Nghiên cứu công nghệ lên men dấm táo mèo bằng phương pháp lên men chìm

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài:
NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ LÊN MEN DẤM TÁO MÈO
BẰNG PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN CHÌM

Người hướng dẫn : TS. Nguyễn Thị Việt Anh
Sinh viên thực hiện : Nguyễn Quang Tuấn
Lớp

: 12 - 03

HÀ NỘI – 2016


Lời cảm ơn
Để hoàn thành được bài báo cáo thực tập chuyên đề tốt nghiệp, em xin
gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến tất cả quý Thầy Cô, những người đã cho em
những kiến thức cơ bản, những bài học, những kinh nghiệm quý báu để em có thể
hình dung được một cách khái quát những gì cần làm khi bước vào thực tập này
cũng như áp dụng những kiến thức đó trong quá trình thực tập và viết chuyên đề.
Đặc biêt, em xin cảm ơn TS. Nguyễn Thị Việt Anh người đã tận tình hướng dẫn
em trong suốt thời gian thực tập. Sự chỉ bảo tận tình và chu đáo của cô giúp em
hoàn thành tốt hơn bài báo cáo, giúp em nhận ra sai sót cũng như tìm ra hướng đi
đúng khi em gặp khó khăn, bối rối. Em xin chân thành cảm ơn ThS. Hà Thị
Phương và các cô, chú, anh, chị công tác tại bộ môn Công nghệ lên men đã tạo
mọi điều kiện giúp đỡ em trong thời gian em tiến hành thực tập và cho em những
lời khuyên để hoàn thành tốt hơn bài báo cáo thực tập. Mặc dù đã có nhiều cố

gắng để thực hiện đề tài một cách hoàn chỉnh nhất. Song do buổi đầu mới làm
quen với công tác nghiên cứu khoa học, tiếp cận với thực tế sản xuất cũng như
hạn chế về kiến thức và kinh nghiệm nên không thể tránh khỏi những thiếu sót
nhất định mà bản thân chưa thấy được. Em rất mong được sự góp ý của quý Thầy,
Cô giáo để khóa luận được hoàn chỉnh hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày tháng năm 2016
Sinh viên
Nguyễn Quang Tuấn


DANH MỤC VIẾT TẮT
Ký hiệu

Tên đầy đủ

AAB

Vi khuẩn axit axetic.

AUA

Anhydrogalacturonic Acid.

CNTP

Công nghiệp thực phẩm


MỤC LỤC

Trang
Giới thiệu ............................................................................................................... 1
Phần I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 4
1.1. NGUYÊN LIỆU QUẢ TÁO MÈO ................................................................. 4
1.1.1. Giới thiệu chung về cây táo mèo.................................................................. 4
1.1.2. Công dụng của táo mèo ................................................................................ 5
1.2. TÁC ĐỘNG CỦA ENZYME PECTINASE ĐẾN KHẢ NĂNG TRÍCH
LY DỊCH QUẢ ...................................................................................................... 7
1.2.1. Enzyme pectinase ......................................................................................... 7
Phân loại enzym pectinaza: .................................................................................... 8
1.2.2. Cơ chất pectin............................................................................................... 9
1.3. CÁC VI SINH VẬT SỬ DỤNG TRONG QUÁ TRÌNH LÊN MEN
DẤM ..................................................................................................................... 12
1.3.1. Nấm men .................................................................................................... 12
1.3.2. Vi khuẩn acetobacter ................................................................................. 14
1.3.3. Phương pháp lên men chìm trong sản xuất axit axetic từ vi khuẩn
Acetobacter........................................................................................................... 21
PHẦN 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................... 23
2.1. NGUYÊN LIỆU VÀ THIẾT BỊ ................................................................... 23
2.1.2. Hóa chất...................................................................................................... 23
2.1.3. Máy móc dụng cụ ....................................................................................... 24
2.2. PHƯƠNG PHÁP ........................................................................................... 24
2.2.1. Phương pháp hóa lý, hóa sinh .................................................................... 24
2.2.2. Phương pháp vi sinh ................................................................................... 31
Phần 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 33
3.1. KHẢO SÁT NGUYÊN LIỆU....................................................................... 33
3.2. NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH XỬ LÝ NGUYÊN LIỆU CHO QUẢ
TRÌNH LÊN MEN DẤM TÁO MÈO ................................................................. 34
3.2.1. Xử lý bằng enzyme Pectinex Ultra SP-L ................................................... 34

3.2.2. Xử lý bằng enzyme Pectinase Ultra Clear ................................................. 40
3.3. THỬ NGHIỆM LÊN MEN DẤM TÁO MÈO SỬ DỤNG DỊCH CHIẾT
BẰNG ENZYME PECTINASE .......................................................................... 43
3.3.1. Lên men rượu ............................................................................................. 43


3.3.2. Lên men axit axetic .................................................................................... 45
3.4. KHẢO SÁT NHIỆT ĐỘ VÀ THỜI GIAN THANH TRÙNG DẤM TÁO . 47
3.3. QUY TRÌNH LÊN MEN DẤM TÁO........................................................... 49
KẾT LUẬN VÀ ĐỊNH HƯỚNG NGHIÊN CỨU ........................................... 52
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 53


DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 3.1. Thành phần hóa học của dịch táo mèo……………………………… 33
Bảng 3.2. Bảng kết quả theo dõi cảm quan các mấu giấm táo với các điều kiện
thanh trùng............................................................................................................ 48


