PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN HỦY SINH HỌC HYDROCACBON THƠM CỦA MỘT VÀI CHỦNG VI KHUẨN ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ NƯỚC Ô NHIỄM DẦU TẠI QUẢNG NINH
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.37 MB, 39 trang )
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
---------------------------------
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
---------------------------------
LÊ TIẾN MẠNH
LÊ TIẾN MẠNH
PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU
KHẢ NĂNG PHÂN HỦY SINH HỌC
HYDROCACBON THƠM
CỦA MỘT VÀI CHỦNG VI KHUẨN
ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ NƯỚC Ô NHIỄM DẦU
TẠI QUẢNG NINH
PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU
KHẢ NĂNG PHÂN HỦY SINH HỌC
HYDROCACBON THƠM
CỦA MỘT VÀI CHỦNG VI KHUẨN
ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ NƯỚC Ô NHIỄM DẦU
TẠI QUẢNG NINH
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60.42.30
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Người hướng dẫn khoa học: TS. NGHIÊM NGỌC MINH
Thái nguyên - 2008
Thái nguyên - 2008
LỜI CAM ĐOAN
Lêi c¶m ¬n!
Trước hết tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành, sâu sắc tới TS.
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số
Nghiêm Ngọc Minh đã tận tình hướng dẫn và dìu dắt tôi trong quá trình
liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa có ai công
nghiên cứu và hoàn thành luận văn.
bố trong một công trình nào khác.
Trong quá trình nghiên cứu vừa qua, tôi đã nhận được sự giúp đỡ và
chỉ bảo tận tình của PGS.TS. Đặng Thị Cẩm Hà và các anh chị Phòng Công
nghệ Sinh học Môi trường, đặc biệt là KS. Đàm Thúy Hằng, Thạc Sỹ Nguyễn
Tác giả
Bá Hữu những người đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn của
mình.
Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học,
Lê Tiến Mạnh
Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để
hoàn thành bản luận văn này.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ban chủ nhiệm khoa,
các thầy cô và các bạn đồng nghiệp Khoa Sinh – KTNN đã tạo điều kiện,
giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu tại trường Đại học Sư
Phạm - Đại Học Thái Nguyên.
Bên cạnh đó, tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình và bạn
bè đã tạo điều kiện động viên giúp đỡ tôi cả về vật chất và tinh thần để tôi
có thể hoàn thành bản luận văn này.
Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả sự giúp
đỡ quý báu đó!
Hà nội, tháng 9 năm 2008
Học viên
Lê Tiến Mạnh
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
MỤC LỤC
2.1.1. Nguyên liệu.........................................................................33
2.1.2. Hóa chất .............................................................................33
BẢNG CHỮ VIẾT TẮT ....................................................................1
2.2. Môi trƣờng nuôi cấy....................................................................33
DANH MỤC CÁC BẢNG.................................................................2
2.3. Máy móc và thiết bị nghiên cứu ...................................................34
DANH MỤC CÁC HÌNH ..................................................................3
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................34
MỞ ĐẦU ..........................................................................................
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................8
2.4.1. Phân lập vi sinh vật trên mẫu nƣớc nhiễm dầu ......................34
2.4.2. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của một số
1.1 Đặc điểm cơ bản của hợp chất hydrocarbon thơm đa nhân .............8
chủng vi khuẩn .............................................................................35
1.1.1. Tính chất hóa lý ..................................................................8
2.4.3. Đánh giá khả năng sử dụng PAH của vi khuẩn......................36
1.1.2 Tính độc của PAH và ảnh hƣởng của nó tới môi trƣờng
2.4.4. Xác định trình tự gen mã hóa 16S rRNA và catechol
sống .............................................................................................10
2,3-dioxygenase............................................................................36
1.2. Nguồn gốc phát sinh PAH ..........................................................13
2.4.4.1. Tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn theo
1.2.1. Hiện trạng ô nhiễm PAH trên thế giới và ở Việt Nam ...........13
phƣơng pháp của Sambrook, Russell ........................................36
1.2.2. Nguồn gốc phát sinh ............................................................14
2.4.4.2. Nhân đoạn gen bằng phƣơng pháp PCR ........................37
1.3. Các biện pháp xử lý tẩy độc PAH ................................................15
2.4.4.3. Quy trình biến nạp và chọn dòng ..................................38
1.3.1 Phƣơng pháp hóa lý ..............................................................16
2.4.4.4. Phƣơng pháp xác định trình tự gen bằng máy tự
1.3.2. Phƣơng pháp phân hủy sinh học ...........................................16
động ........................................................................................40
1.4. Phân hủy sinh học các PAH bởi vi sinh vật ..................................19
2.4.4.5. Phƣơng pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại ...........41
1.4.1. Vi sinh vật phân hủy PAH ...................................................19
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................42
1.4.2. Cơ chế phân hủy PAH bởi VSV ...........................................21
3.1. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng phát triển
1.5. Các yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình phân hủy các hợp chất
trên môi trƣờng chứa PAH .................................................................42
hydrocarbon thơm đa nhân .................................................................25
3.2. Đặc điểm hình thái và tế bào của chủng vi khuẩn BQN31 .............44
1.6. Các phƣơng pháp phân loại vi sinh vật ........................................29
3.3. Khả năng sử dụng các loại PAH của chủng vi khuẩn
1.6.1. Phƣơng pháp phân loại truyền thống ...................................29
BQN31 .............................................................................................45
1.6.2. Phƣơng pháp phân loại bằng sinh học phân tử .....................30
3.4. Xác định trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA của chủng
CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................33
BQN31 .............................................................................................49
2.1. Nguyên liệu và hóa chất .............................................................. 33
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
1
Luận văn tốt nghiệp
3.4.1. Tách chiết DNA tổng số và nhân đoạn gen mã hóa
16S rRNA bằng kỹ thuật PCR .......................................................49
3.4.2. Tách dòng gen mã hóa 16S rRNA từ chủng BQN31 ............50
3.4.3 Tách DNA plasmid và kiểm tra các dòng khuẩn lạc
thích hợp ......................................................................................52
3.4.4. Trình tự gen 16S rRNA của chủng vi khuẩn BQN31 .............54
3.5. Nhân đoạn gen mã hóa catechol 2,3 dioxygenase từ chủng
BQN31 .............................................................................................57
IV. KẾT LUẬN ........................................................................................62
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................63
Khoa Sinh - KTNN
BẢNG CHỮ VIẾT TẮT
bp
Base pair (cặp bazơ)
USEPA
United State Environmental Protection Agency (Cục bảo vệ
môi trường Hoa Kỳ)
LB
Luria-Bertani
PCR
Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp)
POP
Persistent Organic Pollutant
DNA
Deoxyribonucleic acid
RNA
Ribonucleic acid
rRNA
Ribosomal ribonucleic acid
VSV
Vi sinh vật
X-gal
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside
μl
Microlit
μm
Micromet
PAH
Polycyclic aromatic hydrocacbon (hydrocarbon thơm đa
nhân)
ppm
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
đơn vị một phần triệu (mg/l)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Luận văn tốt nghiệp
2
Khoa Sinh - KTNN
DANH MỤC CÁC BẢNG
Luận văn tốt nghiệp
3
Khoa Sinh - KTNN
DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Trang
Bảng 1.1: Tính chất vật lý của một số loại PAH ......................................... 9
Bảng 1.2: Một số chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy PAH ................. 20
Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của một số hydrocacbon thơm đa nhân
Bảng 1.3: Một số phương pháp phân loại vi sinh vật ................................. 30
(PAH) ...................................................................................................... 8
Bảng 3.1: Số lượng vi khuẩn phân lập được trên mô i trường khoáng
Hình 1.2: Các con đường phân hủy PAH ở vi sinh vật ............................... 21
có bổ sung các hợp chất PAH .................................................................... 42
Hình 1.3: Ba con đường phân hủy hiếu khí PAH chính của vi khuẩn
Bảng 3.2. Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn ............................... 44
và nấm .................................................................................................... 22
Bảng 3.3: phổ UV đo khả năng phân hủy các PAH của chủng
Hình 3.1: Khả năng phân hủy phenanthrene của 4 chủng BQN30,
BQN31..................................................................................................... 46
BQN31, BQN32, BQN33.......................................................................... 43
Bảng 3.4: Khả năng sử dụng các PAH khác nhau của chủng BQN31 .......... 46
Hình 3.2: Hình thái khuẩn lạc chủng vi khuẩn BQN31............................... 45
Bảng 3.5: Độ tương đồng của chủng BQN31 so với một số đại diện
Hình 3.3: Hình thái tế bào vi khuẩn BQN31 .............................................. 45
đã được công bố trên ngân hàng gen quốc tế .............................................. 56
Hình 3.4: DNA tổng số của chủng BQN31 ............................................... 50
Bảng 3.6: Độ tương đồng của đoạn gen mã hóa enzyme catechol 2,3
Hình 3.5: Sản phẩm PCR nhân đoạn gene mã hóa 16S rRNA của
dioxygenase của chủng BQN31 so với một số đại diện đã được công
chủng BQN31........................................................................................... 50
bố trên ngân hàng gen quốc tế ................................................................... 60
Hình 3.6: Kết quả biến nạp chủng BQN31 ................................................ 51
Hình 3.7: Sản phẩm điện di kiểm tra DNA plasmid của các dòng
được lựa chọn ........................................................................................... 52
Hình 3.8: Sản phẩm cắt DNA plasmid của dòng số 13 ............................... 53
Hình 3.9: Sản phẩm làm sạch DNA plasmid dòng số 13 của chủng
vi khuẩn BQN31....................................................................................... 53
Hình 3.10: Trình tự đầy đủ đoạn gen 16S rRNA của chủng BQN31 ........... 54
Hình 3.11: Cây phát sinh loài dựa trên so sánh trình tự các đoạn gen
mã hóa 16S rRNA của chủng BQN31 và một số chủng vi khuẩn đại
diện. Thước đo thể hiện hai nucleotide khác nhau trên 1.000
nucleotide so sánh..................................................................................... 55
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Luận văn tốt nghiệp
4
Khoa Sinh - KTNN
Luận văn tốt nghiệp
Hình 3.12: Sản phẩm PCR nhân đoạn gen mã hóa enzyme catechol
2,3-dioxygenaza từ DNA tổng số chủng BQN31 và cặp mồi C23OF
5
Khoa Sinh - KTNN
MỞ ĐẦU
Trong thời đại ngày nay, cùng với sự phát triển nhanh chóng của xã
và C23OR ................................................................................................ 58
hội, nhu cầu về nguyên liệu và nhiên liệu của con người ngày càng tăng, đã
Hình 3.13: Trình tự nucleotide và trình tự axít amin suy diễn đoạn
kéo theo sự mở rộng các ngành công nghiệp khai thác, chế biến như : công
gen mã hóa enzyme catechol 2,3-dioxygenaza của chủng
nghiệp dầu mỏ, khai thác chế biến than, công nghiệp sản xuất sơn, sản xuất
Sphingomonas sp. BQN31 ........................................................................ 58
các hóa chất tẩy rửa...
