Thí nghiệm vi sinh vật học thực phẩm lê văn việt mẫn, lại mai hương

LÊ VĂN VIỆT MẪN (Chủ biên)
LẠI MAI HƯƠNG

THực phẩm

Hư VIỆN
HỌC NHA TRANG

M
664.07
L 250 M

THƯ VIỆN ĐH NHA TRANG

Ó U Í)U Ư ZZíQ 6

NHÀ XUẤT BẢN
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. Hồ CHÍ MINH


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP H ổ CHÍ MINH
TRỪỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
Lê V ă n V iệ t M ẫn (Chủ biên)
L ạ i M ai H ư ơ n g

THÍ NGHIỆM

VI SINH VẬT HỌC THựC

phẩm

(Tái bản lần thứ hai)

TRƯƠNGBệt HỌCNllÀĩ^NG

THƯ VIỆN
«

30022785
N H À X U Ấ T B Ả N Đ Ạ I HỌC Q U ố C G IA
T P HỒ CHÍ M INH - 2010


G T .03.S V (V )
Đ H Q G .H C M - ío

191 -2010/CXB/326-08

GT.SV .843-10(T)


MỤC LỤC

LỜI NỒI ĐẨU
Chương 1

5

MỘT sổ KỸ THUẬT cơ BẢN CỦA VI SINH VẬT HỌC

7

Bài l Tiệt trùng dụng cụ và môi trường làm việc

7

Bài 2 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy vi sinh vật

9

Bài 3 Kỹ thuật gieo cấy vi sinh vật

10

Bài 4 Kỹ thuật nuôi cấy vi sinh vật

12

Bài 5 Các kỹ thuật phân lập vi sinh vật
Bài 6 Các phương pháp giữ giống vi sinh vật

13
15

PHƯƠNG PHÁP DỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT

17

Bài 7

Phương pháp đếm số tế bàovi sinh vật bằng buồng đếm

18

Bài 8
Bài 9

Phương pháp Breed
Định lượng vi sinh vật bằng phương pháp xác định lượngchãi khô

21
23

Chương 2

Bài l(0 Định lượng vi sinh vật bằng phương pháp đo mật độ quang

26

Bài l l Định lƯỢng vi sinh vật bằng phương pháp
đếm số khuẩn lạc phát triển trên môi trường đặc

28

Bài

34

l2

Định lượng vi sinh vật bằng phương pháp pha loãngtới hạn

Bài

l3
Bịnh lượng vi sinh vật bằng phương pháp xác định
hàm lượng ATP nội bào
Bài 14 Xác định sự sinh trưởng của vi sinh vật thông qua
hoạt tính của sinh khối

38
42

KHẢO SÁT HÌNH THÁI VÀ MỘT số TÍNH CHẤT SINH LÝ CỦA VI SINH VẬT

Chương 3

Bài l 5 Quan sát tế bào vi khuẩn

44

Bài

l6

Quan sát nha bào, bao nhày và tiên mao của vi khuẩn

47

Bài

l7

Xác định khả năng chuyển động của vi khuẩn

52

B ài18

Quan sát nấm sợi

53

B àil9

Quan sát nấm men

56

Bài 20

Khảo sát khả năng dị hóa carbohydrate

57

Bài 2 l

Khảo sát khả năng lên men các loại đường

58

Bài 22

Khảo sát khả năng dị hóa một sô" nguồn nitơ

59

Bài 23

Khảo sốt khả năng chịu đựng áp lực thẩm thcấu của vi sinh vật

60


Chương 4

XÁC ĐỊNH CÁC CHỈ TIÊU VI SINH CỦA THỰC PHẨM

Bài 24 Xác định tổng sô" vi khuẩn hiếu khí trong thực phẩm

61

Bài 25 Xác định tổng sô" nâ"m men và nâm sợi trong thực phẩm

63

Bài 26 Xác định sô" bào tử trong gia vị thực phẩm
Bài 27 Định lượng coliform tổng sô", coliform phân và E. coil

64
66

Bài 28 Phát hiện và nhận diện Salmonella

70

Bài 29 Định lượng Staphylococcus aureus trong thực phẩm

79

Bài 30 Phân lập Listeria spp. từ thực phẩm

83

Bài 31 Phát hiện Listeria bằng phương pháp phản ứng dây chuyền
sử dụng polymerase (PCR - polymerase chain reaction)

88

Bài 32 Định lượng Bacillus cereus trong thực phẩm

94

Bài 33 Định lượng Streptococcus faecalis

97

Bài 34 Định lượng Pseudomonas aeruginosa

101

Bài 35 Xác định Vibrio cholerae

103

Bài 36 Định lượng Clostridium perfringens

110

Bài 37 Phát hiện và phân lập Clostridium botulinum trong thực phấm

1 15

Chương 5

VỆ SINH CỒNG NGHIỆP

119

Bài 38 Kiểm tra vi sinh nguồn nước sản xuât

119

Bài 39 Xác định mức độ nhiễm vi sinh vật của không khí
trong phân xưởng sản xuất

120

Bài 40 Xác định mức độ nhiễm vi sinh vật của thiết bị sảnxuất

123

Phụ lục 1

NHỮNG MÔI TRƯỜNG sử DỤNG TRONG CÁCBÀI THÍNGHIỆM

Phụ lục 2

NHỮNG THUỐC NHUỘM, THUỐC THỬ VÀ DUNG DỊCH ĐỆM sử
DỤNG TRONG CÁC BÀI THÍ NGHIỆM

TÀI LIỆU THAM KHẢO

126

150
152


LỜI NÓI ĐẨU
Vi sinh vật học thực p h ẩ m là một môn học cơ sở của ngành Công nghệ thực
phẩm. Môn học này cung cấp cho sinh viên những kiến thức cơ bản về vi sinh đại
cương và vi sin h ứng dụng trong lĩnh vực sản xuất thực p h ẩ m ở quy mô công nghiệp.
T H Í N G H IỆ M V I S IN H V Ậ T HỌC T H ự C P H Ẩ M được biền soạn đ ể giả n g
dạy m ôn học T h í n g h iệm vi sin h vật học thực p h ẩ m cho sin h viên ngành Công
nghệ thực p h ẩ m , Trường Đ ại học Bách klioa-Đ ại học Quốc gia T P Hồ Chí M inh.
N ội dung quyển sách được chia th à n h 5 p h ầ n chính:
P h ầ n 1: M ộ t số kỹ th u ậ t cơ bản của vi sin h vật học-bao gồm kỹ th u ậ t chuẩn

bị m ôi trường, p h â n lập, gieo cấy, nuôi cấy, giữ giống vi sin h vật (6 bài)
P h ẩ n 2: Giới thiệu m ộ t số phương pháp đ ịn h lượng vi sin h vật (8 bài).

P h ầ n 3: K hảo sá t h ìn h thái và m ột số tín h chất sin h lý của nhóm vi sinh vật

thường gặp tro ng thực p h ẩ m (9 bài).
P h ầ n 4: Giới th iệu phương p h á p kiểm tra các chỉ tiêu vi sin h trong thực

p h ẩ m -b a o gồ m các chỉ tiêu liên quan đ ến n h ó m vi sin h vật hoại sin h lẫn nhóm vi
sin h vật gây b ện h (14 bài).
P h ầ n 5: Vệ sin h công nghiệp-G iới thiệu các phương p h á p kiểm tra vi sin h

nguồn nước, m ô i trường k h ô n g k h í trong p h â n xưởng sản x u ấ t và tìn h trạng vệ
sin h của các th iế t bị sản x u ấ t trong quy trìn h công nghệ (3 bài).
Trong quá trìn h biên soạn, chúng tôi có giới th iệ u m ộ t sổ phương p h á p mới
trong phân tích vi sinh thực p h ẩ m n h ư phương p h á p đ ịn h lượng vì sinh vật thông
qua. hà m lượng A denosine TriP hosphate A TP , phương p h á p xác đ ịn h vi sin h vật
bằng kỹ th u ậ t p h ả n ứng dây chuyền sử d ụ n g polym erase (Polymerase Chain
Reaction - PCR) hoặc kỹ th u ậ t m iễn dịch (Im m unological technique)... Q uyển sách
này củng là tà i liệ u th a m khảo cho nhữ ng người dang công tác trong lĩn h vực sản
x u ấ t thực p h ẩ m nói chung.
Giáo trìn h được p h â n công biên soạn n hư sau:
T S Lê Văn V iệt M ẫn: biền soạn chương 2, 4 và 5
T S Lại M ai Hương: biên soạn chương 1 và 3.
C húng tôi m ong n h ậ n được ý kiến đóng góp của bạn dọc về nội dung quyển
sách d ề n h ữ n g lần tái bản sau được hoàn chỉnh liơn.
Tlui từ góp ỷ xin gửi về:
Bộ môn Công nghệ thực phẩm , Trường Đại học Bách khoa-Đ ại học Quốc gia TP
Hồ Chí M inh, 268 L ý T hư ờ ng Kiệt, Quận 10, T P Hồ C hí M inh.
Điện th o ạ i: (08) 864 62 51.
T S L ê V ăn V iệ t M ẩ n

