Tiểu luận CHẨN đoán BỆNH GIA súc GIA cầm CHẨN đoán VIRUS lở mồm LONG MÓNG (FMDV) BẰNG kỹ THUẬT GENE

Oct. 30

Chẩn đoán bệnh lở mồm long móng (FMD)

Trường Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh
Bộ môn Công Nghệ Sinh Học
Lớp DH06SH

P

Tiểu luận: CHẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC GIA CẦM

CHẨN ĐOÁN VIRUS LỞ MỒM LONG MÓNG
(FMDV) BẰNG KỸ THUẬT GENE

Nguyễn Thúy Kiều |
Oct. 30

Chẩn đoán bệnh lở mồm long móng (FMD)


ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh lở mồm long móng (Foot and Mouth Disease – FMD) hiện nay vẫn đang còn gây thiệt
hại kinh tế quan trọng ở nhiều nơi trên thế giới, mặc dù nó đã được thanh toán hoặc khống
chế thành công tại nhiều nước. Bệnh gây thành dịch ở nhiều loài động vật móng guốc chẵn,
chủ yếu là trâu, bò và lợn. Bệnh lở mồm long móng được biết đến như nạn đại dịch của các
đàn bò, cừu và lợn tại nhiều nước từ thế kỷ XIX. Bệnh có ở khắp thế giới. Cuối thế kỷ XIX,
đại dịch đã hoành hành ở hầu hết châu Âu, kéo dài hơn 10 năm không tắt, gây bệnh cho hàng
chục triệu bò, cừu. Nửa đầu những năm 50 của thế kỷ XX, lại có một vụ dịch mới kéo dài
gây thiệt hại lớn cho đàn gia súc ở nhiều nước thuộc châu Âu. ở châu Á và châu Phi, bệnh
cũng xảy ra trầm trọng như ở châu Âu, hầu hết các nước đã từng có bệnh. Điều làm đau đầu

các nhà dịch tễ học là tại nhiều nước và khu vực, sau nhiều năm liên tục tiêm phòng vacxin
cho đàn gia súc và áp dụng các biện pháp kiểm soát bệnh nghiêm ngặt, bệnh tưởng như đã
hoàn toàn biến mất, nay bỗng nhiên lại bùng phát dữ dội. Điển hình ở Đài Loan năm 1997 từ
nguồn dịch là vài con lợn mắc bệnh trên một chiếc thuyền buôn, trong vòng 2 tháng bệnh
nhanh chóng lan ra hàng ngàn trại chăn nuôi lợn, làm suy sụp nền kinh tế chăn nuôi, thiệt hại
khoảng 2 tỷ USD. Để chẩn đoán lở mồm long móng, đầu tiên căn cứ vào dấu hiệu lâm sàng
của bệnh. Tuy nhiên điều này có thể bị nhầm lẫn do những bệnh có triệu chứng tương tự. Ở
trâu, bò bệnh viêm miệng mụn nước (vesicular stomatitis, VS) rất giống bệnh lở mồm long
móng. Ở lợn, bệnh mụn nước ở lợn (swine vesicular disease, SVD) và bệnh mụn nước ban
đỏ (vesicular exanthema ò swine, VES) tuy khác căn nguyên nhưng có triệu chứng giống
nhau. Sự phát hiện sớm giai đoạn nhiễm bệnh và xác định đúng bệnh nếu có thể trước khi
xuất hiện các dấu hiệu lâm sàng là yếu tố chủ yếu cho sự khống chế bệnh hiệu quả, ngăn
chặn bệnh lây lan. Điều đó đòi hỏi phải có phương pháp chẩn đoán nhanh, đặc hiệu, chính
xác có thể cho kết quả trong vòng 24g. Hơn nữa, sự xác định kịp thời typ đặc hiệu của virus
thuộc địa và đặc

Nguyễn Thúy Kiều |
Oct. 30

Chẩn đoán bệnh lở mồm long móng (FMD)


tính phân tử của nó là rất cần thiết để thực hiện tiêm phòng khẩn cấp với kháng nguyên
tương ứng và để đánh dấu nguồn gốc ổ dịch. Vì thế chẩn đoán bằng kỹ thuật gene là
phương pháp đang được nghiên cứu và áp dụng để phát hiện kịp thời để đưa ra những
giải pháp xử lý hiệu quả.

I. TỔNG QUAN
1.1.

FMD (foot and mouth disease)

Lở mồm long móng (FMD) là bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm do virus gây ra.
Đây là bệnh được tổ chức dịch tể thế giới (Office International des Epizooties _ OIE) xếp
vào hàng đầu trong danh mục A gồm 15 bệnh truyền nhiễm nguy hiểm cho các loài móng
guốc chẵn: trâu, bò, dê, cừu, heo (Cục thú y, 1993). Năm 2001, một vụ dịch khác xảy ra
sau hơn 20 năm vắng bóng tại nước Anh, cũng gây thiệt hại cho ngành chăn nuôi và du
lịch khoảng 2 tỷ USD. Ở nước ta bệnh đầu tiên được phát hiện ở Nha Trang (1898) sau
đó lang ở cả ba miền. Năm 1995 có 26 tỉnh, thành có bệnh với hàng ngàn ổ dịch (19.883
trâu, bò và 10.293 heo bệnh, chết 384 trâu bò, 5208 heo _ cục thú y Việt Nam) đã gây tác
hại lớn đến nền kinh tế cho các trại chăn nuôi (giảm 25% sức sản xuất) và nền kinh tế
nước ta. Việt Nam là nước trong vùng Châu Á được báo cáo trên bản đồ dịch tể bệnh lở
mồm long móng thế giới là vùng dịch địa phương (endemic) (Gleeson, 2002). Dịch lở
mồm long móng đã xảy ra trên trâu bò liên tục suốt thời gian từ 1975-2005, trên lợn
1992-2005 và gây thiệt hại nặng nề nhất vào các năm 1993, 1995, 1999, 2000. Ngoài typ
O lưu hành trong nhiều năm qua, typ A cũng đã được phát hiện năm 2004 trên trâu bò và