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Táo mèo .................................................................................................. 4
Hình 1.2. Cây táo mèo............................................................................................ 5
Hình 1.3. Nấm men Saccharomyces cerevisiae ................................................... 14
Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn đường chuẩn galacturoic ........................................... 35
Hình 3.2. Biểu đồ ảnh hưởng của tỷ lệ pha loãng cơ chất tới hoạt lực của
enzym pectinaza ................................................................................................... 36
Hình 3. 3. Biểu đồ ảnh hưởng của tỷ enzyme pectinase tới khả năng thủy phân
pectin .................................................................................................................... 37
Hình 3.4. Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt lực của enzym pectinaza..... 38

Hình 3.5. Biểu đồ ảnh hưởng của thời gian tới hoạt lực của enzym pectinaza ... 39
Hình 3.6. Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng làm trong của
pectinase ............................................................................................................... 40
Hình 3.7. Biểu đồ ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme ultra clear đến khả năng làm
trong...................................................................................................................... 41
Hình 3.8. Biểu đồ ảnh hưởng của thời gian đến khả năng làm trong của ezyme
pectinase ultra clear .............................................................................................. 42
Hình 3.9. Dịch quả sau thủy phân bằng enzyme.................................................. 43
Hình 3.10. Biến đổi động học quá trình lên men rượu ........................................ 44
Hình 3.11. Dịch quả sau 3 ngày lên men rượu..................................................... 44
Hình 3.12. Biến đổi động học quá trình lên men dấm ......................................... 46
Hình 3.13. Các mẫu giấm táo sau khi thanh trùng ............................................... 47
Hình 3.14. Quy trình sản xuất dấm táo ................................................................ 49


Giới thiệu
Táo mèo (docynia indica) được phân bố nhiều tại các tỉnh miền núi phía
bắc Việt Nam.Thành phần hóa học có trong táo mèo bao gồm: các axit hữu cơ,
vitamin C, B, hydratcacbon, chất xơ, tannin, polyphenol, chất khoáng…Táo mèo
được sử dụng trong đông y như một vị thuốc chữa các bệnh về tiêu hóa, tan ứ
huyết, sát trùng tang cường miễn dịch, chống oxy hóa, hạ huyết áp, làm giãn động
mạch vành, cải thiện sức co bóp tim, phòng chống tích cực các biến chứng do cao
huyết áp gây ra, giảm cholesterol….
Loài người đã biết chế tạo và sử dụng giấm(vinegar) từ nhiều ngàn năm
trước. Giấm được dùng như vị thuốc, tác nhân phá hủy và chất bảo quản. Khoảng
5000 năm trước công nguyên, người Babylon đã biết dùng trái chà là để làm rượu
và giấm. Vết tích của giấm đã được tìm thấy ở Ai Cập cổ đại từ 3000 năm
trước công nguyên. Theo sự tích Thần Nông, giấm cũng được tìm thấy ở Trung
Quốc từ đời nhà Hạ, 2000 năm trước công nguyên. 500 năm trước công nguyên, ở
Hy lạp, Hippocrates, vị cha đẻ của ngành y học hiện đại, đã dùng giấm làm từ

nước táo hòa với mật ong để trị những bệnh ho và cảm lạnh. Vào thời trung
nguyên, những nhà luyện kim đổ giấm lên trên chì /để tạo chì axetate. Thời kì
Phục hưng, làm giấm là nghề đem lại lợi nhuận ở Pháp. Nước này đã sản xuất gần
150 loại giấm có mùi vị từ việc bổ sung tiêu, cỏ ba lá, hoa hồng, thìa là, và mâm
xôi. Sản xuất giấm cũng được phát triển ở Anh, sinh lời đến nỗi năm 1693 Nghị
viện thiết lập thuế trên giấm – bia. Vào thời kì đầu ở Mỹ, sản xuất giấm rượu táo
là nền tảng của nông nghiệp và kinh tế hộ gia đình, được giá gấp 3 lần rượu táo
thô truyền thống. Trong Thánh kinh Công giáo, giấm được miêu tả như là thứ gì
đó không "vui", nhưng Boaz cũng cho phép Ruth được chấm mẩu bánh mì của cô
ấy vào giấm. Chúa Giê Su khi bị đóng đinh trên thập tự giá 2000 năm trước cũng
được dâng giấm (Matthew 27:48; Mark 15:36). Trong truyền thống Hồi giáo cũng
được kể giấm là 1 trong 4 gia vị thích nhất của tiên tri Muhammad, ông gọi đó là
1


gia vị được ban phước ("blessed seasoning"). Năm 1864, Louis Pasteur đã chứng
minh giấm là kết quả từ một quá trình lên men tự nhiên. Sự chuyển từ rượu hay
nước trái cây sang giấm là quá trình hóa học trong đó rượu ethylic bị oxy hóa tạo
axid axetic. Về mặt lịch sử, nhiều phương pháp khác đã được dùng để tạo giấm. Ở
phương pháp chậm, tự nhiên vại rượu táo để mở đặt trong nhiệt độ phòng. Suốt
khoảng vài tháng, nước trái cây lên men thành rượu và sau đó bị oxy hóa thành
acid acetic. Phương pháp Orleans (Pháp) được gọi là phương pháp liên tục. Nước
trái cây được thêm định kì vào những mẻ giấm nhỏ và trữ trong thùng gỗ. Khi
nước trái cây chua, ta sẽ vớt ra ở trên thùng. Cả phương pháp chậm và liên tục
đều đòi hỏi vài tháng để sản xuất giấm. Trong sản xuất giấm thương mại hiện
nay, phương pháp thông thường và phương pháp lên men chìm được ứng dụng.
Những phương pháp này dựa trên mục tiêu pha trộn nhiều oxy đến mức có thể
vào sản phẩm rượu.
Ngày nay, acid hữu cơ không chỉ ứng dụng trong công nghệ thực phẩm mà
còn ứng dụng nhiều trong công nghệ chế biến mủ cao su, trong công nghiệp nhẹ