Chương 1

MỘT SỐ KỸ THUẬT cơ BẢN CỦA VI SINH VẬT HỌC
B à i 1 T IỆ T TRÙNG DỤNG c ụ V À MÔI TRƯỜNG LÀM VIỆC
1. T iệ t tr ù n g b ề m ặ t và m ô i trư ờ n g là m v iệ c
Khi làm việc với vi sinh vật, đề tránh bị lây nhiễm những vi sinh vật không mong
muốn ở môi trường xung quanh, cần phải đảm bảo sao cho môi trường và bề m ặt làm
việc được vô khuẩn. Sự vô trùng của nơi làm việc không những phụ thuộc vào phương
pháp tiệ t trùng m à còn phụ thuộc rấ t nhiều vào điều kiện và sự thông gió nơi làm việc.
Nơi làm việc không được có sự thông khí ngay cả khi không khí đó đã được lọc.
Cách tiến hành:
- Cửa sổ và cửa ra vào phải được đóng c h ặ t trước thờ i điểm làm việc.
- Để tiệ t trù n g không khí trong phòng dùng đèn u v , lắp trê n trầ n n h à, có thế
được b ậ t tro n g thời gian 15 phút. K hông khí được chiếu ƯV sẽ sinh ra ozone,
bởi vậy ngay sau thời gian b ậ t đèn u v , không khí sẽ có mùi đặc trưng.
- Bề m ặ t iàm việc có th ế dược tiệ t tru n g b ằn g cách lau VỚI e th an o l 70%, hay
tố t hơn với p ropanol 70%. Khi lau cồn, lưu ý k h ô n g được b ậ t đ èn cồn vì
có th ể x ả y r a h ỏ a hoạn.
2. T iệ t tr ù n g d ụ n g cụ là m v iệ c
a- Đ ụ n g cụ b ằ n g th ủ y tin h h o ặ c k im lo ạ i

C huẩn bị trước k h i tiệt trùng:
- Trước khi t iệ t trùng, dụng cụ thủy tin h cần được làm sạch và sây khô.
- Sau đó, gói kín trong giấy, trong giấy bạc hay để trong hộp đậy kín để đảm bảo
sau khi tiệt trùng, dụng cụ không còn bị nhiễm lại vi sinh vật từ môi trường ngoài.
- Ô ng n ghiệm th ủ y tin h cần được đậy b ằ n g n ú t bông k h ô n g th ấ m nước, sau đó
gói kín p h ầ n đầu ống nghiệm có nú t bông vào giấy rồi mới đem tiệ t trùng.
- Hộp p etri cần được gói kín trong giấy.
- P ip e t th ủ y tin h cần được gắn m ột n ú t bông nhỏ ở p h ầ n cuối của pipet, sau
đó bọc kín tro n g giấy.

- Que trang, đũa thủy tinh nếu cần tiệt trùng cũng cần phải được gói kín vào giấy.
N hừ ng dụng cụ b ằn g thủy tin h có th ể được tiệ t trù n g b ằ n g h ai phương pháp:
tr iệ t trù n g b ằ n g n h iệ t khô hoặc tiệ t trù n g b ằ n g n h iệ t ẩm .


8

CHƯƠNG 1

Phương p h á p tiệ t trù n g hằng n h iệt khô:
- Sấy tro n g tủ sấy ở n h iệ t độ 170-180°c tro n g thời gian 2,5 giờ đối với v ật
cần tiệ t trù n g không có n ắ p bông
- Nếu v ậ t cần tiệ t trù n g có nắp bông, sấy trong tủ sấy ở 150-160°c trong 3 giờ.
Phương pháp tiệt trùng bằng nhiệt ẩm: thường được thực hiện trong nồi autoclave
ở áp suất 0,1 M Pa tương ứng với n h iệt độ 121°c trong thời gian 20-30 phút.
b- D ụ n g cụ b ằ n g p l a s t i c c h ịu n h iệ t

O ng nghiệm có n ắ p nhự a chịu n h iệt, n ắp b ằn g teflon, b ằ n g cao su hay đầu
m icropipette được tiệ t trù n g b ằn g n h iệ t ẩm tro n g nồi autoclave ở áp su ấ t 0 ,lM P a
tương ứng với n h iệ t độ 121°c tro n g thời gian 20-30 phút.
c- M ôi tr ư ờ n g n u ô i c ấ y v i s in h v ậ t

- Môi trư ờ ng nuôi cấy vi sinh v ậ t thường được tiệ t trù n g tro n g autoclave ở
121°c. T hời gian tiệ t trù n g phụ thuộc vào khối lượng môi trường đem tiệ t
trù n g và thư ờ ng kép dài từ 20-30 phút
- Đối với những th à n h phần của môi trường dinh dưỡng nhạy cảm với n h iệt độ
cao không th ể sử dụng phương pháp tiệ t trùng bằng n h iệ t trong nồi autoclave.
Trong những trường hợp đó cần sử dụng m àng lọc vi khuẩn đế tiệt trùng
Có thế' th a m k h ảo m ột số phương pháp tiệ t trù n g khác nhau và ứng dụng của
từng phương p h á p tro n g b ả n g 1.1.

B ả n g 1.1 Các phương pháp tiệt trù n g và ứng d ụ n g
Ưng dụng

Tác nhân tiệt trùng
1- Dụng cụ bằng kim loại

2- Dụng cụ có nắp bằng cao su, teflon, nắp bống, nắp bằng giấy nhôm, màng lọc
Nhiệt ẩm tới 142°c

3- Dụng cụ bằng plastic chịu nhiệt
4- Ống nghiệm hay bình thủy tinh có chứa môi trường nuôi cấy
5- Dụng cụ lọc tiệt trùng
6- Môi trường rẳn, môi trường lòng, paraffin

1- Dụng cụ thủy tinh không chứa môi trường nuôi cấy (có thể có nảp bông)
Nhiệt khô tới

140-160 °c

2- Pipet có nút bông được gói trong giấy hay đựng trong hộp nhôm
3- Hộp petri, que trang, phểu thủy tinh,...
4- Hóa chất hay chất dinh dưỡng dạng bột (tùy theo khả năng chịu nhiệt)
5- Dầu có nhiệt hóa hơi lớn hơn nhiệt độ tiệt trùng

Nhiệt khô 170-

220 °c
Khí ethylene oxide,
formaldehyde,
methyl bromide

1- Dụng cụ thủy tinh không có nắp
2- Dụng cụ bằng kim loại
1- Dụng cụ bằng nhựa
2- Hộp petri hay ống nghiệm bằng nhựa
3- Ống kính hay đồ điện tử
4- Bột hóa chất hay gia vị kém bền nhiệt
5- Ống ly tâm bằng nhựa, bao bì nhựa

Tia

uv, tia X, tia
gamma

Lọc vô khuẩn

1- Dụng cụ bằng nhựa được bao kín trong bao polyethylene (PE)
2- Hộp petri bằng nhựa được bao kín trong bao PE
1- Không khí hay các khí khác
2- Môi trường dinh dưỡng không chịu nhiệt
3- Dắu cỏ độ nhớt thấp

!


MỒT SỐ KỸ THUẬ T cơ BẦN CỦA VI SlNH VẬ T HOC

9

B ài 2 CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG NUÔI CAY VI SIN H VẬT

