Sàng lọc một số chủng vi sinh vật nguồn gốc việt nam có khả năng sinh protease ngoại bào hoạt tính cao dùng để tách chiết hyaluronic acid từ sụn cá nhám(carhinus sorah)

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
---------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài:
SÀNG LỌC MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT NGUỒN GỐC VIỆT
NAM CÓ KHẢ NĂNG SINH PROTEASE NGOẠI BÀO HOẠT TÍNH
CAO DÙNG ĐỂ TÁCH CHIẾT HYALURONIC ACID TỪ SỤN CÁ
NHÁM(CARCHARHINUS SORAH).

Người hướng dẫn : TS VÕ HOÀI BẮC
Sv thực hiện

: KHỔNG THỊ KHÁNH LINH

Lớp

: 12-01

HÀ NỘI- 2016


VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
---------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài:
SÀNG LỌC MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT NGUỒN GỐC VIỆT
NAM CÓ KHẢ NĂNG SINH PROTEASE NGOẠI BÀO HOẠT TÍNH

CAO DÙNG ĐỂ TÁCH CHIẾT HYALURONIC ACID TỪ SỤN CÁ
NHÁM(CARCHARHINUS SORAH).

Người hướng dẫn

: TS VÕ HOÀI BẮC

Sv thực hiện

: KHỔNG THỊ KHÁNH LINH

Lớp

: 12-01

HÀ NỘI- 2016


Khổng Thị Khánh Linh 1201

Khóa luận tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận em bày tỏ lòng biết ơn
chân thành nhất đến cô TS.Võ Hoài Bắc, người đã truyền đạt cho em những
kiến thức và kinh nghiệm quý báu, cô luôn quan tâm, động viên, tận tình
hướng dẫn trong suốt quá trình em thực tập.
Qua đây em cũng xin chân thành cảm ơn toàn thể cán bộ phòng Sinh
hóa Thực vật- Viện Công nghệ Sinh học- Viện Hàn lâm Khoa học và Công
nghệ Việt Nam đã cho phép và tạo điều kiện thuận lợi để em được thực tập tại

phòng nghiên cưú.
Em chân thành cảm ơn Ban giám hiệu và các thầy cô trong trường Viện
đại mở Hà Nội, đặc biệt là các quý Thầy, Cô trong khoa Công nghệ sinh họcViện đại học Mở Hà Nội đã tận tình truyền đạt cho em những kiến thức quý
báu trong những năm em học tập tại trường. Với vốn kiến thức được tiếp thu
trong quá trình học không chỉ là nền tảng cho quá trình nghiên cứu khóa luận
mà còn là hành trang quý báu để em bước vào đời một cách vững chắc và tự
tin.
Cuối cùng em xin kính chúc quý Thầy, Cô dồi dào sức khỏe và đạt
được nhiều thành công trong sự nghiệp cao quý.
Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 22 tháng 5 năm 2016
Sinh viên

Khổng Thị Khánh Linh


Khổng Thị Khánh Linh 1201

Khóa luận tốt nghiệp

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................... 1
MỤC LỤC .................................................................................................... 2
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................... 4
DANH MỤC BẢNG ..................................................................................... 6
DANH MỤC HÌNH ...................................................................................... 7
MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1
PHẦN I. TỔNG QUAN................................................................................ 3
1.1. PROTEASE VÀ ứNG DụNG TRONG THựC TIễN ....................... 3

1.1.1. Định nghĩa Protease ...................................................................... 3
1.1.2. Phân loại Protease ........................................................................ 3
1.1.3. Ứng dụng của protease trong thực tiễn (Đặng Thị Thu, 2012)....... 4
1.2. GIớI THIệU TổNG QUAN Về HYALURONIC ACID ................... 7
1.2.1. Khái niệm Hyaluronic acid ............................................................ 7
1.2.2. Vai trò của Hyaluronic acid .......................................................... 8
1.3. MộT Số NGHIÊN CứU Về HYALURONIC ACID ........................ 9
1.3.1. Nghiên cứu HA trên thế giới ......................................................... 9
1.3.2. Nghiên cứu HA tại Việt Nam ....................................................... 11
1.4. ỨNG DụNG CủA HYALURONIC ACID ..................................... 11
1.5. CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIếT VÀ XÁC ĐịNH HA ......... 13
1.5.1. Tách chiết HA .............................................................................. 13
1.5.2. Xác định HA ................................................................................ 14
1.6. GIớI THIệU NGUồN NGUYÊN LIệU SụN ................................... 14
1.6.1. Sụn động vật ................................................................................ 14
1.6.2. Sụn cá nhám ................................................................................ 16
PHẦN II: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17
2.1. NGUYÊN VậT LIệU ....................................................................... 17
2.2. PHƯƠNG PHÁP NUÔI CấY CÁC CHủNG VI SINH VậT ......... 18


Khổng Thị Khánh Linh 1201

Khóa luận tốt nghiệp

2.3. XÁC ĐịNH HOạT Độ PROTEASE BằNG KHUếCH TÁN TRÊN
ĐĨA THạCH CÓ CHứA CƠ CHấT THEO LELUK VÀ CộNG Sự ..... 19
2.4. XÁC ĐịNH HOạT Độ PROTEASE THEO PHƯƠNG PHÁP
ANSON CảI TIếN .................................................................................... 20
2.5. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐịNH ĐIềU KIệN TốI ƯU CHO HOạT