Hình 3.14: Cây phát sinh loài dựa trên so sánh trình tự các đoạn gen
Quảng Ninh là một tỉnh nằm trong vùng kinh tế trọng điểm Bắc Bộ, có
mã hóa enzyme catechol 2,3-dioxygenaza của chủng Sphingomonas
tốc độ tăng trưởng kinh tế cao so với bình quân chung của cả nước. Trong
sp. BQN31 và một số chủng vi khuẩn đại diện. Thước đo thể hiện
những năm gần đây, các ngành công nghiệp và dịch vụ chiếm một tỷ trọng
một nucleotide khác nhau trên 100 nucleotide so sánh ................................ 59
lớn, khoảng trên 80% GDP của tỉnh. Các ngành công nghiệp khai thác và chế
biến than, xi măng, đóng tàu, nhiệt điện, sản xuất vật liệu xây dựng đang có
tốc độ phát triển nhanh. Quảng Ninh là một trong những điểm trung chuyển
xăng dầu lớn nhất cả nước. Hoạt động vận tải đường bộ, đường thủy; các hoạt
động du lịch, vận tải khách du lịch….diễn ra hết sức sôi động. Các hoạt động
trên đã tạo ra một bộ mặt kinh tế rất đa dạng của Quảng Ninh. Tuy nhiên, các
hoạt động đó cũng đã gây ra những hậu quả không nhỏ về môi trường, đặc
biệt là các hoạt động vận chuyển và khai thác than, chế biến và sử dụng vật
liệu nổ, các hoạt động vận tải, trung chuyển xăng dầu… ở Quảng Ninh.
PAH là một nhóm các hợp chất hữu cơ có hai hay nhiều vòng thơm.
Chúng có mặt khắp nơi trong môi trường (đất, không khí, các nguồn nước và
các lớp trầm tích) và là một trong các thành phần có trong các sản phẩm của
dầu mỏ [16]. Một số PAH có khả năng gây ung thư tiềm tàng, gây đột biến và
là chất gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng. Tổ chức bảo vệ môi trường Mỹ
(USEPA) đã xếp PAH vào nhóm những chất ô nhiễm điển hình và tiến hành
kiểm soát sự có mặt của PAH trong các hệ sinh thái dưới nước cũng như trên
cạn [16], [50].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Luận văn tốt nghiệp
6
Khoa Sinh - KTNN
Trong nước thải tại nhiều cơ sở sản xuất công nghiệp ở Quảng Ninh,
ngoài một số hợp chất hữu cơ, vô cơ (NH4 NO3) thì sự có mặt của dầu và một
số các hợp chất hydrocarbon thơm đa nhân (PAH) đang là vấn đề lớn đặt ra
Luận văn tốt nghiệp
7
Khoa Sinh - KTNN
Mục tiêu nghiên cứu:
Phân lập và tuyển chọn ra được một số chủng vi khuẩn có khả năng
phân huỷ hợp chất hydrocacbon thơm.
đòi hỏi các cấp chính quyền địa phương cần phải quan tâm xử lý triệt để. Hiện
nay để khắc phục hậu quả này có nhiều phương pháp có thể áp dụng như sử
Nội dung nghiên cứu của luận văn bao gồm:
dụng hóa chất, hấp phụ, lắng đọng… Tuy nhiên các phương pháp này đòi hỏi
1. Phân lập và tuyển chọn một số loại vi khuẩn có khả năng phân hủy
chi phí lớn và vẫn có thể gây ra ô nhiễm thứ cấp.
Qua thử nghiệm thực tế, phương pháp xử lý bằng công nghệ sinh học
đã và đang khẳng định tính ưu việt của nó. Đó là giá thành rẻ, có thể tiến hành
thuận lợi trong điều kiện tự nhiên, độ an toàn rất cao và thân thiện với môi
trường. Do vậy, trên thế giới và ở Việt Nam đã có nhiều nhà khoa học tập
trung nghiên cứu về điều tra về phân bố, cấu trúc các tập đoàn vi sinh vật, khả
năng phân hủy PAH của các chủng đơn cũng như các tập đoàn vi sinh vật.
Các gen tham gia quá trình phân hủy sinh học PAH cũng được quan trắc trong
PAH.
2. Nghiên cứu, đánh giá khả năng phân hủy sinh học PAH của một số
chủng vi khuẩn đã được phân lập.
3. Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái tế bào của một đại diện vi khuẩn
có khả năng phân hủy PAH.
4. Phân loại định tên đại diện vi khuẩn có khả năng phân hủy PAH dựa
trên việc xác định trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA.
quá trình xử lý, của các tập đoàn VSV bản địa và trong các nghiên cứu phân
hủy PAH ở điều kiện phòng thí nghiệm. Catechol là một trong các sản phẩm
trung gian của quá trình phân hủy sinh học các hợp chất vòng thơm, do vậy
các gen mã hóa các enzym chuyển hóa catechol được nhiều nhà nghiên cứu
quan tâm.
Chính vì những yêu cầu thực tiễn trên, chúng tôi đã lựa chọn nghiên
cứu và thực hiện đề tài “Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu khả năng
phân hủy sinh học hydrocarbon thơm của một vài chủng vi khuẩn được
phân lập từ nước ô nhiễm dầu tại Quảng Ninh”.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Luận văn tốt nghiệp
8
Khoa Sinh - KTNN
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
9
Luận văn tốt nghiệp
Khoa Sinh - KTNN
Số lượng vòng benzen trong cấu trúc hóa học của các PAH quyết định khả
năng hòa tan của các PAH trong nước. PAH giảm khả năng hòa tan trong
1.1 Đặc điểm cơ bản của hợp chất hydrocarbon thơm đa nhân
nước hay tăng tính kỵ nước khi số lượng vòng benzen tăng [54]. Khả năng
1.1.1 Tính chất hóa lý
Các PAH có mặt khắp nơi trong môi trường, những hợp chất này có 2-
hòa tan của các PAH rất biến động, từ những chất khó hòa tan nhất là
6 vòng benzen kết hợp với nhau. Trọng lượng phân tử vào khoảng 128 – 278
g/mol (Hình 1.1).
benzo(b)perylen có chỉ số hòa tan là 0,003 mg/l cho đến chất dễ hòa tan nhất
là naphthalen có chỉ số hòa tan tới 31 mg/l. Nếu khả năng hòa tan trong nước
của PAH thấp, hay hệ số hấp phụ cao sẽ dẫn đến các PAH có xu hướng bị hấp
phụ trong cặn bùn, đất đá và trầm tích, do đó ảnh hưởng rất nhiều tới khả
năng chúng bị phân hủy sinh học bởi vi sinh vật [10]. Ngược lại, khả năng
hòa tan trong nước của PAH cao thì khả năng bị phân hủy bởi vi sinh vật
cũng cao. Điều đó cho thấy khả năng hòa tan trong nước của các PAH có ảnh
hưởng đặc biệt quan trọng trong quá trình phân hủy sinh học PAH.
Bảng 1.1: Tính chất vật lý của một số loại PAH [31]
Loại PAH
Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của một số hydrocarbon
thơm đa nhân (PAH)
PAH là những chất kỵ nước. Khả năng gây ô nhiễm môi trường tùy
Nhiệt độ
Số
nóng chảy
vòng
(o C)
thơm
Nhiệt độ
sôi
(o C)
Độ tan
trong
nước
(mg/l)
LogKp
d
Áp suất
hơi ở
20o C
(torr)
Phenanthrene
3
101
340
1,29
4,45
6,8x10-4
Anthracene
3
216
340
0,07
4,46
2,0x10-4
Fluoranthene
4
111
250
0,26
5,33
6,0x10-6
Benzo[a]anthracene
4
158
400
0,24
5,61
5,0x10-9
Pyrene
4
149
360
0,14
5,32
6,8x10-7
Chrysene
4
255
488
0,02
5,61
6,3x10-7
Benzo[a]pyrene (BaP)
5
179
496
0,0038
6,04
5,0x10-7
Dibenzo[a]anthracene
5
262
524
0,0005
5,97
1,0x10-10
Benzo[g,h,i]perylen
6
222
--
0,0003
7,23
1,0x10-10
điểm về khả năng hòa tan và áp suất hơi của PAH là nhân tố chính ảnh hưởng
* Kp d= [octanol]/ [nước]
Trong các tính chất vật lý của PAH, hệ số Kp d phản ánh khả năng hấp
đến khả năng phân tán của chúng trong khí quyển, thủy quyển và sinh quyển.
phụ lên bề mặt vật liệu rắn. Nếu hệ số Kp d cao, các PAH có xu hướng tăng
thuộc khả năng hòa tan của chúng trong môi trường nước [16], [48]. Đặc
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Luận văn tốt nghiệp
10
Khoa Sinh - KTNN
Luận văn tốt nghiệp
11
Khoa Sinh - KTNN
khả năng hấp phụ lên bề mặt các vật liệu rắn, đồng nghĩa với sự giảm khả
khác đã đưa ra kết luận: các PAH có khối lượng phân tử nhỏ, cấu tạo phân tử
năng phân hủy sinh học.
chỉ có một, hai, ba vòng thơm là rất độc, trong khi các PAH có khối lượng
Áp suất hơi và nhiệt độ sôi của các PAH cũng có vai trò quan trọng
phân tử lớn lại có thể gây độc ở mức độ gen, hoặc gây ra đột biến, bởi chúng
trong quá trình xử lý loại bỏ PAH khỏi các vùng bị ô nhiễm do nó ảnh hưởng
có khả năng gắn vào các phân tử DNA, RNA, hoặc protein, gây nên những
đến khả năng hóa hơi của mỗi PAH. Khi áp suất hơi tăng, khả năng bay hơi
biến đổi ở mức phân tử [16], [42].
của các PAH cũng tăng, mà sự bay hơi cũng là một con đường để loại bỏ
Naphthalene là một chất ô nhiễm thuộc nhóm PAH gây ảnh hưởng tới
PAH khỏi nguồn ô nhiễm. Khả năng bay hơi của các PAH cũng phụ thuộc
một loạt các cơ quan như phổi, thận và kìm hãm quá trình hô hấp. Nhiễm độc
vào kích thước và khối lượng phân tử. Naphthalene có kích thước nhỏ nhất
naphthalene ở người dẫn tới bệnh thiếu máu và viêm thận. Ngoài ra, sự thay
nên có khả năng bay hơi đến 89%, trong khi đó benzo[a]pyrene (BaP) là hợp
đổi về da và mắt ở những người bị phơi nhiễm naphthalen cũng đã được công
chất có kích thước lớn, chỉ có khả năng bay hơi 1%. Phenanthrene là đồng
nhận. Phenanthrene được biết như chất cảm quang với da người, chất gây dị
phân của anthracene có độ bay hơi thấp hơn do cấu trúc phân tử chứa các
ứng với động vật, đột biến tới hệ thống vi khuẩn trong các điều kiện đặc biệt.
vòng thơm không thẳng hàng như trong cấu trúc của anthracene (Hình 1.1 và
Chất này gây yếu các nhiễm sắc thể tương đồng và kìm hãm sự nối liền các kẽ
Bảng 1.1).
hở gian bào. Ngoài ra, các PAH khác như acenaphthalene, fluoranthene,
PAH còn bị phân hủy dưới ánh sáng tử ngoại từ bức xạ mặt trời. Trong
fluorene đều gây độc cho động và thực vật. Độc tính của benzo(a)pyrene,
khí quyển, PAH có thể phản ứng với những chất ô nhiễm như nitrogen oxid,
benzo(a)anthracene, benzo(b)fluoranthrene, benzo(k)fluoranthrene, dibenzen
sulfur oxid tạo thành các dạng dione, nitro và dinitro PAH và sulfonic acid.