1. N g u y ê n lý
Môi trư ờng nuôi cấy cung cấp đầy dủ nhu cầu d in h dưỡng cần th iế t cho sự
p h á t triể n của vi sin h vật.
P hân loại m ôi trường nuôi cấy:
1- Theo cấu trúc, môi trường nuôi cấy vi sin h v ậ t có th ể được chia ra làm ba
loại: môi trư ờ ng lỏng, môi trường rắn và môi trư ờ ng b á n rắn :
- M ôi trường lỏng: thường sử dụng để n h â n giống, lên m en hay nghiên cứu
m ột số đặc tín h của vi sinh vật. Môi trư ờng lỏng k h ô n g chứa c h ấ t làm đặc
môi trư ờng như ag ar, gelatin...
- M ôi trường rắn (m ôi trường đặc): thường dược tạo th à n h b ằ n g cách cho m ột
hàm lượng nhỏ a g a r hay gelatin vào môi trường lỏng để làm đặc môi
trường. Môi trư ờng rắ n thường được sử dụng đế p h â n lập vi sin h v ật, để
quan s á t h ìn h th á i k h u ẩn lạc hoặc để n ghiên cứu m ột số đặc tín h khác...
- M ôi trường bán rắn: có hàm lượng các ch ất tạo độ đặc ít hơn so với môi
trường rắ n , do đó có cấu trúc dạng dẻo. Môi trường bán rắ n được sử dụng
tro n g m ột số trư ờng hợp, ví dụ để xác định k h ả n ă n g chuyển động cua m ột
sô loài vi khuẩn.
2- Theo th à n h p h ầ n , môi trường nuôi cấy còn có th ế được chia th à n h môi
trường tổng hợp và môi trường tự nhiên:
- Môi trường tổng hợp: có th àn h phần hóa học xác định được m ột cách chính
xác. Môi trường tổ n g hợp thườn? dược chuẩn bi từ nhữ ng hơp c h ấ t hóa học
tin h k h iế t có công thức hóa học xác định
- Môi trường tự n hiên: thường bao gồm nhữ ng hợp c h ấ t chưa được xác định rõ
th à n h p h ầ n , không có công thức hóa học rõ ràn g ; ví dụ như pepton, cao
th ịt... Môi trư ờ ng tổng hợp có độ lặp lạ i cao tro n g khi môi trường tự n h iên
có độ lặp lại tù y thuộc vào nhà sản xuất
- Môi trường hòa tan chuẩn bị sẩn: đế tiệ n lợi cho người sử dụng, ngày nay
nhiều n h à sả n xuất đã cung cấp nhiều môi trư ờ ng p h a trộ n sẵ n dạng bột.
N hững môi trư ờng dạng này có th ể được sử dụng r ấ t đơn giản bằng cách
hòa ta n vào nước m ột hàm lượng n h ấ t định là đã có đủ t ấ t cả các th à n h

p h ần dinh dưỡng cần thiết.
2. Phương pháp chuẩn bị m ôi trường nuôi cây
a- C h u ẩ n b ị m ô i tr ư ờ n g lỏ n g

- C ân ch ính xác riê n g b iệt từng th à n h p h ầ n dinh dưỡng của môi trường nuôi
cấy theo h à m lượng đã định
- Hòa ta n từ ng th à n h p h ần trong m ột lượng nước nhỏ. Sau đó trộ n lẫn t ấ t cả
các th à n h p h ầ n dinh dưỡng với nhau và làm đầy lên m ột th ể tích n h ấ t định


10

CHƯƠNG 1

bằn g nước. Có th ể sử dụng nước cất hoặc nước m áy tùy thuộc vào yêu cầu cua
mỗi trường nuôi cấy.
- K iểm tra pH b ằ n g m áy đo pH hoặc b ằ n g giấy quỳ tím . N ếu pH k h ô n g đúng
với yêu cầu, có th ể chỉnh pH b ằn g dung dịch N aOH h a y HC1.
- Sau khi điều chỉnh pH về giá trị th íc h hợp, p h â n phôi môi trư ờng nuôi cấy
vào ống n g h iệm hay bình nuôi cấy.
- Đóng n ắ p ống nghiệm b ằ n g n ú t bông k h ô n g th ấ m nước. N ếu sử dụn g ống
n g h iệm có n ắp có th ề v ặ n kín, k h ô n g v ặ n c h ặ t hoàn to àn n ắ p ống nghiệm
để khi tiệ t trù n g hơi có th ể th o á t ra.
- Sau khi p h â n phối vào ống nghiệm h ay b ìn h nuôi cấy, môi trường d in h dưỡng
cần p h ải được tiệ t trù n g ngay vì vi sin h v ậ t có th ể p h á t triể n r ấ t n h a n h trong
môi trường chưa tiệ t trù n g và làm th a n h đổi th à n h p h ầ n môi trường.
- Sau khi tiệ t trùng, làm nguội tới n h iệ t độ phòng, sau đó bảo quản trong tủ lạnh.
6- C h u ẩ n b ị m ô i tr ư ờ n g r ắ n và b á n r ắ n

- Đôi với môi trường có chứa c h ấ t làm đặc n h ư ag ar, n ấu chảy ag ar tro n g 1/2

th ể tích nước dùng để p h a môi trường
- C ân và h ò a ta n các th à n h p h ần k h ác của môi trư ờng tro n g 1/2 lượng nước
còn lại
- Khi a g a r đã ta n hoàn to àn , trộ n lẫ n các th à n h p h ần dinh dưỡng k h á c với
dung dịch có chứa ag ar
- L àm đầy lên th ể tích cần th iế t b ằ n g nước, sau đó p h â n phối ngay vào ống
n ghiệm hoặc b ìn h nuôi cấy khi dung dịch còn nóng. N ếu đế nguội, a g a r sẽ
đặc lại và sẽ k h ô n g th ế ró t vào ống n g h iệm được nữa
- Đóng n ắ p ống nghiệm và tiệ t trù n g n h ư đối với môi trư ờng lỏng
- Sau khi tiệ t trù n g , đối với th ạc h ngh iên g , cần đ ặ t ống th ạ c h n g h iên g có
chứa môi trư ờng còn nóng ở vị trí n ằ m n g h iên g cho tới khi nguội
- Bảo quản môi trường đã đông đặc tro n g tủ lạ n h ở vị tr í lậ t ngược.

B à i 3 KỶ THUẬT GIEO CAY VI SINH VẬT
1. N g u y ê n lý
Để có th ể nuôi cấy vi sin h v ật, cần p h ả i thường xuyên cấy vi sin h v ậ t từ môi
trường này sang môi trường khác và phải đảm bảo trong khi cấy chuyền không làm
nhiễm vi sinh v ậ t đang sử dụng với những vi sin h v ậ t không mong m uốn từ môi
trường xung quanh.
Vi sin h v ậ t thường được cấy chuyền b ằ n g que cấy vòng h ay que cây nhọn.
Trong nhữ ng trư ờng hợp đặc b iệt, có th ế dùng nhữ ng dụng cụ khác để cấy chuyền
vi sinh v ậ t nh ư pipet, que đầu có quấn bông, que tra n g hav ông tiêm .


MỘT SỐ KỸ THUÂ T cơ BẢN CỦA VI SINH VÁ T HỌC

11

2. P h ư ơ n g p h á p c ấ y c h u y ề n
- Mỗi lầ n cây chuyền, chỉ nên dùng m ộ t loại vi sin h v ậ t để tr á n h n h iễm

chéo các loại vi sinh v ật với nhau. Ghi n h ã n từ n g ống nghiệm sẽ cấy
chuyền với đầy đủ các thông tin về vi sin h v ậ t tro n g ống n g h iệm , bao gồm:
tê n vi sin h v ậ t, ngày cấy chuyền, môi trư ờ ng cây chuyền.
- Cầm que cấy trong tay phải (tay th u ận ), ống n g h iệm gốc và ống nghiệm sẽ
cấy chuyền tro n g tay trái.
- Tiệt trù n g que cấy 'bằng cách hơ trên ngọn lửa đèn cồn tới khi que cấy nóng đỏ
- Mở n ắ p ống nghiệm gốc trước bằng cách dùng ngón tay ú t kẹp c h ặ t n ú t
bông vào lòng b à n tay, từ từ xoay và kéo n ú t bông ra khỏi ống nghiệm , hơ
n ú t bông và m iệng ống nghiệm gốc trê n ngọn lửa đèn cồn. Chú ý, không
làm cháy n ú t bông cũng như không làm rơi n ú t bông xuống b à n cấy h ay để
n ú t bông chạm vào b ấ t cứ vật gì xung quanh! Luôn giữ m iệng ống nghiệm
đang m ở ở vị trí nằm nghiêng và gần ngọn lửa đèn cồn.
- Mở n ắ p ông nghiệm sẽ cấy chuyền b ằn g cách k ẹp c h ặ t n ú t ông nghiệm giữa
ngón ú t và ngón áp út và làm tương tự như trường hợp ống nghiệm gốc.
- Cho que cấy đã vô khuẩn và làm nguội vào ống n ghiệm gốc, lấy m ột vòng
que cấy môi trường (lỏng hoặc đặc) có chứa vi sin h v ậ t và chuyển nó sang
môi trư ờ ng tro n g ống nghiệm thứ hai.
- Nếu câ'y chuyền vi khuẩn hoặc nấm m en, người ta thư ờ ng di que cấy có chứa
canh trư ờ n g vi sin h v ật lên bề m ặ t th ạch ag ar ở ống nghiệm thứ 2 theo
h ình chữ chi hoặc vạch song song.
- N ếu vi sin h v ậ t cần cấy chuyền là n ấm mốc th ì chí cần chạm nhẹ que cấy
lên bề m ặ t th ạc h ở giữa ống nghiệm .
- Rút que cấy ra, ho' đỏ trên ngọn lửa đèn cồn đế vô k h u ẩ n sau đó đ ặ t que cấy
lên giá đỡ ỏng nghiệm .
- Hơ lầ n lượt m iệng ống nghiệm và n ú t bông qua ngọn lửa đ èn cồn sau đó đậy
n ắ p ống nghiệm lại. Lưu ý, nút bông của ống n ghiệm nào th ì đậy đúng ống
nghiệm đó.
- Que tra n g và đũa thủy tinh được dùng đế' d à n đều vi sin h v ậ t trê n bề m ặt
th ạch tro n g hộp p etri. Que trang và đũa thủy tin h có th ể đưực tiệ t trùng bằng
cách nhúng vào cồn 90-95% sau đó hơ trên ngọn lửa đèn cồn hay bọc kín vào

giấy sau đó tiệ t trùng bằng nhiệt khô trong tủ sấy (170°c trong 2,5 giờ) hay
n h iệt ẩm trong nồi autoclave.
- Khi cấy chuvền, 0,l?nZ dung dịch có chứa vi sinh vật được nhỏ vào giữa môi trường
đặc trong hộp petri, sau đó được dàn đều bằng que tran g ra toàn bộ bề mặt.
- Để cấy chuyền m ột lượng chất lỏng lớn hơn có th ể dùng p ip iet đã dược vô
k h u ẩn. Đầu to của pipet cần phải được nhét bông để trá n h làm nhiễm bẩn dung
dịch được cấy chuyền.