ĐộNG CủA PROTEASE NGOạI BÀO SÀNG LọC ĐƯợC .................. 22
2.5.1. Xác định nhiệt độ thủy phân tối ưu .............................................. 22
2.5.2. Xác định pH tối ưu....................................................................... 23
2.5.3. Xác định thời gian thủy phân tối ưu ............................................. 23
2.5.4. Xác định nồng độ enzyme thủy phân tối ưu .................................. 23
2.6. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐịNH ĐIềU KIệN TốI ƯU CHO SINH
TRƯởNG VÀ TIếT PROTEASE NGOạI BÀO CủA CHủNG B-510 ... 24
2.6.1. Khảo sát môi trường nuôi cấy thích hợp sinh protease ngoại bào
của chủng B510. ..................................................................................... 24
2.6.2. Xác định nhiệt độ nuôi cấy tối ưu ................................................ 24
2.6.3. Xác định pH nuôi cấy tối ưu ........................................................ 25
2.6.4. Xác định thời gian nuôi cấy tối ưu ............................................... 25
2.7. ĐịNH LƯợNG HA: XÁC ĐịNH GốC N-ACETYL-DGLUCOSAMINE CủA HA THEO PHƯƠNG PHÁP REISSING. ...... 25
2.8. XÁC ĐịNH HÀM LƯợNG PROTEIN THEO PHƯƠNG PHÁP
LOWRY ................................................................................................... 27
2.9. PHƯƠNG PHÁP SING HọC TÁCH CHIếT HA .......................... 28
PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................. 29
3.1. SÀNG LọC CÁC CHủNG VI SINH VạT SINH ENZYME
PROTEASE NGOạI BÀO HOạT TÍNH CAO ...................................... 29
3.2. KHảO SÁT ĐIềU KIệN THÍCH HợP CHO SINH TRƯởNG VÀ
TIếT PROTEASE NGOạI BÀO CủA CHủNG B-510 ........................... 32
3.2.1. Khảo sát môi trường thích hợp sản sinh protease ........................ 32
3.2.2. Nhiệt độ nuôi cấy tối ưu............................................................... 33


Khổng Thị Khánh Linh 1201

Khóa luận tốt nghiệp

3.2.3. pH nuôi cấy tối ưu ....................................................................... 34

3.2.4. Thời gian nuôi cấy tối ưu ............................................................. 35
3.3. ẢNH HƯởNG CủA CÁC ĐIềU KIệN PHảN ứNG TớI HOạT Độ
CủA PROTEASE NGOạI BÀO Từ CHủNG VI KHUẩN B-510........... 35
3.3.1. Ảnh hưởng của pH ........................................................................ 36
3.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ ............................................................... 37
3.3.3. Xác định thời gian tối ưu thủy phân sụn cá của protease từ chủng
B-510. .................................................................................................... 37
3.3.4. Ảnh hưởng của nồng độ protease lên quá trình thủy phân sụn cá . 38
3.4. SƠ Đồ THU PROTEASE NGOạI BÀO VÀ CÁC ĐIềU KIệN TốI
ƯU THủY PHÂN SụN CÁ NHÁM CủA PROTEASE NGOạI BÀO Từ
CHủNG B-510.......................................................................................... 39
3.5. SO SÁNH HÀM LƯợNG HA CHIếT RÚT KHI Sử DụNG
PROTEASE KHÁC NHAU .................................................................... 40
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................... 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................... 43
PHỤ LỤC...................................................................................................... 1

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT


Khổng Thị Khánh Linh 1201

Khóa luận tốt nghiệp

A660

Độ hấp phụ ở bước sóng 660nm

A750

Độ hấp phụở bước sóng 750nm

BSA

Albumin huyết thanh bò

CN

Cá nhám

GAG

Glycosaminoglycan

GalNAc

N-acetyl-D-galactosamine

OD

Optical Density

PG

Proteoglycan

TCA

Tricloacetic acid

UV

Ultraviolet

HA

Hyaluronic acid

DMAB

Dimetylamin benzaldehyde

CPC Cetylpyridium chloride
CTAB

Cetyltrimethylamnonium bromide


Khổng Thị Khánh Linh 1201

Khóa luận tốt nghiệp

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Hyaluronic acid từ một số nguồn nguyên liệu .................................. 10
Bảng 1.2: Thành phần chính của mô sụn .......................................................... 15
Bảng 2.1: Các chủng vi sinh vật ....................................................................... 17
Bảng 2.2 Môi trường sử dụng trong các thí nghiệm.......................................... 18
Bảng 2.3: Xác định đường cong chuẩn của tyrosine ........................................ 21
Bảng 2.4: Xây dựng đường cong chuẩn HA .................................................... 27

Bảng 3.1: Hoạt tính protease ngoại bào của các chủng vi sinh vật nghiên cứu .. 30
Bảng 3.2. Hoạt tính protease của chủng Bio2, B26, B-510 ............................... 31
Bảng 3.3: Khả năng sinh trưởng và tiết protease ngoại bào của chủng B510
nuôi trong các môi trường khác nhau ............................................................... 32
Bảng 3.4: Hàm lượng HA hòa tan sau khi sử dụng các protease khác nhau .... 40


Khổng Thị Khánh Linh 1201

Khóa luận tốt nghiệp

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cấu trúc của một đơn phân đường đôi của hyaluronic acid ............. 7
Hình 2.1: Phản ứng tạo màu của N-acetyl-D-glucosamine và DMAB .......... 26
Hình 3.1. Hoạt tính protease của 3 chủng vi sinh vật Bio2, B26, B-510. Thể
tích dịch nuôi vi sinh vật cho vào mỗi giếng là: 150µl; 1: Bio 2 (25mm), 2:
B26 (26mm); 3: B-510 (27mm) .................................................................... 31
Hình 3.2: Khả năng sinh trưởng (A) và hoạt tính protease (B) của chủng
B510 tại các nhiệt độ khác nhau ................................................................... 33
Hình 3.3: Khả năng sinh trưởng (A) và tiết protease của chủng B510 (B) ở các
pH khác nhau ............................................................................................... 34
Hình 3.4: Khả năng sinh trưởng(A) và tiết protease ngoại bào (B) của chủng
B-510 theo thời gian nuôi cấy ...................................................................... 35
Hình 3.5: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính protease củachủng B-510 .......... 36
Hình 3.6: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính protease của chủng B-510 37
Hình 3.7: Ảnh hưởng của thời gian thủy phân sụn cá đến hiệu quả thu nhận
HA ............................................................................................................... 38
Hình 3.8: Ảnh hưởng nồng độ protease của chủng B-510 lên quá trình thủy
phân xương sụn cá nhám .............................................................................. 38