(a,h)anthracene và indenol(1,2,3-c,d)pyrene đã được nghiên cứu chứng minh
1.1.2 Tính độc của PAH và ảnh hưởng của nó tới môi trường sống
gây ung thư cho người. Trong tự nhiên hiếm khi bắt gặp các PAH đơn lẻ mà
Tính độc của PAH đã được người ta biết đến từ những năm 30 của thế
kỷ XX, khi Hieger và Cook cùng những cộng sự khác nghiên cứu và thấy
chỉ gặp chúng ở dạng hỗn hợp nhiều PAH, do đó độc tính của chúng càng
được tăng cường [53].
tinh thể benzo(a)pyrene màu vàng gây khối u ở động vật thí nghiệm [17]. Với
PAH thâm nhập gián tiếp vào cơ thể con người thông qua chuỗi thức
con người, PAH có thể là tác nhân gây đột biến và dẫn đến ung thư [16],
ăn, đường hô hấp hoặc qua sự tiếp xúc trực tiếp với nguồn ô nhiễm, gây ung
[31], [11], [27]. Ở quy mô phòng thí nghiệm, một số nghiên cứu đã chỉ ra
thư, đột biến gen. Rất nhiều PAH có chứa “vùng bay” và vùng tương tự nó
rằng, quá trình gây ung thư bởi PAH là một quá trình phức tạp, đa giai đoạn
“vùng K”. Cả hai vùng này đều cho phép trao đổi chất, tạo ra dạng liên kết
và phụ thuộc vào nhiều yếu tố : kích thước phân tử PAH, độ phân cực trong
“epoxit-vùng bay” và “epoxit- vùng K” có khả năng hoạt động cao và một số
phân tử, hóa học lập thể và các phản ứng xảy ra trong quá trình trao đổi chất,
chúng là nguyên nhân gây ra ung thư [53].
các nguyên tố mang điện tích mà có ảnh hưởng đến sự gắn kết của các sản
Khi xâm nhập vào cơ thể, PAH nhanh chóng xâm nhập vào các mô mỡ
phẩm trao đổi chất với các đại phân tử là DNA, RNA. Một số nghiên cứu
và tiếp tục di chuyển đến những cơ quan khác. Tùy từng loại PAH với liều
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Luận văn tốt nghiệp
12
Khoa Sinh - KTNN
Luận văn tốt nghiệp
13
Khoa Sinh - KTNN
lượng và thời gian tác động mà mức độ ảnh hưởng đến cơ thể khác nhau.
Do tính độc hại như vậy, cơ quan bảo vệ môi trường Mỹ (USEPA) đã
Chẳng hạn, với naphthalene, nếu tiếp xúc trong thời gian ngắn, nồng độ thấp,
xếp PAH vào danh sách một trong những chất ô nhiễm điển hình và đã tiến
nó có thể gây dị ứng, viêm tấy da, mắt. Khi xâm nhập vào hệ tiêu hóa,
hành kiểm định sự có mặt của PAH trong hệ sinh thái dưới nước cũng như
naphthalene sẽ gây bệnh thiếu máu do chúng phá vỡ các tế bào hồng cầu. Nếu
trên cạn [16], [53].
tiếp xúc với naphthalene trong thời gian dài với nồng độ lớn hơn 10 ppm sẽ
1.2. Nguồn gốc phát sinh PAH
dẫn tới các bệnh kinh niên, gây ung thư da phổi và có thể làm giảm khả năng
1.2.1. Hiện trạng ô nhiễm PAH trên thế giới và ở Việt Nam
thụ thai ở phụ nữ và có thể làm nguy hiểm tới sự phát triển của thai nhi [31].
Các hydrocarbon thơm đa nhân đã được tìm thấy ở nhiều môi trường
Trong số các PAH, người ta đặc biệt chú ý đến benzo[a]pyrene vì tính
sinh thái khác nhau, kể cả môi trường không khí. Trong môi trường nước,
độc hại của nó. Benzo[a]pyrene (BaP) là một thành phần có trong khói thuốc
PAH phân bố rộng rãi. Người ta ước tính, hàng năm có khoảng 2,3x105 tấn
lá, và là một trong những nguyên nhân dẫn đến ung thư phổi [16], [31]. Nhiều
các hợp chất này đã xâm nhập vào các hệ sinh thái dưới nước. Đặc biệt, với
nghiên cứu đã chứng minh BaP có thể chuyển hóa thành các loại oxid với sự
hệ sinh thái bị ô nhiễm PAH vùng ven bờ biển thường có nguồn gốc từ phế
xúc tác của phức hệ cytochrome P450, mà những oxid này có thể phản ứng
thải và công nghiệp hóa dầu, công nghiệp khai thác và vận chuyển dầu mỏ,
với các DNA gây đột biến. BaP cũng được xác định là nguyên nhân gây ung
nước thải công nghiệp và sinh hoạt, cháy rừng và cháy đồng cỏ [61]. Người ta
thư cho con người và động vật [16], [31], [55].
đã định lượng được nồng độ BaP trong nước uống là 0,0002 đến 0,024 g/l.
Một vài nghiên cứu trên đối tượng động, thực vật cho thấy, động vật
Trong 90 mẫu nước kiểm tra ở Mỹ cho thấy nồng độ của 6 PAH từ 0,001 đến
nếu tiếp xúc với naphthalene ở nồng độ cao, thì chỉ trong thời gian ngắn cũng
0,01 g/l, 1% mẫu nước kiểm tra cho thấy nồng độ trung bình lớn hơn 0,1
có thể gây mờ mắt, gây độc ở mức độ vừa phải. Hiệu ứng mạnh hơn,
g/l [31].
naphthalene có thể gây chậm phát triển, thậm chí gây chết với động thực vật.
Nhiều công trình nghiên cứu còn cho thấy, sự có mặt của PAH trong
Nghiên cứu ngưỡng độc của naphthalene đối với loài cá vược, người ta đã xác
các mẫu trầm tích với nồng độ đáng kể. Một số nơi có mức độ ô nhiễm PAH
định LC50 là 240 g/l (LC50 là liều gây chết 50% mẫu sinh vật thí nghiệm).
rất cao: nồng độ các hợp chất PAH ở vịnh Boston (Mỹ) có thể lên tới 100.000
Bằng việc thử nghiệm với một nhóm chuột cho sử dụng anthracene với lượng
ng/g. Nguyên nhân chủ yếu là do trong môi trường biển hầu hết các hợp chất
1,8 µg/l, người ta thấy rằng, sau 2 tuần gây nhiễm, tỷ lệ chuột xuất hiện khối
PAH hòa tan kém trong nước đã dẫn đến việc chúng được tích lũy trong các
u là 40% [31].
lớp trầm tích [31].
Sự tồn tại của các hợp chất PAH trong môi trường vùng bờ biển có thể
Trong không khí cũng chứa một lượng đáng kể PAH. Đã có hơn 500
đe dọa tới sức khỏe con người và môi trường biển thông qua các tác động trực
PAH và các hợp chất liên quan được phát hiện trong không khí, đặc biệt là
tiếp hoặc qua các chuỗi thức ăn trong chu trình vật chất [61].
BaP chiếm tỷ lệ cao nhất. Vào những năm 1970, ở Mỹ, nồng độ BaP trong
không khí trung bình là 1- 5 ng/m3. Trong 30 năm trở lại đây, nồng độ BaP có
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Luận văn tốt nghiệp
14
Khoa Sinh - KTNN
Luận văn tốt nghiệp
15
Khoa Sinh - KTNN
xu hướng giảm, tuy nhiên con số này hiện nay vẫn còn cao, khoảng 4 ng/m3 ở
Tại các nước công nghiệp phát triển, các hoạt động có liên quan đến
Copenhagen (Đan Mạch). Ở Trung Quốc, việc đốt than trong các hộ gia đình
đốt cháy tạo ra một lượng lớn PAH. Các PAH này được tích tụ lại trong đất
3
3
tạo ra một lượng BaP khoảng 14,7 g/m , ở Ấn Độ là 4 g/m [31]
Người ta cũng tìm thấy hydrocarbon thơm đa nhân nhiều trong đất bề
và làm tăng nồng độ PAH nhanh chóng trong vòng 100 -150 năm trở lại đây
[31].
mặt. Nồng độ của PAH trong đất rừng rất dao động (từ 5 - 100 g/kg), mà
PAH là nhóm hợp chất độc, nhưng chúng lại khá quan trọng trong công
nguồn chủ yếu là từ xác thực vật do quá trình cháy, hay hấp phụ PAH từ
nghiệp, đặc biệt trong các ngành công nghiệp dược, nhuộm, sản xuất đồ nhựa
không khí. Với đất nông nghiệp, mức độ ô nhiễm PAH từ 10 đến 100 g/kg,
và sản xuất thuốc trừ sâu [31]: naphthalene, anthracene, phenanthrene thường
chủ yếu do mưa làm ngưng tụ các hợp chất PAH từ khí quyển và đi vào đất.
được sử dụng trong công nghiệp sản xuất thuốc nhuộm. Naphthalene cũng
Nếu tính cho cả đất rừng và đất nông nghiệp, lượng ô nhiễm trung bình là
được dùng như thuốc xông diệt bướm trong các gia đình. Đặc biệt,
1000 g/kg. Đối với đất bị nhiễm dầu, nồng độ ô nhiễm lớn hơn nhiều so với
phenanthrene cũng được ứng dụng trong công nghiệp dược dùng để sản xuất
vùng đất rừng và đất nông nghiệp, bởi PAH là một thành phần chính có trong
thuốc ngủ. Ở New York (Mỹ), hỗn hợp phenanthrene và anthracene được sử
dầu mỏ [55].
dụng để chống rỉ cho những thiết bị trữ nước [31]. Benzo[a]pyrene được sử
Trong đất ở thành thị, nồng độ PAH khoảng 600 – 3000 g/kg, và có
thể cao hơn nữa ở những vùng có các hoạt động vận tải và sản xuất công
nghiệp [55].
để liên kết các phần tích điện lại với nhau. Người ta cũng có thể tìm thấy
trong hợp chất Creosote, một chất hóa học được sử dụng làm chất bảo quản
gỗ (PAH chiếm đến 85% khối lượng của creosote) [20], [31]. BaP cũng được
1.2.2. Nguồn gốc phát sinh
Có nhiều nguyên nhân dẫn đến sự phát sinh của PAH, nhưng chúng đều
có bản chất chung là do các quá trình đốt cháy không hoàn toàn các vật liệu
hữu cơ trong tự nhiên hay cho hoạt động sản xuất của con người. Trong tự
nhiên, PAH được phát sinh là từ các quá trình địa chất tự nhiên, hóa lỏng khí
than, các vụ cháy đồng cỏ, cháy rừng thậm chí trong các trận mưa [16], [28],
sử dụng là tác nhân gây đột biến lên động vật thí nghiệm, để kiểm tra đặc tính
gây ung thư của nó trong thời gian ngắn [31].
1.3. Các biện pháp xử lý tẩy độc PAH
Tính chất độc hại và cấu trúc khó bị phân hủy trong tự nhiên của PAH
đã trở thành một vấn đề cấp bách đang được chú ý. Người ta đã và đang
nghiên cứu nhiều biện pháp hóa học, lý học, sinh học v.v…nhằm phân hủy
[31], [38].
Con người cũng có thể gián tiếp hay trực tiếp làm phát sinh PAH vào
môi trường từ việc đốt nhiên liệu (than đá, dầu diesen, ...) trong sinh hoạt hay
trong sản xuất (đốt nhiên liệu cho các phương tiện máy móc có động cơ, quá
trình đốt rác tại các nhà lò đốt). Các vụ tràn dầu do sự cố hay trong quá trình
vận chuyển cũng làm phát sinh một lượng đáng kể PAH vào môi trường [31].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
dụng để hạn chế muội và khói, trong công nghệ quét hắc ín, hay còn sử dụng
PAH. Việc làm thay đổi cấu trúc hóa học của chất độc nhằm tạo ra các sản
phẩm ít độc hoặc không độc cho môi trường và con người đang là một thách
thức đối với các nhà khoa học và công nghệ. Để giảm độc tính của các chất
này, người ta hay phá vỡ cấu trúc phân tử của chúng bằng cách sử dụng
enzyme cắt vòng. Đến nay, trên thế giới, người ta đã đưa ra một số phương
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
16
Luận văn tốt nghiệp
Khoa Sinh - KTNN
Luận văn tốt nghiệp
17
Khoa Sinh - KTNN
pháp tiêu độc như: cô lập, chôn lấp, xử lý hóa học, đốt ở nhiệt độ cao, lý học,
khóa của công nghệ phân hủy sinh học là thúc đẩy tập đoàn vi sinh vật bản
sinh học v.v.