Nguyễn Thúy Kiều |

Oct. 30

Chẩn đoán bệnh lở mồm long móng (FMD)

typ Asia 1 trên lợn năm 2005 ở Việt Nam. FMD là một bệnh địa phương và các type
huyết thanh phổ biến là O, Asia 1 và A. Các typ huyết thanh có sự phân bố khác nhau


trên thế giới. Typ huyết thanh O, A được nhận biết ở nhiều vùng khác nhau trên thế giới.
Trái lại các type huyết thanh SAT1, SAT2, SAT3 được giới hạn ở một số nước thuộc
châu Phi. Typ huyết thanh Asia 1 được tìm thấy ở nhiều nước thuộc châu Á. Riêng typ

huyết thanh C chỉ còn tồn tại một vài nước như Philippine. Trong các ổ dịch, động vật có
thể mắc bệnh do một hoặc cùng một lúc nhiều typ huyết thanh. Sự biến đổi của các typ
huyết thanh cũng khá phức tạp, đôi khi còn những điều chưa được hiểu biết rõ. Các
chủng virus lở mồm long móng biến đổi rất nhiều và do sự phân bố rộng rãi, phức tạp
của chúng nên thường gặp rất nhiều khó khăn trong việc xác định nguồn gốc lây lan của
chúng. Chỉ riêng typ O người ta đã các định được 8 nhóm với kiểu di truyền sai khác
nhau từ 15% trở lên khi so sánh trình tự gene VP1. Virus lở mồm long móng typ A là
nhóm có tính đa dạng kháng nguyên cao nhất, typ A có đến 32 subtype. Và hiện nay
người ta cũng chưa thống nhất được với nhau về số lượng kiểu di truyền của virus typ A
khi giải trình tự gene VP1. Với virus typ C việc giải trình tự gene VP1 cho phép phân
chúng thành 8 nhóm di truyền. Typ virus Asia 1 có sự đa dạng di truyền ít nhất, chúng
chỉ có 1 nhóm di truyền. Theo kết quả giải trình tự gene VP1 các typ SAT1 có 3 nhóm,
SAT2 có 2 nhóm, SAT3 có 3 nhóm di truyền và phân bố theo khu vực địa lý rõ ràng. Ở
Việt Nam đã xác định có typ O, A, và Asia 1 ở trâu, bò và typ A, O ở heo.

Triệu chứng bệnh tích
™ Triệu chứng
1.2.

Ở trâu bò và lợn hoặc các loài vật khác, bệnh có chung đặc điểm là sốt đột ngột 2-3 ngày,

viêm dạng mụn nước rồi lở loét ở miệng, vú, vùng móng chân, nước bọt chảy nhiều như

Nguyễn Thúy Kiều |

Oct. 30

Chẩn đoán bệnh lở mồm long móng (FMD)

bọt bia. Niêm mạc miệng, môi, lợi, chân răng đỏ ửng, khô, nóng. Mụn nước bắt đầu mọc

ở bên trong má, mép, chân răng, môi, lợi, và bề mặt lưỡi. Kích thước mụn bằng hạt gạo,
hạt ngô hoặc to hơn. Mụn nước phồng lên, có màng bọc mỏng, bên trong chứa nước
trong, sau đục dần. Sau 1-2 ngày, mụn nước bị vỡ, lớp niêm mạc tróc ra để lộ mặt dưới
đỏ, chạm nhẹ vào dễ chảy máu. Mụn nước thường không có mủ. Do viêm vùng miệng,


con vật có chịu, luôn lúc lắc đầu, nhai tóp tép, nước bọt sùi ra đầy mõm miệng, chảy lòng
thòng thành sợi dài.
Do có viêm mụn nước ở vùng vành móng, kẽ móng chân làm con vật khó chịu, tỏ ra đau
đớn, bồn chồn, luôn nhấc chân lên. Dễ thấy nhất là hiện tượng què, không đi cày kéo
được trong khoảng 1-2 tuần. Có trường hợp móng chân bị long hẳn ra, phổ biến nhất là
ở lợn. Triệu chứng què ở cả đàn trâu bò gây ảnh hưởng xấu đối với vùng dựa vào sức
kéo của chúng, làm lỡ thời vụ gieo trồng, có nơi năng suất lúa bị giảm 20%.
ở con vật cái đang nuôi con, triệu chứng và bệnh tích ở bầu vú, núm vú cũng tương tự
như ở miệng và chân làm con vật giảm tiết sữa, sữa bị giảm phẩm chất. Con mẹ thường
không cho con bú vì đau, làm con non thiếu sữa. Hơn nữa chính con non cũng bị viêm
lở mồm như mẹ nên không bú được. Hậu quả có tới 50-80% gia súc non bị chết. Ở con
vật trưởng thành, tỷ lệ mắc bệnh trong đàn có serotyp đều gây bệnh giống nhau.
Súc vật cái mang thai nhiễm virus lở mồm long móng sẽ sẩy thai.
Biến chứng: Viên cơ tim ở súc vật non và viêm ruột (bê non, lợn <-2 tháng).

Nguyễn Thúy Kiều |
Oct. 30

Chẩn đoán bệnh lở mồm long móng (FMD)


.