12

CHƯƠNG 1

B à i 4 KỶ THUẬT NUÔI CAY VI SIN H VẬT
1. Nuôi cấy trong m ôi trường lỏng
Vi sin h v ậ t hiếu khí có th ể p h á t triể n tố t trong m ộ t lớp m ỏng m ôi trường
lỏng tro n g điều k iệ n nuôi cấy tĩnh. Trong trường hợp này, bình tam giác có th ể được
làm đầy tới 1/10 th ể tích.
Đối với lớp c h ấ t lỏng dầy hơn, vi sin h v ậ t hiếu khí sẽ cần p h ả i được cung cấp
th êm k h ô n g k h í b ằ n g cách lắc hay sục khí. Bình tam giác có th ể được làm đầy tới
30% th ể tích kh i được lắc ở tốc độ 150 vòng/phút. Lưu ý k h i lắc k h ô n g được để môi
trường lỏng làm ướt n ú t bông vì điều đó sẽ làm cản trở sự lưu th ô n g k h ô n g k h í hay
tạo điều k iện th u ậ n lợi cho vi sinh v ậ t từ ngoài nhiễm vào m ôi trư ờ ng dinh dưỡng
tro n g bình.
2. Nuôi cấy trong m ôi trường dặc
Vi sinh v ậ t thường được nuôi cấy tro n g môi trường đặc tro n g hộp p e tri hay
tron g ống th ạ c h nghiêng. Môi trường nuôi cấy thường được làm đặc bằng 1-2% agar,
14% gelatine hay silica gel. Tuy nhiên chất làm đặc hay được sử dụng n h ấ t là agar.
Agar nóng chảy ở 100°c và đông đặc ở 40-43°C tùy thuộc vào nồng độ. Agar có th ể
được hòa tan trong nồi autoclave bằng cách nâng nhiệt độ lên 121°c sau đó lập tức tắ t

nguồn nhiệt. Phương pháp thứ hai có th ể nấu chảy agar bằng cách đun cách thủy, tuy
nhiên cách này sẽ tốn nhiều thời gian hơn.
Để làm được m ột ống th ạc h n ghiêng trong ống nghiệm kích thước 160xl6/nm ,
cần tới 6m l môi trường agar. Đối với hộp petri có đường kính 90-100mm, cần tới lOĩĩil
môi trường agar cho những quá trìn h nuôi cấy bình thường hay 15m l cho những quá
trìn h nuôi cấy dài hơn.
3. Nuôi cây vi sinh vật vi h iếu khí
Vi sin h v ậ t vi hiếu khí là nhóm vi sinh vật p h á t tr iể n tố t n h ẩ t tro n g môi
trường có h à m lượng CƠ 2 lớn (7-10%) và hàm lượng O2 nhỏ hơn so với tro n g khí
quyển. Để nuôi cấy nhóm vi sinh v ậ t n à y trong phòng th í n g h iệm hay sử dụng
phương p h á p nuôi cấy vi sin h v ậ t tro n g m ột bình kín có đôt n ê n để loại trừ O 2 và
làm tă n g h à m lượng C 0 2. Khi nến cháy sẽ chuyển hóa p h ầ n lớn O 2 tro n g bình
th à n h khí CO 2.
4. Nuôi cấy vi sinh vật kỵ khí
T rong phòng th í nghiệm , vi sinh v ậ t kỵ khí có thế được nuôi cấy b ằ n g cách
loại trừ ho àn to à n 0 2 ra khỏi môi trư ờng xung quanh, b ằ n g cách sử dụng môi
trường có tín h khử h ay k ế t hợp cả hai phương pháp.
Môi trư ờ ng khử là môi trường có m ột th à n h phần có k h ả n ă n g k ế t hợp với O 2
tự do ví dụ nh ư thioglycollate (H SCH 2COONa). C hất chỉ th ị m àu thường được cho
vào môi trư ờng để có th ể n h ậ n b iế t sự có m ặ t của 0 2. Ví dụ re sa z u rin có m àu hồng
khi môi trư ờng nuôi cấy có chứa 0 2 và không màu khi không có 0 2.


MỒT SỐ KỸ THUẢ ĩ cơ BẢN CỦA VI SINH VẢ ĩ HOC

13

N hừng m ôi trường bình thường, không có tín h khứ có th ế được sử dụng đế
nuôi cây vi sin h v ậ t kỵ khí trong bình kỵ khí đặc biệt. 0*2 được loại trừ ra khỏi bình
nuôi cấy này b ằ n g túi G as-P ak và chất xúc tác palladium . T rong túi G as-Pak có chứa

sodium bicarbonate và sodium borohydride. Khi cho nước vào trong túi này sẽ giải
phóng ra khí H 2 và C 0 2. H 2 sẽ tác dụng với 0-2 trong b ìn h nhờ xúc tác của palladium .
M ethylene blue được sử dụng như chất chỉ th ị màu. M ethylene blue có m àu xanh khi
có oxy và không m àu khi bị khử 0 2.
ơ những p h ò n g th í nghiộm hiện đại ngày nay thường có tra n g bị tủ nuôi cấy
kỵ khí. K hông k h í tro n g nhữ ng tủ này được h ú t h ế t ra ngoài b ằn g bơm chân không
và sau đó được th a y b ằ n g C 0 2 hay N 2.

B à i 5 CÁC KỶ THUẬT PHÂN LẬP VI SIN H VẬT
T rong tự n h iê n , p h ầ n lớn vi sinh v ật tồn tại lẫn với nhau tro n g m ột tậ p hợp
bao gồm nhiều sin h v ậ t hay vi sinh vật khác nhau. Đề có th ế n g h iên cứu tín h ch ất
hoặc ứng dụng của vi sin h v ậ t thường phải p h â n lập chúng ra nhữ ng vi sinh v ậ t
riên g rẽ.
H iện nay, có ba phương pháp hay được sử dụng đế p h â n lập vi sinh v ậ t là
phương p h áp đổ đĩa, phương pháp dàn đều và phương p h á p cấy ria:
I- P h ư ơ n g p h á p d ồ d ĩa

N g u yên lý: m ột lượng nhỏ vi sinh v ật đầ pha loãng được trộ n đều với môi
trường ag ar nóng chay và dươc đổ vào hôo p etri đă vô k h uẩn. Sau thờ i gian nuôi
cấv ở n h iệ t độ th ích hợp, vi sinh v ật sè mọc th à n h nhữ ng k h u ẩ n lạc riên g rẽ. Mỗi
khuẩn lạc sẽ chỉ bao gồm m ột loài vi sinh v ậ t th u ần chủng.
Cách tiến h à n h :
- N ấu chảy ba ống nghiệm có chứa 19m ỉ môi trư ờng dinh dưỡng đặc
- Đ ặt ba ống nghiệm có môi trường đã nóng chảy vào bể điều n h iệt ở 45-50°C
- C huẩn bị sẵ n ba hộp petri đã vô khuẩn, ghi độ p h a loãng lên mỗi hộp
- C họn dung dịch chứa hỗn hợp vi sinh v ậ t cần p h â n lập
- H ú t 1m l dung dịch chứa hỗn hợp vi sinh v ậ t cho vào ống nghiệm th ứ n h ấ t,
lắc kỹ tr ê n vortex, ta có độ pha loãng 1/20
- H út 1m ỉ dung dịch ở độ pha loãng 1/20 cho san g ống n g h iệm th ứ 2, lắc kỹ
tr ê n vortex, ta có độ pha loãng 1/400

- H út 1m ỉ dung dịch ở độ pha loãng 1/400 cho san g ông n ghiệm th ứ 2, lắc kỹ
trê n vortex, ta có độ pha loãng 1/8000
- Đố ba ống n g h iệm vào ba hộp petri vô k h u ẩn đã ghi nh ữ n g độ p h a loãng
tương ứng. Để nguội và nuôi cấy ở vị trí lậ t ngược ở n h iệ t độ th ích hợp cho
loài vi sin h v ậ t muôn phân lập
- Sau thời gian nuôi cấy, tách riêng từng k h u ẩn lạc riê n g rẽ.