địa tham gia vào quá trình phân hủy ở mức cao nhất. Các nghiên cứu cơ bản
1.3.1 Phương pháp hóa lý
đều nhằm mục đích thúc đẩy hiệu quả quá trình tẩy độc thông qua việc kích
Trong cấu tạo hóa học của PAH, do có cấu trúc vòng thơm, PAH tương
thích tập đoàn vi sinh vật trong các điều kiện phân hủy khác nhau tạo ra kết
đối khó phân hủy trong tự nhiên. Phương pháp chôn lấp hay được áp dụng đối
quả cuối cùng là các sản phẩm ít độc hoặc hoàn toàn không độc. Chính vì vậy,
với nhiều chất thải, rác thải, kể cả các chất thải nguy hại trong đó có chất độc
công nghệ phân hủy sinh học đã trở thành công nghệ thân thiện với môi
hóa học [22]. Ưu điểm của phương pháp này là không tốn kém nhưng nhược
trường.
điểm là các chất độc vẫn nằm trong đất chứ không được phân hủy, các chất
độc hóa học này sẽ là nguồn tiềm tàng gây ô nhiễm cho môi trường.
Phương pháp phân hủy sinh học đã được các nhà khoa học trên thế giới
nghiên cứu và áp dụng trong những năm gần đây và cũng đã đạt được khá
Công nghệ thiêu đốt cũng đã được sử dụng trên thế giới, phương pháp
nhiều thành tựu. Công nghệ sinh học đảm bảo an toàn cho môi trường hơn tất
xử lý này tương đối triệt để song giá thành lại cao và có khả năng gây ô
cả các công nghệ khác. Đặc biệt, trong điều kiện sinh thái đa hệ, việc áp dụng
nhiễm thứ cấp bởi các sản phẩm phụ tạo trong quá trình vận hành. Các
công nghệ phân hủy sinh học PAH nói riêng và các nguồn chất độc nói chung
phương pháp hóa học như declo hóa, oxy hóa, phương pháp vật lý như quang
sẽ mang lại hiệu quả kinh tế xã hội cao nhất [59], [61].
hóa, sử dụng tia bức xạ, tia cực tím, hay áp suất cao cũng mang lại hiệu quả
Quá trình làm sạch sinh học có thể thực hiện ở quy mô lớn nhỏ khác
nhất định. Theo Draper và cộng sự (1987), xử lý bằng phương pháp quang
nhau và ở điều kiện hiếu khí hoặc kị khí. Việc tẩy độc bằng phân hủy sinh học
hóa, 80% chất độc bị phân hủy dưới tác động của chùm tia cực tím cường độ
có thể được tiến hành riêng rẽ hoặc kết hợp với các phương pháp khác, sau
3
o
20 W/cm ở nhiệt độ 20 C trong thời gian 3 ngày [25]. Tuy nhiên, những
vài tháng hoặc vài năm các chất ô nhiễm có thể được hoàn toàn loại bỏ.
phương pháp trên có nhược điểm là không có tác dụng với lớp đất có độ sâu
Phương pháp phân hủy sinh học không đòi hỏi các điều kiện phức tạp (nhiệt
dưới vài milimet, do đó chỉ xử lý được lớp đất rất mỏng trên bề mặt [49].
độ cao, áp suất lớn, quá trình xúc tác…) không gây ra ô nhiễm thứ cấp, thân
Mặc dù làm sạch PAH có thể được tiến hành bằng nhiều biện pháp lý
thiện với môi trường, chi phí thấp, do đó rất phù hợp với điều kiện ở nước ta.
hóa đã nêu ở trên, nhưng các phương pháp này có nhược điểm là gây ô nhiễm
Tuy nhiên, phương pháp sinh học thường diễn ra với tốc độ chậm, thời gian
thứ cấp nên không an toàn và không xử lý triệt để. Mặt khác, giá thành của
xử lý kéo dài. Đây chính là một nhược điểm cơ bản của nó, đòi hỏi có lời giải
việc sử dụng các phương pháp đó l ại cao nên xu hướng sử dụng chúng ngày
đáp từ phía các nhà khoa học.
càng giảm.
Xử lý chất ô nhiễm theo phương pháp sinh học có thể được tiến hành
1.3.2. Phương pháp phân hủy sinh học
theo hai hướng chính: tăng cường sinh học và kích thích sinh học. Tăng
Hiện nay, phương pháp sinh học đang bắt đầu được quan tâm bởi tính
cường sinh học là phương pháp sử dụng tập đoàn vi sinh vật bản địa đã được
an toàn và hiệu quả không những về mặt công nghệ mà còn về kinh tế. Chìa
làm giàu hoặc vi sinh vật sử dụng các chất độc từ nơi khác, thậm chí vi sinh
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Luận văn tốt nghiệp
18
Khoa Sinh - KTNN
Luận văn tốt nghiệp
19
Khoa Sinh - KTNN
vật đã được cải biến về mặt di truyền bổ sung vào các môi trường bị ô nhiễm.
vật bản địa cùng với hoạt động của vi sinh vật ngoại lai sẽ tăng cường hiệu
Tuy nhiên, vẫn còn có những khó khăn trong việc bổ sung vi sinh vật vào các
quả của quá trình xử lý [26].
nơi bị ô nhiễm do chi phí lớn; hiệu quả phân hủy nhiều khi không cao do
Quá trình làm sạch sinh học có thể thực hiện với các quy mô khác nhau
nhiều nguyên nhân (sự cạnh tranh của vi sinh vật, độ độc của môi trường; sự
và ở điều kiện hiếu khí hoặc kỵ khí. Việc tẩy độc bằng phân hủy sinh học có
thiếu hụt nguồn dinh dưỡng, các chất đa lượng và vi lượng cần thiết cho hoạt
thể tiến hành riêng rẽ hoặc kết hợp với các phương pháp khác. Sau khoảng
động phân hủy của vi sinh vật) [26].
thời gian nhất định (vài tháng hoặc vài năm), các chất ô nhiễm có thể được
Kích thích sinh học là quá trình thúc đẩy sự phát triển, hoạt động trao
loại bỏ hoàn toàn [23], [32].
đổi chất của tập đoàn vi sinh vật bản địa có khả năng sử dụng các chất độc hại
Để bảo vệ sự đa dạng vi sinh vật và an toàn đối với môi trường, cần có
thông qua việc điều chỉnh các yếu tố môi trường như độ pH, độ ẩm, nồng độ
sự giám sát chặt chẽ khi đưa các vi sinh vật từ nơi này sang nơi khác để xử lý
O2, chất dinh dưỡng, các cơ chất, các chất xúc tác v.v.
ô nhiễm, nhất là với các vi sinh vật đã được chuyển gen. Để quá trình bổ sung
Kích thích sinh học hiện là khuynh hướng được sử dụng rộng rãi trong
vi sinh vật đạt hiệu quả, cần phải bổ sung ở thời điểm mới bị ô nhiễm và với
xử lý ô nhiễm theo phương pháp phân hủy sinh học [26]. Trong hoạt động
lượng lớn vi sinh vật ở trạng thái sinh trưởng tốt trước khi các vi sinh vật bản
sống, vi sinh vật cần nguyên tố N, P, một số chất dinh dưỡng khác và các điều
địa kịp thích nghi, tấn công và làm thay đổi cấu trúc cơ chất. Tuy nhiên, việc
kiện sống thích hợp. Từ nguồn ô nhiễm, người ta có thể phân lập những
lên men vi sinh vật với khối lượng lớn là điều không dễ dàng và vô cùng tốn
chủng vi sinh vật có khả năng sử dụng PAH, nghiên cứu các đặc tính sinh lý,
kém, mặt khác cũng không đảm bảo vi sinh vật giữ nguyên được các đặc tính
sinh hóa của chúng để từ đó tìm ra điều kiện sống tối ưu của chúng từ đó ứng
phân hủy ô nhiễm [26], [27].
dụng cho việc kích thích hoạt động sống của tập đoàn vi sinh vật bản địa
1.4. Phân hủy sinh học các PAH bởi vi sinh vật
trong việc phân hủy sinh học PAH tại vùng ô nhiễm. Để tăng cường quá trình
1.4.1. Vi sinh vật phân hủy PAH
phân hủy sinh học, việc bổ sung các nguồn dinh dưỡng như nguồn cacbon,
Hiện nay, có nhiều nghiên cứu về khả năng của vi sinh vật sử dụng các
nitơ, photpho theo phải theo tỷ lệ nhất định đã đề cập ở phần trên là C:N:P =
PAH có trọng lượng phân tử thấp như naphthalene, phenanthrene và
100:10:1. Ngoài ra, các yếu tố môi trường cũng cần điều chỉnh thích hợp, đảm
anthracene. Tuy nhiên, chưa có nhiều nghiên cứu về tiềm năng phân hủy các
bảo cho tốc độ phân hủy ở mức ổn định và đạt hiệu quả cao nhất.
PAH có trọng lượng phân tử cao như chrysene và benzo[a]pyrene [16].
Đôi khi người ta cũng kết hợp cả hai biện pháp để có thể tăng cường sự
Vi sinh vật phân hủy PAH phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Số lượng
phân hủy sinh học. Có nghĩa là vừa bổ sung các chủng vi sinh vật nuôi cấy có
các vi sinh vật có khả năng phân hủy PAH tại các vùng ô nhiễm nhiều hơn so
khả năng phân hủy chất ô nhiễm, đồng thời cũng tạo điều kiện tối ưu cho tập
với các vùng không ô nhiễm. Các loài vi sinh vật trong vùng ô nhiễm có xu
đoàn vi sinh vật bản địa hoạt động. Như vậy, hoạt động của tập đoàn vi sinh
hướng thích nghi, bằng cách thay đổi cấu trúc di truyền để hướng đến việc
phân hủy PAH. Vi khuẩn có vai trò quan trọng trong tham gia phân hủy sinh
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Luận văn tốt nghiệp
20
Khoa Sinh - KTNN
Luận văn tốt nghiệp
học PAH trong nước và trầm tích, trong khi đó, nấm sợi và xạ khuẩn đóng vai
21
Khoa Sinh - KTNN
Trong một thông báo tổng quan gần đây về các phân hủy sinh học PAH
trò quan trọng phân hủy PAH và các chất ô nhiễm trong môi trường đất [27].
của Johnsen (2005) cho thấy Sphingomonas, Burkholderia, Pseudomonas và
Thống kê ở bảng 1.2 cho thấy, vi sinh vật phân hủy PAH thuộc nhiều
nhóm vi sinh vật khác nhau [3], [6], [11], [27], [33], [42], [51], [60], [58],
[61], [62]. Các vi sinh vật có khả năng chuyển hóa PAH phần lớn thuộc vi
khuẩn, vi khuẩn lam và một số vi tảo [16], [38], [58], [39], [60].
Mycobacteria là các vi khuẩn chiếm ưu thế [36].