Hình: Triệu chứng FMD ở trâu, bò và heo

™ Bệnh tích

Nguyễn Thúy Kiều |

6


Oct. 30

Chẩn đoán bệnh lở mồm long móng (FMD)

Từ miệng tới thực quản, dạ dày, ruột đều có mụn loét với từng mảng xuất huyết hoặc tụ
máu. Bộ máy hô hấp cũng bị viêm.
Ở trâu bò hay gặp hiện tượng mặt ngoài cơ tim có những vệt hoại tử màu trắng xen kẽ
trông giống như da hổ nên gọi là “tim vằn hổ”.
Bệnh lở mồm long móng ở người: Lây nhiễm bệnh lở mồm long móng ở người khá hiếm
và nhẹ. Đôi khi gặp ở người hay tiếp xúc với gia súc có bệnh hoặc với virus trong phòng
thí nghiệm như người chăn nuôi, chăm sóc gia súc, cán bộ thú y, công nhân lò mổ, nhân
viên phòng thí nghiệm. Đôi khi do uống sữa nhiễm mầm bệnh không tiệt trùng kỹ, hoặc
qua vết trầy xước trên da. Biểu hiện là có mụn nước nổi trên da ở tay, chân và lưỡi, lợi,
có cảm giác ngứa ngáy và hơi nóng rát. Mụn nước có thể tự vỡ ra hoặc xẹp đi sau
1.3. Đường lây truyền và thời gian lây truyền
™ Đường lây bệnh
Quan trọng là nhiễm virus có trong nước bọt, nước mũi dưới dạng khí dung. Gia súc hít
phải virus có khi từ khoảng cách hàng chục km nếu thuận chiều gió thổi, có khi tới 250
km. Điều này giải thích sự lây lan bệnh mạnh và nhanh chóng trong thời gian ngắn trên
phạm vi nhiều huyện, tỉnh, thậm chí giữa các quốc gia. Sự lây truyền trực tiếp cũng xảy
ra hoặc gián tiếp qua thức ăn, nước uống, bãi chăn, đồng cỏ, dụng cụ, quần áo, tay chân
bị nhiễm trùng. ở đây, con người là yếu tố quan trọng làm lây lan bệnh, nhất là khi đưa
gia súc có bệnh hoặc các sản phẩm của chúng đến nơi khác. Bệnh có thể truyền qua

bào thai.
™ Thời kỳ ủ bệnh
Từ 1 – 7 ngày, trung bình 3 – 4 ngày. Trong suốt thời gian từ khi có các triệu chứng đầu
tiên đến khi khỏi bệnh. Nhiều trâu bò sau khi khỏi bệnh vẫn còn mang trùng và thải trùng
hàng tháng, có trường hợp tới 3 năm. Lợn có vai trò thải trùng rất lớn, gấp nhiều lần trâu

Nguyễn Thúy Kiều |
Oct. 30

Chẩn đoán bệnh lở mồm long móng (FMD)


bò khi đang có triệu chứng, nhưng sau khi khỏi lâm sàng, lợn vẫn thải virut sau 1-2
tháng, trâu bò sau khỏi lâm sàng vẫn thải virut 6-24 tháng. Đây là đặc điểm quan trọng
trong quá trình phòng chống bệnh ở gia súc. Sức đề kháng của mầm bệnh với điều kiện
tự nhiên và thuốc sát trùng.

II. NỘI DUNG
2.1.

Giới thiệu về virus gây lở mồng long móng (FMDV)

Do virus Apthovirus gây ra. Aphthovirus thuộc giống Picornaviridae. Có 7 type huyết thanh
gồm: A, O, C, SAT1, SAT2, SAT3 và Asia 1 gây bệnh có triệu chứng giống nhau nhưng
không gây miễn dịch chéo. Các typ O1, O2, O3 …, A1, A2, A3, C1, C2, C3 … căn cứ vào
sự khác biệt về gen và cấu trúc kháng nguyên. Cấu trúc của FMDV (foot and mouth disease
virus) là cấu trúc đối xứng khối 20 mặt, gồm 1 sợi RNA mạch đơn chứa 8500 nucleotide
được đóng gói trong một vỏ protein được tạo thành từ 60 capsome, không vỏ bọc. Mỗi
capsomer gồm 4 loại polypeptide VP (virus protein) ký hiệu VP1(1D), VP2 (1C), VP3 (1B),
VP4 (1A). 4 loại VP này đều có nguồn gốc từ VP0, VP1 ở lớp ngoài cùng, là yếu tố cấu

trúc, tham gia quá trình cố định virus trên màng tế bào, có tính sinh miễn dịch chủ yếu.
Người ta đã ứng dụng phát hiện này để điều chế vacxin cho hiệu quả cao với VP1 (dẫn liệu
của Lê Anh Phụng, 1996; Trần Thanh Phong, 1996). Do có đặc điểm của các virus sợi đơn
(+) RNA, virus có tính biến dị và truyền nhiễm mạnh.
Bộ gene gồm vùng không giải mã (UTR: untranslated region) dài 1200base ở đầu 5’
(5’UTR) (có vai trò quan trọng trong việc giải mã, độc lực, hình thành capsid), vùng này ch
ứa một cấu trúc thứ cấp có thể xoay (clover-leaf secondary structure), và được biết như là vị
trí để tiến vào bên trong ribosome (IRES: international ribosome entry site) và đầu 3’
(3’UTR). Phần giải mã protein cấu trúc (1ABCD) và phần giải mã protein không cấu trúc
(2ABC và 3ABCD). Chỉ thị phần tử sử dụng nhiều nhất trong định typ và nghiên cứu phả hệ
virus lở mồm long móng là 5’UTR và VP1. Cả hai đầu của bộ gene có thể được

Nguyễn Thúy Kiều |

Oct. 30

Chẩn đoán bệnh lở mồm long móng (FMD)


thay đổi, đầu 5’ tận cùng bở i VPg (genome-linked protein) (khoảng 23 acid amin), đầu
3’ bởi chuổi dài adenyl (King, 2000).
5' UTR L VP4 VP2VP3VP12A2B2C3A3B1 3B2 3B3 3C3D3' UTR

Hình: genome FMDV

VP1: xanh dương

VP2: xanh lá cây
VP3: đỏ

Toàn bộ genome của FMDV mã hóa cho một protein đơn. Sau khi dịch mã, protein này
phân cắ thành 4 sản phẩm sơ cấp: Amino terminal L protease, phân cắt ở đầu cuối
carboxyl , P1-2A, tiền chất của protein vỏ, sẽ trải qua giai đoạn polyprotein sau dịch mã
với sự tham gia của các protease virus để tạo thành 1 protomer. Hạt virus hình thành từ
từng đơn vị protomer (hay đơn vị capsid). Từ đơn vị căn bản này, 5 protomer hợp thành
1
VP4: vàng

Nguyễn Thúy Kiều |

Oct. 30

Chẩn đoán bệnh lở mồm long móng (FMD)


pentamer, 12 pentamer liên kết nhau theo cấu trúc khối đối xứng gồm 3 trục
để hình thành 1 sợi RNA, đó là 1 virus.