14

CHƯƠNG 1

2- P h ư ơ n g p h á p d à n đ ề u

N guyên lý: m ộ t lượng nhỏ vi sinh v ậ t đã được p h a loãng trước được dàn đều
lên tr ê n bề m ặ t hộp p e tri có chứa môi trường d in h dưỡng thích hợp.
Cách tiế n hành:
- Môi trường agar nóng chảy được đố vào hộp petri vô khuẩn và để cho đặc lại
- 0,1/n/ dung dịch có chứa hỗn hợp vi sin h v ậ t cần p h â n lập ở các độ pha
loãng k h ác nhau được pipet vào các hộp p e tri đã chứa môi trư ờ n g đặc và
được d àn đều ra k h ắ p bề m ặ t hộp b ằn g que tra n g vô k h u ẩn
- L ậ t ngược hộp p e tri có chứa vi sính v ậ t và để vào tủ ấm ở

35°c tro n g 48 giờ

- Sau đó tá c h rời các k h u ẩ n lạc mọc lên trê n bề m ặ t m ôi trư ờ ng đặc.
3- P h ư ơ n g p h á p c â y r ia

N guyên lý: que cấy được sử dụng đế cấy ria nhiều lần hỗn hợp vi sin h vật cần
phân lập trê n k h ắp bề m ặ t môi trường đặc trong hộp p etri. Sau mỗi lần cấy ria, vi

sinh v ậ t sẽ hi tách d ần ra khỏi hỗn hợp và p h á t triể n th à n h m ột k h u ẩn lạc riên g rẽ.
Cách tiến hành:
- Hơ đỏ que cấv, làm nguội vằ lấy một vòng que cấy đầy hỗn hợp vi sinh vật cần
phân lập
- N g h iêng hé mở hộp p e tri, dùng que cấy gạch nh ữ n g đường song song ở ph ần
a của hộp p e tri
- Hơ đỏ que cấy, làm nguội và gạch những đường song song ở p h ầ n b của hộp
p etri như h ìn h 1.1
- Hơ đỏ que cấy, làm nguội và gạch nhữ ng đường song song ở p h ầ n c của hộp
p etri như h ìn h 1.1
- Hơ dỏ que cấy, làm nguội và gạch nhừ ng đường song song ở p h ầ n d của hộp
p e tri như h ìn h 1.1
- L ậ t ngược hộp p e tri có chứa vi sinh v ậ t và để vào tủ ấm ở 35°c tro n g 48 giờ
- Sau đó tác h rời các k h u ẩn lạc mọc lên tr ê n bề m ặ t môi trường đặc

H ìn h 1.1 Phương p h á p cấy ria


MỘT SỐ KỸ THUẬT cơ BẦN CỦA VI SINH VẬT HỌC

B ài 6

15

CÁC PHƯƠNG PHÁP GIỮ G IốN G VI SIN H VẬT

Các ch ủ n g vi sin h v ậ t th u ần k h iết sau khi p h â n lập được cần p h ải được bảo
quản ở điều k iện tối ưu sao cho sau thời gian bảo quản chúng v ẫ n ở trạ n g th á i h o ạ t
động và giữ được h o ạ t tín h không bị thay đổi.
1. Các phương pháp cấy chuyền

Cấy ch u yền đ ịn h kỳ: vi sinh v ật có th ể được cấy chuyền từ m ôi trường nuôi
cấy cũ san g m ôi trư ờ ng mới đế đảm bảo nhu cầu dinh dưỡng cho vi sin h vật. Thời
gian giữa h a i lầ n cấy chuyền dao động từ vài tu ầ n đến vài th á n g tùy từng loại vi
sinh vật. N ếu vi sin h v ậ t sau khi cấy chuyền được bảo quản ở n h iệ t độ th ấ p th ì có
th ể kéo d ài th ờ i gian giữa hai lần cấy chuyền.
Bảo q u ả n dưới dầu: paraffin phủ trê n lớp th ạ c h n g h iên g sẽ giúp ngăn cản sự
bay hơi nước của môi trường nuôi cấy vi sinh v ậ t và làm chậm tốc độ p h á t triể n
của vi sin h v ậ t nhờ h ạ n chế 0 2.
Phương p h á p thực hiện:
- C h u ẩn bị ổng nghiệm có chứa môi trưừng ag ar đông đặc ở

30°c

- C ấy chuyền vi sin h v ậ t sang ống nghiệm và đế cho vi sin h v ậ t có thời gian
p h á t tr iể n tố t ở n h iệ t độ tối ưu
- T iệ t trù n g paraffin hai lần ở 121°c, 15 ph ú t
- Đổ p a raffin đã tiệ t trù n g lên lớp th ạ c h n g h iên g có chứa vi sinh v ậ t sao cho
lớp p a raffin cao hơn lớp thạch n ghiêng 1cm
- Có th ể bảo quản ở n h iệ t độ th âp hay n h iệ t độ phòng
- Thời g ian giữa hai lầ n cấy chuyền có th ể lên đ ến vài n ăm tùy thuộc vào
từ ng loài vi sin h vật.
Bảo q u ả n trong nước:
- C ắ t m ộ t khôi ag ar 6m m từ rìa k h u ẩn lạc
- Đ ặ t k h ô i a g a r đó vào tro n g ống nghiệm có chứa nước c ất vô k h u ẩn , đậy c h ặ t
n ắ p ố ng n g h iệm và bảo quản ở 25°c
2. Các phương pháp sấ y khô hoặc đông cô
Sấy khô làm giảm sự trao đổi ch ất của vi sin h v ậ t. T ế bào h ay bào tử vi sin h
v ậ t có th ể được sấ y khô bằng cách thổi không khí, b ằ n g các c h ấ t h ú t ẩm như silica
gel hay đ ấ t h a y b ằ n g phương pháp đông cô. T hường bào tử có h à m lượng nước th ấ p
hơn so với t ế bào dinh dưỡng và chịu được điều k iện khô tố t hơn.

S ấ y khô b à n g kh ô n g khí:
T hổi k h ô n g khí khô có n h iệ t độ th ấ p hơn n h iệ t độ làm c h ế t vi sinh v ật.
Phương p h á p n à y thường được sử dụng để bảo quản n ấ m mốc và n ấm m en.


16

CHƯƠNG 1

Báo quản trong silica g e l:
- Silica gel được đổ vào 1/3 ống nghiệm và tiệ t trù n g ở 180°c, 3 giờ
- Cho ống nghiệm tr ê n vào tủ đông ở -20°c
- C huẩn bị huyền phù bào tử vi sinh v ậ t tro n g 5% dung dịch sữa gầy
- ĐỐ huyền phù bào tử vào silica gel lạ n h và lắc đều
- Bảo quản ống n ghiệm ở n h iệ t độ thường với n ắ p không v ặ n c h ặ t cho tới khi
silica gel khô
- Vặn c h ặ t n ắ p ống nghiệm và bảo quản ở 4°c.
Đ ông cô:
- C huẩn bị hỗn hợp vi sin h v ậ t tro n g 10% sữa gầy hay tre h a lo se đã vô k h u ẩn
- Cho 0,2-0,5m l hỗn hợp có chứa vi sin h v ậ t vào am poule đã tiệ t trù n g
- Đ ặt hờ n ắ p cao su lên m iệng ampoule
- Đ ặ t am poule vào m áy đông cô ở n h iệ t độ -35°c
- Khi n h iệ t độ tro n g am poule hạ xuống -20°c, b ậ t bơm chân k h ô n g
- Sau 3 giờ, tă n g n h iệ t độ của m áy lên 10°c với 0,08°c/m in.
- T ắ t m áy đông cô sau 24 giờ, n ú t cao su sẽ bị h ú t vào cổ am poule
- Lấy am poule ra khỏi m áy và có th ể h à n k ín m iệng am poule b ằ n g ngọn lửa.
Bảo quản ở n h iệt độ lạ n h đ ô n g :
H ạ th ấ p n h iệ t độ m ôi trư ờng nuôi cấy vi sin h v ậ t sẽ làm giảm quá trìn h trao
đổi ch ất cho tới k h i nó dừng h ẳ n khi to à n bộ nước tro n g t ế bào vi sin h v ậ t bị đóng
băng. Dưới -70°c, h ầu như không còn có sự trao đổi c h ấ t nào của vi sin h v ật. Tuy

n hiên, sự th ay đổi cấu trú c tin h th ể đá v ẫn có th ể xảy ra ở n h iệ t độ -135°c. Bởi
vậy, bảo quản vi sin h v ậ t ở n h iệ t độ của nitơ lỏng (-196°C) là phương p h áp bảo
quản an to à n n h ấ t h iệ n nay đang được sử dụng.
- C huẩn bị h ỗ n hợp vi sin h v ậ t tro n g 10% glycerol vô k h u ẩn
- Cho 0,5m l hỗn hợp trê n vào ống nghiệm b ằn g nhự a đã vô k h u ẩ n
- Làm lạ n h ông nghiệm xuống -50°c với v ận tốc làm lạ n h th íc h hợp cho từng
loài vi sin h v ậ t
- Khi n h iệ t độ hỗn hợp đã hạ thấp xuống -50°c, đ ặ t ống nghiệm vào nitơ lỏng.
Ngoài n itơ lỏng, vi sinh v ậ t có th ể được bảo quản ở n h iệ t độ cao hơn như
-2 0 ° c , - 4 0 ° c hoặc -7 0 ° c , tuy n h iên n h iệ t độ càng cao th ì thờ i gian bảo quản càng
ngắn và vi sin h v ậ t càng dễ bị m ấ t h o ạ t tín h .