Bảng 1.2: Một số chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy PAH
1.4.2. Cơ chế phân hủy PAH bởi VSV
Phân hủy sinh học các PAH có thể diễn ra theo hai cơ chế trao đổi chất
và đồng trao đổi chất. Quá trình chuyển hóa PAH bởi vi sinh vật có thể phân
hủy thành các dạng không độc hoặc chuyển hóa hoàn toàn thành CO2.
Cerniglia cho rằng quá trình phân hủy PAH có thể theo ba chiều hướng: phân
Vi khuẩn
Acinetobacter sp.
Aeromonas sp.
Alcaligenes
denitrificans
Arthobacter sp.
Bacillus cereus
Beijerinckia sp.
Cycloclasticus
Corinebacterium renale
Flavobacterium sp.
Micrococcus sp.
Mycobacterium sp.
Staphylococcus
auriculans
Pseudomonas stuzeri
Rhodococcus sp.
Sphingomonas. sp
Staphylococcus
auriculans
Vi khuẩn lam
Agmenellum
quadruplicatum
Anabena sp. CA
Amphora sp.
Aphanocapsa sp.
Chlorella autotrophica
Chlamydomonas
angulosa
Coccochloris elabens
Cylindrotheca sp.
Dunaliella tertiolecta
Microcoleus
chthonoplastes
Navicula sp.
Nostoc sp.
Phorphyridium
Scapricomutum
Synedar sp.
Ulva fasciata
Vi nấm
Aspergillus sp. FVX5
Basidiobolus ranarum
Bjerkandera adusta
Candida maltosa
Chrysosporium
pannorum
Claviceps paspali
Gliocladium sp.
Helicostylum
catenoides
Linderina pennispora
Mucor hiemalis
Penicillium
chrysogenum
Phycomyces
blakesleeanus
Ramaria sp.
Rhizopus stononife
Sordaria fimicola
Trchoderma viride
hủy hoàn toàn, đồng phân hủy và oxi hóa không đặc hiệu [16].
Cerniglia (1993) đã tóm lược phân hủy PAH bởi vi sinh vật theo 3
nhóm chính (hình 1.2). Theo Cerniglia, catechol là chất trung gian của phân
hủy sinh học PAH bởi vi khuẩn và tảo, tiếp theo catechol lại được cắt vòng ở
vị trí ortho và meta [16].
Vi nấm, tảo
Cyt P-450/Methan
Monooxygenase
Nấm tr¾ng
PAH
C¾t vßng
Lignin peroxidase,
laccase
Vi khuẩn, tảo
Dioxygena
se
C¾
t
Dehydrogena
se
C¾
t
Hình 1.2. Các con đường phân hủy PAH ở vi sinh vật
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
22
Luận văn tốt nghiệp
Khoa Sinh - KTNN
Luận văn tốt nghiệp
23
Khoa Sinh - KTNN
Suntherland (1995) cũng đưa ra sơ đồ tương tự về các con đường phân
Các enzyme này tham gia chuyển hóa PAH đến dạng aren oxit, sau đó dạng
hủy PAH bởi vi khuẩn và nấm (Hình 1.3)[51]. Cụ thể, các PAH được phân
hợp chất trung gian này được hydrat hóa bởi enzyme epoxyt hydrolase đến
hủy bởi vi sinh vật như:
dạng trans-dihydrodiols hoặc được tái sắp xếp không có sự tham gia của
- Chuyển hóa PAH đến cis-dihydrodiol, phenol và các sản phẩm cắt
vòng bởi vi khuẩn và vi khuẩn lam
enzyme tạo thành dạng phenol. Trong trường hợp các vi sinh vật chỉ có thể
thực hiện theo cách chuyển hóa này, thì chúng sẽ không sử dụng PAH như
- Chuyển hóa PAH đến phenol bởi vi khuẩn nhóm methylotrophic
- Chuyển hóa PAH đến trans-dihydrodiol bởi vi nấm, vi khuẩn, và vi
khuẩn lam
nguồn cacbon mà chỉ có thể loại bỏ tính độc của PAH [16], [51].
Chuyển hóa PAH đến quinon bởi nấm trắng (white- rot fungi): Một số
nấm trắng phân hủy lignin và cellulo (có trong gỗ) sẽ chuyển hóa PAH đến
- Chuyển hóa PAH đến quinon bởi nấm mục trắng (white-rot fungi)
quinon và các chất khác mà không qua cis-dihydrodiol hoặc transdihydrodiol, trong một số trường hợp quá trình chuyển hóa này có sự tham
gia của lignin peroxydase [16], [51].
Nhiều nghiên cứu cho thấy, trong vi khuẩn, các gen mã hóa các enzym
tham gia vào quá trình chuyển hóa PAH có thể nằm trên plasmid hoặc
chromosome [29]. Trong hai thập kỷ vừa qua, một nhóm các gen bảo thủ cao
dị hóa PAH (các gen giống nah) từ các loài Pseudomonas đã được điều tra
đầy đủ bao gồm cả quan hệ chức năng-cấu trúc và tiến hóa của các gen này
[29]. Tuy nhiên, gần đây các gen dị hóa PAH mà có sự khác nhau về tiến hóa
đối với gen giống nah đã được nghiên cứu ở các vi khuẩn Gram âm khác và
cả vi khuẩn Gram dương [29].
Theo Wikstrom (1996), bước đầu tiên của phân hủy sinh học hiếu khí
PAH phụ thuộc có sự tham gia của hệ enzyme đa thành phần xúc tác sự
hydroxyl hóa các hợp chất PAH và tạo ra dạng cis-dihydrodiol [56]. Một số
Hình 1.3. Ba con đường phân hủy hiếu khí PAH chính
tác giả khác cho rằng, các con đường phân hủy hydrocarbon thơm trong điều
của vi khuẩn và nấm
kiện hiếu khí đều xảy ra qua các bước cắt vòng thơm, loại vòng theo con
Chuyển hóa PAH đến trans-dihydrodiol bởi vi nấm, vi khuẩn và vi
khuẩn lam. Hiện nay người ta đã biết đến các enzyme cytochrome P450
monooxygenase được sinh ra bởi một loài vi nấm, vi khuẩn và vi khuẩn lam.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
đường ở phần trên cùng (upper pathway) và tạo thành catechol [56], [46],
[44]. Tiếp theo, quá trình cắt vòng của catechol bởi enzyme dioxygenase có
thể xảy ra tại các vị trí meta và ortho. Cắt vòng catechol ở vị trí ortho được
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Luận văn tốt nghiệp
24
Khoa Sinh - KTNN
Luận văn tốt nghiệp
25
Khoa Sinh - KTNN
thực hiện bởi enzym catechol 1,2-dioxygenase để tạo ra cis, cis-muconic acid,
đã được loại bỏ (rất ít) bởi hỗn hợp vi khuẩn khử nitrat, tuy nhiên cơ chế trao
chất này sau đó được phân hủy theo con đường β-ketoadipate [34]. Cắt vòng
đổi chất của quá trình chưa được sáng tỏ. Gần đây, Coates và cộng sự đã công
tại vị trí meta của catechol được thực hiện bởi enzyme catechol 2,3-
bố về khả năng oxy hóa PAH đến CO 2 dưới điều kiện khử sulphat của các
dioxygenase (C23O) tạo ra 2-hydroxymucomic semialdehyde [34], đây được
mẫu tràm tích vịnh San Diego [18]. Tuy nhiên quá trình này đòi hỏi nhiều
coi là quá trình phổ biến nhất ở các giai đoạn tiếp sau ở con đường phía dưới
thời gian và tốc độ rất chậm [16].
(lower pathway) của quá trình phân hủy các PAH [56], [45], [44]. Enzyme
Phân hủy kỵ khí PAH đã được nghiên cứu với NO3-, ion Fe hoặc SO 42-
catechol 2,3-dioxygenase là thành viên của liên họ enzyme Extradiol
như là các chất nhận điện tử và dưới các điều kiện sinh methan. Các con
dioxygenase. Các enzyme extradiol dioxygenase được xem như là các
đường phân hủy sinh hóa đã được nghiên cứu với các tập đoàn vi khuẩn hoặc
enzyme chìa khóa trong rất nhiều con đường phân hủy các hợp chất thơm bởi
chủng sạch phân hủy napthalene và cho thấy, 2-naphthoic acid là chất trao đổi
vi khuẩn cũng như các phản ứng được xúc tác bởi các enzyme này [46]. Do vị
chất trung gian. Naphthalene được họat hóa bởi bổ sung đơn vị C1 để tạo ra
trí quan trọng và trung tâm của catechol nên gen mã hóa cho enzyme catechol
2-naphthoic acid, trong khi đó methylnaphthalene được hoạt hóa bởi bổ sung
2,3- dioxygenase được quan tâm đặc biệt trong các nghiên cứu đánh giá cũng
fumarate đối với nhóm methyl và được phân hủy tiếp thành 2-naphthoic acid.
như phát hiện ra khả năng phân hủy PAH của các chủng vi sinh vật, tập đoàn
Phân hủy 2-naphthoic acid được thực hiện qua khử và cắt vòng để tạo ra
vi sinh vật tại các điểm ô nhiễm hydrocarbon dầu mỏ [45]. Đã có rất nhiều
5,6,7,8-tetrahydro-2-naphthoic acid. Sản phẩm trung gian cắt vòng như là 2-
nghiên cứu khai thác các giá trị tiềm tàng ứng dụng và lý thuyết của C23O
carboxyclohexylacetic acid cho thấy sự phân hủy diễn ra qua các dẫn x uất
trong bảo vệ môi trường và trong các lĩnh vực khác. Các enzyme extradiol
cyclohexan chứ không qua các hợp chất thơm. Phân hủy kỵ khí PAH cũng đã
dioxygenase có hoạt tính tốt sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến sự gia tăng các hoạt
được chứng minh trong môi trường nước nhiễm bằng xác định các hợp chất
động đồng hóa PAH. Tính đến năm 2004 đã có trên 30 enzym C23O và nhiều
trao đổi chất đặc hiệu và nghiên cứu đồng vị phóng xạ. Các sản phẩm trao đổi
trình tự nucleotide của các gen mã hóa C23O đã được xác định [34]. Hiện
chất đặc hiệu phân hủy kỵ khí PAH như naphthyl-2-methylsuccinate đã được
nay, các nhà nghiên cứu vẫn đang khai thác các khía cạnh ứng dụng và học
phát hiện chứng tỏ sự phân hủy kỵ khí của 2-methylnaphthalene, trong khi đó
thuyết của C23O và gen mã hóa C23O trong các chủng đơn, tập đoàn và trong
2-naphthoic acid là dấu hiệu của phân hủy kỵ khí naphthalene và 2-
quá trình phân hủy các chất vòng thơm ở tự nhiên và trong xử lý làm sạch
methylnaphthalene [43].
bằng phân hủy sinh học.