Hình 3.9: Khả năng thủy phân sụn cá nhám của các protease khác nhau ..... 40
Hình 3.10: Hàm lượng HA từ dịch thủy phân sụn cá nhám sau khi sử dụng
cácprotease khác nhau .................................................................................. 41


MỞ ĐẦU
Thủy sản, ngoài việc cung cấp thực phẩm cho con người còn là một
nguồn dược liệu tự nhiên quý như: iốt chống biếu cổ từ rong mơ, vitamin A từ
dầu cá, guanine từ vây cá... Đặc biệt, nhiều dược liệu quý đã được chiết xuất
từ phế thải của các nhà máy chế biến thuỷ sản.
Các nghiên cứu trên thế giới cho thấy các nguyên liệu từ sụn cá (Murado
et al, 2012) đều có thành phần hyaluronic acid (HA). HA là một polymer tự
nhiên mạch thẳng thuộc nhóm glycosaminoglycan (GAG), không chứa nhóm
sulfat , được cấu tạo bởi hai đơn vị cơ bản là N-acetylglucosamine và
glucuronic ạcid xen kẽ nhau và liên kết với nhau bởi liên kết β(1-3) và β (1-4)
glycosidic.
Trong những năm gần đây, HA đã được sử dụng rộng rãi trong các loại
chế phẩm bổ sung dinh dưỡng và đang ngày càng được mở rộng ứng dụng
trong hỗ trợ điều trị nhiều loại bệnh. Hiện nay ở Việt Nam đã và đang nhập
khẩu thuốc chứa thành phần HA để điều trị bệnh viêm khớp, chống lão hóa,
xóa nếp nhăn làm đẹp da như (Duovital của CHLB Đức, Havital-HA drink
của Thụy Sỹ với giá thành rất cao), nhưng chưa có đơn vị nào trong nước sản
xuất được HA để phục vụ trong Y dược.
Nghiên cứu trước đây của chúng tôi cũng đã xác định trong sụn cá nhám
(Carcharhinus sorrah) của Việt Nam chứa hàm lượng khá cao HA. Hàm
lượng HA từ sụn cá nhám tuy không cao bằng các nguồn nguyên liệu từ mào
gà hay vi khuẩn, nhưng việc nghiên cứu tận thu HA từ phế thải sụn cá từ các
nhà máy chế biến thủy sản của Việt Nam không những giải quyết vấn đề ô
nhiễm môi trường mà còn làm tăng giá trị của thủy sản. Trong quá trình chiết
rút HA từ sụn động vật, việc sử dụng protease thay thế các chất hóa học đang

được các nhà khoa học nghiên cứu ứng dụng vì giảm độ độc hại của các chất
hóa học khi sản xuất cũng như tăng chất lượng của chế phẩm HA.

1


Để thay thế nguồn protease nhập ngoại, giảm giá thành trong quá trình
thủy phân sụn cá nhám, chiết rút HA, chúng tôi đặt vấn đề sàng lọc một số
chủng vi sinh vật nguồn gốc Việt Nam có khả năng sinh protease ngoại bào
mạnh và nghiên cứu ứng dụng nguồn enzyme sàng lọc được cho quá trình
tách chiết HA.Kết quả nghiên cứu này sẽ là bước khởi đầu tạo ra công nghệ
tách chiết HA bằng nguồn enzyme sản xuất tại Việt Nam, giúp các sản phẩm
thực phẩm chức năng có chứa HA của Việt Nam có giá thành rẻ, cạnh tranh
được với các chế phẩm HA nhập ngoại.
Trong đề tài này, chúng tôi tập trung nghiên cứu các nội dung chính sau
đây:
- Sàng lọc một số chủng vi sinh vật sinh protease ngoại bào có hoạt tính
cao dùng để tách chiết HA.
- Nghiên cứu các điều kiện tối ưu để thu nhận được nguồn protease
ngoại bào từ một chủng vi sinh vật có hoạt tính cao nhất sàng lọc được
- Tìm điều kiện thuỷ phân thích hợp (pH, nhiệt độ, nồng độ enzyme,
thời gian thuỷ phân) của protease ngoại bào đã sàng lọc được từ vi sinh vật.
- So sánh tách chiết HA từ xương sụn cá nhám bằng chế phẩm protease
sàng lọc được với protease thương mại của nước ngoài.
* Mục tiêu nghiên cứu
-Sàng lọc được ít nhất một chủng vi sinh vật sinh protease ngoại bào có
hoạt tính cao thủy phân sụn cá nhám (Carcharhinus sorrah) để tách chiết HA.
-Xác định được các điều kiện tối ưu để thu nhận protease ngoại bào từ
chủng vi sinh vật đã sàng lọc được và các điều kiện tối ưu của protease này
thủy phân sụn cá.

2


1.1.

PHẦN I.TỔNG QUAN
PROTEASE VÀ ứNG DụNG TRONG THựC TIễN
1.1.1. Định nghĩa Protease
Protease là enzyme thuộc nhóm hydrolase, xúc tác cho quá trình thủy

phân liên kết peptid (-CO – NH-) của phân tử protein và polypeptid tạo thành
các peptid mạch ngắn và các acid amin tự do.
1.1.2. Phân loại Protease
Protease được chia thành 2 loại chính: endopeptidase và exopeptidase
1.1.2.1. Exopeptidase
• Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được
phân chia thành 2 loại:
- Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptid ở đầu N tự do của
chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một
tripeptide.
- Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của
chuỗi polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide.
1.1.2.2. Endopeptidase
• Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia
thành 4 nhóm sau ( Lê Ngọc Tú, 2010).
- Serin protease: là những protease chưá nhóm –OH của gốc serine
trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động
xúc tác của enzyme. Nhóm này bao gồm 2 nhóm nhỏ: chymotrypsin và
subtilisin. Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như