và cả trong y học. Nhu cầu sử dụng acid hữu cơ ngày càng nhiều, trong đó có hai
loại acid acetic và acid lactic được sản xuất nhiều nhất và ứng dụng rộng rãi nhất.
Sản phẩm đồ uống giấm táo mèo có chứa các thành phần sinh hóa cần thiết điều
tiết hoạt động của tuần hoàn máu như các thành phần các axit hữ cơ và
polyphenol có tác động trực tiếp tới hoạt động của renin, dẫn tới làm giảm áp lực
huyết áp, giàu hàm lượng kali có tác đông tốt cho bệnh huyết áp cao, có các thành
phần đường dễ tiêu hóa, có tác động tốt tới hệ tim mạch, tiêu hóa. Do vậy có thể
nói sản phẩm đồ uống giấm táo mèo có tác dụng tốt trong phòng và chữa bệnh
cao huyết áp, giảm béo.
Do có nhiều tác dụng chức năng nên hiện nay sản phẩm giấm táo, đặc biệt
là giấm táo mèo, được người tiêu dùng ưa thích. Các sản phẩm giấm táo nhập
ngoại mặc dù có giá cao vẫn được chấp nhận tại thị trường Việt Nam. Từ yêu cầu
thị trường, rất nhiều sản phẩm giấm táo mèo được sản xuất tự phát tại các cơ sở
2

Comment [W1]:


sản xuất nhỏ. Tuy nhiên do được sản xuất theo phương pháp thủ công, không có
các quy trình chuẩn, do vậy khó quản lý về vệ sinh an toàn thực phẩm. Các sản
phẩm giấm táo mèo sản xuất trong nước hiện nay còn tiềm ẩn nhiều mối nguy.

3


Phần I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. NGUYÊN LIỆU QUẢ TÁO MÈO
1.1.1. Giới thiệu chung về cây táo mèo
Táo mèo là tên người H’Mông gọi quả sơn tra (Fructus Crataegi) thuộc chi
sơn tra (Crataegus), họ hoa hồng (Rosaceae).

Tuỳ theo quốc gia mà cách phát âm tên vị thuốc khác biệt ít nhiều. Chẳng
hạn, người châu Âu gọi sơn tra là Hawthorn, người Trung quốc gọi là Shanzha,
người Nhật bản gọi là Sanzashi, người Hàn Quốc gọi là Sansaja…. Tiếng dân tộc
H’Mông gọi sơn tra là "chi tô di ", tức táo mèo.

Hình 1.1. Táo mèo
Chi sơn tra có khoảng 280 loài, phân bố ở nhiều quốc gia: Nga, Ba Lan,
Hungary, Ðức, Anh, Thuỵ Sĩ, Pháp, Trung Quốc, Hàn quốc, Nhật bản, Việt
Nam… trong đó, quả của cây C.pinnatifida, C.monogyna , C.oxycantha và
C.laevigata được sử dụng nhiều nhất. Ở Việt Nam, cây sơn tra mọc tự nhiên và
trồng ở các tỉnh Lạng Sơn, Lai Châu, Lào Cai, Sơn La… trên các dãy núi cao
1.500 – 2.000m.
Táo mèo có nguồn gốc ở vùng ôn đới, Việt Nam chỉ thấy phân bố rải rác ở
vùng núi phía bắc. Cây ưa sáng, ưa khí hậu ẩm mát của vùng ôn đới, nhiệt độ
trung bình năm từ 15 đến 180C, lượng mưa từ 1.500 3.800 mm/năm (Sa Pa) và độ
4


ẩm không khí mèo thường mọc rải rác trên đất nương rẫy cũ, vôi, đôi khi thấy ở
xung quanh làng bản. Độ cao Cây sinh trưởng mạnh trong mùa xuân – hè. Đến
tháng ba là mùa ra hoa, trên cây tràn ngập những một màu trắng của những cánh
hoa từ ba đến bốn cánh, nhị vàng với số lượng từ 30-40 nhị. Tầm tháng 7- 11 là
mùa quả, với hình dáng hình cầu, kích thước đa dạng từ 3-4cm gọi là táo bi và 67cm gọi là táo to, khi trái chín có màu hồng phấn hoặc vàng trong, mùi rất thơm
và ăn có vị chua, chát.
Về đặc điểm hình dáng và kích thước, nó là loại cây vừa với chiều cao
trung bình khoảngtừ 4-5m, thân gỗ, tán rộng, cành non có gai và lông nhung màu
trắng, khi già nhẵn cây mọc không tập trung mà có khoảng cách. Lá hình mũi
mác dài 7-10cm, rộng 1,5-2cm, khi non có 3-5 thùy, tròn ở gốc, thuôn nhọn ở
đỉnh, mép lá nguyên hoặc có hình răng cưa,lông nhung màu trắng ở mặt dưới, gân
bên 6-10 đôi, phân chia tới tận mép lá, cuống lá dài 15-20mm. Lá kèm hình mũi

dùi, sớm rụng. Cụm hoa chùm 1-3 hoa hoặc đơn, có lông, cuống hoa rất ngắn
hoặc không có. Đài có lông, mặt trong nhẵn, cánh hoa 5, màu trắng, mép có mũi
nhọn, nhỏ. Bầu 5 ô, mỗi ô có 3-10 noãn, xếp theo chiều dọc của bầu, vòi nhụy 5,
hàn liền với nhau ở gốc, có lông, quả dạng quả táo, hạt màu đen.