PAH là các chât gây ô nhiễm quan trọng trong nước ngầm. Các PAH
có 2 và 3 vòng được quan tâm đặc biệt do khả năng hòa tan cao hơn trong
1.5. Các yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình phân hủy các hợp chất
hydrocarbon thơm đa nhân
nước và dễ di chuyển vào nước ngầm [43]. Hiện nay, có rất ít công bố về
Sự phân hủy sinh học PAH phụ thuộc rất nhiều yếu tố. Ngoài các yếu tố
chuyển hóa PAH bởi vi khuẩn kỵ khí. Mặc dù naphthalene và acenaphthalene
môi trường như pH, nhiệt độ, dinh dưỡng, độ ẩm của đất, nồng độ oxy, nó còn
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
26
Luận văn tốt nghiệp
Khoa Sinh - KTNN
Luận văn tốt nghiệp
27
Khoa Sinh - KTNN
phụ thuộc vào tính chất vật lý, hóa học của các PAH, sự có mặt đồng thời hay
tác giả khác cũng phát hiện điều kiện tối ưu cho phân hủy sinh học PAH ở
riêng rẽ của các PAH trong môi trường. Ngoài ra nó còn phụ thuộc vào bản
30oC và pH 7 [31], [51], [61]. Trên đây là những kết quả quan trọng trong
thân các vi sinh vật, phương thức mà các vi sinh vật chuyển cơ chất qua màng
việc kích thích tập đoàn vi sinh vật bản địa trong đó có vi khuẩn để tiến tới xử
tế bào. Thường những phân tử tan có thể được vận chuyển qua màng tế bào
lý vùng đất nhiễm độc hóa học.
và có khả năng phân hủy sinh học tốt hơn [16], [51], [31], [42], [61].
Trong tự nhiên, thường không tồn tại một loại hydrocarbon thơm đa
Các yếu tố môi trường tại nơi mà vi sinh vật được phân lập ảnh hưởng
nhân mà thường tồn tại dưới dạng hỗn hợp. Do đó việc nghiên cứu khả năng
rất lớn đến sự phát triển của chúng. Do vậy, trong quá trình xử lý làm sạch
phân hủy hỗn hợp các PAH là điều cần thiết để xem ảnh hưởng qua lại của
môi trường, vấn đề này đóng vai trò quan trọng và quyết định hiệu quả của
chúng trong hỗn hợp cũng như nồng độ của chúng. Sự tồn tại của các PAH
việc xử lý. Quá trình phân hủy các hợp chất hydrocarbon thơm đa nhân bởi
khác nhau có thể thúc đẩy hoặc ức chế quá trình phân hủy sinh học, nồng độ
các vi sinh vật thường xảy ra với tốc độ chậm, do vậy việc tạo điều kiện thích
của PAH cao sẽ làm giảm quá trình phân hủy sinh học và gây độc cho vi sinh
hợp cho tập đoàn vi sinh vật phát triển tốt nhất, có hiệu quả phân hủy sinh học
vật. Các PAH có trọng lượng phân tử thấp, cấu trúc đơn giản dễ dàng phân
cao có thể coi là chìa khóa của công nghệ phân hủy sinh học.
hủy hơn so với các PAH có trọng lượng phân tử cao và có cấu trúc phức tạp.
Theo Yuan và cộng sự (2000), điều kiện tối ưu cho sự phân hủy các
o
Theo Yuan, điều kiện tối ưu cho sự phân hủy các hydrocarbon thơm đa nhân
hydrocarbon thơm đa nhân của đối tượng mà tác giả nghiên cứu là 30 C, pH
đối với đối tượng tác giả nghiên cứu là tại nhiệt độ 30 oC, pH 7 [52]. Tác giả
7. Hai chủng vi khuẩn Alcaligenes eutrophus JMP134 và Pseudomonas
Zaidi cùng các cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến sự phân hủy
o
cepacia AC1100 phát triển tốt nhất ở 29 C [30]. Một số nghiên cứu khác cho
phenanthrene và nhận thấy tại pH từ 6 đến 7 thì không ảnh hưởng mạnh đến
thấy chủng Streptomyces danangensis XKDN19 có khả năng phát triển tốt
khả năng phân hủy, nhưng tại pH 10 thì gây ức chế khả năng phân hủy
o
nhất ở 32 C, pH 6, nồng độ NaCl 0 - 3% [9]; chủng Streptomyces
o
danangensis XKDN11 ở 30 C, pH 7, nồng độ NaCl 0,5% [1]; chủng nấm sợi
o
phenanthrene của vi sinh vật [14],[61].
Bên cạnh các yếu tố quan trọng kể trên phải kể đến các yếu tố dinh
FDN20 ở 28 C, pH 6, nồng độ NaCl 3% [3]. Các yếu tố khác như nguồn nitơ,
dưỡng. Đó là nguồn nitơ, phốt pho, các nguồn cacbon có thể bổ sung như cao
photpho, cacbon và các khoáng khác cũng ảnh hưởng đến sự phát triển và
men, glucoza, axetat, pyruvat.v.v. Đây cũng sẽ là những nghiên cứu rất cần
phân hủy chất độc của các vi sinh vật.
thiết phục vụ cho quá trình tạo các yếu tố công nghệ thích hợp trong xử lý tẩy
Nghiên cứu của Nguyễn Bá Hữu và cộng sự (2002) về ảnh hưởng của
độc [37].
các yếu tố môi trường đến sự phân hủy các hợp chất hydrocarbon thơm đa
Sự phân hủy sinh học các hydrocarbon thơm đa nhân riêng rẽ trong
nhân của một số chủng vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas, Sphingomonas phân
mẫu thí nghiệm đã không ngừng được nghiên cứu và ngày càng thu được
lập từ đất nhiễm dầu cho thấy các chủng này có khả năng phát triển tốt nhất ở
nhiều kết luận có giá trị [16], [42], [58]. Các PAH có cấu trúc phân tử đơn
o
nhiệt độ 30 C, pH 7 - 7,8 và nồng độ muối NaCl từ 0% đến 3% [4]. Một số
giản, trọng lượng phân tử thấp dễ dàng phân hủy sinh học hơn so với các
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Luận văn tốt nghiệp
28
Khoa Sinh - KTNN
Luận văn tốt nghiệp
29
Khoa Sinh - KTNN
PAH có trọng lượng phân tử cao và cấu trúc phức tạp [11], [16], [58], [59].
hủy sinh học (bioremediation), đảm bảo các điều kiện thuận lợi làm cho tốc
Tuy nhiên, chúng ta còn ít hiểu biết về khả năng phân hủy sinh học các PAH
độ phân hủy các hydrocarbon đa nhân có thể đạt tới mức tối đa.
khi chúng có mặt đồng thời trong các vùng ô nhiễm. Thường trong tự nhiên
1.6. Các phƣơng pháp phân loại vi sinh vật
không chỉ tồn tại một loại PAH mà tồn tại hỗn hợp các PAH. Do đó, việc
Vi sinh vật rất đa dạng trong tự nhiên. Tuy nhiên, chỉ một phần nhỏ
nghiên cứu khả năng phân hủy hỗn hợp PAH là điều cần thiết để có thể đánh
trong số chúng là có thể nuôi cấy được ở trong điều kiện phòng thí nghiệm.
giá được ảnh hưởng qua lại và tương quan nồng độ của chúng đến sự phân
Do đó, việc phân loại chúng gặp nhiều khó khăn. Hiện nay có nhiều phương
hủy hỗn hợp. Sự tồn tại của các PAH khác nhau có thể thúc đẩy hoặc ức chế
pháp để phân loại vi sinh vật. Các phương pháp cổ điển chỉ dựa vào các đặc
quá trình phân hủy sinh học [58]. Yuan cùng cộng sự (2000) tiến hành nghiên
điểm sinh lý, sinh hóa và hình thái cấu tạo bên ngoài để phân loại vi sinh vật,
cứu khả năng phân hủy đồng thời các PAH trong bùn sông có nhiễm PAH.
còn phương pháp hiện đại lại chú trọng nhiều đến việc nghiên cứu các phân tử
Kết quả cho thấy, tốc độ phân hủy Phenanthrene giảm khi có mặt thêm bất kì
axit nucleic như DNA, RNA để áp dụng trong phân loại. Từ đó có thể thành
một PAH nào trong mẫu. Khi 6 PAH có mặt đồng thời, tốc độ phân hủy
lập cây phát sinh chủng loại, phản ánh mối quan hệ về mặt tiến hóa giữa các
phenanthrene, acenaphthalene giảm nhưng tốc độ phân hủy Anthracene,
loài với nhau.
Fluorene và Pyrene lại tăng [58].
1.6.1. Phương pháp phân loại truyền thống
Ngoài ra, tốc độ phân hủy PAH cũng còn bị ảnh hưởng mạnh bởi các
Phương pháp phân loại cổ điển sử dụng hình thái kết hợp những đặc
chất hoạt động bề mặt không phân cực như Bij 30, Bij 35, triton X100, triton
điểm hình dạng bên ngoài và các đặc điểm sinh lý để phân loại. Các phương
N110. Các chất này gây độc và ức chế hoạt động của vi sinh vật vì chúng có
pháp cổ điển thường dùng các chỉ tiêu để phân loại là: màu sắc, kích thước
khả năng tương tác với màng tế bào hay chính xác hơn là các phân tử chất
của khuẩn lạc phát triển trên môi trường; các đặc điểm giống nhau về hình
hoạt động bề mặt tương tác với protein màng tế bào [40]. Các chất này cũng
dạng, kích thước, có hay không có tiên mao của tế bào vi khuẩn; sự khác nhau
có thể trực tiếp gây ức chế hoạt động của các enzyme liên quan tới con đường
về đặc điểm sinh hóa: phản ứng nhuộm Gram, sự kháng chất kháng sinh, sự
chuyển hóa PAH. Có thể chúng còn liên kết với cả các enzyme hay với các cơ
trao đổi chất và dinh dưỡng, đối tượng vật chủ, phân tích phân tử axit
chất . Một lí do làm giảm khả năng phân hủy sinh học các hợp chất này là
teichoic.
chúng hạn chế sự tiếp xúc của tế bào vi sinh vật với các chất hữu cơ hòa tan
trên bề mặt [61].
Ngoài ra, còn rất nhiều phương pháp phổ biến khác nữa như: kiểm tra
các phản ứng sinh hóa của vi sinh vật với các chất phản ứng khác nhau, các
Tóm lại, việc nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự phân hủy sinh
phản ứng miễn dịch của các kháng nguyên là thành phần cấu tạo của tế bào
học các hợp chất hydrocarbon thơm đa nhân là rất quan trọng. Có thể coi đây
như kháng nguyên O của lipopolysaccharid hay của bao nhầy thường được sử
là cơ sở công nghệ cho quá trình xử lý ô nhiễm PAH bằng phương pháp phân
dụng để phân biệt các chủng của một loài [15].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Luận văn tốt nghiệp
30
Khoa Sinh - KTNN
1.6.2. Phương pháp phân loại bằng sinh học phân tử
Luận văn tốt nghiệp
Màng
Hiện nay, các phương pháp phân loại hiện đại thường dựa trên việc
đánh giá mức phân tử axit nucleic. Trên cơ sở trình tự DNA, người ta có thể
31
Axít béo
Lipid phân cực
Axit mycolic
Isoprenoid quinonones
Khoa Sinh - KTNN
Loài và chi
có nhiều các phương pháp khác nhau để tiến hành phân loại.
