởng thành

của các tế bào bạch cầu ở tuỷ xơng hay tuyến ức, do đó tác động lên các tế bào có
thẩm quiền MD làm cho chúng từ trạng thái "nghỉ" hoặc cha hoàn chỉnh về chức
năng trở thành các tế bào có chức năng MD thực thụ. Sự phát triển đầy đủ về số

11


Dự án KC10-DA13

lợng các tế bào có chức năng của mỗi dòng chính là cơ sở để tăng cờng hệ thống
MD nói chung.
- Chất KTMD có khả năng làm tăng cờng hoạt động chức năng của các tế bào
MD: Mỗi loại tế bào MD có chức năng riêng, khi tế bào đợc hoạt hoá sẽ tham gia
vào ĐƯMD không đặc hiệu hay đặc hiệu để chống lại một hay nhiều tác nhân gây
bệnh nào đó: Tế bào thực bào đợc hoạt hoá sẽ có khả năng ăn các vật lạ, tiêu hoá
chúng và chế tiết ra những yếu tố hoà tan để tham gia vào ĐƯMD cũng nh phản
ứng viêm mạnh hơn nhiều so với khi chúng đang ở trạng thái nghỉ. Tơng tự nh
vậy, các tế bào lympho B đợc hoạt hoá sẽ biệt hoá thành plasmocyte (tơng bào)
sản xuất ra những KT dịch thể; tế bào lympho T đợc hoạt hoá sẽ gây độc trực tiếp
hay gián tiếp các tế bào nhiễm virus hoặc tế bào ung th thông qua lymphokin. Vai
trò chủ yếu của chất KTMD là làm tăng quá trình hoạt hoá này và thờng là nó có
khả năng phục hồi chức năng của các tế bào MD đã bị suy giảm do một nguyên
nhân nào đó gây ra. Tác dụng này rất có ý nghĩa vì phục hồi chức năng của mỗi tế
bào chính là cơ sở để phục hồi chức năng của cả dòng tế bào đó và cho cả hệ thống
MD.
- Chất KTMD giúp cho các tế bào MD có sự liên hệ, hợp tác với nhau tốt hơn trong
quá trình ĐƯMD. Mọi tế bào khi hoạt động bình thờng vẫn đảm bảo đợc chức
năng của nó, nhng nếu chúng không liên hệ, hợp tác đợc với nhau và với các
dòng tế bào khác thì cũng sẽ dẫn đến rối loạn MD. Còn trong các trờng hợp suy
giảm MD, việc dùng chất KTMD có thể đợc xem nh là một sự bổ xung thêm

vào tình trạng thiếu hụt các chất có chức năng điều hoà ĐƯMD trong điều kiện
bệnh lý.
1.2.3. Phơng thức sử dụng thuốc KTMD
Hiệu lực tác dụng của thuốc KTMD liên quan đến nhiều yếu tố nh: liều
lợng, thời điểm dùng, đờng dùng, sự tơng tác của các thuốc khác dùng đồng
thời và trạng thái của cơ thể khi sử dụng thuốc.

12