Hình: Cấu trúc của
FMDV. Có 3 loại protein
bề mặt là VP1, VP2,
VP3. Mỗi protein hiện
diện với dạng hình thang
trên bề mặt. Ba loại
protein này nhóm lại tạo
thành 1 đơn vị cấu trúc
được chỉ ở bên trái.

Nguyễn Thúy Kiều |
Oct. 30

Chẩn đoán bệnh lở mồm long móng (FMD)


Vỏ protein ngoài của virus
được tạo thành từ 60 bản copy
của mỗi loại protein 1A (VP4),
1B (VP2), 1C (VP3), và 1D
(VP1). 4 loại protein này lắp
ráp thành một đơn vị thay thế
protein (protein sub-unit) hay
một protomer. 5 protomer kết
hợp thành 1 pentamer. 12
pentamer đóng gói vào sợi
RNA và tạo thành hạt virus.
Hình: cấu trúc FMDV

Nguyễn Thúy Kiều |
Oct. 30

Chẩn đoán bệnh lở mồm long móng (FMD)


Thành phần hệ gene của virus luôn biến đổi ngay cả trong một serotyp, các chủng phân
lập ở các vùng địa lý khác nhau có mức độ tương đồng về thành phần nucleotide và acid
amin cũng khác nhau (Feng và ctv, 2004).
™ Sức đề kháng
Tương đối mạnh, chịu lạnh, chịu khô đến 14 ngày (mùa hè), 6 tháng (mùa đông). Trong
đất từ 3-28 ngày. Trong nước tiểu virus tồn tại 39 ngày. Virus bền vững ở pH 7,2 và 7,6
0

nhưng rất mẫn cảm với pH <4 và pH >11. Ở 4 C virus có thể sống sót 1 năm, nhưng khi
0
0
nhiệt độ tăng lên thì thời gian sống sót còn 8-10 tuần ở 28 C, 10 ngày ở 37 C và ít hơn 30
0
0
0
phút ở 50 C. Đun nóng 70 C, chết sau 15 phút, 100 C chết ngay. Trong tủ lạnh sống được
425 ngày, trong cỏ khô sống được 8-15 tuần. Trong đất ẩm virut sống hàng năm. Xút 1%

Nguyễn Thúy Kiều |
Oct. 30

Chẩn đoán bệnh lở mồm long móng (FMD)

diệt virus sau 10 phút, Formol 2% - 6 giờ.
Virus trong không khí còn sống tốt nhất ở ẩm độ tương đối RH > 60%.
2.2.

Các phương pháp chẩn đoán

Các kỹ thuật phân tích khác nhau đã được sử dụng để phát hiện acid nucleic của virus,
kháng nguyên và sự đáp ứng miễn dịch của vật chủ gồm: kết hợp bổ thể (complement


fixation test_CFT), trung hòa virus (virus neutralization), ELISA (enzyme_linked
immunosorbent assay), RT_PCR (reverse transcriptase polymerase chain reaction),
xác định trình tự chuổi acid nucleic (nucleic acid sequence_based amplification,
NASBA) (Anonymous, 2000; Collins và ctv, 2002; Feng và ctv, 2003).
™ Kết hợp bổ thể: dùng kháng thể chuẩn để phát hiện serotype virus O, A, C trong

bệnh phẩm. Phản ứng nhanh chỉ trong 12 giờ, đơn giản giúp khẳng định hoặc loại
trừ nghi ngờ bệnh lở mồm long móng (FMD). Phản ứng này cũng đã được hoàn
thiện và nếu sử dụng thành thục sẽ là một phương pháp hữu hiệu để chẩn đoán
phân biệt giữa virus lở mồm long móng và các virus gây viêm mụn nước khác.
™ Trung hòa virus: phát hiện qua xét nghiệm mẫu bằng phản ứng trung hòa virus
dựa trên khả năng bắt cặp đặc hiệu của kháng thể kháng virus (nếu có) trong mẫu
bệnh phẩm với virus lở mồm long móng. Đây là phản ứng được dùng làm thí
nghiệm kiểm chứng do có tính đặc hiệu cao nhưng phản ứng này không phân biệt
được kháng thể có được là do tiêm phòng hay nhiễm bệnh. Phương pháp này sử
dụng dòng tế bào mẫn cảm BHK-21, hoặc tế bào sơ cấp của thận heo, cừu. Kháng
thể trung hòa được phát hiện sau 4-5 ngày bệnh.
™ ELISA: được dùng phát hiện kháng nguyên và kháng thể virus trong vòng 3-4
giờ, không phụ thuộc môi trường mô, đặc hiệu nhanh, ít (+) tính giả. Hiện bộ kit
chẩn đoán đang được sử dụng tại Việt Nam gồm bộ kháng thể chuẩn để phát hiện
4

Nguyễn Thúy Kiều |
Oct. 30

Chẩn đoán bệnh lở mồm long móng (FMD)

serotyp kháng nguyên O, A, C, Asia 1, và bộ kháng nguyên chuẩn để chẩn đoán 3
serotyp O, A, C. Phương pháp này chẩn đoán nhanh, đặc hiệu và độ nhạy cao,
được dùng trong giám định serotype của virus, thay thế phương pháp kết hợp bổ
thể. Có thể đây là 1 kỹ thuật huyết thanh học nhạy nhất với mục đích chẩn đoán
và xác định typ.
Cả hai phương pháp trung hòa virus và ELISA cạnh tranh trong pha lỏng đều phát hiện
kháng thể kháng protein cấu trúc, protein vỏ của virus nhưng không phân biệt được đó là
kháng thể của động vật đã tiêm vacxin hay do nhiễm virus.