Từ cuối thế kỷ 20, đặc biệt là những năm 1980 trở lại đây, với sự phát
Trước đây, việc phân loại vi sinh vật đôi khi gặp khó khăn và thiếu
triển mạnh mẽ của sinh học phân tử, người ta đã sử dụng một phương pháp
chính xác. Với sự phát triển của kỹ thuật sinh học phân tử, việc phân loại
nghiên cứu mới cho phân loại vi sinh vật đó là “phân loại học phân tử”.
ngày nay dựa chủ yếu vào nghiên cứu trên các phân tử axit nucleic (DNA,
Phương pháp mới này có thể phát hiện, mô tả và giải thích tính đa dạng sinh
RNA). Các phương pháp này phản ánh chính xác hơn mối quan hệ về mặt tiến
học ở mức phân tử giữa các loài và trong phạm vi loài trong thời gian ngắn và
hóa giữa các nhóm sinh vật. Tuy nhiên, cũng không thể phủ nhận vai trò của
có độ chính xác cao.
các phương pháp phân loại dựa trên các đặc điểm bên ngoài. Do vậy, cần kết
Jesus và Silvia (1999) đã tóm tắt các phương pháp phân tích và khả
mức độ sử dụng trong phân loại vi sinh vật (Bảng 1.3) [35]
Ngày nay, việc nghiên cứu phân tử rRNA được coi là phương pháp hữu
Bảng 1.3: Một số phương pháp phân loại vi sinh vật
Thành phần tế
bào
DNA nhiễm sắc
thể
RNA riboxom
Protein
Thành tế bào
hợp cả hai phương pháp để kết quả phân loại được chính xác.
hiệu nhất để xác định mối quan hệ trên cây tiến hóa của các vi sinh vật, vì
rRNA có mặt ở tất cả các loại vi sinh vật, có chức năng xác định và là trình tự
Phương pháp phân tích
Phạm vi phân loại
Thành phần bazơ (%G+C)
Biến tính DNA :DNA
Các phần DNA được cắt bằng
enzyme giới hạn
Đa hình chiều dài các đoạn giới
hạn của RNA riboxom
Trình tự nucleotide
Lai DNA : rRNA
Trình tự axit amin
So sánh bằng phản ứng huyết
thanh
Các kiểu điện di
Điện di enzyme đa vị trí
Cấu trúc peptidoglycan
Polysacharid
Axit teichoic
Chi
Loài
vào sự khác nhau này, người ta có thể đánh giá được mối quan hệ phát sinh
Loài và dưới loài
khuẩn (5S, 16S, 23S) thì gen 16S rRNA là phù hợp nhất cho việc nghiên cứu
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
có tính bảo thủ cao, chúng chỉ khác nhau rất ít giữa các nhóm vi sinh vật. Dựa
chủng loại và phân loại các chủng vi sinh vật. Trong 3 loại gen rRNA của vi
phân loại. Gen mã hóa cho 5S rRNA có kích thước khoảng 120 nucleotide, dễ
Loài, chi và trên chi
Chi và trên chi
Loài và chi
đọc và so sánh trình tự, nhưng lại không đủ để phân biệt một cách chi tiết
giữa các chủng. Ngược lại, gen mã hóa 23S rRNA lại có kích thước lớn
(3000) nucleotide do đó gây khó khăn cho việc tách dòng, đọc và so sánh
trình tự. Chỉ có gen 16S rRNA với kích thước khoảng 1500 nucleotide vừa đủ
để phân loại chi tiết giữa các chủng vi sinh vật và cũng không gây khó khăn
Các dòng trong loài
Loài và chi
trong nghiên cứu. Do đó, nó được ưu tiên chọn lựa trong việc phân loại vi
khuẩn. Gen mã hóa cho cấu trúc 16S rRNA đã được các nhà khoa học nghiên
cứu kỹ lưỡng và họ đã thiết lập được rất nhiều các cặp mồi để nhân đoạn
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Luận văn tốt nghiệp
32
Khoa Sinh - KTNN
chúng bằng kỹ thuật PCR. Đây là một thuận lợi lớn cho các nghiên cứu phân
33
Luận văn tốt nghiệp
Khoa Sinh - KTNN
CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
loại dựa trên gen mã hóa 16S rRNA [35].
2.1. Nguyên liệu và hóa chất
2.1.1. Nguyên liệu
Nguyên liệu để sử dụng trong đề tài nghiên cứu này là mẫu nước nhiễm
dầu thu thập tại bể thu gom của xí nghiệp khai thác mỏ Quảng Ninh.
2.1.2. Hóa chất
Các hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu này có độ tinh khiết cao
của các hãng trên thế giới như New England Biolabs, Sigma, Merk v.v.
Cặp mồi 27F và 1492R được tổng hợp tại hãng InvitrogenTM , vector
PCR®2.1 (Invitrogen).
Mồi xuôi
(27F ): 5’ - AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG - 3’
Mồi ngược (1492R) : 5’ - GGY TAC CTT GTT ACG ACT T - 3’
Cặp mồi catechol 2,3-dioxygenase được tổng hợp tại hãng Alpha DNA
(Canada).
Mồi xuôi (C23OF) : 5’ - ATG GAT DTD ATG GGD TTC AAG GT - 3’
Môi ngược (C23OR) : 3’ - ACD GTC ADG AAD CGD TCG TTG AG - 5’
2.2. Môi trƣờng nuôi cấy
+ Môi trường muối khoáng dịch (g/l)
NH4NO3
4
NaCl
1,2
KH2PO4
0,3
Nước máy vừa đủ 1 lít
MgSO4
0,4
pH
NaH2PO4
0,7
6,5
+ Môi trường muối khoáng thạch (g/l): Thành phần các loại hóa chất
giống như môi trường khoáng dịch nhưng được bổ sung thêm 20g agar.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
34
Luận văn tốt nghiệp
Khoa Sinh - KTNN
+ Môi trường muối khoáng được bổ sung thêm hỗn hợp vitamin, hỗn
hợp vi lượng và cao men. Môi trường trước khi được sử dụng được khử trùng
ở 121oC, 1 atm trong 25 phút.
10
Trytone
10
Cao men
5,0
35
Khoa Sinh - KTNN
sung vitamin, vi lượng, cao men và PAH với nồng độ 50 ppm. Nuôi lắc bình
200 vòng/phút, ở 30oC trong 5 ngày.
Làm giàu vi sinh vật lần 2 và lần 3 tương tự như mẫu làm giàu lần 1.
+ Môi trường LB dịch (g/l)
NaCl
Luận văn tốt nghiệp
Tiến hành pha loãng mẫu làm giàu lần 3, rồi gạt mẫu pha loãng trên môi
Nước cất vừa đủ 1 lít
pH
trường muối khoáng có bổ sung vitamin, vi lượng, cao men và 100 ppm PAH.
Mẫu được đem nuôi tĩnh ở 30oC. Chọn chủng vi khuẩn có khả năng phát triển
7
trên môi trường có PAH rồi tiến hành nuôi lắc và làm sạch.
+ Môi trường LB thạch (g/l): Thành phần các hóa chất tương tự môi
2.4.2. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của một số chủng vi khuẩn
* Phƣơng pháp nhuộm Gram
trường LB dịch nhưng có bổ sung thêm 20g agar.
Lam kính được rửa sạch bằng các dung dịch rửa, sau đó làm khô trên
+ Nước muối sinh lý (0,85%)
NaCl
8,5g
ngọn lửa đèn cồn. Lấy một giọt dịch sau 16 giờ nuôi nhỏ lên lam kính rồi
Nước cất
1 lít
dùng que cấy vô trùng dàn đều giọt dịch và cố định tế bào trên ngọn lửa đèn
cồn. Nhuộm tiêu bản bằng dung dịch tím kết tinh (Cystal violet) trong thời
2.3. Máy móc và thiết bị nghiên cứu
Trong quá trình nghiên cứu, các thiết bị, máy móc đã được sử dụng có
gian 1 phút. Rửa bằng nước cất rồi nhuộm tiêu bản với lugon trong thời gian 2
độ chính xác cao tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học môi trường và
phút. Tiếp tục rửa tiêu bản bằng cồn 70 % khoảng 20 giây, sau đó rửa bằng
phòng thí nghiệm trọng điểm Quốc gia về công nghệ Gen - Viện Công nghệ
nước sạch rồi để khô. Nhuộm tiếp với safarin trong 1 phút, rửa lại bằng nước
sinh học bao gồm: kính hiển vi, cân kỹ thuật, máy đo pH Hanna, tủ cấy vô
cất 2 lần và để khô tự nhiên.
trùng Laminar của Pháp, tủ sấy, nồi khử trùng, máy nuôi lắc ở các nhiệt độ
Mẫu được quan sát bằng kính hiển vi quang học với độ phóng đại 100
khác nhau, tủ nuôi ổn nhiệt, máy ly tâm Eppendorf, máy PCR, máy soi DNA,
lần dưới vật kính dầu. Nếu vi khuẩn bắt màu xanh tím thuộc loại Gram (+)
o
o
máy điện di Bio-Rad, máy chụp ảnh Gel-Doc, tủ lạnh các loại 4 C, -20 C, o
80 C, máy xác định trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic
còn bắt màu hồng là Gram (-). Vi khuẩn sử dụng làm đối chứng cho nhóm
Gram (-) là E. coli và Gram (+) là Bacillus.
Analyzer, lò vi sóng, pipet man của hãng Eppendorf, bình nón, đầu côn, ống
* Quan sát hình thái tế bào bằng kính hiển vi điện tử quét
ly tâm v.v.
Vi khuẩn được nuôi cấy 5-7 ngày trên môi trường muối khoáng chứa
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
PAH. Dịch nuôi cấy được lọc qua giấy lọc vô trùng để loại bỏ cặn, rồi ly tâm
2.4.1. Phân lập vi sinh vật trên mẫu nước nhiễm dầu
5000 vòng/phút trong 5 phút để thu sinh khối tế bào. Rửa lại sinh khối vi
Làm giàu vi sinh vật lần một bằng cách hút 5 ml mẫu nước nhiễm dầu
khuẩn bằng nước cất vô trùng 2 lần để loại các chất cặn bẩn trong môi trường
chuyển vào trong bình tam giác chứa 45 ml môi trường khoáng dịch có bổ
nuôi cấy. Tế bào vi khuẩn được hòa tan trong glutaraldehyt 2,5 % trong đệm
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Luận văn tốt nghiệp
36
Khoa Sinh - KTNN
photphat natri 100 mM (pH 7,2) trong 30 phút. Lấy một giọt tế bào đã xử lý
đưa lên lưới đồng khoảng 1 phút để cho mẫu bám được vào lưới. Rửa nhẹ
Luận văn tốt nghiệp
37
Khoa Sinh - KTNN
Bƣớc 5: Bổ sung phenol (tỷ lệ 1:1 v/v), lắc đều và ly tâm 12.000
vòng/phút trong 15 phút ở 4oC.
bằng nước sạch sau đó làm khô mẫu qua cồn 25, 50, 75, 100 % T-butyl. Sau
Bƣớc 6: Hút pha trên chuyển sang eppendorf mới, bổ sung CI (24:1)
đó làm khô mẫu bằng máy đông khô và phủ mẫu bằng vàng. Mẫu được quan
với tỷ lệ 1:1 v/v, lắc nhẹ sau đó ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC.
sát dưới kính hiển vi điện tử quét JEOL 5410 LV. Hình thái tế bào vi khuẩn
Bƣớc 7: Hút pha trên chuyển sang eppendorf mới và tủa DNA bằng
được chụp ảnh và đo kích thước. Cố định mẫu và soi kính được thực hiện tại
cồn tuyệt đối, giữ ở -20oC trong khoảng 2-3 giờ.
Viện 69, Bộ tư lệnh Lăng Hồ Chí Minh.
Bƣớc 8: Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC, thu tủa DNA.
2.4.3. Đánh giá khả năng sử dụng PAH của vi khuẩn
Bƣớc 9: Rửa tủa bằng cồn 70 %, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC
PAH được xác định bằng phương pháp đo quang phân tử, dựa trên sự
dịch chuyển điện tử trên các orbital п của các nối đôi liên kết trong vòng thơm
Bƣớc 10: Làm khô tủa và hòa tan tủa trong nước khử ion vô trùng
2.4.4.2. Nhân đoạn gen bằng phương pháp PCR
của PAH. Khả năng chuyển hóa PAH của vi khuẩn trong dịch nuôi cấy được
Phương pháp PCR do Kary Mullis và cộng sự phát minh năm 1985.
xác định trên máy quang phổ tử ngoại khả kiến UV-VIS: GBC - CINTRA 4.
