Bài làm sắc ký rây phân tử và sắc ký cột

Chào mừng cô và các bạn đang đến với bài
thuyết trình của nhóm

8/30/16

1


Trường
Trường Đại
Đại Học
Học Thủ
Thủ Dầu
Dầu Một
Một
Khoa
Khoa Khoa
Khoa Học
Học Tự
Tự Nhiện
Nhiện

NHÓM 6

ĐỀ TÀI

VŨ DUY HẢI
PHẠM THỊ HÒA
HOÀNG XUÂN ÁI
LÂM THỊ MỸ HỒNG
TRƯƠNG MINH HIẾU

Sắc ký rây phân tử &
sắc ký khí

NGUYỄN THANH BÌNH
NGUYỄN THỊ KIM HUYỀN

8/30/16

2


NỘI DUNG

8/30/16

SẮC KÝ

SẮC KÝ

RÂY PHÂN TỬ

CỘT

3


Phần I: Phương Pháp Sắc Kí
Rây Phân Tử
1. Định nghĩa:Sắc ký rây phân tử là phương pháp chia tách các phân tử trong

dung dịch dựa trên kích thước của chúng.
Trong đó:




8/30/16

Pha động là một dung môi hữu cơ,kỹ thuật được gọi là sắc ký thấm qua gel.
Pha động là nước thì kỹ thuật được gọi là sắc ký lọc trên gel.

4


2. Nguyên lý hoạt động
Các phân tử có kích thước lớn
hơn kích thước lỗ xốp lớn nhất
chỉ di chuyển được dọc theo cột

Những phân tử có kích thước đủ
nhỏ để có thể đi vào trong tất cả

Khoảng kích thước lỗ của vật

khoảng không gian của lỗ xốp và

liệu nhồi trong cột sẽ xác định

được rửa giải trong tổng thể tích

Mẫu được đưa vào cột chứa

khoảng kích thước phân tử

thấm Vt

đầy gel hoặc một loại vật

được chia tách qua quá trình sắc

liệu xốp, và được pha động

ký.

qua các khoảng trống
giữa các hạt vật liệu nhồi mà
không bị giữ lại, được rửa giải
trong thể tích loại trừ Vo

dẫn chạy qua cột.

8/30/16

5


Đường ra của cột được nối với một
detector có gắn với một máy ghi tự

Pha động chạy qua cột ở tốc độ không

động

đổi

04

02

3. CẤU TẠO

01

03
Một đầu của cột được nối với một

Một cột sắc ký có kích thước phù

thiết bị phù hợp để cấp mẫu

hợp
8/30/16

6


Sắc kí rây phân tử dùng để xác định:

1

Xác định tỷ lệ thành phần tương đối

2

Xác định khối lượng phân tử

3

8/30/16

Sự phân bố polymer theo kích thước phân tử

7


4. Ví dụ: Phân bố khối lượng phân tử trong dextran
Kiểm tra bằng phương
pháp sắc ký rây phân tử:

Dung dịch
hiệu chuẩn

Hoà tan riêng rẽ 15 mg các chất đối chiếu hóa học
Dung dịch
đánh dấu

dextran 4,dextran 10 dùng cho hiệu chuẩn và 20 mg
các chất đối chiếu hóa học dextran 40,dextran 70,
dextran 250 dùng cho hiệu chuẩn trong 1 ml pha
động.t đối chiếu hóa học dextran Vo trong 1ml pha

Dung dịch(1)

Hoà tan 5 mg dextrose chuẩn và

động.

2 mg chất đối chiếu hóa học
Hoà tan 0,200 g mẫu thử vào pha

dextran Vo trong 1ml pha động.

động và pha loãng tới 10 ml bằng
pha động.