Virus lở mồm long móng (FMDV) khi xâm nhiễm vào tế bào vật chủ sẽ dịch mã để tạo
nên các protein cấu trúc và protein không cấu trúc. Các protein không cấu trúc liên quan
đến hoạt động của virus và biến đổi chức năng tế bào vật chủ. Một số protein không cấu
trúc gây đáp ứng miễn dịch và tạo ra các kháng thể đặc hiệu với chúng. Vacxin chỉ chứa
hạt virus tinh sạch với dung dịch đệm và chất bổ trợ nên đáp ứng miễn dịch với vacxin
chỉ tạo ra kháng thể kháng protein cấu trúc của virus. Trong trường hợp vacxin không
tinh sạch bị nhiễm protein không cấu trúc, cũng xảy ra một đáp ứng miễn dịch yếu và
ngắn ngủi đối với loại protein này, vì hàm lượng chúng rất thấp. Do đó nếu phát hiện
kháng thể kháng protein không cấu trúc ta có thể kết luận con vật bị nhiễm virus lở mồm
long móng (FMDV) chứ không phải do vacxin.
Một số protein không cấu trúc của virus gây đáp ứng miễn dịch: 3D, 3A/3AB/3ABC, 2C,
pro
2B, 3C và L . Trong thời gian gần đây một số protein không cấu trúc 2C, 3B, 3AB,
3ABC đã được nghiên cứu và nhiều phương pháp có độ nhạy cao đã được phát triển.
™ RT_PCR: để xác định gia súc nhiễm bệnh đồng thời xác định typ virus gây bệnh

FMD dai dẳng ở thực địa thì kỹ thuật PCR rất nhạy, nhanh, chính xác, hiệu quả sẽ

Nguyễn Thúy Kiều |

Oct. 30

Chẩn đoán bệnh lở mồm long móng (FMD)

cần thiết và được xem như là phương pháp bổ sung hay thay thế cho phương
pháp huyết thanh học.
Phương pháp kết hợp bổ thể, phương pháp ELISA mới chỉ dừng lại ở việc trả lời câu
hỏi type gây bệnh thuộc loại gì. Phương pháp RT- PCR không dừng lại ở đó, chúng còn

có thể phân biệt được sự khác biệt biến chủng có trong bệnh phẩm đã xác định có cùng
một type huyết thanh, thông qua việc định chuỗi các sản phẩm PCR và so sánh trình tự
đoạn DNA với các trình tự DNA khác của virus lở mồm long móng được chứa sẵn
trong ngân hàng dữ liệu gen.
9 Ưu

điểm của RT-PCR


Những mẫu huyết thanh dương tính từ mẫu máu thu nhận có biểu hiện lâm sàn đối với
virus thì không đủ cơ sở cho việc chẩn đoán virus. Có thể đó chính là sự hiện diện của
kháng thể mẹ truyền cho con. Vì thế việc dùng kỹ thuật PCR để xác định chính xác sự
hiện diện của FMDV. Dùng kỹ thuật PCR không cần phân lập virus trong môi trường
nuôi cấy tế bào. Vì thế PCR sẽ tốn ít thời gian để phát hiện hơn so với phương pháp
nuôi cấy tế bào. PCR còn được coi là phương pháp có độ nhạy và độ đặc hiệu cao.
Thông thường thời gian chẩn đoán bệnh phải mất trên 10 giờ đồng hồ đối với kỹ thuật
soi bằng mắt, 5- 6 giờ đối với kỹ thuật ELISA (kỹ thuật này độ nhạy còn kém và chi phí
khá cao). Áp dụng kỹ thuật RT- PCR vào chẩn đoán thời gian đã được rút ngắn xuống
còn 4-5 giờ với độ chính xác cao, an toàn. TS Tô Long Thành cho biết: "Bình thường để
biết con vật có mắc bệnh hay không, chúng ta phải đợi đến khi chúng phát bệnh ra ngoài
với các hiện tượng chảy nước bọt ở mồm, mũi hay nứt toác móng chân. Kỹ thuật RTPCR cho phép phát hiện bệnh ngay trong giai đoạn đầu tiên".

Nguyễn Thúy Kiều |
Oct. 30

Chẩn đoán bệnh lở mồm long móng (FMD)

Sở dĩ RT- PCR nhận biết được bệnh nhanh như vậy vì nhờ việc kết hợp PCR với cặp mồi
1F/1R khả năng xác định các type O, A, C và ASIA- 1 gây bệnh của virus lở mồm long
móng diễn ra rất nhanh. Theo TS. Tô Long Thành, khi tiến hành dùng RT- PCR nhất

thiết phải làm trên 14 mẫu RNA vào cùng một thời điểm. Từ đây, chúng ta tiến hành theo
dõi các thay đổi của bệnh lý trên phác đồ điều trị. Trong thời gian này chỉ cần một trong
số các mẫu có sự thay đổi lên, xuống bất thường là chúng ta đã có thể xác định được
nguồn bệnh.
2.3. Chẩn đoán bằng RT-PCR
2.3.1. Nguyên tắc
PCR là kỹ thuật invitro dùng để khuếch đại một trình tự DNA dựa trên nguyên tắc
của một phản ứng sinh hóa nhờ hoạt động của enzyme polymerase.


Về nguyên tắc, bước đầu tiên của phản ứng RT-PCR là quá trình phiên mã ngược từ
khuôn mẫu mRNA để tạo ra sợi đơn cDNA. Một primer oligodeoxynucleotide sẽ gắn
vào mRNA và sau đó chúng sẽ được kéo dài nhờ một enzyme phiên mã ngược có hoạt
tính polymerase để tạo thành bản sao cDNA, bản sao này sau đó sẽ được khuếch đại nhờ
vào phản ứng PCR ở bước thứ hai.
2.3.2. Nguyên liệu
DNA quan tâm, enzyme tổng hợp DNA chịu nhiệt, 2 đoạn mồi nucleotide, 4 loại dNTP,
2+

dung dịch đệm cho phản ứng, Mg .
™ Các enzyme sử dụng cho phiên mã ngược
Sự phát hiện enzyme phiên mã ngược năm 1970.