Hình 1.2. Cây táo mèo
1.1.2. Công dụng của táo mèo
Theo y học cổ truyền, sơn tra có vị chua ngọt, tính hơi ấm, quy kinh tan, tỳ,
vị, thuộc nhóm thuốc tiêu thực hóa tích, giúp tiêu hóa do tăng bài tiết acid mật và
5


pepsin dịch vị. Công dụng chủ yếu là điều trị các chứng rối loạn tiêu hóa do ăn
nhiều thịt, dầu mỡ, trẻ em ăn sữa không tiêu, … Đây chính là tác dụng giúp ăn
uống ngon miện của vị thuốc này.
Thực nghiệm invivo cho thấy dịch chiết sơn tra có tác dụng ức chế trực
khuẩn E.coli, trực trùng lị, bạch hầu, thương hàn, tụ cầu vàng khá mạnh. Khi sao
đen (sơn tra thán) có thể hấp thu hầu hết độc tố của vi khuẩn và các chất hoại tử,
làm giảm kích thích thành ruột, giảm nhu động ruột, cầm tiêu chảy, kết lỵ do
nhiều nguyên nhân khác nhau.
Nghiên cứu hiện đại cho thấy, sơn tra có tác dụng kháng khuẩn, cường tim,
làm giãn động mạch vành, chống rối loạn nhịp tim, hạ áp, bảo vệ tế bào gan, tăng
cường công năng miễn dịch, trấn tĩnh an thần, chống co thắt, ức chế quá trình
ngưng tập tiểu cầu, điều chỉnh rối loạn lipit máu, xơ vữa động mạch huyết áp cao,
phòng ngừa đau thắt ngực, nhồi máu cơ tim, béo phì, lị trực khuẩn cấp, viêm ruột
cấp, tiêu chảy do nhiễm giun sán, viêm cầu thận cấp và mãn tính, hậu sản, ứ trệ
gây đau bụng, …
Các nhà y học Trung Quốc dã dùng viên Sơn Tra Giáng Mỡ (mỗi viên chứa
0,06g bột chiết sơn tra) điều trị rối loạn lipit máu với liều uống mỗi ngày 3 lần,
mỗi lần 2 viên, liệu trình bốn tuần. Kết quả cho thấy nồng độ cholesterol và

triglyceride huyết thanh giảm với tỉ lệ 76% và 88%. Người châu Âu đã sử dụng
sơn tra để làm thuốc từ thế kỷ thứ nhất trước Công nguyên. Đến thập niên 70 của
thế kỷ trước, vai trò của việc sơn tra trong việc tăng cường chức năng tuần hoàn,
giảm mỡ máu, giãn mạch, điều hòa huyết áp đã được chứng minh. Chiết xuất sơn
tra có mặt trong hơn 100 đặc chế trị bệnh tim mạch như: Crataegutt, Eurython,
Esbericard, …
Theo TS Dharmananda (giám đốc viện Y học cổ truyền, Portland, Oregon)
các tác dụng sinh học của sơn tra có liên quan đến bốn nhóm hợp chất chủ yếu:
các flavonoid (hyperoside, luteolin-7-glucoside, rutin, quercetin, vitexin, vitexin
framnosides), oligomeric procyanidins và flavans (catechin, epicatechin
polymers) các dẫn xuất triterpene (oloanoic axit, ursolic axit), các axit hữu cơ
6


(citric, acetic, tartaric, ascorbic). Các phenolic đơn giản (chlorgenic axit, caffeic
axit). Các flavonoid làm gia tăng lưu lượng máu qua động mạch vành, tăng nhịp
tim, giãn mạch vành, giảm xơ vữa động mạch. Sơn tra còn có tác dụng tốt trong
các trường hợp nghẽn mạch máu tim. Kết quả thực nghiệm tại phòng dược lý viện
cây thuốc và tinh dầu Nga cho thấy chiết xuất sơn tra có đặc tính chống nghẽn
mạch rõ rệt, cải thiện việc đưa oxy về tế bào cơ tim, giảm cholesterol, trglycerid,
độ quánh của máu và fibrinogen…
1.2. TÁC ĐỘNG CỦA ENZYME PECTINASE ĐẾN KHẢ NĂNG TRÍCH
LY DỊCH QUẢ
1.2.1. Enzyme pectinase
Enzyme pectinase là một nhóm enzyme thủy phân các chất pectin, sản
phẩm tạo thành là acid galacturonic, galactose, metanol. Enzyme pectinase được
tìm thấy ở thực vật bậc cao, pectinase có nhiều trong lá, củ khoai tây, trong
chanh, cà chua dứa, cỏ ba lá. Trong các loại khác chỉ có enzyme pectinesterase.
Chúng cũng có thể được chiết xuất từ nấm mốc. Couri và cộng sự (1995) đã
nghiên cứu “thao tác trên gen trên chủng Aspergillus” nhằm tăng khả năng tổng

hợp các enzyme phân giải pectine.
Enzyme pectinase thuộc nhóm enzyme thủy phân. Nó sử dụng cơ chất là
pectin và sản phẩm sau khi thủy phân là acid pectic và methanol. Enzyme
pectinase được sử dụng nhiều trong công nghiệp chế biến trái cây nhằm mục đích
gia tăng hiệu suất thu hồi dịch quả, cải thiện chất lượng dịch quả và có tác dụng
làm trong (Nilay Demir et al, 2000).
Enzym pectinaza được sử dụng nhiều trong công nghiệp chế biến trái cây
nhằm mục đích gia tăng hiệu suất thu hồi dịch quả, cải thiện chất lượng dịch quả
và có tác dụng làm trong.
7


Lượng dịch quả có xu hướng giảm dần khi nồng độ enzyme thấp hơn hoặc
cao hơn. Khi thừa cơ chất, vận tốc phản ứng tăng khi nồng độ enzym tăng nhưng
khi nồng độ enzym bão hòa với nồng độ cơ chất thì vận tốc phản ứng không thay
đổi hoặc không tăng thêm khi tăng nồng độ enzym. Phản ứng thủy phân xúc tác
bởi enzym cần có một khoảng thời gian tối thiểu đối với từng loại enzym. Việc
kéo dài thời gian cho hoạt động thủy phân là cần thiết để tạo ra lượng sản phẩm
(dịch quả) nhiều. Tuy nhiên, thời gian thủy phân quá kéo dài cũng không tạo ra
lượng sản phẩm nhiều hơn mà lại mất nhiều thời gian. Ngược lại thời gian thủy
phân quá ngắn là không đủ cho phản ứng.
Phân loại enzym pectinaza:
Enzym pectinaza gồm 3 loại nhóm chính: pectinestaraza, các enzyme khử
mạch polyme và protopectinaza.