chymotrypsin, trypsin, elastase. Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi
khuẩn như subtilisin Carlsberg. Các serine thường hoạt động mạnh ở vùng
kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng.
- Cysteine protease: Các protein chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt
động. Cystein protease bao gồm các protease thực vật như: papain, bromelin,
3


một vài protein động vật và protease ký sinh trùng. Các cystein protease
thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng.
- Aspartic protease: Hầu hết các aspartic protease thuộc nhóm pepsin.
Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, rennin. Aspartic
protease có chứa nhóm cacboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt
động mạnh ở pH trung tính.
- Metallo protease: Là nhóm protease được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm
mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các protease thường hoạt động ở
pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA.
Ngoài ra, protease được phân loại 1 cách đơn giản hơn thành 3 nhóm:
- Protease acid: pH 2-4 có nhiều ở tế bào động vật, nấm men, nhưng ít
thấy ở vi khuẩn.
- Protease trung tính: có pH 7-8 như papain, bromelin, ficin. Những
protease này là Cystein protease, papain là protease là enzyme ổn định với nhiệt
độ nhất.
- Protease kiềm có pH 9-11.
1.1.3. Ứng dụng của protease trong thực tiễn (Đặng Thị Thu, 2012)
• Trong công nghiệp chế biến thịt: Protease được dùng làm mềm thịt nhờ
sự thủy phân 1 phần protein trong thịt, làm cho thịt có độ mềm thích hợp và
có vị tốt hơn. Sử dụng protease để sản xuất dịch đạm: từ Streptomyces fradiae
tách được chế phẩm keratineza thuỷ phân được keratin rất có giá trị để sản xuất
dịch đạm từ da, lông vũ. Nếu dùng axit để thuỷ phân sẽ mất đi hoàn toàn các axit

amin chứa lưu huỳnh, nếu dùng kiềm để thuỷ phân sẽ bị raxemic hoá (chuyển
dạng L sang D làm giảm giá trị sinh học của axit amin). Để thuỷ phân sâu sắc và
triệt để protein (trong nghiên cứu, chế tạo dịch truyền đạm y tế) cần dùng các
protease có tính đặc hiệu cao và tác dụng rộng, muốn vậy người ta thường dùng
phối hợp cả 3 loại protease của 3 loài: vi khuẩn, nấm mốc, thực vật với tỷ lệ tổng
cộng 1- 2% khối lượng protein cần thuỷ phân. Ưu điểm của việc thuỷ phân

4


protease bởi enzyme là bảo toàn được vitamin của nguyên liệu, không tạo ra các
sản phẩm phụ, không làm sẫm màu dịch thuỷ phân.
• Trong chế biến nước mắm: Trong sản xuất nước mắm cổ truyền thời
gian chế biến thường rất dài, hiệu suất thuỷ phân protein phụ thuộc rất nhiều
vào phương pháp chế biến của các địa phương và nguyên liệu cá. Hiện nay
quy trình sản xuất nước mắm ngắn ngày đã được hoàn thiện trong đó sử dụng
chế phẩm enzyme thực vật (bromelain và papain) và vi sinh vật để rút ngắn
thời gian làm và cải thiện hương vị của nước mắm.
• Trong sản xuất bia, chế phẩm protease có ý nghĩa quan trọng trong việc
làm tăng độ bền của bia và rút ngắn thời gian lọc. Protease của A. oryzae được
dùng để thủy phân protein trong hạt ngũ cốc, tạo điều kiện xử lý bia tốt hơn.
• Trong công nghiệp thực phẩm: protease được dùng trong sản xuất
phomat nhờ hoạt tính làm đông tụ sữa của chúng. Protease từ một số vi sinh
vật như A. candidus, P. roquerti, B. mesentericus,… được dùng trong sản
xuất phomat. Trong công nghiệp sản xuất bánh mì, bánh quy... protease làm
giảm thời gian trộn, tăng độ dẻo và làm nhuyễn bột, tạo độ xốp và nở tốt hơn.
• Trong công nghệ thuộc da: Quá trình chế biến da bao gồm 1 số công
đoạn như ngâm ướt, tẩy long, làm mềm da hoặc thuộc da. Thông thường, các
phương pháp thuộc da thường dùng các hóa chất độc hại như natri sulfide,
làm ảnh hưởng đến môi trường khi nước thải nhà máy thải ra xong. Việc sử

dụng enzyme để thay thế các hóa chất đã rất thành công trong việc nâng cao
chất lượng da và làm giảm ô nhiễm môi trường. Protein là một thành phần cơ
bản của da và lông nên protease đã được sử dụng để thủy phân 1 số thành
phần phi collagen của da và loại bỏ các protein phi fibrin như albumin,
globulin trong quá trình thuộc da rất có hiệu quả.
• Trong công nghệ tơ tằm: Làm bóng và tách rời các sợi tơ.
• Trong hương mỹ phẩm: Người ta trộn một lượng nhỏ protease vào kem
xoa, kem cạo râu, dầu gội, dầu bôi tóc, kem mặt,... để làm mềm da, tẩy tế bào
chết.
5


• Trong sản xuất chất tẩy rửa: Protease là một trong những thành phần
không thể thiếu trong tất cả các loại chất tẩy rửa (chất tẩy rửa dùng trong gia
đình, chất làm sạch kính). Việc ứng dụng enzyme vào các chất tẩy rửa nhiều
nhất là trong bột giặt. Các protease thích hợp để bổ sung vào chất tẩy rửa vết
thương có tính đặc hiệu cơ chất rộng để dễ dàng loại bỏ các vết bẩn do thức
ăn, vết máu, sữa và các chất do cơ thể người tiết ra. Protease dùng trong chất
tẩy rửa phải hoạt động tốt trong điều kiện nhiệt độ và pH cao cũng như phải
thích hợp với các tác nhân oxy hóa và các chất kìm hãm có trong thành phần
của chất tẩy rửa. Subtilisin đáp ứng được đầy đủ những yêu cầu khắt khe trên.
Hiện nay, tất cả các protease bổ sung vào chất tẩy dùng trên thị trường đều là
serine protease được sản xuất từ các chủng Bacillus và chủ yếu là B. subtilis.
Trên thế giới, mỗi năm người ta đã sử dụng 89% enzyme này cho ngành công
nghiệp tẩy rửa.
• Trong y học:
- Protease được dùng để sản xuất môi trường dinh dưỡng nuôi vi sinh
vật, sản xuất huyết thanh miễn dịch.
- Dùng để phân hủy các cục máu đông trong cơ thể, chữa bệnh nghẽn tĩnh
mạch...