Nguyễn Thúy Kiều |

Oct. 30

Chẩn đoán bệnh lở mồm long móng (FMD)

Nay, có ba loại enzyme phiên mã ngược được sử dụng để tổng hợp cDNA invitro tương

ứng với RNA mẫu.
9

Enzyme phiên mã ngược của avian mycloblastosis virus (AMV) và dòng Moloney
của virus murine leukemia (Mo-MLV).

Cả hai loại enzyme này đều đòi hỏi primer sử dụng cho quá trình phiên mã ngược phải có
nhóm 3’OH. Loại enzyme này không có hoạt tính 3’-5’ enxonuclease. Khi sử dụng loại
này thì đòi hỏi nồng độ dNTP cao.
•

•

Enzyme được mã hóa AMV có hoạt tính RNase nên có thể cắt nửa phần của RNADNA và có thể dính chặt vào đầu 3’ của sợi DNA nếu phản ứng phiên mã ngược
bị dừng lại trong quá trình tổng hợp (dẫn liệu từ Rotawicz và cộng sự,1988). Vì sự
hoạt động ở mức độ cao của RNase H cùng với việc phiên mã ngược có xu hướng
ngăn chặn việc tạo ra cDNA và giảm chiều dài của nó.
Enzyme murine phù hợp cho rt-PCR hơn vì hoạt tính RNase của nó yếu hơn.
0
Tuy nhiên, Mo-MLV sẽ hoạt động tối ưu ở điều kiện nhiệt độ thấp (37 C) hơn so


0

với emzyme AMV (42 C), chính đặc điểm này làm cho Mo-MLV không thuận
lợi trong các phản ứng mà RNA có nhiều cấu trúc bậc hai.
Những dạng biến thể của enzyme phiên mã ngược Mo-MLV không có hoạt tính
RNase.
9 Đối với mẫu RNA khó phiên mã ngược do cấu trúc thứ cấp, ta có thể sử dụng nhiệt
độ cao để biến tính trước, nhưng các reverse transcriptase thông thường chỉ

0

hoạt động ở 37-42 C. Trong những trường hợp này phải sử dụng reverse
TM
0
transcriptase chịu nhiệt thermoscript RT hoạt động ở 42-65 C.
™ Các primer trong phiên mã ngược

Nguyễn Thúy Kiều |
Oct. 30

Chẩn đoán bệnh lở mồm long móng (FMD)

Mồi là những trình tự oligonucleotide có khả năng bắt cặp chuyên biệt với đầu 5’ hay đầu
3’ của đoạn DNA cần khuếch đại. Mồi là yếu tố quan trọng quyết định tính đặc hiệu của
phản ứng PCR. Mồi cũng đóng vai trò khởi động hoạt động của DNA polymerase khi đã
ở trạng thái bắt cặp ở đầu 3’ (Mc Pherson và Moller, 2000). Có 3 loại mồi
Mồi chuyên biệt (gene specific primer_GSP): có thể giúp giảm hiện tượng bắt cặp
không chuyên biệt và tăng hiệu suất tổng hợp DNA bổ sung. Mồi chuyên biệt gene
được thiết kế giống mồi ngược antisense của PCR. Để phân biệt sản phẩm khuếch
đại từ cDNA hay từ DNA bộ gene, mồi chuyên biệt nên được thiết kế nằm trong
đoạn exon, khi đó sản phẩm PCR từ cDNA sẽ ngắn hơn sản phẩm khuếch đại từ
DNA bộ gene nhiễm vào. Primer này sẽ lai lên các vị trí có chọn lọc trên một trình
tự đặc biệt của mRNA. Tuy nhiên khi sử dụng primer làm mồi cho quá trình phiên
mã ngược thì cặp primer sử dụng cho phản ứng PCR sau đó cần được thiết kế sao
cho primer trên sợi antisense sẽ bắt cặp ở phía trên đối với vị trí của
oligonucleotide sử dụng làm primer cho tổng hợp cDNA.
9 Oligo T (dT): thiết kế dựa vào đặc tính của mRNA là thường tồn tại đuôi polyA
tận cùng ở đầu 3’. Primer sẽ bắt cặp với đuôi polyA ở đầu 3’ của hầu hết mRNA
của tế bào động vật. Vì đuôi polyA chỉ chiếm 1-2% RNA tổng số nên hàm lượng

9


và độ phức tạp của các sản phẩm cDNA không đáng kể như khi sử dụng mồi
ngẫu nhiên.
9 Mồi ngẫu nhiên (Random hexanucleotide): sử dụng khi mRNA đích có kích
thước lớn hay có quá nhiều cấu trúc bậc hai. Khi đó việc tổng hợp cDNA không
thể thực hiện một cách hiệu quả bằng sử dụng mồi oligo dT hay oligonucleotide
antisense (Lee và Caskey, 1990). Tuy nhiên mồi này có tính chuyên biệt thấp vì
nó bắt cặp ngẫu nhiên với nhiều vị trí trên RNA khuôn mẫu và nó tạo ra các
cDNA ngắn, từng phần.

Nguyễn Thúy Kiều |

Oct. 30

Chẩn đoán bệnh lở mồm long móng (FMD)

Trong đa số các trường hợp sử dụng RT_PCR những primer chuyên biệt được thiết kế
để gắn kết vào vùng 3’ không dịch mã của mRNA đích là những primer được ưu tiên
chọn lựa. Primer oligo dT là lựa chọn tốt nhất kế sau và random hexamer là lựa chọn
cuối vì không đặc hiệu và tạo ra cDNA có kích thước không đều, chúng thường được sử
dụng khi các primer trước sử dụng không thành công.
™ DNA polymerase: kéo dài mạch mới bổ sung với mạch khuôn từ mồi khởi động.