PE (pectinesteraza) xúc tác thủy phân liên kết este của axit pectic với nhóm
metyl giải phóng ra pectat và metanol. Các pectat dễ kết lắng trong điều kiện có
Ca2+, làm cho sản phẩm kém ổn định, đồng thời rượu metanol là thành phần
không mong muốn trong sản phẩm. Do đó enzym này ít được sử dụng trong sản
xuất.

PG (polygalaturonaza) xúc tác thủy phân liên kết α-1,4-D galacturonic
trong phân tử pectin tạo thành axit galacturonic có phân tử nhỏ và khó kết lắng,
giúp sản phẩm ổn định hơn.
8


Polymetylgalacturonaza tác dụng chủ yếu lên các este-metylic của các
polygalacturonic. Các enzyme này được chia thành 2 nhóm nhỏ tùy theo liên kết
glycoside bị cắt đứt: endo-glucosidase polymethyl – galactoronaza (phân cắt ngẫu
nhiên

liên

kết

1,4

glycozit

của

pectin)

và

exo-glucosidaza-

polymetylgalactoronaza (phân cắt lần lượt các liên kết a-1,4 glycozit của mạch
pectin từ đầu không khử).
Polygalacturonaza tác dụng chủ yếu lên axit pectinic và pectic. Các enzym

này cũng được chia làm 2 nhóm dựa vào vị trí liên kết glycozit bị thủy phân.
Gồm: endo-glucozit - polygalacturonaza và exo-glucosidaza-polygalacturonaza.
Ngoài các enzyme chủ yếu kể trên, tham gia sự phân giải các hợp chất
pectin còn có: enzym protopectinaza xúc tác sự thủy phân protopectin không tan
thành pectine hòa tan. Enzym này thường được dùng cho các loại quả như nho,
enzym tác động phá vỡ cấu trúc thành tế bào giúp trích rút dịch nhiều hơn.
1.2.2. Cơ chất pectin
Pectin là một polysaccharide tồn tại phổ biến trong thực vật, là thành phần
tham gia xây dựng cấu trúc tế bào thực vật. Ở thực vật pectin tồn tại chủ yếu ở 2
dạng là pectin hòa tan và protopectin không hòa tan. Dưới tác dụng của acid,
enzyme protopectinaza hoặc khi gia nhiệt thì protopectin chuyển thành pectin.
Pectin như một loại keo gắn chặt các tế bào thực vật với nhau, vì thế người ta gọi
chúng là chất cement trong cấu trúc tế bào thực vật. Khi quả còn xanh,
protopectin chiếm tỉ lệ khá cao, protopectin không hòa tan trong nước, giúp quả
có độ cứng. Khi quả chín dần, dưới tác dụng của enzyme protopectinase,
protopectin sẽ chuyển sang pectin hòa tan, làm giảm sự liên kết giữa các tế bào,
quả trở nên mềm hơn. Quá trình này cũng xảy ra dưới tác dụng của axit hoặc khi
gia nhiệt.
Pectin là hợp chất cao phân tử polygalactoronic có đơn phân tử là
galactoronic và rượu metylic. Trọng lượng phân tử từ 20.000 - 200.000 đvC. Hàm
9


lượng pectin 1% trong dung dịch có độ nhớt cao, nếu bổ sung 60 % đường và
điều chỉnh pH môi trường từ 3,1-3,4 sản phẩm sẽ tạo đông.
Cấu tạo phân tử pectin là một dẫn suất của acid pectic, acid pectic là một
polymer của acid D-galacturonic liên kết với nhau bằng liên kết 1-4-glycozide.

Hợp chất pectin được đặc trưng bởi 2 chỉ số quan trọng là chỉ số methoxyl
“MI” biểu hiện cho phần trăm khối lượng nhóm methoxyl –OCH3 có trong phân

tử pectin và chỉ số este hóa “DE” thể hiện mức độ este hóa của các phân tử acid
galactoronic trong phân tử pectin.
Dựa trên mức độ methoxy hóa và este hóa, trong thương mại chia pectin
thành 2 loại: pectin có độ methoxyl hóa cao và pectin có độ methoxyl hóa thấp.
- Pectin methoxyl hóa cao (High Methoxyl Pectin – HMP): DE >50 % hay
MI > 7%. Chất này có thể làm tăng độ nhớt cho sản phẩm. Muốn tạo đông cần
phải có điều kiện pH = 3,1 – 3,4 và nồng độ đường trên 60 %.

- Pectin methoxyl hóa thấp (Low Methoxyl Pectin – LMP): DE < 50 % hay
MI < 7%. Được sản xuất bằng cách giảm nhóm methoxyl trong phân tử pectin.
10


Pectin methoxy thấp có thể tạo đông trong môi trường không có đường. Chúng
thường được dùng làm màng bao bọc các sản phẩm.