- Sử dụng các chất hoạt hóa và kìm hãm protease để điều trị các bệnh đặc
trưng.
- Sản xuất thuốc làm tăng khả năng tiêu hóa protein cho những người
bị tiêu hóa kém...
• Trong nông nghiệp: Protease được dùng để sản xuất dịch thủy phân
giàu đạm bổ sung vào thức ăn của lợn và gia cầm.
• Trong kỹ nghệ phim ảnh: Protease từ vi khuẩn được dùng để tái sinh
các nguyên liệu như phim điện ảnh, phim Rơnghen... Protease phân giải và
hòa tan lớp nhũ tương gelatin trên phim và giấy ảnh, do đó có thể làm sạch và
sử dụng trở lại các loại phim và giấy ảnh quý.

6


1.2.

GIớI THIệU TổNG QUAN Về HYALURONIC ACID
1.2.1. Khái niệm Hyaluronic acid
HA

là

một

polymer

tự

nhiên

mạch

thẳng

thuộc

nhóm

glycosaminoglycan (GAG), không chứa nhóm sulfat, được cấu tạo bởi hai
đơn vị cơ bản là N-acetylglucosamine và glucuronic ạcid xen kẽ nhau và liên
kết với nhau bởi liên kết β(1-3) và β(1-4) glycosidic (hình 1.1).

Hình 1.1: Cấu trúc của một đơn phân đường đôi của hyaluronic acid

Số lượng các disaccharides lặp lại trong phân tử HA khoảng 10.000,
khối lượng phân tử HA khoảng 104 đến 107 kDa (Cowman and Matsuoka,
2005). Những phân tử HA dài và kích thước lớn tạo ra độ nhớt cao có tác
dụng bôi trơn và chống lại lực nén, cho phép các khớp xương và da chịu trọng
lượng và vận động dễ dàng
Hyaluronic acid được tìm thấy trong mọi tế bào trong cơ thể và xuất
hiện với nồng độ cao ở các vị trí đặc biệt như: xương, sụn, dịch khớp, gân,
dây chằng, mô liên kết, da,…


1.2.2. Vai trò của Hyaluronic acid
Hyaluronic acid được chú ý nhiều sau khi kênh truyền hình ABC new đã công
bố một báo cáo về một làng người Nhật Bản ở Yuzuri Hara, nơi dân cư ở đây
có tỷ lệ người sống khỏe mạnh và tuổi thọ cao nhất thế giới. Nghiên cứu đã
tìm ra rằng những người dân ở đây có chế độ ăn và bổ sung tỷ lệ rất cao hàm
lượng HA cho cơ thể( />HA là thành phần cấu tạo độ ẩm quan trọng nhất của lớp hạ bì. Ở người sau

tuổi 25, số lượng hyaluronic acid chỉ còn lại 65% so với thời tuổi vị thành
niên và dần chỉ còn lại 25% ở độ tuổi 60. Khi già, sự sống của các tế bào giảm
dần và da trở nên khô nhăn vì mất độ ẩm. HA có khả năng cung cấp độ ẩm và
tăng cường vững chắc độ bền dai của các lớp đàn hồi trong da. Ngoài ra HA
còn có nhiều chức năng sinh học khác trong cơ thể sống: ức chế giải phóng
các yếu tố tiền viêm, các gốc oxi hóa tự do, làm lành vết thương, giảm sự di
căn của ung thư, có tác dụng giảm đau và có hiệu quả cao trong điều trị bệnh
viêm khớp, tim mạch. Hyaluronic acid được ví như một thần dược trong
những thập niên gần đây. Hyaluronic acid và chondroitin là thành phần cơ
bản của proteoglycan (PG) chứa trong xương sụn (tilage).
Trong cơ thể sống, các PG và GAG giữ vai trò quan trọng trong nhiều quá
trình khác nhau như: điều hòa hoạt động của enzyme và sự bám dính, phát
triển và di thực của tế bào (Lyon, 1998; Selleck, 2000; Turnbull, 2001). Các
phân tử (monomer) PG của mô sụn cùng với protein gắn kết và acid
hyaluronic tạo thành một phức hệ thuỷ động học có khả năng nén thuận
nghịch rất cần thiết cho sụn để chống lại sự ép nén với sự biến dạng nhỏ nhất
(Hascall, 1988). HA và Collagen là thành phần rất quan trọng để duy trì các
lớp của da và cấu trúc của nó. Collagen giúp cho da săn chắc, nhưng HA giúp
nuôi dưỡng và cung cấp nước cho sợi collagen. HA giữ độ ẩm và độ đàn hồi
cho da.

8


1.3.