Tth polymerase chịu nhiệt được tách chiết từ một loại vi khuẩn chịu nhiệt Thermus
aquaticus, không bị biến tính ở nhiệt độ cao, có khả năng xúc tác sự tổng hợp từ
đầu đến cuối quá trình phản ứng (Mc Pherson và Moller, 2000).
2+

2+

™ Mg : nồng độ Mg

là thông số quan trọng trong phản ứng RT-PCR và PCR nó
xác định dựa trên lượng RNA tổng số và loại reverse transcriptase sử dụng. Nếu
2+
2+
M-MLV RT, nên dùng 3mM Mg cho 1µg RNA tổng số và dùng 5mM Mg
2+
cho 1-5µg RNA tổng số. Nếu dùng AMV RT, nồng độ Mg tối ưu là 8mM. Nếu
2+
nồng độ Mg thấp sẽ ứu chế hoạt động enzyme nên làm giảm hiệu quả kéo dài
2+
mạch. Nếu nồng độ quá cao thì Mg sẽ ức chế sự biến tính hoàn toàn sản phẩm
trong mỗi chu kỳ, làm giảm số lượng bản sao của sản phẩm cuối cùng. Dư thừa
2+
Mg dẫn đến bắt cặp sai của mồi với DNA mẫu nên sẽ khuếch đại không chuyên
biệt cho sản phẩm không đặc hiệu và làm giảm độ chính xác của phản ứng PCR.
2+
Nồng độ Mg tối ưu phải được xác định cho từng loại phản ứng qua nhiều thử
nghiệm (Mc Pherson và Moller, 2000).


o

™ Nhiệt độ bắt cặp: t quá cao thì không xảy ra sự bắt cặp, nếu thấp thì sẽ gia tăng

sự bắt cặp không đặc hiệu và tạo ra các dimer của mồi. Nhiệt độ bắt cặp thường là
0

55-70 C. Cách tính nhiệt độ bắt cặp thông qua Tm (là nhiệt độ mà ở đó việc lai bắt
cặp đúng phân ly).
Tm =4* (G + C) + 2* (A + T)

Nguyễn Thúy Kiều |
Oct. 30

Chẩn đoán bệnh lở mồm long móng (FMD)

G + C: số nucleotide G và C trong trình tự primer.
A + T: số nucleotide A và T trong trình tự primer.

Tm = 81,5 + 16,6 (log10[Na+]) + 0,41 (%G +%C) – 675/n
+

+

+

Với n: số base có trong mồi, [Na ]: nồng độ muối Na hay K .
0

0

Dãy nhiệt độ cần khảo sát bắt đầu từ nhiệt độ nhỏ hơn Tm 5 C và tăng dần thêm 2 C
(Mc Pherson và Moller, 2000).
2.3.3. Các bước thực hiện PCR
0

•

Giai đoạn 1: biến tính (denateration), nhiệt độ 94-95 C trong 30-60s.

•

Giai đoạn 2: bắt cặp (annealation), nhiệt độ 40-70 C.
0
Giai đoạn 3: kéo dài (elongation), nhiệt độ 72 C trong 1-2 phút.

•

0

Một phản ứng PCR bình thường không vượt quá 40 chu kỳ là tốt nhất. Trong phản ứng
PCR, sản phẩm được tạo ra theo cấp số nhân trên cơ sở những sản phẩm ban đầu nên nếu số
chu kỳ khuếch đại quá lớn sẽ làm cho sản phẩm càng bị sai lệch so với sản phẩm ban
đầu.

2.3.4. Quy trình chẩn đoán
™ Lấy mẫu


Mẫu huyết thanh, bệnh phẩm, dịch mụn nước thu nhận từ heo/bò trâu có biểu hiện lâm
sàn nghi nhiễm virus (hay những mẫu có phản ứng ELISA dương tính với kháng thể
kháng virus).
™ Xử lý mẫu:

Nguyễn Thúy Kiều |
Oct. 30

Chẩn đoán bệnh lở mồm long móng (FMD)

Mẫu bệnh phẩm: cho vào nghiền với cát vô trùng hay mảnh thủy tinh và sau đó
cho nước muối sinh lý vào tạo huyễn dịch 10-20%, cho vào tủ lạnh rồi rã đông
(làm nhiều lần để tách tế bào). Sau đó lọc lấy nước trong cho vào ống khác và
cho thêm 2 loại kháng sinh penicillin và streptomycin để trong 30 phút-1 giờ. Lọc
qua lọc đường kính 0,2µm rồi đưa vào môi trường nuôi cây tế bào (môi trường
Baby Hamster Kidney_BHK 21)
9 Mẫu huyết thanh: Lọc qua lọc đường kính 0,2µm rồi đưa vào môi trường nuôi
cây tế bào. (môi trường Baby Hamster Kidney_BHK 21).
9 Thu hoạch virus.
9 Thêm 200 μl mẫu vào 1ml thuốc thử TRIzol® cho vào 1 ống vô trùng. Trữ ở –
70°C cho đến khi li trích RNA.
™ Chẩn đoán RT-PCR:
9

Quy trình được sử dụng tại OIE Reference Laboratory at Pirbright. Chẩn đoán bằng RTPCR gồm 3 quá trình kế tiếp nhau.
Li trích RNA từ mẫu kiểm tra và mẫu đối chứng.
• Tạo cDNA từ RNA đã li trích, khuếch đại bằng PCR.
• Phát hiện sản phẩm PCR bằng điện di trên gel agarose.
9 Li trích RNA
- Chuyển 1ml dung dịch vào ống vô trùng chứa 200 μl chloroform. Trộn hỗn hợp
trong 10-15 giây và giữ ở nhiệt độ phòng trong 3 phút.
- Li tâm 15 phút , 200000 vòng.
- Chuyển 500 μl pha lỏng vào 1 ống vô trùng chứa 1 μl glycogen (20 mg/ml) và
thêm 500 μl iso-propyl-alcohol (propan-2-ol). Trộn hỗn hợp trong vài giây.
- Giữ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút, sau đó đem li tâm trong 10 phút, 20000 vòng.
•

-

Loại bỏ phần lỏng nổi ở trên và thêm 1ml ethanol 70%. Trộn hỗn hợp trong vài
giây.