Trong quá trình bảo quản có thể bị tách nước hoặc lão hóa. Quá trình tạo
đông phụ thuộc vào nhiều yếu tố: nguồn pectin, mức độ methoxy hóa càng cao thì
khả năng tạo đông càng cao. Khi sử dụng cần phải hòa tan pectin vào nước, khi
pectin hút đủ nước thì mới sử dụng ở công đoạn cuối chế biến.
Các pectin đều là những chất keo háo nước nên có khả năng hydrat hóa cao
nhờ sự gắn các phân tử nước vào nhóm hydroxyl của chuỗi polymethyl
galacturonic. Ngoài ra, trong phân tử pectin có mang điện tích âm nên chúng có
khả năng đẩy lẫn nhau có khả năng làm giãn mạch và làm tăng độ nhớt của dung
dịch. Khi làm giảm độ tích điện và hydrat hóa sẽ làm cho sợi pectin xích lại gần
nhau và tương tác với nhau tạo nên một mạng lưới ba chiều rắn chứa pha lỏng ở
bên trong.
Lượng pectin phân bố trong các phần của quả cũng khác nhau. Đa phần,
hàm lượng pectin trong vỏ quả, hạt nhiều hơn so với phần thịt quả. Đối với một
số loại quả chứa nhiều axit như: cam, chanh, bưởi... pectin tồn tại chủ yếu ở hạt

và vỏ cùi. Tuy nhiên, một số loại quả thì hàm lượng pectin trong thịt quả cao hơn
như: chuối, ...
Lượng pectin là nguyên nhân chính làm tăng độ nhớt dịch quả, gây khó
khăn cho quá trình chế biến và sản xuất rượu vang. Hàm lượng pectin cao làm
tăng độ nhớt dịch quả nên hiệu suất lọc giảm, rượu vang và dấm trong quá trình
tàng trữ lâu dài sẽ bị lắng cặn, vẩn đục.
11


Vì thế trong quá trình lên men rượu và lên men dấm, đặc biệt đối với
nguyên liệu ban đầu là hoa quả, những chất có hàm lượng pectin cao thì việc xử
lý bằng enzyme pectinase:
•

Làm tăng hiệu suất chiết rút dịch quả.

•

Độ nhớt của dịch quả giảm mạnh.

•

Giúp quá trình lọc tốt và nhanh hơn.

•

Hiệu suất thu ép cao hơn (tăng 14-30%).

•

Tăng nhanh quá trình làm trong dịch quả.

1.3. CÁC VI SINH VẬT SỬ DỤNG TRONG QUÁ TRÌNH LÊN MEN DẤM
1.3.1. Nấm men
Nấm men là sinh vật nhân chuẩn, có khoảng 1500 loài khác nhua đã được
phát hiện trên thế giới, chúng thường có hình dạng khác nhau, và không ổn định,
thông thường chúng có hình cầu, hình elip, hình bầu dịc và cả hình dài. Một số
loài nấm men có tế bào hình dài nối với nhau thành những sợi gọi là khuẩn ty
(mycelium) hay khuẩn ty già (pserdomycelium).
Tế bào nấm men thường có kích thước lớn gấp 5-10 lần tế bào vi khuẩn,
kích thước trung bình của tế bào nấm men, chiều dàu 9-10 um, chiều rộng 2-7
um. Kích thước của chúng thay đỏi theo độ tuổi và phụ thuộc vào điều kiện nuôi
cấy.Hầu hết chúng sinh sản vô tính bằng cách nảy chồi. Mặc dù có một vài loài có
thể tạo cơ thể đa bào, kích thước lên đến 40um.
Nấm men rất phổ biến trong môi trường, ví dụ như nấm men xuất hiện
trong tự nhiên trên vỏ của trái cây (như nho, táo hay đào) và dịch chiết từ thực
vật, một số được tìm thấy trong đất côn trùng và đường ruột của động vật có vú.
12


Nấm men là sinh vật tựu dưỡng chúng sử dụng các hợp chất hữu cơ như là nguồn
năng lượng chính và không cần có ánh sáng mặt trời, nguồn cacbon chính được
nhận chủ yếu từ các hexose như glucose và fructose, các disaccharide như
saccharose và maltose, một số loài có thể chuyển hóa đường pentose, cồn và các
axit hữu cơ.
Nấm men phát triển tốt nhất trên môi trường pH trung tính hoặc hơi chua.
Nhiệt độ phát triển của nấm men cũng hoàn toàn khác nhau, ví dụ như
leucosporidium fridium phát triển ở -2 -200C (28-600F), saccharomyces telluris
phát triển từ 5 – 350C (41-950F) và candida slooffi phát triển ở 28 – 450C (821130F).
Nấm men được sử dụng rộng rãi trong khá nhiều lĩnh vực. Trong đó, quá

trình lên men bằng phương pháp công nghệ sinh học tạo ra các sản phẩm đặc
trưng, chi phí thấp được quan tâm nhiều nhất. Các loại nấm men được ứng dụng
vào công nghiệp sản xuất đồ uống có cồn như rượu, bia, dấm…. Công nghệ sản
xuất thực phẩm: bánh mì với khá nhiều sản phẩm đa dạng phong phú. Công nghệ
sản xuất nguồn nguyên nhiên liệu (bioethanol)…. Ngày nay còn hướng đến lĩnh
vực đồ uống không cồn, probiotic, thực phẩm chức năng đem lại nguồn thực
phẩm có giá trị dinh dưỡng cao.
Saccharomyces là một trong các loại nấm men điển hình, có khoảng 40 loài
(van der Walt, J.P. 1970), chúng hiện diện nhiều trong sản phẩm có đường, đất,
trái cây chin, phấn hoa, … Chúng có hình bầu dục, gần tròn, kích thước khoảng 6
– 8 µm x 5 - 6µm. Saccharomyces cerevisiae thường có cấu tạo hình elip, đường
kính lớn từ 5 – 10 nm và đường kính nhỏ từ 1 – 7 nm, tế bào gia tăng kích thước
theo độ tuổi, thể tích tế bào đơn bội là 29mm3 và tế bào lưỡng bội là 55mm3. Các
tế bào của nấm men mang cấu trúc và chức năng của eukaryote bậc cao.