MộT Số NGHIÊN CứU Về HYALURONIC ACID
1.3.1. Nghiên cứu HA trên thế giới
Năm 1934, Karl Meyer và John Palmer lần đầu tiên đã phát hiện

Hyaluronic acid (HA) trong dịch ở cầu mắt bò (Meyer, 1934). Cấu trúc của
HA cũng đã được xác định bởi Karl Meyer và cộng sự (hình 1.1).
Hyaluronic acid được tìm thấy trong mọi tế bào trong cơ thể và xuất hiện với
nồng độ cao ở các vị trí đặc biệt như: xương, sụn, dịch khớp, gân, dây chằng, mô
liên kết, da,…
Nguồn nguyên liệu HA từ sụn, da của động vật cũng đã được các nhà
khoa học trên thế giới điều tra (bảng 1.1). HA đã được phát hiện trong sụn lợn
(Timothy,1970), trong sụn cá mập (Pat, 1974), sụn bò (Cullis-Hill, 1989). Gần
đây các nhà khoa học trên thế giới đã tiến hành tìm kiếm nguồn HA từ nguyên
liệu biển, các nghiên cứu cho thấy HA có trong dịch thủy tinh thể của nhiều
loài cá và trong sụn cá (Murado, 2012). HA cũng đã được xác định trong da
của lợn (Pat, 1975; 1976; Lu, 2002; Zhao, 2008), da của thỏ (Chain,1940).
Gần đây, Mansour và cộng sự (2009) đã tách được GAG từ da cá đuối (Raja
radula), nghiên cứu đã tìm thấy 2 polysaccharide là dermatan sulfate và
hyaluronic acid. Các nghiên cứu trên thế giới cho thấy hàm lượng HA từ sụn và
da cá không cao so với các nguồn nguyên liệu từ mào gà hay vi khuẩn. Nhưng
việc nghiên cứu HA tận thu từ phế thải thủy sản không những giải quyết vấn đề
ô nhiễm môi trường mà còn có ý nghĩa kinh tế và xã hội (Jose’, 2013).
HA được phát hiện và tách chiết từ mào gà, cuống rốn và một số chủng
vi khuẩn như Streptococcus pyogenes, Streptococcus zooepidermicus
(Shiedlin, 2004) và Streptococcus thermophilus (Izawa, 2009). HA thương
mại được sản xuất chủ yếu từ một số chủng vi khuẩn Streptococcus (Chong,
2003). Tuy nhiên sự hiện diện của nội độc tố của vi khuẩn sản xuất HA từ liên
cầu đã giới hạn ứng dụng của HA trong lĩnh vực Y sinh học (Chien, 2007;

9


Widner, 2005). Vì vậy hiện nay trên thế giới, việc nghiên cứu sản xuất HA tái
tổ hợp từ vi khuẩn đang được thay thế (Widner, 2005; Mao, 2007; Yu, 2008).

Bảng 1.1: Hyaluronic acid từ một số nguồn nguyên liệu
Nguồn HA

(%)

Tài liệu

Mào gà

4,5

Nakano (1994)

Sụn lợn

0,35

Timothy (1970)

Hoạt dịch trong các xương khớp của bò

1,5-4,0

Hoạt dịch trong các xương khớp của lợn

0,6

Thủy tinh thể mắt của bò

0,3

Gherezghiher (1987)

0,843

Zhao Yuhong (2008)

Da lợn

Cullis-Hill (1989)

Thủy tinh thể mắt cá mập

0.3

Murado (2012)

Nhuyễn thể hai mảnh vỏ A. plueronectus

0,42

Shankar (2013)

Vi khuẩn

Amstrong (1997),

Streptococcus zooepidermicus

Krahulec (2006), Don

0,6

Streptococcus pyogenes

(2010)
Shiedlin (2004)

Streptococcus thermophilus

Izawa (2009)
Hyaluronic acid được tìm thấy trong tất cả các xương và các cấu trúc
sụn khắp cơ thể, trong dịch khớp (Balazs, 1993). Sụn động vật là loại mô liên
kết đặc tồn tại trong cơ thể động vật có xương sống, cũng như ở động vật
không xương sống (sam, sên biển và động vật chân đầu (cephalopod)...) (
http://BME/ME 456 Biomechanics). Trong cơ thể người và các loài động vật
có xương sống khác, sụn có ở nhiều bộ phận như các khớp, xương sườn, tai,
mũi, ống hô hấp, đĩa đệm, cột sống…. Các loài cá sụn (chondrichthyes) như
cá mập, cá đuối là những loài động vật có xương sống nhưng bộ xương chứa
hoàn toàn sụn cả khi ở tuổi trưởng thành.

10


Hyaluronic acid trong da người chiếm khoảng 50 % tổng số HA có
trong cơ thể (Juhlin, 1997). Mặc dù HA có thể được tìm thấy tự nhiên từ mọi
tế bào trong cơ thể, nhưng nó được tìm thấy ở nồng độ lớn nhất trong các mô
da. Da là cơ quan lớn nhất trong cơ thể chiếm khoảng 15% trọng lượng cơ
thể, khoảng 50% Hyaluronic Acid trong cơ thể được tìm thấy trong da. HA và
Collagen là thành phần rất quan trọng để duy trì các lớp của da và cấu trúc
của nó. Collagen giúp cho da săn chắc, nhưng HA giúp nuôi dưỡng và cung

cấp nước cho sợi collagen. HA giữ độ ẩm và độ đàn hồi cho da.
1.3.2. Nghiên cứu HA tại Việt Nam
Tại Việt Nam, nhóm nghiên cứu của (Phạm Võ Minh Thiên, 2010) đã
nghiên cứu và phát hiện sự hiện diện của hyaluronic acid trong mào gà, cuống
rốn và nguồn cầu khuẩn có vỏ nang Streptococcus có từ Việt Nam. Nhóm
nghiên cứu của Võ Hoài Bắc và công sự đã nghiên cứu điều tra HA trong
nguồn nguyên liệu phế thải thủy sản từ các nhà máy chế biến thủy sản của
Việt Nam đã xác định hàm lượng HA trong cá nhám là 4,7 (±0,32)% (Võ
Hoài Bắc, 2016).
1.4.