Nguyễn Thúy Kiều |
Oct. 30

Chẩn đoán bệnh lở mồm long móng (FMD)

-

Li tâm 10 phút, 20000 vòng.
Cẩn thận di chuyển phần lỏng nổi phía trên ra và không làm mất kết tủa ở đáy
của ống.
Để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng trong 2-3 phút.
Tạo dịch huyền phù bằng cách thêm 20 μl nước cất không chứa enzyme phân
giải acid nucleic (Nuclease-free water).
Giữ mẫu RNA đã được li trích trong đá nếu phản ứng RT được thực hiện hoặc
trữ ở -70°C.

Có thể dùng bộ kit chuyên dùng hoặc các TRIzol để ly trích mẫu. RNA tổng số được
trích với thuốc thử TRIzol® từ những tế bào nhiễm virus nổi trên bề mặt (trong môi
trường BHK-21) theo sự hướng dẫn của nhà sản xuất. Miếng gạc họng, mũi được
thấm với 1ml PBS (phosphate-buffered saline) trước khi ly trích RNA. Mẫu huyết
thanh đượ c li trích mà không cần bất kì thao tác b ằng tay nào. Như một sự lự a chọn,
pha loãng 10 lần trong PBS của những chất đồng chất từ những mô, cơ quan phân
tích được li trích.
9 Thiết kế primer
• Cặp primer FM1F-FM1R có thể sử dụng để nhân vùng gene không mã hóa 5’UTR

từ khuôn RNA của các chủng O, A, C, Asia 1, cho sản phẩm cDNA có độ dài 323328nucleotide, có độ dài biến động theo từng chủng/typ.
Trình tự primer 1(FM1F): 5’-GCCTG-GTCTT-TCCAG-GTCT-3’ (positive strand)
Trình tự primer 2 (FM1R): 5’-CCAGT-CCCCT-TCTCA-GATC-3’ (negative strand)
Thông số của chu trình: 94°C for 5 minutes (1 cycle); 94°C for 1 minute, 55°C for
1 minute, 72°C for 2 minutes (30 cycles); 72°C for 7 minutes (1 cycle).


Nguyễn Thúy Kiều |
Oct. 30

Chẩn đoán bệnh lở mồm long móng (FMD)

Hình : Sản phẩm PCR từ sự khuếch đại của FMDV từ những động vật được lây nhiễm
khi sử dụng cặp mồi FM1F-FM1R. Lane M: DNA size maker; lane 1: chuẩn âm; lane 2:
chuẩn dương; lane 3: FMDV serotype A; lane 4: FMDV serotype O; lane 5: FMDV
serotype C.
•

Thiết kế primer có khả năng khuếch đại những đoạn gene mã hóa 1D (VP1) của
virus FMD liên quan đến các chủng O, A, C, Asia. Đoạn primer sense (+) của
virus được thiết kế có trình tự giống đoạn 1C (VP3) của virus. Khi thiết kế đoạn
primer antisense (-) NK61 phải dựa vào trình tự của đoạn gene 2B của chủng O,

Nguyễn Thúy Kiều |

Oct. 30


Chẩn đoán bệnh lở mồm long móng (FMD)

A, C và SAT2. Trình tự của primer NK72 dùng để xác định virus FMD được dùng
cho tất cả các nghiên cứu về trình tự RNA trong phòng thí nghiệm.
Đoạn mồi trình tự nucleotide (5’-3’) – chiều dài sản phẩm (bp)
Positive sense (+)
O-1C124 (ARS4)
O-1C564
O-1C609 (Ovp3)
A-1C562
A-1C612
C-1C536
C-1C616
As1-1C505
As1-1C616
Negative sense (-)
FMD-2B58 (NK61) GACATGTCCTCCTGCATCTG
FMD-2A34 (NK72) GAAGGGCCCAGGGTTGGACTC
Thông số tối ưu cho phản ứng PCR với các cặp mồi tương ứng

Nguyễn Thúy Kiều |

Oct. 30

Chẩn đoán bệnh lở mồm long móng (FMD)


Serotype
O
A
C
Asia 1

Cặp primer A/B được thiết kế cho sự khuếch đại vùng gene 3D của virus (the
viral RNA polymerase 3D) và bao gồm vị trí giới hạn Ahd I (Ahd I restriction
site) được bảo tồn cao trong số các thể phân lập mà có thể sử dụng như một bước
xác nhận thêm trong chẩn đoán nhanh tiếp theo sự khuếch đại. Không có phản
ứng chéo
được phát hiện với thể phân lập SVDV (swine vesicular disease Virus),
VSV (vesicular stomatitis virus) và BVDV (Bovine viral diarrhea virus).
Sử dụng primer A và B để khuếch đại một đoạn 290bp của gene 3Dpol t ương ứng với
C-terminus của protein. Kết quả của RT-PCR với những th ể phân lập khác nhau từ tất
cả 7 serotype của FMDV chỉ tạo ra 1 b ăng duy nhất với kích thước mong muốn được
quan sát tương ứng với những thể phân lập FMDV. Không có sản phẩm khuếch đại
được quan sát trong mẫu từ SVDV (swine vesicular disease virus), VSV (vesicular
stomatitis Virus) hoặc BVDV (Bovine viral diarrhea virus) chỉ ra rằng primer A và B
không có phản ứng chéo với genome của những virus có quan hệ lâm sàn này.
Primer A (5´-CACACGGCGTTCACCCA(A/T)CGC-3´)
Primer B (5´-GACAAAGGTTTTGTTCTTGGTC-3´)
•

0

0

Thông số của chu trình được ủ đầu tiên ở 48 C trong 30 phút và 95 C trong 10 phút,
0
0
0
sau đó 35 chu kỳ gồm có 94 C trong 30 giây, 60 C trong 45 giây và 72 C trong 45
0
giây, và sau cùng ủ ở 72 C trong 7 phút.

Nguyễn Thúy Kiều |

Oct. 30

Chẩn đoán bệnh lở mồm long móng (FMD)


Hình: Sản phẩm PCR từ sự khuếch đại của FMDV từ những động vật được lây nhiễm
khi sử dụng cặp mồi A/B. Lane M: DNA size maker.

Nguyễn Thúy Kiều |
Oct. 30

Chẩn đoán bệnh lở mồm long móng (FMD)