Phương pháp này tạo ra bước nhảy vọt trong kỹ thuật sinh học phân tử và
20 ml dịch nuôi cấy vi sinh vật sử dụng PAH được chiết bằng 180 ml acetone,
được sử dụng phổ biến đến nay. Phương pháp này cho phép nhân lên số lượng
sau đó lọc toàn bộ, thu dịch lọc đưa đi phân tích. Nồng độ của mỗi PAH trước
lớn đoạn gen cần thiết trong thời gian ngắn.
và sau xử lý được tính toán dựa vào chiều cao peak hấp thụ tại các bước sóng,
Để thực hiện được phản ứng PCR cần có các nguyên liệu chính là đoạn
các PAH hấp thụ tại các bước sóng như: pyrene 275 nm; fluorene: 257,7 nm,
DNA khuôn, cặp mồi đặc hiệu, enzyme DNA polymerase, các nucleotide tự
fluoranthrene: 286,7 nm, phenanthrene: 292,6 nm, anthracene: 252 nm,
do, máy PCR v.v.
naphthalene: 296 nm.
* Thành phần phản ứng:
2.4.4. Xác định trình tự gen mã hóa 16S rRNA và catechol 2,3-dioxygenase
Buffer Taq 10X
2,5
µl
2.4.4.1. Tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn theo phương pháp của
MgCl2 25 mM
3,0
µl
Sambrook, Russell [47].
dNTPs 2,5 mM
2.5
µl
Mồi xuôi 20 µM
1
µl
Mồi ngược 20 µM
1
µl
Taq DNA polymerase (5 U/µl)
0,2
µl
H2O
13,3 µl
DNA khuôn
1,5
µl
Tổng thể tích
25
µl
Bƣớc 1: Thu sinh khối tế bào bằng cách lấy dịch nuôi cấy chuyển vào
ống li tâm rồi li tâm với vận tốc 6.000 vòng/phút ở 4oC trong 10 phút.
Bƣớc 2: Hòa tan mẫu trong 400 µl đệm lysis rồi lắc kỹ cho tan tủa.
o
Bƣớc 3: Bổ sung 50 µl lysozym và ủ ở 37 C trong 30 phút.
o
Bƣớc 4: Bổ sung 20 µl protease K rồi ủ ở 56 C trong 2 giờ.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
38
Luận văn tốt nghiệp
Khoa Sinh - KTNN
Luận văn tốt nghiệp
Đối với nhân đoạn gen mã hóa 16S rRNA sử dụng cặp mồi 27F và
39
Khoa Sinh - KTNN
* Thành phần phản ứng:
1492R thì chu trình nhiệt cho phản ứng PCR như sau:
Dung dịch đệm
1,0 µl
Bƣớc 1
95oC trong 5 phút
Vector pCR2.1
1,5 µl
Bƣớc 2
94oC trong 1 phút
Sản phẩm PCR (đoạn DNA cần thiết)
1,2 µl
Bƣớc 3
55oC trong 1 phút
Enzyme T4 ligase
1,0 µl
Bƣớc 4
72oC trong
Nước
5,3 µl
Bƣớc 5
Lặp lại 35 chu kỳ từ bước 2 đến bước 4
Tổng thể tích
10 µl
Bƣớc 6
72oC trong 7 phút
Phản ứng gắn đoạn DNA cần thiết vào vector được thực hiện trong điều
Bƣớc 7
4oC bảo quản mẫu
kiện nhiệt độ 14oC, thời gian 18 giờ. Sau đó sản phẩm này được biến nạp vào
2 phút
Trong trường hợp nhân đoạn gen mã hóa catechol 2,3-dioxygenase sử
tế bào khả biến (vi khuẩn E. coli INV F’).
* Quy trình biến nạp:
dụng cặp mồi C23OF và C23OR với chu trình nhiệt dưới đây:
Bƣớc 1: Lấy 4 µl vector tái tổ hợp ở trên cho vào ống đựng tế bào khả
Bƣớc 1
94oC trong 7 phút
Bƣớc 2
94oC trong 1 phút
Bƣớc 3
55oC trong 1 phút
Bƣớc 2: Sốc nhiệt 42oC trong thời gian 45 giây.
Bƣớc 4
72oC trong
Bƣớc 3: Đặt ống tế bào lên đá trong 2 phút.
Bƣớc 5
Lặp lại 35 chu kỳ từ bước 2 đến bước 4
biến E. coli INV F’ rồi ủ trên đá 30 phút.
1 phút
Bƣớc 6
72oC trong 10 phút
Bƣớc 7
4oC bảo quản mẫu
Bƣớc 4: Thêm 250 µl SOC vào ống đựng tế bào rồi đem nuôi ở tủ lắc
o
37 C trong khoảng 1 giờ.
Bƣớc 5: Hút dịch nuôi gạt trên đĩa môi trường LB có bổ sung 50 mg/l
ampicilin, và 50 mg/ml X-Gal. Sau đó nuôi ở 37oC trong khoảng 16-18 giờ.
Chọn các dòng khuẩn lạc màu trắng và một dòng khuẩn lạc màu xanh
2.4.4.3. Quy trình biến nạp và chọn dòng
Biến nạp: bộ Kit TA Cloning(R) của hãng InvitrogenTM (Mỹ) đã được
nuôi trên môi trường LB dịch. Trên môi trường LB có X-gal những khuẩn lạc
màu trắng là những cá thể có thể mang DNA plasmid đã gắn đoạn DNA ngoại
sử dụng cho quá trình biến nạp.
Nguyên tắc: Đoạn DNA cần thiết nhân lên trong phản ứng PCR được
sử dụng để gắn vào vector PCR 2.1 tạo thành vector mang đoạn gen 16S
lai, những khuẩn lạc màu xanh là những cá thể không đính đoạn DNA
plasmid và DNA ngoại lai.
* Quy trình tách chiết DNA plasmid:
rRNA.
Bƣớc 1: Thu sinh khối tế bào bằng cách ly tâm dịch nuôi 6.000
vòng/phút trong 10 phút ở 4oC, đổ dịch và thu tủa.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Luận văn tốt nghiệp
40
Khoa Sinh - KTNN
Luận văn tốt nghiệp
41
Khoa Sinh - KTNN
Bƣớc 2: Bổ sung 100 µl Sol I rồi vontex kỹ cho tan hết tủa.
tự hai đoạn gen 16S rRNA và đoạn gen mã hóa catechol 2,3-dioxygenase của
Bƣớc 3: Thêm 200 µl Sol II và đảo nhẹ, ủ đá khoảng 5 phút.
vi khuẩn BQN31 được đăng ký trên GenBank.
Bƣớc 4: Bổ sung 150 µl Sol III, đảo đều rồi ủ đá 10 phút.
2.4.4.5. Phương pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại
Bƣớc 5: Bổ sung C:I theo tỷ lệ 1:1 v/v, lắc đều rồi ly tâm 12.000
vòng/phút trong 10 phút.
Sử dụng chương trình Blast so sánh mức độ tương đồng giữa trình tự
các đoạn gen mã hóa 16S rRNA, gen mã hóa catechol 2,3-dioxygenase của vi
Bƣớc 6: Hút pha trên chuyển sang ống mới và thêm 500 µl isopropanol
100 % tủa DNA, để khoảng 2-3 giờ.
khuẩn BQN31 với các trình tự gen liên quan trên ngân hàng gen. Tiếp theo,
sử dụng phần mềm Clustal X, NJ để xây dựng cây phát sinh chủng loại đoạn
Bƣớc 7: Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút.để thu tủa.
gen mã hóa 16S rRNA, gen mã hóa catechol 2,3-dioxygenase của vi khuẩn
Bƣớc 8: Rửa tủa bằng cồn 70 %, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10
BQN31 và các đoạn gen đại diện.
phút.
Bƣớc 10: Làm khô tủa bằng cách ly tâm khô, sau đó tủa được hòa tan
trong nước khử ion.
* Phản ứng cắt vector tái tổ hợp bằng enzym e EcoRI:
*Thành phần phản ứng:
Đệm EcoRI 10X
2,0
µl
Enzyme cắt EcoRI (5 U/µl)
0,2
µl
RNase (1 mg/ml)
0,5
µl
H2O
15,3 µl
DNA plasmid
2,0
µl
Tổng thể tích
20
µl
Trộn đều các thành phần phản ứng với nhau rồi đặt ống phản ứng vào
bể ổn nhiệt ở 37oC trong 16 giờ.
2.4.4.4. Phương pháp xác định trình tự gen bằng máy tự động
Xác định trình tự hai đoạn gen mã hóa 16S rRNA và catechol 2,3dioxygenase của vi khuẩn BQN31 trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM
3.100 Avant Genetic Analyzer tự động theo phương pháp của Sanger. Trình
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Luận văn tốt nghiệp
42
Khoa Sinh - KTNN
43
Luận văn tốt nghiệp
Khoa Sinh - KTNN
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng phát triển trên môi
trƣờng chứa PAH
Từ mẫu ban đầu, vi sinh vật sử dụng PAH được phân lập theo phương
pháp làm giàu trên môi trường muối khoáng chứa các nguồn PAH như nguồn
cacbon và năng lượng duy nhất. VSV sử dụng PAH trong mẫu nước nhiễm
dầu không đa dạng, trên mỗi loại PAH chỉ có từ 1 đến 4 loại khuẩn lạc, trong
đó loại vi khuẩn có mầu trắng, trơn, lồi bóng và nhỏ chiếm ưu thế (Bảng 3.1).
BQN30
K
K
K
BQN33
BQN31
Khả năng phát triển của vi khuẩn được đánh giá sơ bộ bằng sự thay đổi mầu
môi trường.
Bảng 3.1: Số lượng vi khuẩn phân lập được trên
môi trường khoáng có bổ sung các hợp chất PAH
Môi trường chứa
PAH và hỗn hợp PAH
Số lượng vi khuẩn phân lập
Phenanthrene
5
Anthracene
4
Fluorene + Fluoranthene
1
Pyrene + Chrysene
3
Naphthalene
2
BQN32
K
Hình 3.1: Khả năng phân hủy phenanthrene của 4 chủng
BQN30, BQN31, BQN32, BQN33
(Ghi chú: K: mẫu đối chứng)
Môi trường trong các bình nuôi cấy vi khuẩn và các PAH có mầu vàng
Các số liệu trong bảng 3.1 cho thấy, từ mẫu làm giàu vi sinh vật trên
hai nguồn phenanthrene và anthracene có số lượng vi khuẩn phân lập được
nhiều nhất. Tổng số 15 chủng vi khuẩn có khả năng phát triển tốt trên môi
trường chứa các nguồn PAH khác nhau đã được phân lập và được ký hiệu từ
BQN20-BQN34. Trong số 15 chủng vi khuẩn này, 4 chủng vi khuẩn BQN30,
BQN31, BQN32, BQN33 có khả năng phát triển mạnh hơn cả trên nguồn
nâu. Trong số 15 chủng vi khuẩn, chủng BQN31 phân hủy phenanthrene
mạnh nhất, môi trường đổi màu chỉ sau 32 giờ nuôi cấy. Các chủng vi khuẩn
còn lại chuyển hóa ở mức độ yếu hơn, sinh khối vi sinh vật ít hơn, môi trường
không đổi mầu hoặc đổi màu sau nhiều ngày.
Hình thái khuẩn lạc của 4 chủng vi khuẩn sử dụng phenanthrene mạnh
được trình bày tóm tắt ở Bảng 3.2.
phenanthrene (Hình 3.1).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