13


Hình 1.3. Nấm men Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae là loài nấm men được sử dụng rộng rãi nhất
trong công nghiệp sản xuất bánh mì và đồ uống có cồn. Saccharomyces
cerevisiae được dùng trong phòng thí nghiệm và giữ vai trò quan trọng trong
nghiên cứu vi sinh tế bào, tìm hiểu những thông tin về tế bào để phục vụ những
nghiên cứu của con người.
Quá trình lên men rượu bằng nấm men, thực chất là quá trình chuyển hóa
đường thành rượu etylic, CO2 và các sản phẩm phụ khác như Glycerin.
C6H12O6→ 2C2H5OH + 2CO2 +Q
1.3.2. Vi khuẩn acetic acid
Vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp acid acetic từ đường, hoặc rượu được
phát hiện đầu tiền từ năm 1864 là loài Acetobacter aceti. Sau đó vào năm 1935,

Comment [W2]: Viết hoa: A

chủng vi khuẩn Gluconobacter đã được phân loại. Đây là chủng vi khuẩn có khả

Comment [W3]: Viêt hoa

năng chuyển hoá đường tạo thành hỗn hợp acid gluconic và acid acetic, khác với
loài Acetobacter aceti. Hơn 20 năm sau, loài Acetomonas được phân loại và đặt
tên. Đây là loài vi khuẩn có tiên mao ở một đầu và là dạng chủng không oxy hóa
acetate, khác với loài Acetobacter là nhóm chu mao và có khả năng oxy hóa
acetate.
14


Hiện nay vi khuẩn axit axetic đã được phân loại thành 6 nhóm, trong đó
nhóm Acetobacter được ứng dụng nhiều nhất trong sản xuất cũng như trong quá
trình nghiên cứu. Acetobacter là trực khuẩn khá lớn thuộc loài hiếu khí bắt buộc,
nhiệt độ thích hợp là 28-40oC. Trong tự nhiên chúng phân bố rộng rãi trong
không khí và rau quả, nhiều trường hợp có thể phát triển đồng thời cùng với nấm
men trên cơ chất thực vật có nhiều đường.
Một số chủng Acetobacter điển hình:
Acetobacter aceti: là trực khuẩn ngắn xếp thành chuỗi, không di động,
nhuộm mày vàng với dung dịch iot, có khả năng phát triển ở nồng đọ rượu khá
cao 11% và có khả năng tích lũy được khoảng 6% axit axetic, nhiệt độ thích hợp
là 28-30oC
Acetobacter pasterianum: tế bào hình que, có khi xếp liên tiếp thành
hính sợi dài, tạo lớp váng khô nhăn nheo, nhuộm màu xanh với iot. Có thể tạo
được 6,2% axit axetic
Acetobacter orleaneuse: tế bào hình que nhỏ, đôi khi dị dạng (nhiệt độ

cao), không di động trên cơ chất tạo váng dày trong, có khả năng phát triển ở
nồng độ rượu cao 10-12% và có khả năng tích lũy 9,5% axit axetic.
Acetobacter xylinum: tế bào hình que, không di động tạo thành váng
dày trên cơ chất, nhuộm màu xanh với iot và axit sunfuric, có khả năng tích lũy
được 4,5% axit axetic.
Acetobacter shuizenbachii: trực khuẩn dài, khi già mới tạo thành váng
dày không bền có khả năng tích lũy 11,5% axit axetic.
Trong sản xuất với mỗi phương pháp khác nhau cần phải chọn những
chủng vi khuẩn có đặc tính thích hợp để quá trình lên men đạt hiệu quả cao nhất.
Các chủng vi khuẩn được lựa chọn phải thỏa mãn một số yêu cầu sau:
Phải oxy hóa rượu tốt nhất và oxy hóa dấm thấp nhất.
Phải tạo ra dấm có chất lượng tốt (thơm, có nồng đô axit axetic cao).
15


Chịu được độ rượu và axit cao.
Các tính chất ban đầu của chúng phải giữ nguyên trong suốt quá trình.
Điều kiện nuôi cấy, phân lập và bảo quản giống đoen giản, không tốn
kém.
Đặc điểm trao đổi chất:
Một trong những đặc điểm chính AAB (vi khuẩn acetic acid) là khả oxy
hoá nhiều nguồn cơ chất và tích luỹ sản phẩm trao đổi chất trong môi trường mà
không gây độc cho sự tồn tại và phát triển của vi khuẩn. Khả năng này là do hoạt
động của enzyme dehydrogenase trong thành tế bào.
Sự chuyển hoá ethanol: sự oxy hoá ethanol thành acid acetic là một đặc
điểm chính của AAB.Sự oxy hoá ethanol bởi AAB xảy ra qua 2 giai đoạn:
Giai đoạn 1: Ethanol bị oxy hoá thành acetaldehyde.
Giai đoạn 2: Acetaldehyde bị hydrate hoá thành acid acetic. Hai enzyme
đóng vai trò quan trọng trong quá trình oxy hoá là enzym của màng tế bào chất:
alcohol dehydrogenase và aldehyde dehydrogenase.