8/30/16

8


Chuẩn hóa hệ thống sắc ký
Tiến hành tiêm lặp lại vài lần một thể tích nhất định dung dịch đánh dấu.

 peak đầu tương ứng chất đối chiếu dextran Vo V0
 peak thứ 2 là của dextrose Vt
Tiêm một thể tích nhất định các dung dịch chuẩn. Vẽ cẩn thận đường nền của mỗi sắc ký đồ. Phân chia mỗi sắc
ký đồ thành p phần (ít nhất là 60) bằng những đường gạch thẳng dọc bằng nhau.

8/30/16

9


Chuẩn hóa hệ thống sắc ký
Trong mỗi phần, i tương ứng với một thể tích rửa giải Vi, đo chiều cao (yi) của đường sắc ký đồ phía trên đường
nền và tính hệ số phân bố Ki theo công thức:

K i=

Trong đó:



Vo = thể tích trống của cột, được xác định bởi píc tương ứng với chất đối chiếu hóa học dextran Vo trong sắc ký đồ thu được từ dung
dịch đánh dấu,



8/30/16

Vt = thể tích thấm tổng của cột, được xác định bởi píc tương ứng với dextrose trong sắc ký đồ thu được từ dung dịch đánh dấu,
Vi = thể tích rửa giải của phần i trong sắc ký đồ thu được với mỗi dung dịch chuẩn..

10


Tiến hành hiệu chuẩn
Vẽ đường cong chuẩn:

8/30/16

11


Tiến hành hiệu chuẩn
Tính toán qua đường cong chuẩn:

Trong đó:
p = số phân đoạn chia trong sắc ký đồ,
y = chiều cao của đường sắc ký phía trên đường nền trong phân đoạn i.
Mi = khối lượng phân tử trong phân đoạn i.

8/30/16

12


Điều kiện sắc ký rây phân tử:

 Cột (0,3 m x 10 mm) nhồi agarose loại liên kết chéo dùng trong sắc ký hoặc một dãy các cột
(0,3 m x 10 mm) nhồi gel polyether hydroxyl hóa dùng trong sắc ký

 Dung dịch chứa 7g natri sulfat khan và 1g clorobutanol trong 1lít nước đểlàm pha động, tốc
độ dòng 0,5 - 1 ml/phút, giữ ổn định với sai số ±1%/giờ

 Detector khúc xạ ánh sáng vi sai
 Buồng tiêm mẫu dung tích 100 - 200 μl duy trì hệ thống hoạt động ở nhiệt độ ổn định (±
0,1°C)

8/30/16

13


Phần II. SẮC KÝ CỘT
1. KHÁI NIỆM:
Sắc kí cột là phương pháp dùng để tách các chất (cấu tử) ra khỏi hỗn hợp dựa vào
tính phân cực của từng chất.

8/30/16

14


2. NGUYÊN TẮC:

 Sắc ký là một phương pháp vật lý để tách riêng các thành phần trong một hỗn hợp
bằng cách phân chia chúng thành 2 pha: pha động và pha tĩnh.

 Sắc ký hấp phụ được thực hiện trên một ống thủy tinh thẳng đứng gọi là “cột” với chất

hấp phụ đóng ai trò pha tĩnh, dung môi rửa cột đóng vai trò pha động chảy qua chất
hấp phụ.

8/30/16

15


2. NGUYÊN TẮC:

 Đối với các chất riêng biệt trong hỗn hợp tùy theo khả năng hấp phụ và khả năng
hòa tan của nó đối với dung môi rửa cột để được lấy ra lần lượt trước hoặc sau.

 Chất hấp phụ trong sắc ký cột thường dùng oxid nhôm, silicagel,CaCO3, than
hoạt tính, polyamid,… các chất này phải được tiêu chuẩn hóa.

 Dung môi dùng có thể là 1, 2 hoặc 3 loại dung môi có tỉ lệ thích hợp.

8/30/16

16


2. NGUYÊN TẮC:

 Với các chất hấp phụ cổ điển dung môi sử dụng có độ phân cực tăng dần.
 Cột là những ống làm bằng thủy tinh, đầu dưới có khóa, đầu trên có mút mài để
nối với nhiều loại kích cỡ lớn nhỏ.