ỨNG DụNG CủA HYALURONIC ACID
Hyaluronic acid là thành phần cấu tạo độ ẩm quan trọng nhất của lớp hạ

bì. Ở người sau tuổi 25, số lượng hyaluronic acid chỉ còn lại 65% so với thời
tuổi vị thành niên và dần chỉ còn lại 25% ở độ tuổi 60. Khi già, sự sống của
các tế bào giảm dần và da trở nên khô nhăn vì mất độ ẩm. HA có khả năng
cung cấp độ ẩm và tăng cường vững chắc độ bền dai của các lớp đàn hồi trong
da. Ngoài ra HA còn có nhiều chức năng sinh học khác trong cơ thể sống: ức
chế giải phóng các yếu tố tiền viêm, các gốc oxi hóa tự do, làm lành vết
thương, giảm sự di căn của ung thư, có tác dụng giảm đau và có hiệu quả cao
trong điều trị bệnh viêm khớp, tim mạch. Hyaluronic acid được ví như một
thần dược trong những thập niên gần đây. Có rất nhiều nghiên cứu về phân tử
này và vai trò của nó trong các lãnh vực điều trị cũng như ứng dụng của nó

11


trong ngành Y khoa. HA đã được sử dụng rộng rãi trong các loại chế phẩm bổ
sung dinh dưỡng khác nhau và đang ngày càng được mở rộng ứng dụng trong

hỗ trợ điều trị nhiều loại bệnh khác nhau. Thị trường trên toàn thế giới hiện
nay tiêu thụ HA khoảng hơn 1 tỷ USD (Chong, 2005) .
Tác dụng của HA lên khớp: HA giúp nuôi dưỡng sụn, giúp cho dịch
khớp được duy trì độ nhớt, làm các khớp được vận động dễ dàng và chịu được
tải trọng. Ở khớp thoái hóa, nồng độ HA giảm rõ rệt làm cho sự nuôi dưỡng
sụn kém đi, và độ nhớt của dịch khớp cũng giảm theo. Vì vậy, bổ sung HA
cho dịch khớp là một trong những liệu pháp đã được chứng minh là có hiệu quả
rất cao. HA có tác dụng giảm đau và có hiệu quả cao trong điều trị bệnh viêm
khớp (Balazs và Denlinger, 1989; Echigo, 2006). Số bệnh nhân viêm xương
khớp đầu gối tăng từ 15 triệu người năm 2000 lên 19 triệu năm 2010, do vậy nhu
cầu sử dụng HA trong điều trị sẽ tăng cao.
Tác dụng của HA lên da: Tại da, HA giúp giữ nước trong chất gian bào
tạo độ ẩm cần thiết cho các tế bào da tồn tại và phát triển. Khi thiếu hụt HA,
mô da sẽ bị khô làm cho các tế bào và tổ chức liên kết bị thoái hóa, đứt gẫy,
và tạo ra những nếp nhăn. Hiện nay, trong ngành thẩm mỹ, có rất nhiều loại
mỹ phẩm dưỡng da có chứa thành phần HA dùng bôi ngoài, hoặc tiêm trực
tiếp vào da để làm căng da, xóa nếp nhăn, nâng ngực…
Các chức năng sinh học khác trong cơ thể sống: HA điều hòa chức
năng sinh học qua sự gắn kết với các protein và các receptor bề mặt của tế bào
như CD44 (Knudson, 2002). HA ức chế giải phóng các yếu tố tiền viêm, các
gốc oxi hóa tự do (Balazs và Denlinger, 1984). HA có khả năng tổng hợp các
proteoglycan, kích thích làm lành vết thương, kháng viêm và giảm sự di căn
của ung thư (Stern, 2005; Heldin, 2003). HA còn có khả năng điều trị bệnh
tim mạch (giảm sự bám dính của tiểu cầu và làm tan các cục máu đông
(Leach và Schmidt, 2004).
Hiện nay HA là thành phần quan trọng trong các sản phẩm mỹ phẩm
(kem dưỡng làm mịn da, kem chống nhăn) và y dược (ngăn ngừa và điều trị

12

bệnh viêm xương khớp, chống các chất gây oxy hóa, chống lão hóa, làm lành
vết thương nhanh chóng…).
1.5.

CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIếT VÀ XÁC ĐịNH HA
1.5.1. Tách chiếtHA
Các phương pháp truyền thống để tách chiết HA từ động vật (ví dụ: từ

mào gà) được phát triển theo công trình báo cáo của (Swann, 1968) và
(Balazs, 1979) gồm: chuẩn bị vật liệu, rửa bằng nước hoặc alcohol, sau đó
chiết bằng nước hoặc dung môi hữu cơ (chủ yếu là chloroform) , thu tủa HA
bằng cetylpiridinium clorua (CPC), lọc và chiết lại bằng chloroform để loại
protein , ly tâm và tinh sạch bằng các cột sắc ký.
Quá trình thu nhận chế phẩm HA thô từ sụn và da có thể được thực
hiện bằng phương pháp hoá học hoặc phương pháp sinh học (dùng enzyme)
để thuỷ phân sụn, da.
Trong phương pháp hoá học mô sụn và da được xử lý bằng nước nóng,
dung dịch muối (sodium acetate, muối kim loại nặng), kiềm (NaOH),
hydrochloric acid hoặc các dung môi hữu cơ như chloroform, phenol… (Yu,
1990). Tuy nhiên phương pháp này rất tốn kém, chất lượng HA bị ảnh hưởng,
làm hạn chế các ứng dụng của HA (O’Regan, 1994).
Phương pháp sinh học dùng enzyme để thuỷ phân mô sụn, da là
phương pháp có hiệu quả để thu nhận HA không bị biến đổi về cấu trúc, giữ
được hoạt tính sinh học của chúng và làm giảm thiểu ô nhiễm môi trường do
các hoá chất (muối, kiềm, acid...) gây nên. Nhiều nghiên cứu đã sử dụng các
protease (papain, actinase, pronase, tripsin…) để thuỷ phân sụn giải phóng
GAG khỏi các protein liên kết. Sau khi loại bỏ protein thì HA được tách ra và
tinh sạch. Phương pháp này đã được dùng để thu nhận GAG từ da cá Labeo
rohita (Sikder, 1979), sụn của cá mực (Vynios, 1985), (Cullis-Hill và cộng sự

1989) đã sử dụng protease để thủy phân protein lặp lại nhiều lần và ethanol
kết hợp 2% acetic acid để loại protein.