Chương

PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT
MỞ ĐẨU
Việc đ ịn h lượng vi sin h v ật trong thực phẩm là r ấ t cần th iế t. Điều đó cho
phép chúng ta đ án h giá ch ất lượng vệ sinh an toàn của sả n phẩm . Các chỉ tiêu vi
sin h của thực phẩm thường liên quan đến hàm lượng của m ộ t sô" loài vi sin h v ậ t
hoại sin h hoặc vi sin h v ậ t gây bệnh trong thực phẩm . N goài ra, dựa vào các chỉ
tiêu vi sin h của thực phẩm , chúng ta có th ể đ án h giá k h á i q u á t về tìn h trạ n g vệ
sin h tro n g quy trìn h sả n xuất của các cơ sở chế biến.
T rong công nghệ lên m en thực phẩm và công nghệ vi sin h nói chung, khi
thực h iệ n các quá trìn h nuôi cấy vi sinh v ậ t ở quy mô phòng th í nghiệm cũng như
quy mô công nghiệp, việc theo dõi sự sinh trưửng của giống vi sinh v ậ t tro n g canh
trư ờng cũng râ"t quan trọng. Nó giúp cho các n h à công nghệ hiểu rõ hơn về động
học của quá trìn h lên m en, từ đó đề xuất các giải p h áp kỹ th u ậ t để điều k h iển quá
trìn h lên m en tạo ra các sả n phẩm như ý muôn.
H iện n ay có r ấ t n hiều phương pháp vừa để định lượng vi sin h v ậ t trong m ẫu

thực p h ẩm n h ằ m mục đích kiểm tra chỉ tiêu vi sin h sả n p hẩm , vừa để định lượng
vi sin h v ậ t tro n g các canh trường lên men nhằm mục đích theo dõi sự sín h trưởng
của vi sin h v ậ t tro n g quá trìn h nuôi cấy. Tuy n h iên , có m ột số phương pháp chỉ
được sử dụ n g để theo dõi sự sinh trưởng của vi sinh v ậ t tro n g các quá trìn h lên
m en m à th ô i.
Các phương p h á p định lượng vi sinh v ậ t hoặc đ á n h giá sự sin h trưởng của
chúng có th ể được chia th à n h bô"n nhóm như tro n g b ả n g 2.1.
T rong quyển sách này, chúng tôi sẽ lần lượt đề cập đến m ột sô" phương pháp
quan trọ n g tro n g bô"n nhóm phương pháp đã được đề cập đến ở trê n .


18

CHƯƠNG 2

B ả n g 2.1 Các phương pháp định lượng vi sinh vật hoặc đảnh giá

sự sinh trưởng của chúng
Nhóm phương pháp

Tên phương pháp

Phạm vi áp dụng

Phương pháp xác định

- Kỹ thuật đếm tế bào trên buồng đếm

- Khảo sát sự sinh trưởng của vi sinh vật

số lượng tế bào

- Kỹ thuật Breed...
- Phương pháp nuôi cấy trên môi trường
đặc

trong canh trường lên men
- Định lượng vi sinh vật trong thực phẩm
- Khảo sát sự sinh trưởng của vi sinh vật
trong canh trường lên men

Phương pháp X ó c định

- Phương pháp đo độ đục

sinh khối

- Phương pháp xác định hàm lượng chất

- Khảo sát sự sinh trưởng của vi sinh vật
trong canh trường lên men

khồ của sinh khối...
Phương pháp xác định

- Hàm lượng A T P nội bào

hàm lượng các chất nội

- Định lượng vi sinh vật trong thực phẩm

- Khảo sát sự sinh trưởng của vi sinh vật

bào

trong canh trường lên men
- Hàm lượng NAD, NADH...
- Hàm lượng nitơ tổng

Phương pháp xác định

- Động học quá trình sử dụng cơ chất

hoạt tính của sinh khối

- Động học quá trình tạo sản phẩm

- Khảo sát sự sinh trưởng của vi sinh vật
trong canh trường lên men
- Khảo sát sự sinh trưởng của vi sinh vật
trong canh trường lên men

Bài 7 PHƯƠNG PHÁP ĐÊM s ố TẾ BÀO VI SINH VẬT BANG BUồNG ĐEM
1. G iới t h iệ u c h u n g
Nếu vi sinh v ậ t dạng đơn bào, đứng riêng lẻ và có kích thước lớn (vài
m icrom eter) th ì ta có th ể sử dụng các buồng đếm và k ín h hiển vi để định lượng số tế
bào trong mẫu. Phương pháp này thường được sử dụng để đếm m ột số loài nấm m en
và vi khuẩn. N ấm sợi và xạ khuẩn có hình sợi; riêng nấm sợi có bào tử với kích thưíớc
rấ t nhỏ. Do đó, ta không th ể sử dụng buồng đếm để định lượng nấm sợi và xạ khuẩn.
Phương p h áp đếm t ế bào b ằ n g buồng đếm và k ín h h iể n vi thư ờ ng được sử
dụng để theo dõi sự sin h trư ởng của vi sin h v ậ t tro n g các quá trìn h lên m en thự c

h iện tr ê n m ôi trư ờ ng lỏng. Phương p h áp n à y không được áp dụng đ ể kiểm tra h à m
lượng vi sin h v ậ t tro n g các m ẫu thực phẩm .
c ấ u tạ o b u ồ n g đ ế m : có nhiều loại buồng đếm k h ác nhau. Tuy n h iên , nguyên

tắc cấu tạo của chúng lại giống nhau. Buồng đếm là m ột p h iế n k ín h dày, với bề
m ặ t h ìn h chữ n h ậ t (H.2.1). T rê n bề m ặ t buồng đếm , có đục bốn r ã n h song song với
chiều rộ n g và chia bề m ặ t th à n h ba k h o an g chính A, B và c . C hiều cao của hai
khoang A và c là nh ư nhau. K hoang giữa B th ấ p hơn h ai k h o an g b ê n A và c m ột
đoạn h. Giá trị h được gọi là chiều cao của buồng đếm . K hoang B được chia tiêp
th à n h h ai khoang nhỏ Bi và B2 nhờ m ột r ã n h đục song song với chiều dài của bề
m ặ t buồng đếm . T rê n m ỗi khoang nhỏ, người ta có kẻ m ột lưới đếm gồm nhiều ô
lớn h ìn h vuông hoặc h ìn h chữ n h ậ t. M ột số ô lớn được chia tiế p th à n h các ỏ nhỏ
hơn. Buồng đếm có kèm theo lá k ín h để đậy. Lá k ín h có bề m ặ t h ìn h vuông và r ấ t
phẳng. C hiều cao của buồng đếm và diện tích m ột ô lớn thường được ghi ở m ột góc
trê n bề m ặ t buồng đếm .


PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VÀT

19

T hông thường, các buồng đếm có chiều cao h dao động từ 0,01m ra đến 0,10,2m m . N h ữ n g buồng đếm có chiều cao th ấ p (h = 0,01 m m ) nh ư Petroff-H auser
thường được sử dụng đế đếm vi khuẩn. N hững buồng đếm có chiều cao lớn hơn (h =
0,1-0,2m m ) n h ư Thom a, M alassez, G oraev... đưọ'c dùng để đếm n ấ m m en. H ình 2.2
va 2.3 mô tả lưới đếm của buồng đêm T hom a và M alassez.
T iếp theo, ta sẽ xem x é t kích thước của m ột sô buồng đếm th ô n g dụng. Buồng
đếm T hom a có t ấ t cả 16 ô vuông lớn kích thước nh ư nhau, mòi ô vuông lớn được
chia th à n h 16 ô vuông nhỏ b ằn g nhau. Mỗi ô vuông nhỏ có cạnh dài (l/20)m m .
Buồng đêm M alassez có t ấ t cả 25 ô h ìn h chữ n h ậ t, m ỗi ô h ìn h chữ n h ậ t được chia
th ả n h 20 ô vuông. C hiều dài mỗi cạnh ô vuông nhỏ là (1/20)mm .