 Việc lựa chọn kích thước cột rất quan trọng. Thông thường cột có đường kính
nhỏ và chiều dài càng dài thì sự tách càng tốt.

8/30/16

17


3. ĐIỀU KIỆN:

•
•

Sắc ký cột được tiến hành ở điều kiện áp suất khí quyển.
Pha tĩnh là những hạt có kích thước tương đối lớn (50-150um), được nạp trong cột
thủy tinh.

8/30/16

18


3. ĐIỀU KIỆN:

•

Mẫu chất cần phân tích được đặt trên đầu cột, phía trên pha tĩnh (có một lớp thủy tinh
che chở để lớp mặt không bị xáo trộn), bình chứa dung môi giải ly được đặt phía trên
cao.

•

Dung môi giải ly ra khỏi cột ở phần bên dưới cột được hứng vào những lọ nhỏ đặt
ngay ống dẫn ra của cột

8/30/16

19

4. ƯU – NHƯỢC ĐIỂM:

 Ưu điểm:
 Sắc ký cột cũng có ưu điểm là pha tĩnh và các dụng cụ rẻ tiền, dễ kiếm.
 Có thể triển khai với một lượng mẫu tương đối lớn.

 Nhược điểm:
Tuy vậy, phương pháp này thường làm cho quá trình tách bị chậm, hiệu quả thấp so với sắc
ký lỏng cao áp (HPLC).

8/30/16

20


5. CÁC BƯỚC THỰC HIỆN:

Lựa chọn chất hấp thu
Lựa chọn dung môi
Nạp chất hấp thu dạng khô vào cột
Nạp mẫu

8/30/16

21


5. CÁC BƯỚC THỰC HIỆN:

(1) Lựa chọn chất hấp thu:

Pha tĩnh là silicagel loại thường, hợp chất không phân cực được giải ly khỏi cột
trước, hợp chất phân cực được giải ly sau.
Với 2 phân tử không phân cực, phân tử nào có trọng lượng phân tử lớn sẽ có tính
phân cực mạnh hơn phân tử kia, nó bị pha tĩnh giữ lại trong cột nên di chuyển ra khỏi cột
chậm hơn so với các phân tử nhỏ, và cũng có khi nó ở lại lâu hơn trong cột so với phân tử
tuy có tính phân cực.

8/30/16

22


5. CÁC BƯỚC THỰC HIỆN:

•

(2) Lựa chọn dung môi:
Mẫu cần sắc ký đuợc hoà tan hoàn toàn trong dung môi phù hợp với nồng độ
10mg/ml, gọi là dung dịch mẫu (A).
Chuẩn bị 4-6 tấm bản mỏng 2,5x10cm. Chấm lên những tấm bản này mỗi tấm
khoảng 2-5l dd(A).
Mỗi bản mỏng được triển khai với một loại dung môi giải ly khác nhau, kế đó phát
hiện bằng đèn UV hay thuốc thử.

8/30/16

23


5. CÁC BƯỚC THỰC HIỆN:

(2) Lựa chọn dung môi:
Với đơn dung môi sẽ dễ dàng thấy được dung môi nào phù hợp.
Từ kết quả đó, cố gắng tìm một hỗn hợp dung môi, trong đó một dung môi phân cực
và một dung môi kém phân cực thí dụ như ete dầu hỏa: etyl acetate.

8/30/16

24


5. CÁC BƯỚC THỰC HIỆN:
(3) Nạp chất hấp thu dạng khô vào cột:
Dùng kẹp giữ cho cột thẳng đứng trên giá, cho dung môi loại kém phân cực nhất vào
khoảng 2/3 chiều cao cột.
Cho chất hấp thu dạng khô vào thẳng trong cột, đều đặn, mỗi lần một lượng nhỏ, vừa
cho vừa khỏ nhẹ vào thành cột.

8/30/16

25