13


1.5.2. Xác định HA
- Việc định tính và định lượng HA được thực hiện theo phương pháp
(Reissig, 1955) là phương pháp cải tiến của phương pháp Morgan-Elson.
-Phát hiện sự hiện diện của gốc N-acetyl-D-glucosamine trong HA qua
phản ứng với p-dimethylaminobenzaldehyde (DMAB), làm dung dịch chuyển
từ màu vàng nhạt sang màu tím hồng. Dựa trên sự thay đổi trong quang phổ
hấp thụ, dùng đồ thị đường chuẩn HA để thấy mối quan hệ tuyến tính hấp thụ
ở bước sóng 585nm của phức chất DMAB và HA. Đây là một phản ứng đặc
hiệu và rất nhạy, có thể định tính và định lượng được HA có hàm lượng rất
nhỏ (µg)
1.6.

GIớI THIệU NGUồN NGUYÊN LIệU SụN
1.6.1. Sụn động vật
Sụn động vật là loại mô liên kết đặc tồn tại trong cơ thể động vật có

xương sống, cũng như động vật không có xương sống như: sam, sên biển và
động vật chân đầu (cephalopod)…..(http://BME/ME 456 Biomechanics).
Trong cơ thể người và các loài động vật có xương sống khác, sụn có
nhiều ở các bộ phận như các khớp, xương sườn, tai, mũi, ống hô hấp, đĩa đệm
cột sống…Sụn là phần chính trong bộ xương của bào thai, nhưng nó sẽ biến
đổi thành xương khi cơ thể trưởng thành. Các loài cá sụn (chondrichthyes)
như cá mập, cá đuối là những loài động vật có xương sống nhưng bộ xương
chứa hoàn toàn sụn cả khi ở tuổi trưởng thành. Sụn khác biệt ở chỗ chỉ chứa

một loại tế bào, không có mạch máu, không chứa các tế bào thần kinh
(aneurol)

và

không

chứa

hệ

(tilage).

14

bạch

huyết

(alymphatic)


Bảng 1.2: Thành phần chính của mô sụn
Proteoglycan

Mô

Nước (%)

Collagen (%)

Sụn khớp

68,0 - 85,0

10,0 - 20,0 ( loại I)

5,0-10,0

Sụn chêm

60,0 - 70,0

15,0 - 25,0 ( loại II)

1,0- 2,0

(%)

Thành phần chính của hai loại sụn được thể hiện trong bảng 1.2. Có hai
loại sụn là sụn khớp và sụn chêm. Thành phần hóa học của cả hai loại nêu
trên đều bao gồm hai pha chủ yếu là pha lỏng bao gồm nước và các chất điện
phân, pha rắn do các đại phân tử tạo thành gồm sợi collagen (collagen loại II
trong sụn chêm và loại I trong sụn khớp). Proteoglycan và tế bào sụn
(chondrocytes). Tế bào sụn tạo nên chất cơ bản (matrix) của sụn
(ndroitin Sulfate). Ba thành phần chính này tác động
đồng bộ tạo nên đặc tính cơ học của sụn. Sự thay đổi của các thành phần này (
do bị lão hóa…) sẽ làm thay đổi đặc tính cơ học phụ thuộc vào thời gian của
sụn. Có tới 30% nằm trong khoảng không giữa các sợi collagen. Kích thước
sợi collagen và hàm lượng nước được xác định nhờ áp suất trương sinh ra do

mật độ điện tích của các đại phân tử proteoglycan mang điện tích âm phân bố
trong khối collagen. Sự gắn kết của proteoglycan ảnh hưởng đến trương lực
và sự chuyển động của pha lỏng khi bị nén ép. Chondrontin sulfate và
hyaluronic acid là thành phần cơ bản của proteoglycan chứa trong sụn
(http//Wikipedia.Cartilage). Trong cơ thể sống, các PG và GAG giữ vai trò
quan trọng trong nhiều quá trình khác nhau như: điều hòa hoạt động của
enzyme và sự bám dính, phát triển và di thực của tế bào (Lyon, 1998; Selleck,
2000; Turnbull, 2001). Phân tử (monomer) PG của mô sụn cùng với protein
gắn kết và acid hyaluronic tạo thành một phức hệ thuỷ động học có khả năng
nén thuận nghịch rất cần thiết cho sụn để chống lại sự ép nén với sự biến dạng
nhỏ nhất (Hascall, 1988).

15


1.6.2. Sụn cá nhám

Cá nhám thuộc bộ cá sụn cỡ lớn và vừa,
vừa sống ở biển. Thân thon dài,
dài mõm
nhọn, vây ngực rộng,, nằm dọc. Vây đuôi lớn, khỏe, hai thùy không bằng
nhau. Nhiều loài có giá trị kinh tế lớn,
lớn thường được khai thác lấy gan làm dầu
cá, vây làm cước cá, thịt để ăn,
ăn da làm hàng mỹ nghệ. Có nhiều họ
họ: cá nhám
búa (Sphyrnidae);cá
cá nhám xà (Carchariidae); cá nhám thu (Lamnidae); cá
nhám voi (Cetorhinidae
Cetorhinidae); cá nhám kình (Rhincodontidae). Ở biển Việt Nam,

Nam
người ta đã gặp nhiều loại cá nhám khác nhau.
nhau Các loài cá nhám thường được
lấy làm dầu cá, gan chiếm 10- 15% trọng lượng cơ thể, khoảng 50% dầu gan
cá nhám có hàm lượng vitamin A và D cao hơn dầu gan cá thu.
thu. Thịt cá nhám
chứa hàm
m lượng cao protit,
protit 1.9% lipit trong đó có 0.5% omega
omega-3. Sụn có độ
ẩm khoảng 6% thì chứa khoảng 40% protein, trong đó chủ yếu là
mucopolisacaridos (chondroitin
chondroitin, hyaluronic acid) và collagen.. Sụn cá nhám
chứa khoảng 6% canxi và 9% phospho.
( /> />