H ìn h 2.1: Cấu tạo buồng đ ếm tế bào ui sin h vật

C hiều cao buồng đếm:

h = 0,1 m m

D iện tíc h 1 ô vuông nhỏ:

(1/20)

Thế’ tíc h 1 ô vuông nhỏ:

(1/400)

T hế tíc h 1 ô vuông lớn:

(1/4.000)

X
X

(1/20) = (l/400)m m 2
0,1 = (l/4000)m m 2
X

16 = (l/250)/?im 2


20

CHƯƠNG 2

C hiều cao buồng đếm:

h = 0,2771771

D iện tích 1 ô vuông nhỏ:

(1/20)

T hể tích 1 ô vuông nhỏ:

(1/400)

X

(1/20) = (l/400)7777772
X

T hể tích 1 ô chữ n h ậ t lớn: (1/2.000)

0,2 = (l/2000)/777772
X

20 = (1/100)7777?72

2. C á ch th ự c h iệ n
T rong bài th í nghiệm này, chúng ta sẽ đếm n ấ m m en tro n g can h trường lỏm g,
sử dụng buồng đếm T hom a hoặc M alassez.

Lắc th ậ t đều canh trường b a n đầu: nếu canh trư ờ n g được đựng tro n g e rlen tth ì
dùng cá từ để trộ n m ẫu, nếu canh trư ờ ng được đựng tro n g ống n g h iệm th ì sử diụing
th iế t bị trộ n V ortex để các vi sin h v ậ t p h ân bố t h ậ t đều tro n g can h trường. ILúấy
m ẫu và tiế n h à n h p h a loãng m ẫu b ằ n g nước vô k h u ẩ n . N ếu cần xác địn h tỷ lệ tế
bào n ấ m m en sống và chết, sử dụng dung dịch x an h m eth y len để p h a lo ãn g lắần
cuối với độ p h a loãng hai lần.
D ùng lá k ín h đậy lên lưới đếm , sử dụng các ngón ta y đè p h ầ n lá k ín h ép c.hiặt
và t h ậ t s á t vào bề m ặ t của h a i k hoang b ên A và c n h ằ m đảm bảo chiều cao butồmg
đếm đúng nh ư đã th iế t kế. D ùng p ip e t P a ste u r lấy m ẫu đã p h a lo ãn g rồi cho liên
m ép giữa lá k ín h và bề m ặ t k hoang B, m ẫu sẽ tự k huếch tá n vào k h o ản g trố m g
giữa bề m ặ t k hoang và lá kính. l à ii th ao tác, cần chú ý tr á n h tạo n ê n các bọt kíhí
tro n g lưới đếm và tr á n h làm rơi m ẫu xuống các rã n h tr ê n buồng đếm .
Sau 3-5 p h ú t, đ ặ t buồng đếm lên k ín h h iể n vi ở độ phóng đại *400 lần. T itến
h à n h đếm số t ế bào tro n g các ô tr ê n lưới đếm . Đối với buồng đếm T hom a, ta <ỉế:m
tổng số t ế bào tro n g 10 ô vuông lớn (được ký hiệu dấu * tr ê n h ìn h 2.2). Đối V'ới
buồng đếm M alasseze, ta đếm tổ n g số tế bào tro n g 5 ô h ìn h chữ n h ậ t theo đưởing
chéo của lưới đếm (được ký hiệu dấu * tr ê n h ìn h 2.3). T heo quy ước, các t ế bào ruằ.m
trê n cạn h b ê n ph ải và b ê n dưới của ô đếm th ì được xem là thuộc về ô đếm đíó.
Ngược lại, các t ế bào n ằ m tr ê n cạn h b ê n tr á i và c ạ n h tr ê n của ô đếm th ì k h ô n g
được xem là thuộc ô đếm . T ổng số t ế bào đếm được tro n g 10 ô vuông lớn t r ẽ n
buồng đếm T hom a hoặc tro n g 5 ô h ìn h chữ n h ậ t tr ê n buồng đếm M alassez n ẽ n
nằm tro n g k h o ản g từ 100 đến 250 t ế bào.


PHƯƠNG PHÁP ĐINH LƯỢNG VI SINH VẬT

21

3. C á c h tín h k ế t q u ả
Số t ế bào có tro n g 1m l m ẫu ban đầu được tính theo công thức:

N = A .1000.F

h.s
trong đó: A - sô t ế bào tru n g bình trong m ột ô đếm
h - chiều cao của buồng đếm {mm)

s - diện

tích m ột ô đếm (m m 2)

1000 - hệ số chuyển đổi từ niỉĩi3 sang cm 3
F - h ệ số ph a loãng của m ẫu trước khi đếm
Ví dụ: buồng đếm Thom a có h = 0,1 mm \
tro n g lm L m ẫu ban đầu là:
N = A .1000.F

s

- (1/250)m m 2 n ê n số tế bào có

= 25.105.A.F

trong đó: A - số tế bào tro n g 1 ô vuông lớn
F - hệ số ph a loãng của 'mẫu trước khi đếm

B à i 8 PHƯƠNG PHÁP B R E E D
1. G iới t h iệ u c h u n g
Đây là phương p h áp đếm tế bào trê n các vết bôi đã được cố định và nhuộm
màu. Phương p háp n à y thường được dùng để xác đ ịnh nồng độ vi k h u ẩ n trong các
quá trìn h lên m en sử dụng môi trường lỏng. Tương tự như phương p háp sử dụng

buồng đếm , phương p h áp Breed chỉ có thể đếm được các t ế bào vi sin h v ậ t dạng
riên g lẻ.
2. C á ch th ự c h iệ n
Trong bài th í nghiệm này, chúng ta sẽ đếm vi khuẩn bằng phương pháp Breed.
Hóa c h ấ t sử dụng:
- Cồn 96% v/v
- Dung dịch x anh m ethylen
Các bước thực hiện:
- T iến h à n h ph a loãng m ẫu chứa vi sinh v ật b ằn g nước vô k h u ẩ n (nếu cần).
- Lắc t h ậ t đều m ẫu và dùng m icropipet lấy chính xác 0 ,0 lm l m ẫu cho lên m ột
p h iến k ính có kẻ ô với diện tích là lcm 2. Nếu k h ô n g có p h iến k ín h kẻ sẵn
ô, ta có th ể đ ặ t phiến k ính lên trê n m ột tờ giấy trắ n g kẻ ô.


22

CHƯƠNC 2

- T hêm vào m ẫu tr ê n p h iến k ính m ột giọt dung dịch a g ar 0,03% vô trùng
(n h iệ t độ dung dịch ag ar xấp xỉ 50°C). D ùng que cấy vòng vô trù n g trộ n th ật
n h a n h m ẫu và dung dịch ag ar trê n phiến k ín h để p h â n bố đều hỗn hợp trên
ô kẻ có d iện tích le m 2 nói trê n , v ế t bôi được làm khô tro n g không khí.
- Nhỏ tiế p lê n v ế t bôi vài giọt cồn 96% và chờ tro n g th ờ i gian 20-30 phút.
- Cho v ài g iọ t thuốc nhuộm lên v ế t bôi (có th ể sử d ụ n g dung dịch xanh
m ethylen). Sau đó, rử a cẩn th ậ n tiêu b ả n tro n g chậu th ủ y tin h đựng nước.
T h ay đổi nước rử a cho đến k h i n h ú n g tiê u b ả n vào nước rử a k h ô n g th ấy
nước rử a bị đổi m àu nữa.
- Sấy khô tiê u b ả n tro n g khô n g khí.
- Q uan s á t tiê u b ả n dưới k ín h h iển vi (sử dụng v ậ t k ín h dầu nếu cần),
- Trường hợp sử d ụ n g lưới th ị kính: gắn vào th ị k ín h m ộ t lưới đếm có vẽ các

ô vuông có d iện tích b ằ n g nhau. T iến h à n h đếm tổ n g số vi k h u ẩ n ít n h ấ t là
tro n g 10 ô vuông của lưới đếm b ằn g cách dịch chuyển dần tiêu b ản theo
đường chéo.
- Trường hợp kh ô n g cỏ lưới th ị kính: tiế n h à n h đếm h ế t tổ n g sô" t ế bào vi
sin h v ậ t tro n g to à n bộ d iện tích của th ị trư ờ ng k ín h h iể n vi.
3- C á ch tín h k ế t q u ả
Trường hợp sử d ụ n g lưới th ị kính:
Số tế bào tru n g b ình tro n g m ột ô vuông của lưới đếm

X

là:

n

i=1

tro n g đó:

Xi -

số t ế bào đếm được tro n g ô vuông th ứ i của lưới đếm

n - tổ n g số ô vuông đã đếm trê n lưới th ị k ín h
Độ lệch chuẩn S x được tín h n h ư sau:

Với xác su ấ t là 95%, kho ản g tin cậy là:

tro n g đó: a = 0,05
- chỉ số S tu d en t với bậc tự do (n - 1)

PHƯƠNG PHÁP ĐINH LƯỢNG VI SINH VÁT

23

SỐ t ế bào có tro n g 1m l m ẫu ban đầu là:
N =

Sỉ

X

0,01

X

K = — .IO10
Si

X

K

S i - diện tích m ột ô vuông của lưới th ị k ính (pm 2)
108 - diện tích v ế t bôi (1 c m 2 = 108ụm 2)
K - độ p h a loãng m ẫu ban đầu
0,01 - th ể tích m ẫu đã sử dụng (ml)
Trường hợp kh ô n g sử d ụ n g lưới thị kính.
Sô" t ế bảo có tro n g 1/??/ m ẫu ban đầu là:

N =
X-

X.10

S2

X

0,01

x K = — .10w x K
^2

số tế bào đếm được trong th ị trường k ín h h iể n vi đã quan sá t

Sơ - diện tích của th ị trư ờng kính hiển vi (ụ m 2)
108 - diện tích v ế t bôi (lc m 2 = 108p/?i2)
K - độ p h a loãng m ẫu ban đầu
0,01 - th ế tích m ẫu đã sử dụng (ml)
Theo L ange và cộng sự (1993), phương pháp B reed cho độ sai số tru n g bình là
8%. Việc lây m ầu đặc trưng và lắc đều m ẫu là m ột yêu tô quan trọ n g ả n h hưởng
quyết định đ ến độ sai sô' của k ế t quả thu được.

B à i 9 ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT BANG p h ư ơ n g
XÁC ĐỊNH LƯỢNG CHAT KHÔ

pháp

1. G iới t h iệ u c h u n g

T rong phương p háp này, người ta sẽ thu n h ậ n sin h khối (bio m a ss) từ mẫu
chứa vi sin h v ậ t b ằ n g phương p h á p vi lọc hoặc ly tâm . Đế làm trô i đi các ch ất hóa
học còn bám lại trê n bề m ặ t th à n h tế bào, tiế n h à n h rử a sin h khối b ằn g dung dịch
nước muối sin h lý. Sau cùng, sin h khối sẽ được đem sây đến khôi lượng không đổi.
K ết quả sẽ được tín h to án và biểu diễn dưới dạng số g c h ấ t khô sin h khôi có trong
1 lít m ẫu k h ảo sá t.
Phương pháp n ày được sử dụng đế theo dõi sự sinh trưởng của vi sinh v ật trong
các quá trìn h lên m en ở cả quy mô phòng th í nghiệm lẫn quy mô sản xuất. Để định
lượng vi sinh v ậ t tro n g thực phẩm , người ta không sử dụng phương p háp nảy.
T rong bài th í nghiệm này, chúng ta sẽ định lượng n ấ m m en tro n g quá trìn h
lên m en rượu.


24

CH ƯƠN ì 2

Hóa chất:
- Dung dịch nước muôi sinh lý nồng độ 0,9%
- Nước vô k h u ẩ n
T h iế t bị:
- Hệ th ố n g lọc ch ân k h ông (H.2.4) hoặc th iế t bị ly tâm
- Tủ sấy
1- bình chứa dịch lọc
2- lỗ thông dể nối với bơm chân không
3- nắp dậỵ dược làm bằng vật liệu
ceramic, có những mao quản với dường
kính trung bình vài chục micrometer
4- membrane
5- phễu rời

6- kẹp để gắn chặt phễu rời (5) voi
mernbrane (4) và nắp đậy (3)

H ình 2.4 Hệ thống lọc chân không
2. C á c h th ự c h iệ n
1- Sử dụn g phương p h á p vi lọc đ ể thu nh ận sinh khối
Đối với vi k h u ẩ n , người ta thường sử dụng m em b ran e có đường k ín h mao
quản 0,2ụm để tá c h t ế bào. Còn đối với n ấ m m en và n ế m sợi, sử dụng m em b ran e
với đưdng k ín h m ao quản 0,45ụm . Chọn m em b ran e được làm từ n h ữ ng v ậ t liệu ưa
nước n hư acetate cellulose.
Các bước thực hiện:
- T iến h à n h sấy khô (nếu cần) và xác đ ịn h khối lượng m em b ran e. D ùng kẹp
đ ặ t m em b rane vào đúng vị tr í tro n g hệ th ố n g lọc ch ân không.
- Lắc t h ậ t đều m ẫu chứa vi sinh v ậ t. D ùng pipet vô k h u ẩn , lấ y chính xác m ột
th ể tích m ẫu cho vào phễu (5) của hệ th ố n g lọc ch ân không. T hể tíc h m ẫu cần lấy
phụ thuộc vào n ồng độ t ế bào vi sinh v ậ t có tro n g m ẫu, thư ờ ng dao động tro n g
kho ản g 10-50m/.
- Cho m áy bơm ch ân k h óng h o ạ t động. B ình (1) sẽ chứa dịch lọc bao gồm các
c h ất hò a ta n và các c h ấ t không ta n có kích thước nhỏ hơn đường k ín h mao quản
của m em brane. Các t ế bào vi sin h v ậ t sẽ n ằ m lại trê n bề m ặ t m em brane.
- Khi p h ầ n dịch lỏng tro n g phễu (5) đ ã di chuyển xuống h ế t vào bình (1), cho
tiếp vào phễu lO m l dung dịch nước muối sin h lý và tiế p tục lọc. Sau cùng, cho th êm
10m l nước vô k h u ẩ n vào phễu và chờ cho đ ến k h i quá trìn h lọc k ế t thúc.
- T háo k ẹp (6), tá c h rời phễu (5) rồ i dùng m ộ t chiếc k ẹp nhỏ để lấy
m em brane có chứa vi sin h v ậ t tr ê n bề m ặ t ra khỏi p h ầ n n ắ p đậy (3).


PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT

25

- Đ ặt m em b ran e vào m ột đĩa th ủ y tin h sạch rồi cho vào tủ sấy ở n h iệ t độ
105'c . T iến h à n h sấy khô m em bran e đến khôi lượng không đổi.’Xác định lại khôi
lượng của m em b ran e sau khi sấy.
2- Sử d ụ n g phư ơng p h á p ly tă m đ ể thu nhận sinh khối
- Lắc đều m ẫu chứa vi sinh v ậ t, dùng p ip et lấy chính xác m ột lượng m ẫu cho
vào ống ly tâm . T h ể tích m ẫu cần lấy phụ thuộc vào nồng độ t ế bào vi sinh v ậ t có
tro n g mẫu.
- T iến h à n h ly tâ m m ẫu trong thờ i gian 15 phút, sử dụng tốc độ 2000xg đế
tách n ấm m en và 12000xg đế tách vi k h uẩn.
- Khi quá trìn h ly tâ m k ế t thúc, bỏ p h ầ n dịch lỏng. Cho vào ống ly tâm m ột
p h ầ n th ế tích dung dịch nước muối sin h lý. D ùng đũa th ủ y tin h đế huyền phù hóa
p h ầ n sinh khối tro n g ống ly tâ m và sử dụng nước muối sin h lý đế rửa đũa thủy
tin h . P h ầ n nước rửa cũng được cho luôn vào ống ly tâm . T iếp tục ly tâ m với tốc độ
đã chọn tro n g th ờ i gian 15 phút.
- Lặp lại th ao tá c tr ê n với nước vô k h u ẩn
- Sau cùng, sử dụng cồn để huyền phù hóa p h ầ n sin h khối tro n g ống ly tâm
và chuyến h ỗ n hợp n à y vào m ột đĩa th ủ y tin h sạch có khôi lượng đã biết. Đ ặt đĩa
th ủ y tin h vào tủ sấy ở 105°c. T iến h à n h sấy khô đ ến khối lượng không đổi. Xác
định lại khối lượng đĩa th ủ y tin h sau k h i sấy.
3. T ín h k ế t q u ả
Lượng c h ấ t khô t ế bào vi sin h v ậ t có tro n g m ẫu p h â n tích được xác định theo
công thức:
X = (m 2 - m x)
tro n g đó: X - sin h khối (g/l)
rrii - khối lượng m em brane (hoặc đĩa thủy tin h ) ban đầu (g)
7712

- khối lượng m em brane (hoặc đĩa th ủ y tin h ) có chứa vi sinh v ậ t sau
khi được sấy đến khối lượng k h ô n g đổi (g)

V - th ể tích m ẫu đã sử dụng (ml)
1000 - hệ số quy đổi k ế t quả cho 1 lít m ẫu p h â n tích
Theo Leclerc H. và cộng sự (1994), phương p h á p n à y có độ sai số tru n g bình
là 10%. Sai số chủ yếu là ở quá trìn h rử a t ế bào tro n g dung dịch nước muối sin h lý
và trong nước c ấ t vô khuẩn.