Chuyển hoá rượu đa chức: đa số các AAB có khả năng oxy hoá rượu
ethanol thành đường, manitol thành fructose, sorbitol thành sorbose và eritritol
thành ẻitrolose. Một khả năng rất quan trọng của chúng là sử dụng glycerol như
nguồn cacbon và chuyển hoá chúng thành dihydroxyacetone, một lượng nhỏ được
sử dụng để tổng hợp năng lượng. Enzyme xúc tác cho tất cả các phản ứng tồn tại
trong màng tế bào và cảm ứng cho sự tính luỹ nồng độ cao cơ chất trong môi
trường, điều này giúp cho ÂB trở thành một chủng vi sinh công nghiệp – công
nghệ sinh học.
Sự oxy hoá glucose: sự oxy hoá glucose dừng lại khi đạt được 1,3 -1,4g oxy
trong 1g cơ chất được hấp thu. Trong hô hấp hiếu khí, CO2 không được tạo thành
16


trong 5-15 phút đầu mặc dù sự tiêu thụ oxy vẫn diễn ra. Sản phẩm cuối cùng gồm
0,9-1g CO2 trong 1 g cơ chất. Sự oxy hoá glucose qua 2 giai đoạn và có thể
chuyển hoá nhiều loại cacbonhydrate khác nhau.
Acetobacter có thể chuyển hoá đường qua các con đường: hexose
monophophate và embde-meyerhof-parnas và entner-doudoroff. Sự chuyển hoá
glucose bằng các chủng vi khuẩn này tao ra một lượng lớn các chất trao đổi
quan trọng.
Chuyển hoá acid hữu cơ: AAB có khả năng oxi hóa nhiều loại axit hữu cơ,
chúng oxy hóa các axit của chu trình tricacboxylic thành CO2 và nước.
Gluconobacterthiếu chức năng thực hiện chu trình tricacboxylic, không có khả
năng oxi hóa hầu hết các axit hữu cơ. Các axid acetic, fumaric, lactic, citric,
malic, pyruvic và succinic bị oxy hóa hoàn toàn thành CO2 và nước. Những sự
chuyển hóa này có ý nghĩa rất quan trọng trong công nghiệp sản xuất rượu vang
vì nó dẫn đến sư giảm sút chất lượng rượu.
Chuyển hóa nguồn Nitơ: Mặc dù một số loài vi khuẩn AAB có thể cố định
Nitơ không khí, phần lớn chúng sử dụng Ammonium như nguồn carbon. Những
vi khuẩn này có thể tổng hợp nên các amino acid và hợp chất chứa nitơ từ

ammonium. Sự phát triển của chúng có thể được kích thích hoặc bị ức chế tùy
vào sự có mặt của amino acid trong môi trường. Glutamate, glutamine, proline,
histidine kích thích sự phát triển của AAB, trong khi đó valine, threonine,
homoserine lại gây hiệu quả ức chế sự phát triển của vi khuẩn.
1.3.2.1. Quá trình sinh tổng hợp axit axetic từ vi khuẩn axit axetic
Để chuyển hóa rượu thành axit axetic, rượu phải thẩm thấu qua thành tế
bào vi khuẩn. Ở đây sẽ xảy ra quá trình chuyển hóa rượu thành axit axetic rồi
thẩm thấu ra ngoài môi trường. Thực chất của quá trình này gồm 2 phản ứng với
2 enzyme của vi khuẩn acetic xúc tác. Sau sự hydrat hóa acetaldehyde diễn ra
17


phản ứng loại hydro lần thứ hai. Hydro được NADP nhận và qua các xitocrom
của chuỗi hô hấp được chuyển cho O2(chất nhận). Trong lên men axit axetic, cơ
chất dinh dưỡng chủ yếu là cồn etanol với nồng độ trên dưới 10% trong môi
trường. Ngoài ra còn có them một ít đường, nguồn Nitơ vô cơ hoặc hữu cơ, cũng
như các chất khoáng khác.
1.3.2.2. các điều kiện ảnh hưởng tới quá trình sinh tổng hợp axit axetic
a) Ảnh hưởng của oxy.
Quá trình sinh tồng hợp axit axetic bởi vi khuẩn axetic là quá trình chuyển
hóa bởi phản ứng oxy hóa etanol, trong đó oxy đóng vai trò như chất nhận hydro,
do vậy sự có mặt của oxy trong quá trình là quan trọng. Trong các quá trình lên
men, phương pháp lên men chìm là phương pháp đạt hiệu suất lên men tốt nhất,
có thể áp dụng trong sản xuất công nghiệp, do quá trình lên men được sục khí
mạnh, lên tục, nhờ oxy được phân tán đều trong khối dịch, do vậy tốc độ lên men
xảy ra mạnh, năng suất lên men cao hơn so với phương pháp lên men bề mặt
(phương pháp lên men chậm), oxy chỉ được tiếp xúc trên bề mặt thoáng của dịch
lên men.
Tuy nhiên, các nghiên cứ đã chỉ ra rằng, nồng đọ oxy hòa tan quá cao trong
môi trường lên men có ảnh hưởng tới sự phát triển của vi khuẩn axit axetic, dẫn

tới làm giảm khả năng sinh tổng hợp axit của chúng. Nồng độ oxy hòa tan tối ưu
trong quá trình sản xuất axit axetic trong điều kiện lên men chìm, bán liên tục là
2-8 mg/l.
b) Ảnh hưởng của nhiệt độ.
Nhiệt độ là yếu tố quan trọng trong ảnh hưởng đến sự phát triển của vi sinh
vật và hiệu quả lên men. Đới với quá trình lên men sản xuất axit axetic, khoảng
nhiệt độ để vi khuẩn acetobacter có thể phát triển tốt nằm trong khoảng từ 2040oC.Tuy nhiên, nếu nhiệt độ lên men quá thấp thì tốc độ quá trình lên men chậm.
Ngược lại, khi nhiệt độ quá cao sẽ làm tổn thất do bay hơi rượu, axit axetic. Do
đó nhiệt độ thích hợp cho quá trình sản xuất dấm là 28-34oC. Dưới đây là khoảng
18